CN110272938A - ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌涂料防霉性能的方法 - Google Patents

ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌涂料防霉性能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗菌涂料防霉性能检测方法，检测步骤包括：样品提取、制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的涂料防霉性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养48h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌涂料防霉性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。

Description

ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌涂料防霉性能的 方法
技术领域
本发明涉及抗菌涂料的防霉性能测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，属于涂料抗菌功能检测技术领域。
背景技术
伴随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，室内环境及家居装修质量备受关注，抗菌涂料因此应运而生且供不应求；据统计，2017年全球抗菌涂料产量已逾40万吨；相关机构Zion Research最新研究报告显示，2020年国际抗菌涂料市场预计将突破50亿美元，复合年平均增长率为9％。可见抗菌技术在涂料产业的应用和普及势不可挡，抗菌功能已成为涂料产品极具特色的一个“卖点”；但现有检测技术的滞后却严重制约着产业发展。
目前，国内外抗菌材料性能检测技术体系主要针对细菌和真菌，其中防霉检测方法基本源自美标、日标和欧标，所涉标准主要包括国外基于土埋培养法、琼脂平板法和湿室培养法的ISO 846:1997《塑料制品的抗菌培养评估》、DIN 53793《抗菌高分子材料的抗真菌测定方法》和国内侧重于平皿培养法和悬挂法的GB/T 1741-2007《漆膜耐霉菌性测定法》、GB/T 24346-2009《纺织品防霉性能的评价》、GB/T 24128-2009《塑料防霉性能试验方法》、QB/T 4199-2011《皮革防霉性能测试方法》、HG/T 4301-2012《橡胶防霉性能测试方法》、LY/T 2230-2013《人造板防霉性能评价》等。总体而言，现有防霉性能检测方法在技术内容和实际应用中存在以下共性问题：一是由于霉菌孢子生长过程中形成的菌丝体无法准确计数，只能进行定性判定，无法定量测试；二是因霉菌生长周期较长，培养时间至少2周～4周，导致测试周期较长，时间及经济成本高；三是实验过程繁琐，技术难度较高；相关操作受人为因素影响大，使得测试误差大，缺乏可比性。近年来，在国际细菌检测技术领域ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比检测结果相关性为98％，准确度高且可实现快速检测。受需求牵引，国外抗菌材料性能检测技术研究领域针对当前定量化、快速化和简易化发展趋势，已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO 20743:2007-2013《Textiles-Determination ofantibacterial activity of textile products(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO 13629-1:2012《Textiles-Determination of antifungal activity oftextile products.Part1Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料，在活菌回收方式、试验有效条件等关键技术方面不适用于具有非吸水性硬质表面且对照样细菌增长值＜0的建材、金属等涂料底板材料；同时未提供明确的结果计算公式和测量不确定度评估。另外，该标准方法相关抗菌性能表征参数相对单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用抗菌率R。
因此，为抵御国外技术壁垒，规范国内市场秩序，推动产业转型升级，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的抗菌涂料性能测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可有效填补国内外相关技术领域空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，能够解决抗菌涂料乃至其他产品领域抗菌材料及制品防霉性能精准定量测试问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种抗菌涂料防霉性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IB测定中：
明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将霉菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜霉菌孢子培养物制备孢子悬液；应用MTT比色分析法建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2。对不同稀释度的孢子悬液进行活菌含量CB标定后，选择CB为2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL的孢子液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标曲，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2。然后，选取活菌含量CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的混合孢子液作为接种菌液；向各组样品待测表面分别滴加0.3mL菌液，立即用4.6mL洗脱液对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij，根据lgCB-lgIB曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij。同时，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(28±2)℃、(95±2)％RH的条件下培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及经48h培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其霉菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌涂料样品抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定防霉性能分级判定标准；当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组(件)抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计作为测试设备，能够精准快速测定涂料样品培养特定时间后回收的活菌量，达到了涂料防霉性能检测的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，突破了传统平皿培养法的定性分析局限；实现了检测结果的定量化，并大幅度提高检测数据的准确性；检测技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据ATP荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌含量对数值lgCB─相对荧光强度对数值lgIB标准曲线；构建了抗菌涂料防霉性能测试的ATP生物荧光实时定量分析方法数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取抗菌率R及抗菌活性值A为相关性能评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行操作繁、周期长、非定量的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的ATP荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了涂料防霉性能检测结果的精准化和定量化并具备良好的重现性和可比性；同时大幅度缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgCB、lgIB线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了霉菌孢子悬液活菌含量测定方法和涂料样品前处理方式，明确对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收液活菌相对荧光强度值IB作为结果评价形式来计算并判定抗菌率R或抗菌活性值A，并通过组内及组间变异系数C·V考察测量不确定度，在技术上具有一定的前瞻性。
(5)可操作性：ATP荧光光度计价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线法和涂料防霉性能ATP荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平的微生物实验人员，有利于促进成果转移转化和推广应用。
(6)普适性：因ATP普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑涂料防霉性能检测技术实现普适化，同时可对塑料、玻璃等产品领域防霉性能检测技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的提取、制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)涂料样品提取：本专利方法所涉涂料样品为建筑和木器用抗菌涂料，包括液态或加热时可液化但不发生化学变化以及粉状、粒状、膏状的色漆和清漆物料；取样地点涵盖罐、柱状桶、贮槽、集装箱、槽车/槽船以及鼓状桶、袋、大包、贮仓、贮仓车或传送带等场所。取样由具备相关经验人员参照GB/T 3186-2006《色漆、清漆和色漆与清漆用原材料取样》中有关规定，根据待测涂料类别、聚集状态及容器大小，选择适用类型和规格的清洁器具提取至少2kg或抗菌试验所需量3～4倍的样品。当涂料存放于鼓状桶、柱状桶、袋等小容器时，如果交付批存在若干个容器，取样数量遵循GB/T 3186-2006中表1的规定，否则从每个容器中各提取一件样品；若交付批由不同生产批容器组成，则从每个生产批容器中分别提取。当涂料存放于贮槽、公路槽车、贮仓、贮仓车、铁路槽车、槽船或平均高度至少1m的反应器等大容器时，对于均匀物料及搅拌或加热后可成为均匀物料的暂时性不均匀物料，上部样品可用取样勺或取样管提取，中部样品用浸人式罐提取，距液面十分之九深度处的底部样品用浸人式罐或区域取样器提取；如果大容器由几个隔段组成，从每个隔段中至少提取一件样品，并将所取单一样品混合成一件平均样品。对于永久性不均匀物料，至少提取2件样品，其中上层样品可用取样勺、下层样品用区域取样器、浸人式瓶(罐)或在容器底阀处取样；制备样品时将所取两层样品按照产品标准规定的配比称量混合成1件平均样品。
取样结束后，使用旋转分样器将所提取的全部固、液体涂料样品充分混匀并分成15等分；其中固体样品每份500g，液体样品每份400mL。然后，将每份涂料样品分别放入带螺旋盖的罐、瓶、桶或塑料袋等容器中存放，其中金属容器配有密封金属盖，无焊料且内部不涂色漆和清漆(不用镀锌和铝质容器)；玻璃容器配有密封盖；
(2)对照样品：除未添加任何抗菌防腐防霉成分外，对照样品的涂料类别、底板材质及制备方法、规格尺寸、试板厚度等均与抗菌样品完全相同。每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和48h培养试验各用3组，每组5件样品；
(3)抗菌样品：添加抗菌成分的涂料试板，根据待测涂料样品的实际应用情况，可选择石棉水泥板、木质板、金属板、塑料板、玻璃板、贴膜纸板等底材；试板尺寸为(50±1)mm×(50±1)mm；其中钢板、铝板、马口铁板等金属试板厚度为1mm，木质试板厚度不大于10mm，矿石建筑板、石棉水泥板、复合木板、玻璃等材质试板厚度为1mm～10mm。所用试板表面平整、无锈、无油污，金属试板表面经磨砂纸打磨粗糙后，用75％的乙醇溶液擦拭2min；木质面板不取木心材且无树节，烘干后使用。
按照GB/T 1727-1992《漆膜一般制备法》要求制作漆膜，涂料施涂包括两次涂刷过程，第一次表干后再涂刷第二次，漆膜总厚度(湿膜)小于100μm；若以木板或纸板为底材，应确保漆膜封住整个木板。抗菌样品数量与对照样品相同，每组待测样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
(4)样品前处理：试板涂刷后置于(23±2)℃、(50±5)％RH的洁净环境中，彼此间距至少20mm；避免日光直射，自然状态下调节7d，直至试板涂膜完全干燥。试验前将各组对照样品和抗菌样品置于超净工作台上，紫外灭菌消毒5min；然后将其待测表面向上放入无菌平皿内，备用；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，孢子总数检测范围101CFU/mL～105CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～30)℃±1℃、(20～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；分样比率≥1:15的旋转分样器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；96孔平底培养板；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；生化检测用药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；宽的漆刷或喷嘴内径的喷枪；适用的涂料取样器及存放容器；
(4)试剂：75％的乙醇溶液；5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化及其菌落总数平板计数用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(霉菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及孢子悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月；
(3)菌种活化：用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)孢子悬液制备：向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，将各试验菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，4d内使用；
所述的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定，按下述步骤进行：
(1)菌液OD值测定：采用血球计数板对混合孢子悬液的孢子总量进行初筛，用察氏培养液对浓度为6.0×108CFU/mL的混合孢子液进行1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正。然后，将100μL上述不同稀释度的孢子液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(28±1)℃、(95±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度孢子悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值。同时，参照国标GB 4789.15-2016规定的方法，对上述混合孢子悬液进行适当稀释后，在(28±1)℃培养3d，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB；
(2)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定：以不同稀释度孢子悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2。当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的孢子悬液活菌含量CB有效。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的霉菌混合孢子液进行稀释，得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液；
所述的活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立，按下述步骤进行：
用察氏培养液对已知活菌含量CB的混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL并混匀。根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高顺序，测定并记录上述标准溶液及0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值(将后者记为IB0)。然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式Y＝aBX+bB及线性相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效；
所述的样品接种、培养及洗脱回收，按下述步骤进行：
(1)接种培养：用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用孢子液取自同一支混合孢子液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面。盖上皿盖，用医用胶带将装有6组48h接触样品的平皿密封；(28±2)℃、(95±2)％RH培养48h±2h；
(2)洗脱回收：6组0h接触样品接种霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将洗液移入无菌试管中；3000r/min振摇试管2min，混匀后将其作为待测样品的回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)。各组经48h培养后的样品采用与0h接触样品相同的洗脱方式回收霉菌；
所述的回收液相对荧光强度值IB测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL察氏培养液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(2)回收液相对荧光强度值IB测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0mL的ATP提取试剂并再次混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值；
所述的回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌含量CB及TB推算
根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算各组样品经0h接触及48h培养后回收液的活菌含量CB和TB。相关计算见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij。则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效。
(3)霉菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经48h培养后，霉菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌涂料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后，回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌涂料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌涂料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌涂料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(6)数据修约要求：采用血球计数板和酶标仪标定霉菌孢子液活菌含量CB时，参考GB 4789.2—2016中相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；霉菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于涂料防霉性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
所述的抗菌涂料样品防霉性能的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无防霉作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有防霉作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品防霉作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品防霉作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品防霉作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无防霉作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有防霉作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品防霉作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品防霉作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品防霉作用极强；
(2)当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果；
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以经添加纳米银系抗菌剂加工而成的环氧-丙烯酸抗菌乳胶涂料样品(底材为铝板)的防霉性能检测为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品提取、制备及前处理
1.1涂料样品提取：本专利方法所涉涂料样品为建筑和木器用抗菌涂料，包括液态或加热时可液化但不发生化学变化以及粉状、粒状、膏状的色漆和清漆物料；取样地点涵盖罐、柱状桶、贮槽、集装箱、槽车/槽船以及鼓状桶、袋、大包、贮仓、贮仓车或传送带等场所。取样由具备相关经验人员参照GB/T 3186-2006《色漆、清漆和色漆与清漆用原材料取样》中有关规定，根据待测涂料类别、聚集状态及容器大小，选择适用类型和规格的清洁器具提取至少2kg或抗菌试验所需量3～4倍的样品。当涂料存放于鼓状桶、柱状桶、袋等小容器时，如果交付批存在若干个容器，取样数量遵循GB/T 3186-2006中表1的规定，否则从每个容器中各提取一件样品；若交付批由不同生产批容器组成，则从每个生产批容器中分别提取。当涂料存放于贮槽、公路槽车、贮仓、贮仓车、铁路槽车、槽船或平均高度至少1m的反应器等大容器时，对于均匀物料及搅拌或加热后可成为均匀物料的暂时性不均匀物料，上部样品可用取样勺或取样管提取，中部样品用浸人式罐提取，距液面十分之九深度处的底部样品用浸人式罐或区域取样器提取；如果大容器由几个隔段组成，从每个隔段中至少提取一件样品，并将所取单一样品混合成一件平均样品。对于永久性不均匀物料，至少提取2件样品，其中上层样品可用取样勺、下层样品用区域取样器、浸人式瓶(罐)或在容器底阀处取样；制备样品时将所取两层样品按照产品标准规定的配比称量混合成1件平均样品。
取样结束后，使用旋转分样器将所提取的全部固、液体涂料样品充分混匀并分成15等分；其中固体样品每份500g，液体样品每份400mL。然后，将每份涂料样品分别放入带螺旋盖的罐、瓶、桶或塑料袋等容器中存放，其中金属容器配有密封金属盖，无焊料且内部不涂色漆和清漆(不用镀锌和铝质容器)；玻璃容器配有密封盖。
1.2对照样品：除未添加任何抗菌防腐防霉成分外，对照样品的涂料类别、底板材质及制备方法、规格尺寸、试板厚度等均与抗菌样品完全相同。每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和48h培养试验各用3组，每组5件样品。
1.3抗菌样品：添加抗菌成分的涂料试板，根据待测涂料样品的实际应用情况，可选择石棉水泥板、木质板、金属板、塑料板、玻璃板、贴膜纸板等底材；试板尺寸为(50±1)mm×(50±1)mm；其中钢板、铝板、马口铁板等金属试板厚度为1mm，木质试板厚度不大于10mm，矿石建筑板、石棉水泥板、复合木板、玻璃等材质试板厚度为1mm～10mm。所用试板表面平整、无锈、无油污，金属试板表面经磨砂纸打磨粗糙后，用75％的乙醇溶液擦拭2min；木质面板不取木心材且无树节，烘干后使用。
按照GB/T 1727-1992《漆膜一般制备法》要求制作漆膜，涂料施涂包括两次涂刷过程，第一次表干后再涂刷第二次，漆膜总厚度(湿膜)小于100μm；若以木板或纸板为底材，应确保漆膜封住整个木板。抗菌样品数量与对照样品相同，每组待测样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
1.4样品前处理：试板涂刷后置于(23±2)℃、(50±5)％RH的洁净环境中，彼此间距至少20mm；避免日光直射，自然状态下调节7d，直至试板涂膜完全干燥。试验前将各组对照样品和抗菌样品置于超净工作台上，紫外灭菌消毒5min；然后将其待测表面向上放入无菌平皿内，备用。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，孢子总数检测范围101CFU/mL～105CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～30)℃±1℃、(20～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；分样比率≥1:15的旋转分样器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉。
2.3材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；96孔平底培养板；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；生化检测用药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；宽的漆刷或喷嘴内径的喷枪；适用的涂料取样器及存放容器。
2.4试剂：75％的乙醇溶液；5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化及其菌落总数平板计数用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL。
2.6ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(霉菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备
3.1试验菌种：黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月。
3.3菌种活化：用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液。
3.4孢子悬液制备：向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，将各试验菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，4d内使用。
(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定
4.1菌液OD值测定：采用血球计数板对混合孢子悬液的孢子总量进行初筛，用察氏培养液对浓度为6.0×108CFU/mL的混合孢子液进行1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正。然后，将100μL上述不同稀释度的孢子液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(28±1)℃、(95±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度孢子悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值。同时，参照国标GB 4789.15-2016规定的方法，对上述混合孢子悬液进行适当稀释后，在(28±1)℃培养3d，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB。
4.2OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定：以不同稀释度孢子悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2。当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的孢子悬液活菌含量CB有效。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的霉菌混合孢子液进行稀释，得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液。
(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立
用察氏培养液对已知活菌含量CB的混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL并混匀。根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高顺序，测定并记录上述标准溶液及0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值(将后者记为IB0)。然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式Y＝aBX+bB及线性相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。
(6)样品接种、培养及洗脱回收
6.1接种培养：用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用孢子液取自同一支混合孢子液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面。盖上皿盖，用医用胶带将装有6组48h接触样品的平皿密封；(28±2)℃、(95±2)％RH培养48h±2h。
6.2洗脱回收：6组0h接触样品接种霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将洗液移入无菌试管中；3000r/min振摇试管2min，混匀后将其作为待测样品的回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)。各组经48h培养后的样品采用与0h接触样品相同的洗脱方式回收霉菌。
(7)回收液相对荧光强度值IB测定
7.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL察氏培养液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)。
7.2回收液相对荧光强度值IB测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0mL的ATP提取试剂并再次混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值。
(8)回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算
8.1回收液活菌含量CB及TB推算
根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算各组样品经0h接触及48h培养后回收液的活菌含量CB和TB。相关计算见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5。
8.2试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij。则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效。
8.3霉菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经48h培养后，霉菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.4抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌涂料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后，回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.5抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌涂料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌涂料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌涂料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率。
8.6数据修约要求：采用血球计数板和酶标仪标定霉菌孢子悬液活菌含量CB时，参考GB 4789.2—2016中相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；霉菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字。
8.7测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于涂料防霉性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
(9)结果评价
9.1参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无防霉作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有防霉作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品防霉作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品防霉作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品防霉作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无防霉作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有防霉作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品防霉作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品防霉作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品防霉作用极强。
9.2当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。
本实施例所用检测资质、仪器设备和试验器材、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)生物安全资质
在机构注册号为CNAS BL0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备和试验器材
2.1二级生物安全柜：Thermo Scientific 1300系列二级B2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)。
2.2超净工作台：美国品牌Thermo ScientificTM HeraguardTM、型号ECO的超净工作台，内部宽×深×高＝920mm×585mm×645mm；空气流速为0.15m/s～0.25m/s和0.36m/s～0.45m/s。
2.3ATP生物荧光快速检测系统：美国Hygiena公司的便携式system SURE ATP荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；ATP含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0CFU/ml，RLU读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％。
2.4酶标仪：美国品牌Thermo Scientific、型号Multiskan FC的全自动酶标仪，波长范围(340～850)nm±1nm，读数范围(0.0～6.0)Abs±0.001Abs；405nm对应的测量精度为±1％(0.0Abs～3.0Abs)或±2％(3.0Abs～4.0Abs)。
2.5生物光学显微镜：具备10倍宽视场可调目镜以及4倍、10倍、20倍、40倍和100倍平场消色差物镜的奥林巴斯BX43三目研究级生物显微镜。
2.6恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号WS-380H、容积380L、控温范围(0～50)℃±0.8℃、控湿范围(30～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱。
2.7恒温水浴箱：上海基玮试验仪器设备有限公司型号DK-S420的电热恒温水槽，容积15L，控温范围(5～99.9)℃±0.5℃，定时范围1min～999min。
2.8恒温振荡器：上海一恒型号WS-380H、控温范围(4～65)℃±0.1℃、振荡频率(40～300)r/min、定时范围(1～99)h。
2.9冷冻离心机：北京新诺立华仪器有限公司型号DL7M-12L的立式冷冻离心机，转速8000r/min±20r/min，相对离心力12300×g；容量14400ml，定时范围1s～99h59min99s，控温范围(-20～40)℃±1℃，离心管规格Ф74mm×168mm。
2.10压力蒸汽灭菌器：日本Sanyo公司型号MLS-3780高压灭菌器，容积75L，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235MPa，定时器(1～250)min。
2.11低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号DW-HL398的超低温冷冻储存箱，有效容积398L，存储温度-10℃～-86℃。
2.12冰箱：东莞市昊欣仪器设备有限公司型号HXL-25-250AD的低温箱超低温冰箱，其冷藏箱(2～10)℃±0.1℃，冷冻箱(-30～20)℃±0.1℃。
2.13电子天平：日本岛津型号AUX220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.14超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号YQ-120C的超声波清洗机，容量3.2L，超声频率40KHz/28KHz/25KHz，定时范围1min～30min/99min。
2.15旋涡振荡器：美国品牌Coleparmer Votex-Genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.16旋转分样器：德国Fritsch公司型号L27的旋转分样器，其转速100r/min,进料漏斗长度215mm，分样比率1:8、1:10、1:30，进样尺寸≤10mm，进样量≤4000ml，分装容器容量15ml、20ml、30ml、250ml、500ml。
2.17pH计：上海精密仪器仪表有限公司型号MP512-03的精密pH计，量程范围(-2.000～19.999)pH±0.002pH，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.18电炉：常州德科仪器有限公司型号DLD-1KW的1KW封闭式调温电炉。
2.19血球计数板：上海求精规格为25×16的血球计数板。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
四甲基偶氮唑盐、三磷酸腺苷二钠标准品及配制ATP荧光试剂缓冲溶液、ATP裂解液、ATP提取液和ATP荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国Amresco品牌。
(5)标准菌株
黑曲霉ATCC 16404、球毛壳霉ATCC 6205、产黄青霉ATCC 9179购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用ATP荧光光度计经lgCB-lgIB标准曲线法对抗菌涂料样品的防霉性能进行检测，相关检测数据及测量不确定度计算结果分别见表1～表2。
表1相对荧光强度测定值及抗菌率R、抗菌活性值A计算结果
表1相对荧光强度测量不确定度计算结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗菌涂料防霉性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IB测定中：
明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将霉菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜霉菌孢子培养物制备孢子悬液；应用MTT比色分析法建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2，对不同稀释度的孢子悬液进行活菌含量CB标定后，选择CB为2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL的孢子液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标曲，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB 2，然后，选取活菌含量CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的混合孢子液作为接种菌液；向各组样品待测表面分别滴加0.3mL菌液，立即用4.6洗脱液对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij，根据lgCB-lgIB曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij，同时，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(28±2)℃、(95±2)％RH的条件下培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及经48h培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其霉菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌涂料样品抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定防霉性能分级判定标准；当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的样品提取、制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)涂料样品提取：本专利方法所涉涂料样品为建筑和木器用抗菌涂料，包括液态或加热时可液化但不发生化学变化以及粉状、粒状、膏状的色漆和清漆物料；取样地点涵盖罐、柱状桶、贮槽、集装箱、槽车/槽船以及鼓状桶、袋、大包、贮仓、贮仓车或传送带等场所，取样由具备相关经验人员参照GB/T3186-2006《色漆、清漆和色漆与清漆用原材料取样》中有关规定，根据待测涂料类别、聚集状态及容器大小，选择适用类型和规格的清洁器具提取至少2kg或抗菌试验所需量3～4倍的样品，当涂料存放于鼓状桶、柱状桶、袋等小容器时，如果交付批存在若干个容器，取样数量遵循GB/T 3186-2006中表1的规定，否则从每个容器中各提取一件样品；若交付批由不同生产批容器组成，则从每个生产批容器中分别提取，当涂料存放于贮槽、公路槽车、贮仓、贮仓车、铁路槽车、槽船或平均高度至少1m的反应器等大容器时，对于均匀物料及搅拌或加热后可成为均匀物料的暂时性不均匀物料，上部样品可用取样勺或取样管提取，中部样品用浸人式罐提取，距液面十分之九深度处的底部样品用浸人式罐或区域取样器提取；如果大容器由几个隔段组成，从每个隔段中至少提取一件样品，并将所取单一样品混合成一件平均样品，对于永久性不均匀物料，至少提取2件样品，其中上层样品可用取样勺、下层样品用区域取样器、浸人式瓶(罐)或在容器底阀处取样；制备样品时将所取两层样品按照产品标准规定的配比称量混合成1件平均样品；
取样结束后，使用旋转分样器将所提取的全部固、液体涂料样品充分混匀并分成15等分；其中固体样品每份500g，液体样品每份400mL，然后，将每份涂料样品分别放入带螺旋盖的罐、瓶、桶或塑料袋等容器中存放，其中金属容器配有密封金属盖，无焊料且内部不涂色漆和清漆(不用镀锌和铝质容器)；玻璃容器配有密封盖；
(2)对照样品：除未添加任何抗菌防腐防霉成分外，对照样品的涂料类别、底板材质及制备方法、规格尺寸、试板厚度等均与抗菌样品完全相同，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和48h培养试验各用3组，每组5件样品；
(3)抗菌样品：添加抗菌成分的涂料试板，根据待测涂料样品的实际应用情况，可选择石棉水泥板、木质板、金属板、塑料板、玻璃板、贴膜纸板等底材；试板尺寸为(50±1)mm×(50±1)mm；其中钢板、铝板、马口铁板等金属试板厚度为1mm，木质试板厚度不大于10mm，矿石建筑板、石棉水泥板、复合木板、玻璃等材质试板厚度为1mm～10mm，所用试板表面平整、无锈、无油污，金属试板表面经磨砂纸打磨粗糙后，用75％的乙醇溶液擦拭2min；木质面板不取木心材且无树节，烘干后使用；
按照GB/T 1727-1992《漆膜一般制备法》要求制作漆膜，涂料施涂包括两次涂刷过程，第一次表干后再涂刷第二次，漆膜总厚度(湿膜)小于100μm；若以木板或纸板为底材，应确保漆膜封住整个木板，抗菌样品数量与对照样品相同，每组待测样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
(4)样品前处理：试板涂刷后置于(23±2)℃、(50±5)％RH的洁净环境中，彼此间距至少20mm；避免日光直射，自然状态下调节7d，直至试板涂膜完全干燥，试验前将各组对照样品和抗菌样品置于超净工作台上，紫外灭菌消毒5min；然后将其待测表面向上放入无菌平皿内，备用。
3.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，孢子总数检测范围101CFU/mL～105CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～30)℃±1℃、(20～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；分样比率≥1:15的旋转分样器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；96孔平底培养板；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；生化检测用药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；宽的漆刷或喷嘴内径的喷枪；适用的涂料取样器及存放容器；
(4)试剂：75％的乙醇溶液；5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化及其菌落总数平板计数用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(霉菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
4.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及孢子悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月；
(3)菌种活化：用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)孢子悬液制备：向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，将各试验菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，4d内使用。
5.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定，按下述步骤进行：
(1)菌液OD值测定：采用血球计数板对混合孢子悬液的孢子总量进行初筛，用察氏培养液对浓度为6.0×108CFU/mL的混合孢子液进行1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正，然后，将100μL上述不同稀释度的孢子液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(28±1)℃、(95±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度孢子悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值，同时，参照国标GB 4789.15-2016规定的方法，对上述混合孢子悬液进行适当稀释后，在(28±1)℃培养3d，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB；
(2)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定：以不同稀释度孢子悬液的活菌OD值作为纵坐标，以其活菌含量对数值lgCB为横坐标，绘制OD值-lgCB标准曲线；应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0 2，当R0 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法测得的孢子悬液活菌含量CB有效，然后，用察氏培养液对已知活菌含量CB的霉菌混合孢子液进行稀释，得到CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的接种菌液。
6.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立，按下述步骤进行：
用察氏培养液对已知活菌含量CB的混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL并混匀，根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高顺序，测定并记录上述标准溶液及0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值(将后者记为IB0)，然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式Y＝aBX+bB及线性相关系数RB 2；当RB 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。
7.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的样品接种、培养及洗脱回收，按下述步骤进行：
(1)接种培养：用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用孢子液取自同一支混合孢子液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面，盖上皿盖，用医用胶带将装有6组48h接触样品的平皿密封；(28±2)℃、(95±2)％RH培养48h±2h；
(2)洗脱回收：6组0h接触样品接种霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将洗液移入无菌试管中；3000r/min振摇试管2min，混匀后将其作为待测样品的回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)，各组经48h培养后的样品采用与0h接触样品相同的洗脱方式回收霉菌。
8.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IB测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL察氏培养液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样，然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(2)回收液相对荧光强度值IB测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0mL的ATP提取试剂并再次混匀；室温静置10min，用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样，向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值。
9.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液活菌含量CB和TB推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌含量CB及TB推算
根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，推算各组样品经0h接触及48h培养后回收液的活菌含量CB和TB，相关计算见公式(1)～(12)：
式中：
CB0和CBt—3组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
CB0i和CBti—每组0h接触和经48h培养后对照样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距；
TB0和TBt—3组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；
TB0i和TBti—每组0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触对照样品的回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CBtij≥0.1×CB0ij，则当3组0h接触对照样品回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效；
(3)霉菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经48h培养后，霉菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CB0ij和CBtij—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TB0ij和TBtij—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌涂料样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌涂料样品的抗菌率，％；
TBtij和CBtij—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经48h培养后，回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌涂料样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌涂料样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌涂料样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌涂料样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经48h培养后的霉菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后对照样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经48h培养后抗菌样品回收液相对荧光强度的测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；
(6)数据修约要求：采用血球计数板和酶标仪标定霉菌孢子液活菌含量CB时，参考GB4789.2—2016中相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；霉菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于涂料防霉性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％；
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及 分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及 分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的标准偏差及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
10.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无防霉作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有防霉作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品防霉作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品防霉作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品防霉作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无防霉作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有防霉作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品防霉作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品防霉作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品防霉作用极强；
(2)当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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