CN105177109B - 检测金黄色葡萄球菌的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的方法,该方法包括:(1)称取定量的待测样品至定量的预制的培养基中,进行增菌培养,获得增菌液;(2)取定量的(1)中的增菌液置于测试片中培养,测试片能够使金黄色葡萄球菌菌落显示为紫红色菌落;(3)对(2)中的培养的结果进行判定,以检测所述金黄色色葡萄球菌。还公开一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒。利用本发明的方法和/或试剂盒进行金黄色葡萄球菌,操作简单、方便快捷且检验结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测领域,具体的,本发明涉及食品微生物检验领域,更具体的,本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的方法和一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,由于其形状为球型,在显微镜下排列成葡萄串状而得名,该菌广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中。因而,食品及食品原料受其污染的机会很多。
目前国内外对于金黄色葡萄球菌的检测方法主要可分为两大类,一类是传统的微生物培养分离鉴定检测方法,另一类是一些基于分子生物学的方法,其目的是检测特定基因存在与否,以检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检测方法有很多,如:微生物学方法、生物学方法、免疫学方法、基因探针技术、耐热核酸酶法、生物传感技术、超抗原技术、聚合酶链反应技术,这些检测技术中,除微生物学方法外,其它检测技术一方面其只在研究开发阶段,推广应用价值有待研究;另一方面对于企业检测,成本及操作简便程度,对操作人员的技术能力要求均较高。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中的存在的技术问题之一或者提供一种商业选择。为此,本发明的一个目的是提供一种检测食品中的金黄色葡萄球菌的方法。
依据本发明的一方面,本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌的方法,该方法包括以下步骤:(1)称取定量的待测样品至定量的预制的培养基中,进行增菌培养,获得增菌液;(2)取定量的(1)中的增菌液置于测试片中培养,所述测试片能够使金黄色葡萄球菌菌落显示为紫红色菌落;(3)对(2)中的培养的结果进行判定,以检测所述金黄色色葡萄球菌,其中包括,当(2)中的培养的结果显示为无菌落时,判定所述待测样品中无金黄色葡萄球菌,当(2)中的培养的结果中显示有紫红色菌落时,判定所述待测样品中有金黄色葡萄球菌,当(2)中的培养的结果显示有非紫红色的其它颜色的菌落时,在所述测试片中置入确认片进行培养,以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,所述确认片能够使含有金黄色葡萄球菌的菌落显示为带粉红色晕的菌落。所称测试片是一种预先制备好的快速检验系统,它含有显色功能的培养基,对金黄色葡萄球菌具有很强的选择性,并含有冷水可溶性凝胶,测试片上的紫红色菌落为金黄色葡萄球菌。当测试片上出现除紫红色以外的其它颜色,则必须使用确认反应片,即使用所称的确认片,确认片上含有显色剂和脱氧核苷酸(DNA),金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶(DNase)会和确认片中的显色剂形成粉红色晕圈。
本发明的这一方面的金黄色葡萄球菌的检测方法,通过将被检测样品进行检测前增菌,接着使用单个测试片法进行定性检测,建立了单测试片法快速检验金黄色葡萄球菌的方法,该方法能够避免由于概率、人员操作等原因不能够检出目标菌,而且通过与国家标准检测方法GB 478910-2010的检测结果比较,证明本发明的这一方面的方法检测的准确性高,特异性、灵敏度及一致性都高,并且检出限低、工作周期短,降低了检测的工作量。
根据本发明的实施例,本发明的这一方面的检测金黄色葡萄球菌的方法还可以具有以下附加技术特征至少之一:
本发明的这一方法适于各种食品中金黄色葡萄球菌的检测。根据本发明的一个实施例,待测样品为乳或者乳制品。通过与国家标准检测方法GB 478910-2010的检测同一乳或者乳制品的结果比较,证明该示例的方法用于检测乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌,检测的准确性高,特异性、灵敏度及一致性都高,并且检出限低、工作周期短,能够降低检验乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌的工作量。
根据本发明的较佳实施例,步骤(1)中的称取定量的待测样品至定量的预制的培养基中,其中的定量的待测样品与定量的预制的培养基的体积比或者重量体积比为1:9。如此,利于金黄色葡萄球菌的得到有效的特异性的增殖。根据本发明的一个较佳实施例,步骤(1)为:称取25g或者25ml的待测样品至盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内,均质后于36℃±1℃中培养18h-24h以获得所述增菌液。该增菌培养步骤以及该增殖条件能有效的特异性的增加含有金黄色葡萄球菌的待测样品中的金黄色葡萄球菌含量,能有效的降低检出限,而且能够避免由于概率、人员操作等原因造成的不能检出。能使多数含有金黄色葡萄球菌的乳及乳制品中的该菌得到有效且适用测试片显色检测的扩增。
根据本发明的一个实施例,步骤(2)为:将1mL步骤(1)获得的增菌液加入到所述测试片中,36℃±1℃中培养22h-26h。该示例中,测试片选用市售的3M金黄色葡萄球菌测试片。取经过步骤(1)的增殖培养的增菌液1mL于36℃±1℃中培养22h-26h,能使该增菌液中的金黄色葡萄球菌以紫红色的菌落显示出。
根据本发明的实施例,步骤(3)中的当步骤(2)中的培养的结果显示为无菌落时,判定所述待测样品中无金黄色葡萄球菌,包括:给出所述待测样品中的金黄色葡萄球菌的含量为小于1CFU/定量的待测样品。根据本发明的一个实施例,所称取的定量的待测样品为牛奶25mL,测试片无菌落显示,则认定该牛奶的金黄色葡萄球菌含量为小于1CFU/25mL。
根据本发明的实施例,步骤(3)中的当步骤(2)中的培养的结果中显示有紫红色菌落时,判定所述待测样品中有金黄色葡萄球菌之后,还包括:对所述紫红色菌落进行计数,以定量所述待测样品中的金黄色葡萄球菌。定量表示为紫红色菌落数目/定量的待测样品。计数可利用目视或者菌落计数器进行,或者利用放大镜辅助计数,以准确定性定量。
根据本发明的实施例,步骤(3)中的当步骤(2)中的培养的结果显示有非紫红色的其它颜色的菌落时,在所述测试片中置入确认片进行培养,以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,包括:在所述测试片中置入所述确认片后于36℃±1℃中培养1h-3h,根据获得的培养结果中是否显示有带粉红色晕的菌落以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,带粉红色晕的菌落为包含金黄色葡萄球菌的菌落。该示例中的测试片和确认片都来自PetrifilmTM。确认片上的培养温度和时间利于包含金黄色葡萄球菌的菌落显示出带粉红色晕圈。
根据本发明的一个实施例,步骤(3)中的当步骤(2)中的培养的结果显示有非紫红色的其它颜色的菌落时,在所述测试片中置入确认片进行培养,以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,还包括:当确定所述待测样品中含有金黄色葡萄球菌时,对带粉红色晕的菌落进行计数以定量所述待测样品中的金黄色葡萄球菌。将待测样品中的金黄色葡萄球菌的含量表示为带粉红色晕的菌落数目/定量的待测样品。
根据本发明的一个实施例,步骤(3)中的当步骤(2)中的培养的结果显示有非紫红色的其它颜色的菌落时,在所述测试片中置入确认片进行培养,以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,包括:在所述测试片中置入所述确认片后于36℃±1℃中培养1h-3h,当获得的培养结果中整个培养面积呈粉红色而没有明显的晕圈时,确定所述待测样品中含有多不可计的金黄色葡萄球菌。
对比国标GB 478910-2010金黄色葡萄球菌检验方法,国标方法复杂、繁琐,特别是鉴定过程,不利于作为批量性生产检验,结果出具需要的时间长,一般日常检测时需要72~96小时;而且,由于金黄色葡萄球菌无处不在,对具备检验单位是否具有具备检验能力的人员、检验环境有着高要求;另外,对于废弃物处理环节,需制定特殊的流程;特别是对于操作中划线、溶血实验观察需要有较长工作经验或较深资质的人员担当。类似企业实验室人员流动大的单位,难有能力具备。而且,材料的使用中,在进行血浆凝固酶鉴定时,需要使用新鲜兔血浆,其制作环节为:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血四份,混好静置或者3000r/min离心30min,使血液细胞下降,即可得血浆。要使非研究性实验室类的企业具备该能力有难度。再者,物理性污染,按照HACCP的原则,在生产现场应避免使用可能导致物理性危害污染的玻璃器皿,划线的平皿均已产生物理性污染。
对比测试片检验法,测试片检验方法适用于含目标菌量较高的样品,使用该方法需进行两个稀释度、每个稀释度进行平行样检测,不适宜金黄色葡萄球菌含量低的样品的检测,而且检测费用过高,例如,使用测试片计数法检验时,每个样品需使用3M测试片4片,验证片4片,按照目前市售价格,单单测试片一个样品需要62.24元(测试片40.84元+验证片25.20元)。
本发明的这一方面或者上述任一实施例中的检测方法,对被检测样品进行检测前增菌,接着后使用单片测试片法进行定性检测,能够避免由于概率、人员操作等原因不能够检出的情况,操作所需时间短,检测费用低,而且经过准确性比较验证后该方法准确性高,特异性、灵敏度以及一致性都高。本发明这一方面或者上述任一实施例的方法,建立了一种适宜食品,特别是乳及乳制品食品中的金黄色葡萄球菌的快速定性和/或定量检测。采取不同产业链上样品进行检验结果准确性的验证,证明该方法具有操作简单、方便快捷、结果易观察、结果准确可靠、抑制杂菌能力强以及工作周期短的特点。
依据本发明的另一方面,本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒,该试剂盒用以进行上述本发明一方面或者任一实施例中的方法,该试剂盒包括:测试片,所述测试片能够使金黄色葡萄球菌菌落显示为紫红色菌落;确认片,所述确认片能够使含有金黄色葡萄球菌的菌落显示为带粉红色晕的菌落;以及说明书,所述说明书包括指示利用测试片、任选的利用确认片,以及按照上述本发明一方面或者任一实施例中的方法进行金黄色葡萄球菌的检测。所称测试片是一种预先制备好的快速检验系统,它含有显色功能的培养基,对金黄色葡萄球菌具有很强的选择性,并含有冷水可溶性凝胶,测试片上的紫红色菌落为金黄色葡萄球菌。当测试片上出现除紫红色以外的其它颜色,则必须使用确认反应片,即使用所称的确认片,确认片上含有显色剂和脱氧核苷酸(DNA),金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶(DNase)会和确认片中的显色剂形成粉红色晕圈。
根据本发明的较佳实施例,该试剂盒还包括培养基,培养基为7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤。该试剂盒方便于金黄色葡萄球菌的检测。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是本发明的一个实施例中的检测金黄色葡萄球菌的方法的流程图;
图2是本发明的一个实施例中的国标法检验金黄色葡萄球菌的流程。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。另外,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
1、设备和材料
(1)恒温培养箱:36℃±1℃。
(2)冰箱:2℃~5℃。
(3)恒温水浴箱:37℃~65℃。
(4)天平:感量0.1g。
(5)均质器(旋刀式或拍击式)。
(6)振荡器。
(7)无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
(8)无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。
(9)无菌培养皿:直径90mm。
(10)注射器:0.5mL。
(11)PH计或精密PH试纸。
(12)放大镜或(和)菌落计数器。
(13)金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片。
(14)金黄色葡萄球菌PetrifilmTM确认反应片。
2、培养基和试剂
(1)10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤。
(2)7.5%氯化钠肉汤。
(3)血琼脂平板。
(4)Baird-Parker琼脂平板。
(5)脑心浸出液肉汤(BHI)。
(6)兔血浆。
(7)稀释液。
(8)营养琼脂小斜面。
(9)革兰氏染色液。
(10)无菌生理盐水。
3、试验验证设计及实验步骤
接种模拟使样品含有已知预定量的金黄色葡萄球菌,利用国标法GB478910-2010和本发明的方法分别对同一样品进行金黄色葡萄球菌检测,样品包括生乳、灭菌乳和乳粉。表1显示模拟的样品包含的菌的情况,其中的竞争菌株包括:大肠菌群、荧光假单胞菌、鞘氨醇杆菌和黄杆菌等,将以上标准菌种人工污染制备成阳性样品,其它乳制品包括无水奶油、干酪和再制干酪。
表1
选择性是对灵敏度和特异性的衡量。灵敏度是待确认方法从众多菌中检测到目标菌的能力;特异性是待确认方法对可能引起交叉反应的相关非目标菌株的抗干扰能力。灵敏度和特异性的数据可以用来证实某个方法能够检测目标菌的主要血清型而对相关的不同属和/或种不反应。表2显示对本发明的这一检测方法的选择性验证的条件。
表2
图1显示本发明方法的实验步骤,包括以下:
(1)检验:样品处理,符合微生物检测的前处理,包括样品称量、稀释。
其中,固体和半固体样品称量与稀释操作,例如表4所示的乳粉、无水奶油、干酪、乳糖或者酪蛋白粉等:称取25g样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。
液体样品的称量与稀释操作,例如生乳、灭菌乳或者酸奶饮品等:以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。
(2)增菌:吸取5mL上述样品匀液,接种于50mL7.5%氟化钠肉汤内,采取36℃±1℃培养18~24h。该增菌步骤所采用的上述培养基是通过筛选组合一种抑制剂和一种促进剂而确定的,该抑制剂为1000mL蒸馏水中75g氯化钠,该种促进剂为1000mL蒸馏水中10g蛋白胨、5g牛肉膏,利用该培养基,在所示培养条件下,金黄色葡萄球菌能够得到选择性富集;
(3)测试:在金黄色葡萄球菌被增菌以后,使用美国3M公司Petrifilm TM的金黄色葡萄球菌测试片,采取单测试片进行检测,培养:36℃±1℃培养,24h±2;
(4)判读:对菌落形态进行观察并判定,如果测试片上没有菌落生长或菌落全部是紫红色(典型的金黄色葡萄球菌特征),无需进行确认;如果测试片上出现黑色、蓝绿色菌落或紫红色菌落不明显,需要使用Petrifilm TM的确认反应片进行进一步确认;
(5)确认:将上层膜掀起,将确认反应片置入测试片的培养范围内,再将上层膜放下覆盖在确认反应片上,用手指以滑动的方式轻轻将测试片与确认反应片压紧,包括确认反应片的边缘,此步骤可使测试片与Petrifilm TM的确认反应片紧密接触并除去气泡,最后把插入确认反应片的测试片放在36℃±1℃培养箱内培养1h~3h;确认是否属于金黄色葡萄球菌;
(6)报告:依据观察结果进行报告。
概括上述步骤为:检样→增菌培养→测试培养→判定→确认结果→报告。
图2显示国标法的检测步骤。
4、检验结果比较
为利用本发明的单片法代替国标方法,所以需要保证二者检测结果无差异。
分别使用这两种方法对以上相同的乳及乳制品的测试,通过统计分析比较,确定检测数据结果无差异。
表3显示灵敏度和特异性验证结果。表4显示检测准确性验证结果。
表3
表4
从表3和表4可看出,本发明的检测方法的灵敏度、特异性均大于95%,对各乳制品的检测结果均与国标方法的检测结果相同,说明本发明的这一方法准确可靠,抑制杂菌能力强。而且,耗时短即工作周期短,降低了工作量及检测费用。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种检测金黄色葡萄球菌的方法,其特征在于,包括:
(1)称取25g或者25ml的待测样品至盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,均质后于36℃±1℃中培养18h-24h以获得增菌液,所述待测样品为乳或者乳制品,所述7.5%氯化钠肉汤含有7.5%氯化钠作为抑制剂,1%蛋白胨和0.5%牛肉膏作为促进剂;
(2)取定量的(1)中的增菌液置于测试片中培养,所述测试片能够使金黄色葡萄球菌菌落显示为紫红色菌落;
(3)对(2)中的培养的结果进行判定,以检测所述金黄色色葡萄球菌,其中包括:
当(2)中的培养的结果显示为无菌落时,判定所述待测样品中无金黄色葡萄球菌,
当(2)中的培养的结果中显示有紫红色菌落时,判定所述待测样品中有金黄色葡萄球菌,对所述紫红色菌落进行计数,以定量所述待测样品中的金黄色葡萄球菌,
当(2)中的培养的结果显示有非紫红色的其它颜色的菌落时,在所述测试片中置入确认片进行培养,以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,包括:在所述测试片中置入所述确认片后于36℃±1℃中培养1h-3h,根据获得的培养结果中是否显示有带粉红色晕的菌落以确定所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌,
当确定所述待测样品中含有金黄色葡萄球菌时,对带粉红色晕的菌落进行计数以定量所述待测样品中的金黄色葡萄球菌,在所述测试片中置入所述确认片后于36℃±1℃中培养1h-3h,当获得的培养结果中整个培养面积呈粉红色而没有明显的晕圈时,确定所述待测样品中含有多不可计的金黄色葡萄球菌。
2.权利要求1的方法,其特征在于,(2)为:
取1mL所述增菌液加入到所述测试片中,36℃±1℃中培养22h-26h。
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金黄色葡萄球菌显色培养基研究进展;黄汝添等;《中国卫生检验杂志》;20070610;第17卷(第6期);第1148-1150页 * |
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