CN110283873A - ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法检测纳米无机材料抗细菌性能的方法 - Google Patents

ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法检测纳米无机材料抗细菌性能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种及培养；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的纳米无机材料抗细菌性能进行精准定量测试。本发明规定测定振荡培养前后对照样品和抗菌样品回收液IB，以lgIB表征和计算R或A并提供结果评价依据。本发明研发的纳米无机材料抗细菌性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。

Description

ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法检测纳米无机材料抗细菌性能 的方法
技术领域
本发明涉及纳米无机抗菌材料的抗细菌性能测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的纳米无机抗菌材料抗细菌性能进行精准定量检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，属纳米无机材料抗菌功能检测技术领域。
背景技术
近年来，伴随着社会科技进步的日新月异和人们健康环保意识的日益强化；纳米无机抗菌材料在建材、家电、轻纺、食包、日化等诸多领域应用广泛，其国内市场规模早已突破千亿且逐年递增，但目前现有检测技术的滞后却严重制约着产业发展。
目前，国内外抗菌材料性能检测技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗细菌性能测试方法原理多基于对细菌进行分离培养的平板计数法，一是日本工业标准提出的贴膜培养和浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法；五是日本企业针对光催化型抗菌制品研发的盖玻片法。截至目前，我国已制定实施GB/T 21510-2008《纳米无机材料抗菌性能检测方法》，但现有检测方法在技术内容和实际应用中存在以下共性问题：一是所涉实验菌种过少，难以满足企业与时俱进的新品研发与质控需求；二是实验过程繁琐，相关操作受实验员专业经验影响，测试误差大，缺乏可比性；三是测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。近年来，在国际细菌检测技术领域ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比ATP检测结果的相关性为98％，准确度高且可实现快速检测；发达国家已将此方法运用于HACCP中。国内ATP相关研究起步较晚，受应用需求牵引，现ATP荧光检测仪已成为中国卫生部门指定的卫生监督和食品安全相关的专用检测设备。当前国外抗菌材料性能检测技术研究向定量化、快速化和简易化趋势发展，注重检测结果准确性和可比性；已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO20743:2007-2013《Textiles-Determination of antibacterial activity of textileproducts(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO 13629-1:2012《Textiles-Determination of antifungal activity of textile products.Part1Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料，在试验有效条件等关键技术方面不适用于具有非吸水性且对照样细菌增长值＜0的纳米无机材料；同时未提供明确的结果计算公式和测量不确定度评估。另外，该标准方法相关抗菌性能表征参数相对单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用抗菌率R。
因此，为促进产品更新换代，推动产业转型升级，规范国内市场秩序，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的纳米无机抗菌材料性能测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可有效填补国内外相关技术领域空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的纳米无机抗菌材料抗细菌性能进行检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，能够解决纳米无机材料乃至其他抗菌材料及制品抗细菌性能精准定量测试问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，包括：(1)样品制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种及振荡培养；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的纳米无机抗菌材料抗细菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IB测定中：
明确对照样品和抗菌样品的粒度、质量及前处理要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液。应用MTT比色分析法进行活菌计数，建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2；并对接种菌液进行活菌含量CB标定：5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL。同时，选择CB为1.8×103CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×105CFU/mL的稀释液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标准曲线，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2。然后，向装有各组对照样品和抗菌样品的锥形瓶中分别滴加5mL接种菌液；在1min内应用ATP荧光光度计对6组0h接触样品回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij进行测定，根据曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij。同时，将装有6组待培养样品的锥形瓶固定于恒温振荡器上，(37±1)℃以250r/min～300r/min的转速振荡培养至规定时间后；应用ATP荧光光度计测定其回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，并推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据试验菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及振荡培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和 作为基础数据；在试验有效条件下，计算其经振荡培养后的细菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗细菌性能分级判定标准；当某组(件)纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组(件)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的评价结果。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计和酶标仪作为测试设备，达到了活菌含量测定和纳米无机抗菌材料抗细菌性能检测的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，避免了传统平皿培养法普遍存在的较大误差；能够确保检测结果的定量化，同时大幅度提高检测数据的准确性；检测技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据ATP荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌含量对数值lgCB─相对荧光强度对数值lgIB标准曲线；构建了纳米无机抗菌材料抗细菌性能ATP生物荧光实时定量分析方法的数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取抗菌率R及抗菌活性值A为相关性能评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行操作繁、误差大、周期长的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的ATP荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了纳米无机材料抗细菌性能检测结果的精准化和定量化并具备良好重现性和可比性；同时大幅缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgCB、lgIB线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了菌悬液活菌含量测定方法和纳米无机材料样品前处理方式，明确了对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收活菌相对荧光强度值IB作为结果评价形式来计算并判定抗菌率R或抗菌活性值A，并通过组内及组间变异系数C·V考察测量不确定度，在技术上具有一定的前瞻性。
(5)可操作性：ATP荧光光度计和酶标仪价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的活菌含量MTT比色分析法和纳米无机材料抗细菌性能ATP荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平微生物实验人员，有利于促进成果转移转化和推广应用。
(6)普适性：因ATP普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑纳米无机材料抗细菌性能检测技术实现普适化，同时可对日化品等产品领域抗细菌性能检测技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的样品制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)对照样品：未经抗菌处理的二氧化硅粉末，粒度不大于100nm，纯度98％～99％；将0.5g±0.05g样品粉末和15mL含0.1％吐温-80的试验菌种培养液倒入50mL锥形瓶中，密封后121℃高压灭菌30min。每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和特定时间振荡培养试验各用3组，每组5件样品粉末；
(2)抗菌样品：具有抗菌作用的纳米级粉体型无机材料，其粒度、质量、数量及前处理等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的细菌总数ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，检测范围101CFU/mL～107CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1的pH计；电炉；
(3)材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量50mL、150mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；96孔平底培养板；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；酒精灯；分度值1mm的直尺； 的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔；
(4)试剂：5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；85％的生理盐水(121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；
平板计数琼脂(PCA):将5g胰蛋白胨、2.5g酵母浸膏、1g葡萄糖、15g琼脂加热溶解于1000mL水中,调节pH至7.0±0.2；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲液中，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC 14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散。然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代；
(3)菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d。试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物；
(4)菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀。将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度6.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止；
所述的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定，按下述步骤进行：
(1)菌液OD值测定：用试验菌种培养液对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行1:5、1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正。然后，将100μL上述不同稀释度的菌液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(37±1)℃、(90±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度菌悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值。同时，按照国标GB 4789.2-2016规定的方法，对上述菌悬液进行适当稀释后，在(37±1)℃培养24h±2h，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB；
(2)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定：以不同稀释度菌悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2。其中大肠埃希氏菌(或志贺氏菌)和金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)分别选取稀释度为1:10、1:15、1:20和1:5、1:10、1:15的菌悬液作为标准系列溶液绘制曲线，当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的菌悬液活菌含量CB有效。然后，经试验菌种培养液调整得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液；
所述的活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立，按下述步骤进行：
(1)标准系列菌悬液确定及其IB测定：用试验菌种培养液将已知活菌含量CB的菌液梯度稀释为标准系列菌悬液：1.8×103CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×105CFU/mL并充分混匀。然后，根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高的顺序，对上述标准系列菌悬液及5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值进行测定并记录(将后者记为IB0)；
(2)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立：以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以其相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效；
所述的样品接种及振荡培养，按下述步骤进行：
3000r/min振摇装有各组对照样品和抗菌样品的锥形瓶30s，混匀后用灭菌移液枪向瓶内分别注入5mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)；立即再次振摇装有6组0h接触样品的锥形瓶10s，并将瓶内混匀液作为待测样品的回收液，在1min内应用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值。同时，将装有6组待培养样品的锥形瓶固定于恒温振荡器上，在(37±1)℃以250r/min～300r/min的转速进行振荡接触培养；其中需稀释后使用的纳米无机材料样品培养1h～4h，无需稀释直接使用的纳米无机材料样品培养4h～24h；并将振荡培养至规定时间后的瓶内混匀液作为待测样品的回收液；
所述的回收液相对荧光强度值IB测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组的本底值(或按照仪器使用说明校准本底值)；
(2)回收液相对荧光强度值IB测定：如本底水平符合仪器使用要求，则用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照相关使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IB)；
所述的回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌含量CB及TB推算
根据试验菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后回收液的活菌含量CB和TB。相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌含量CB和TB)见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经振荡培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij。则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效。
(3)细菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后，细菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌材料样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(6)数据修约要求：采用平板计数法标定菌悬液活菌含量CB时，参考GB4789.2—2016相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；细菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于纳米无机抗菌材料抗细菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1，2，3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1，2，3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
所述的纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无抗细菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有抗细菌作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品抗细菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品抗细菌作用极强；
如果采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无抗细菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有抗细菌作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品抗细菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品抗细菌作用极强；
(2)当某组(件)纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的评价结果；
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以经添加纳米银系抗菌剂制备而成的纳米无机抗菌粉体材料样品的抗细菌性能检测为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品制备及前处理
1.1对照样品：未经抗菌处理的二氧化硅粉末，粒度不大于100nm，纯度98％～99％；将0.5g±0.05g样品粉末和15mL含0.1％吐温-80的试验菌种培养液倒入50mL锥形瓶中，密封后121℃高压灭菌30min。每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和特定时间振荡培养试验各用3组，每组5件样品粉末。
1.2抗菌样品：具有抗菌作用的纳米级粉体型无机材料，其粒度、质量、数量及前处理等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的细菌总数ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，检测范围101CFU/mL～107CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1的pH计；电炉。
2.3材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量50mL、150mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；96孔平底培养板；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；酒精灯；分度值1mm的直尺； 的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔。
2.4试剂：5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；85％的生理盐水(121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d)。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；
平板计数琼脂(PCA):将5g胰蛋白胨、2.5g酵母浸膏、1g葡萄糖、15g琼脂加热溶解于1000mL水中,调节pH至7.0±0.2。
2.6ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲液中，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备
3.1试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC 14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散。然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代。
3.3菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d。试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物。
3.4菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀。将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度6.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止。
(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定
4.1菌液OD值测定：用试验菌种培养液对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行1:5、1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正。然后，将100μL上述不同稀释度的菌液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(37±1)℃、(90±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度菌悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值。同时，按照国标GB 4789.2-2016规定的方法，对上述菌悬液进行适当稀释后，在(37±1)℃培养24h±2h，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB。
4.2OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定：以不同稀释度菌悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2。其中大肠埃希氏菌(或志贺氏菌)和金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)分别选取稀释度为1:10、1:15、1:20和1:5、1:10、1:15的菌悬液作为标准系列溶液绘制曲线，当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的菌悬液活菌含量CB有效。然后，经试验菌种培养液调整得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液。
(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立
5.1标准系列菌悬液确定及其IB测定：用试验菌种培养液将已知活菌含量CB的菌液梯度稀释为标准系列菌悬液：1.8×103CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×105CFU/mL并充分混匀。然后，根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高的顺序，对上述标准系列菌悬液及5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值进行测定并记录(将后者记为IB0)。
5.2活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立：以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以其相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。
(6)样品接种及振荡培养
3000r/min振摇装有各组对照样品和抗菌样品的锥形瓶30s，混匀后用灭菌移液枪向瓶内分别注入5mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)；立即再次振摇装有6组0h接触样品的锥形瓶10s，并将瓶内混匀液作为待测样品的回收液，在1min内应用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值。同时，将装有6组待培养样品的锥形瓶固定于恒温振荡器上，在(37±1)℃以250r/min～300r/min的转速进行振荡接触培养；其中需稀释后使用的纳米无机材料样品培养1h～4h，无需稀释直接使用的纳米无机材料样品培养4h～24h；并将振荡培养至规定时间后的瓶内混匀液作为待测样品的回收液。
(7)回收液相对荧光强度值IB测定
7.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组的本底值(或按照仪器使用说明校准本底值)。
7.2回收液相对荧光强度值IB测定：如本底水平符合仪器使用要求，则用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照相关使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IB)。
(8)回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算
8.1回收液活菌含量CB及TB推算
根据试验菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后回收液的活菌含量CB和TB。相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌含量CB和TB)见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5。
8.2试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经振荡培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij。则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效。
8.3细菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后，细菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.4抗菌率R计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.5抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌材料样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.6数据修约要求：采用平板计数法标定菌悬液活菌含量CB时，参考GB4789.2—2016相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；细菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字。
8.7测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于纳米无机抗菌材料抗细菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1，2，3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1，2，3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
(9)结果评价
9.1参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无抗细菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有抗细菌作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品抗细菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品抗细菌作用极强；
如果采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无抗细菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有抗细菌作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品抗细菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品抗细菌作用极强。
9.2当某组(件)纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的评价结果。
本实施例所用实验室生物安全资质、仪器设备、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)实验室生物安全资质
在机构注册号为CNAS BL0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备
2.1二级生物安全柜：Thermo Scientific1300系列二级B2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)。
2.2超净工作台：美国品牌Thermo ScientificTMHeraguardTM、型号ECO的超净工作台，内部宽×深×高＝920mm×585mm×645mm；空气流速为0.15m/s～0.25m/s和0.36m/s～0.45m/s。
2.3细菌总数ATP生物荧光快速检测系统：美国Hygiena公司的便携式system SUREATP荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；ATP含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0CFU/ml，RLU读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％。
2.4酶标仪：美国品牌Thermo Scientific、型号Multiskan FC的全自动酶标仪，波长范围(340～850)nm±1nm，读数范围(0.0～6.0)Abs±0.001Abs；405nm对应的测量精度为±1％(0.0Abs～3.0Abs)或±2％(3.0Abs～4.0Abs)。
2.5恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号WS-380H、容积380L、控温范围(0～50)℃±0.8℃、控湿范围(30～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱。
2.6恒温振荡培养箱：上海一恒型号WS-380H、控温范围(4～65)℃±0.1℃、振荡频率(40～300)r/min、定时范围(1～99)h。
2.7恒温水浴箱：上海基玮试验仪器设备有限公司型号DK-S420的电热恒温水槽，容积15L，控温范围(5～99.9)℃±0.5℃，定时范围1min～999min。
2.8压力蒸汽灭菌器：日本Sanyo公司型号MLS-3780的高压灭菌器，容积75L，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235MPa，定时范围(1～250)min。
2.9低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号DW-HL398的超低温冷冻储存箱，有效容积398L，存储温度-10℃～-86℃。
2.10冷藏箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号YC-968L的医用冷藏箱，有效容积968L，存储温度(2～8)℃±0.1℃。
2.11电子天平：日本岛津型号AUX220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.12超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号YQ-120C的超声波清洗机，容量3.2L，超声频率40KHz/28KHz/25KHz，定时范围1min～30min/99min。
2.13旋涡振荡器：美国品牌Coleparmer Votex-Genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.14pH计：上海精密仪器仪表有限公司型号MP512-03的精密pH计，量程范围(-2.000～19.999)pH±0.002pH，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.15电炉：常州德科仪器有限公司型号DLD-1KW的1KW封闭式调温电炉。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
四甲基偶氮唑盐、三磷酸腺苷二钠标准品及配制ATP荧光试剂缓冲溶液、ATP裂解液、ATP提取液和ATP荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国Amresco品牌。
(5)标准菌株
大肠埃希氏菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用ATP荧光光度计经lgCB-lgIB标准曲线法对纳米无机抗菌粉体材料样品的抗细菌性能进行检测，相关检测数据及测量不确定度计算结果分别见表1～表4(志贺氏菌和沙门氏菌的检测结果分别与大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的检测结果接近)。
表1相对荧光强度测定值及抗菌率R、抗菌活性值A计算结果(大肠埃希氏菌)
表2相对荧光强度值测量不确定度计算结果(大肠埃希氏菌)
表3相对荧光强度测定值及抗菌率R、抗菌活性值A计算结果(金黄色葡萄球菌)
表4相对荧光强度测量不确定度计算结果(金黄色葡萄球菌)
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，包括：(1)样品制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种及振荡培养；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的纳米无机抗菌材料抗细菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IB测定中：
明确对照样品和抗菌样品的粒度、质量及前处理要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液，应用MTT比色分析法进行活菌计数，建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2；并对接种菌液进行活菌含量CB标定：5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL，同时，选择CB为1.8×103CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×105CFU/mL的稀释液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标准曲线，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2，然后，向装有各组对照样品和抗菌样品的锥形瓶中分别滴加5mL接种菌液；在1min内应用ATP荧光光度计对6组0h接触样品回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij进行测定，根据曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij，同时，将装有6组待培养样品的锥形瓶固定于恒温振荡器上，(37±1)℃以250r/min～300r/min的转速振荡培养至规定时间后；应用ATP荧光光度计测定其回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，并推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据试验菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及振荡培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和 作为基础数据；在试验有效条件下，计算其经振荡培养后的细菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗细菌性能分级判定标准；当某组(件)纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的评价结果。
2.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的样品制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)对照样品：未经抗菌处理的二氧化硅粉末，粒度不大于100nm，纯度98％～99％；将0.5g±0.05g样品粉末和15mL含0.1％吐温-80的试验菌种培养液倒入50mL锥形瓶中，密封后121℃高压灭菌30min，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和特定时间振荡培养试验各用3组，每组5件样品粉末；
(2)抗菌样品：具有抗菌作用的纳米级粉体型无机材料，其粒度、质量、数量及前处理等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
3.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的细菌总数ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，检测范围101CFU/mL～107CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1的pH计；电炉；
(3)材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量50mL、150mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；96孔平底培养板；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；酒精灯；分度值1mm的直尺； 的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔；
(4)试剂：5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；85％的生理盐水(121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；
平板计数琼脂(PCA):将5g胰蛋白胨、2.5g酵母浸膏、1g葡萄糖、15g琼脂加热溶解于1000mL水中,调节pH至7.0±0.2；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲液中，混匀后室温静置15min，3h内使用。
4.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散，然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代；
(3)菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d，试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物；
(4)菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀，将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度6.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止。
5.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定，按下述步骤进行：
(1)菌液OD值测定：用试验菌种培养液对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行1:5、1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正，然后，将100μL上述不同稀释度的菌液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(37±1)℃、(90±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度菌悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值，同时，按照国标GB 4789.2-2016规定的方法，对上述菌悬液进行适当稀释后，在(37±1)℃培养24h±2h，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB；
(2)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种菌液CB标定：以不同稀释度菌悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2，其中大肠埃希氏菌(或志贺氏菌)和金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)分别选取稀释度为1:10、1:15、1:20和1:5、1:10、1:15的菌悬液作为标准系列溶液绘制曲线，当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的菌悬液活菌含量CB有效，然后，经试验菌种培养液调整得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液。
6.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立，按下述步骤进行：
(1)标准系列菌悬液确定及其IB测定：用试验菌种培养液将已知活菌含量CB的菌液梯度稀释为标准系列菌悬液：1.8×103CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×105CFU/mL并充分混匀，然后，根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高的顺序，对上述标准系列菌悬液及5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值进行测定并记录(将后者记为IB0)；
(2)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立：以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以其相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。
7.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的样品接种及振荡培养，按下述步骤进行：
3000r/min振摇装有各组对照样品和抗菌样品的锥形瓶30s，混匀后用灭菌移液枪向瓶内分别注入5mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)；立即再次振摇装有6组0h接触样品的锥形瓶10s，并将瓶内混匀液作为待测样品的回收液，在1min内应用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值，同时，将装有6组待培养样品的锥形瓶固定于恒温振荡器上，在(37±1)℃以250r/min～300r/min的转速进行振荡接触培养；其中需稀释后使用的纳米无机材料样品培养1h～4h，无需稀释直接使用的纳米无机材料样品培养4h～24h；并将振荡培养至规定时间后的瓶内混匀液作为待测样品的回收液。
8.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IB测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样，向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组的本底值(或按照仪器使用说明校准本底值)；
(2)回收液相对荧光强度值IB测定：如本底水平符合仪器使用要求，则用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液依次加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样，向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照相关使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IB)。
9.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌含量CB及TB推算
根据试验菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后回收液的活菌含量CB和TB，相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌含量CB和TB)见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经振荡培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与5mL接种菌液经15mL含0.1％吐温-80的洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经振荡培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij，则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效，
(3)细菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后，细菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经振荡培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批纳米无机抗菌材料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经振荡培养后的细菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经振荡培养后抗菌材料样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(6)数据修约要求：采用平板计数法标定菌悬液活菌含量CB时，参考GB4789.2—2016相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；细菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及振荡培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于纳米无机抗菌材料抗细菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％；
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经振荡培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经振荡培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h培养后，各ATP测试平行样的相对荧光强度测定值)：
10.根据权利要求1所述的纳米无机抗菌材料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无抗细菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有抗细菌作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品抗细菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品抗细菌作用极强；
如果采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无抗细菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有抗细菌作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品抗细菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品抗细菌作用极强；
(2)当某组(件)纳米无机抗菌材料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)纳米无机抗菌材料样品抗细菌性能的评价结果。
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