CN110272954A - ATP生物荧光lgCA-lgIA标曲法评价液体消毒剂真菌杀灭效果的方法 - Google Patents

ATP生物荧光lgCA-lgIA标曲法评价液体消毒剂真菌杀灭效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种液体消毒剂真菌杀灭效果评价方法，检测步骤包括：样品提取及消毒剂最低有效浓度确定；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液活菌CA标定；中和剂鉴定及定量悬液试验；回收液IA测定及CA和TA推算；杀灭率R及灭菌指数A计算；结果判定；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量评价。本发明规定测定作用不同时间后试验样液和对照样液的IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果判定依据。本发明研发的液体消毒剂真菌杀灭效果评价的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，可完善相关评价方法体系。

Description

ATP生物荧光lgCA-lgIA标曲法评价液体消毒剂真菌杀灭效果 的方法
技术领域
本发明涉及液体消毒剂的真菌杀灭效果效果评价方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以杀灭率R或灭菌指数A表征的液体消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，属于消毒剂灭菌效果评价技术领域。
背景技术
伴随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，为切断传染病传播途径，过氧化物类、醛类、酚类、季铵盐类等液体消毒剂在医疗、食品、教育、餐饮、居家等领域应用日趋广泛，且对其细菌、真菌及其孢子等病原微生物的杀灭作用和广谱要求日益严苛；产业相关工艺创新和产品研发压力不断攀升，质检技术与测试效率被提上日程。
目前，国内外抗菌消毒效果评价技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗真菌效果测试方法原理多基于对白色念珠菌进行分离培养的平板计数法，鲜有涉及霉菌者；其中适用于白色念珠菌测试的一是日本工业标准提出的浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法。虽然我国已颁布实施GB 15981-1995《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》、GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》和QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》等相关标准，但其规定的测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。另外，多年来国际防霉效果评价技术体系基本源自美标、日标和欧标，所涉标准主要包括土埋培养法、琼脂平板法、湿室培养法等；由于霉菌孢子生长过程中形成的菌丝体无法准确计数，只能进行定性判定，无法定量测试；且因霉菌生长周期较长，培养时间至少2周～4周，导致测试周期较长，时间及经济成本高。无论针对白色念珠菌还是霉菌，现有标准方法的实验过程繁琐，技术难度较高；相关操作受人为因素影响大，使得测试误差大，缺乏可比性。近年来，在国际细菌检测技术领域ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比检测结果相关性为98％，准确度高且可实现快速检测。受需求牵引，国外抗菌材料性能检测技术研究领域针对当前定量化、快速化和简易化发展趋势，已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO 20743:2007-2013《Textiles-Determination of antibacterial activity of textile products(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO 13629-1:2012《Textiles-Determination of antifungalactivity of textile products.Part1 Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其提供的吸收法、转移法和转印法仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料；液体消毒剂真菌杀灭效果评估须针对中和效果评价、结果计算公式等关键技术方面形成一整套明确而具体的方法，且需提供相关测量不确定度评估。另外，该标准方法抗菌性能表征参数较为单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用杀灭率R。
因此，为提高疾病防控效果，规范国内市场秩序，推动产业转型升级，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的液体消毒剂真菌杀灭效果测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可填补国内外相关技术领域空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的液体消毒剂真菌杀灭效果进行检测的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，能够解决液体消毒剂乃至其他医疗卫生领域灭菌效果精准定量评价问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及消毒剂最低有效浓度确定；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)中和剂鉴定及定量悬液试验；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算及杀灭率R和灭菌指数A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀灭率R或灭菌指数A表征的液体消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确样品提取要求，确定消毒剂10min内抑杀指示菌的最低有效浓度，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定。然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液梯度稀释为高、低浓度标准系列溶液：3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L、3.0×10-5mol/L(如果仪器检测上限无法达到10- 5mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为3.0×10-8mol/L、3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L)和1.5×10-9mol/L、1.5×10-8mol/L、1.5×10-7mol/L，测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算其活菌ATP浓度CA；经调整得到CA为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L的接种菌液。然后，以待测消毒剂的最低有效浓度进行中和剂鉴定试验，确定中和剂种类及浓度；同时将4.41mL各浓度试验样液和对照样液置于(20±2)℃水浴中并使其与0.49mL接种菌液混合；待灭菌作用持续t1、t2、t3、t4四段不同时间后，将0.49mL染菌样液分别与4.41mL中和剂溶液混合，中和作用进行10min后将其混匀液作为回收液；应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值和并根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算相应的活菌ATP浓度和
在杀灭率R或灭菌指数A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，针对t1、t2、t3、t4四段不同的灭菌时间，以每次定量悬液试验中各浓度试验样液及对照样液回收活菌的相对荧光强度测定值作为基础数据；计算其对真菌的杀灭率 或灭菌指数并取其五次试验的算术平均值作为相应浓度待测液体消毒剂样品在相同灭菌时间内对真菌的杀灭率 或灭菌指数同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果判定中：
参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的在特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格。当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计作为测试设备，能够精准快速测定消毒剂样品灭菌特定时间后回收的活菌量，达到了真菌杀灭效果评价的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，突破了传统平皿培养法操作繁、周期长的局限；实现了评价过程的精简化和评价数据的精准化；评价技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据ATP荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌ATP浓度对数值lgCA─相对荧光强度对数值lgIA标准曲线；构建了液体消毒剂真菌杀灭效果ATP生物荧光实时定量分析方法的数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取杀灭率R及灭菌指数A为相关效果评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行通用的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的ATP荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了消毒剂真菌杀灭效果评价的精准化和定量化并具备良好的重现性和可比性；同时大幅度缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgCA、lgIA线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了白色念珠菌和霉菌孢子悬液活菌含量测定方法和消毒剂样品稀释方式，明确对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收活菌相对荧光强度值IA作为结果评价形式来计算并判定杀灭率R及灭菌指数A，并通过组内及组间变异系数C·V考察测量不确定度，技术上具有一定前瞻性。
(5)可操作性：ATP荧光光度计价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的美蓝染色后血球板活菌孢子计数法和消毒剂真菌杀灭效果评价的ATP荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平微生物实验人员，有利于促进成果转移转化和推广应用。
(6)普适性：因ATP普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑消毒剂真菌杀灭效果评价技术实现普适化，同时可对日化品、卫生用品等领域抗菌效果评价技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的样品提取及最低有效浓度确定，按下述步骤进行：
(1)对照样品：以察氏培养液作为对照样品；
(2)试验样品：从某生产批号1个完整运输包装中随机抽取1件最小销售包装的液体消毒剂样品，用于中和剂鉴定和定量悬液试验；每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
(3)消毒剂样品最低有效浓度的确定：按照待测消毒剂样品使用说明书标注的有效浓度范围，将其用无菌水稀释为高、中、低三个适宜浓度；用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的稀释液分装三支无菌试管，并向各试管中分别滴加0.49mL接种菌液；3000r/min振摇试管30s后，将其置于(20±2)℃水浴中。待试管内溶液温度与水浴温度平衡后开始计时，使消毒剂对真菌的杀灭作用持续10min；然后，以其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录回收液的相对荧光强度值。同时，以4.41mL察氏培养液作为对照样品重复上述杀菌试验及回收液IA测定过程；并依据本专利中杀灭率R计算公式，对不同浓度稀释液的杀灭率进行计算；若某浓度杀灭率R为99.9％，则将此浓度设定为待测消毒剂样品的最低有效浓度；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-5mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；
(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；小牛血清；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于氯型消毒剂)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于非氧化型消毒剂)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于氧型消毒剂)等(或针对待测消毒剂样品类型，选择其它相适用的中和剂)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)指示菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；
(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用；
所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数，按下述步骤进行：
(1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；
(2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；
(3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL；
所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液梯度稀释为高、低浓度标准系列溶液：3.0×10-7mol/L、3.0×10- 6mol/L、3.0×10-5mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-5mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为3.0×10-8mol/L、3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L)和1.5×10-9mol/L、1.5×10-8mol/L、1.5×10-7mol/L并充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样；
(2)空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂。3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(3)ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(5)接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定其相对荧光强度值IA；然后，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA。经察氏培养液调整，得到CA范围为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L的接种菌液；
所述的中和剂鉴定及定量悬液试验，按下述步骤进行：
(1)中和剂鉴定试验：选取作用10min抑杀指示菌99.9％的消毒剂最低有效浓度作为中和剂鉴定试验的样液浓度，并将1mL试验样液与9mL中和剂溶液混合；作用10min形成中和产物后，进行试验分组如下：将0.49mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支指示菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)分装五支含4.41mL试验样液(1#、2#)、4.41mL中和产物溶液(3#)、4.41mL察氏培养液(4#)、4.41mL中和剂溶液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使其溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.49mL各组混匀液分装五支含4.41mL察氏培养液(1#、3#、4#、5#)、4.41mL中和剂溶液(2#)的无菌试管中，同时将另外一支无菌试管中的4.9mL察氏培养液作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后，将其混匀液作为试验样液的回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述6组回收液相对荧光强度值。
(2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明所选中和剂种类可用于待测液体消毒剂样品真菌杀灭效果试验，并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度后重复上述中和剂鉴定试验，确定消毒剂试验浓度对应的中和剂浓度。
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
(3)定量悬液试验：按照待测消毒剂使用说明中标注的有效浓度和作用时间范围，用无菌水将其稀释为高、中、低三个适宜浓度：C1、C2、C3(C1为产品说明中规定的最低使用浓度)，其中C2＝2C1、C3＝2C2；同时选取四段不同的灭菌时间t1、t2、t3、t4(t2为产品说明中规定的最短作用时间)，其中t1＝0.5t2、t3＝1.5t2、t4＝2t2。然后，用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的试验样液分装三支无菌试管中；并置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后，分别滴加0.49mL接种菌液。3000r/min振摇试管30s后开始记时，当灭菌作用持续至设定的t1、t2、t3、t4四段不同时间后，用灭菌移液枪将0.49mL不同浓度的混匀液分装三支含4.41mL中和剂溶液的无菌试管中，3000r/min振摇试管30s并开始记时，待中和作用持续10min后，将其混匀液作为各浓度试验样液的回收液。然后，用察氏培养液替代试验样液重复上述试验；
试验重复5次。
然后，将小牛血清加入菌悬液中，使其最终血清含量为10％并确保接种菌液CB为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L，重复上述定量悬液试验5次；确定待测液体消毒剂样品在有机物存在的条件下，对真菌具备消毒效果的有效浓度和时间；
所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值；
所述的回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀灭率R和灭菌指数A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌ATP浓度CA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算每次不同浓度的试验样液及对照样液经t1～t4四段灭/染菌时间后，回收液的活菌ATP浓度CA和TA。相关计算见公式(2)～(9)：
式中：
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
(2)杀灭率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的杀灭率分别按照公式(10)～(17)计算：
式中：
—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(3)灭菌指数A的计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的灭菌指数分别按照公式(18)～(25)计算：
式中：
—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；其中样品组别i＝1,2,3,4,5；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度、接种菌液和回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。试验样液及对照样液经四段灭/染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，对真菌的杀菌率计算结果取三位有效数字，灭菌指数计算结果取两位有效数字；
(5)测量不确定度：本专利方法通过计算5次定量悬液试验中不同浓度的试验样液和对照样液经四段不同的灭/染菌时间后，其回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)；判断将ATP生物荧光分析法应用于液体消毒剂真菌杀灭效果测试的重现性，规定变异系数C·V≤10％。相相关计算见公式(26)～(33)：
式中：
—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3；
所述的液体消毒剂样品真菌杀灭效果的结果评价，按下述步骤进行：
参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的在特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格。当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)；
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以浓度为120g/L的13α-(N,N-二甲基氨基)乙氨基苦参碱消毒液样品对真菌的杀灭效果检测为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品提取及最低有效浓度确定
1.1对照样品：以察氏培养液作为对照样品。
1.2试验样品：从某生产批号1个完整运输包装中随机抽取1件最小销售包装的液体消毒剂样品，用于中和剂鉴定和定量悬液试验；每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
1.3消毒剂样品最低有效浓度的确定：按照待测消毒剂样品使用说明书标注的有效浓度范围，将其用无菌水稀释为高、中、低三个适宜浓度；用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的稀释液分装三支无菌试管，并向各试管中分别滴加0.49mL接种菌液；3000r/min振摇试管30s后，将其置于(20±2)℃水浴中。待试管内溶液温度与水浴温度平衡后开始计时，使消毒剂对真菌的杀灭作用持续10min；然后，以其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录回收液的相对荧光强度值。同时，以4.41mL察氏培养液作为对照样品重复上述杀菌试验及回收液IA测定过程；并依据本专利中杀灭率R计算公式，对不同浓度稀释液的杀灭率进行计算；若某浓度杀灭率R为99.9％，则将此浓度设定为待测消毒剂样品的最低有效浓度。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-5mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉。
2.3材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表。
2.4试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；小牛血清；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于氯型消毒剂)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于非氧化型消毒剂)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于氧型消毒剂)等(或针对待测消毒剂样品类型，选择其它相适用的中和剂)。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL。
2.6ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备
3.1指示菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌。
3.3菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液。
3.4菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。
(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数
4.1美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀。
4.2血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子。
4.3活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL。
(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定
5.1ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液梯度稀释为高、低浓度标准系列溶液：3.0×10-7mol/L、3.0×10- 6mol/L、3.0×10-5mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-5mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为3.0×10-8mol/L、3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L)和1.5×10-9mol/L、1.5×10-8mol/L、1.5×10-7mol/L并充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样。
5.2空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂。3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)。
5.3ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值。
5.4ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效。
5.5接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定其相对荧光强度值IA；然后，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA。经察氏培养液调整，得到CA范围为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L的接种菌液。
(6)中和剂鉴定及定量悬液试验
6.1中和剂鉴定试验：选取作用10min抑杀指示菌99.9％的消毒剂最低有效浓度作为中和剂鉴定试验的样液浓度，并将1mL试验样液与9mL中和剂溶液混合；作用10min形成中和产物后，进行试验分组如下：将0.49mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支指示菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)分装五支含4.41mL试验样液(1#、2#)、4.41mL中和产物溶液(3#)、4.41mL察氏培养液(4#)、4.41mL中和剂溶液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使其溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.49mL各组混匀液分装五支含4.41mL察氏培养液(1#、3#、4#、5#)、4.41mL中和剂溶液(2#)的无菌试管中，同时将另外一支无菌试管中的4.9mL察氏培养液作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后，将其混匀液作为试验样液的回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述6组回收液相对荧光强度值。
6.2中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明所选中和剂种类可用于待测液体消毒剂样品真菌杀灭效果试验，并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度后重复上述中和剂鉴定试验，确定消毒剂试验浓度对应的中和剂浓度。
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距。
6.3定量悬液试验：按照待测消毒剂使用说明中标注的有效浓度和作用时间范围，用无菌水将其稀释为高、中、低三个适宜浓度：C1、C2、C3(C1为产品说明中规定的最低使用浓度)，其中C2＝2C1、C3＝2C2；同时选取四段不同的灭菌时间t1、t2、t3、t4(t2为产品说明中规定的最短作用时间)，其中t1＝0.5t2、t3＝1.5t2、t4＝2t2。然后，用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的试验样液分装三支无菌试管中；并置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后，分别滴加0.49mL接种菌液。3000r/min振摇试管30s后开始记时，当灭菌作用持续至设定的t1、t2、t3、t4四段不同时间后，用灭菌移液枪将0.49mL不同浓度的混匀液分装三支含4.41mL中和剂溶液的无菌试管中，3000r/min振摇试管30s并开始记时，待中和作用持续10min后，将其混匀液作为各浓度试验样液的回收液。然后，用察氏培养液替代试验样液重复上述试验。
试验重复5次。
然后，将小牛血清加入菌悬液中，使其最终血清含量为10％并确保接种菌液CB为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L，重复上述定量悬液试验5次；确定待测液体消毒剂样品在有机物存在的条件下，对真菌具备消毒效果的有效浓度和时间。
(7)回收液相对荧光强度值IA测定
7.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值。
7.2回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值。
(8)回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀灭率R和灭菌指数A计算
8.1回收液的活菌ATP浓度CA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算每次不同浓度的试验样液及对照样液经t1～t4四段灭/染菌时间后，回收液的活菌ATP浓度CA和TA。相关计算见公式(2)～(9)：
式中：
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3。
8.2杀灭率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的杀灭率分别按照公式(10)～(17)计算：
式中：
—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
8.3灭菌指数A的计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的灭菌指数分别按照公式(18)～(25)计算：
式中：
—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；其中样品组别i＝1,2,3,4,5；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
8.4数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度、接种菌液和回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。试验样液及对照样液经四段灭/染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，对真菌的杀菌率计算结果取三位有效数字，灭菌指数计算结果取两位有效数字。
8.5测量不确定度：本专利方法通过计算5次定量悬液试验中不同浓度的试验样液和对照样液经四段不同的灭/染菌时间后，其回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)；判断将ATP生物荧光分析法应用于液体消毒剂真菌杀灭效果测试的重现性，规定变异系数C·V≤10％。相相关计算见公式(26)～(33)：
式中：
—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
(9)结果评价
参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的在特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格。当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。
本实施例所用实验室生物安全资质、仪器设备、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)实验室生物安全资质
在机构注册号为CNAS BL0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备和试验器材
2.1二级生物安全柜：Thermo Scientific 1300系列二级B2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)。
2.2ATP生物荧光快速检测系统：美国Hygiena公司的便携式system SURE ATP荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；ATP含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0CFU/ml，RLU读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％。
2.3生物光学显微镜：具备10倍宽视场可调目镜以及4倍、10倍、20倍、40倍和100倍平场消色差物镜的奥林巴斯BX43三目研究级生物显微镜。
2.4恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号WS-380H、容积380L、控温范围(0～50)℃±0.8℃、控湿范围(30～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱。
2.5恒温水浴箱：上海基玮试验仪器设备有限公司型号DK-S420的电热恒温水槽，容积15L，控温范围(5～99.9)℃±0.5℃，定时范围1min～999min。
2.6恒温振荡器：上海一恒型号WS-380H、控温范围(4～65)℃±0.1℃、振荡频率(40～300)r/min、定时范围(1～99)h。
2.7冷冻离心机：北京新诺立华仪器有限公司型号DL7M-12L的立式冷冻离心机，转速8000r/min±20r/min，相对离心力12300×g；容量14400ml，定时范围1s～99h59min99s，控温范围(-20～40)℃±1℃，离心管规格Ф74mm×168mm。
2.8压力蒸汽灭菌器：日本Sanyo公司型号MLS-3780高压灭菌器，容积75L，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235MPa，定时器(1～250)min。
2.9低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号DW-HL398的超低温冷冻储存箱，有效容积398L，存储温度-10℃～-86℃。
2.10冰箱：东莞市昊欣仪器设备有限公司型号HXL-25-250AD的低温箱超低温冰箱，其冷藏箱(2～10)℃±0.1℃，冷冻箱(-30～20)℃±0.1℃。
2.11电子天平：日本岛津型号AUX220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.12超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号YQ-120C的超声波清洗机，容量3.2L，超声频率40KHz/28KHz/25KHz，定时范围1min～30min/99min。
2.13旋涡振荡器：美国品牌Coleparmer Votex-Genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.14pH计：上海精密仪器仪表有限公司型号MP512-03的精密pH计，量程范围(-2.000～19.999)pH±0.002pH，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.15电炉：常州德科仪器有限公司型号DLD-1KW的1KW封闭式调温电炉。
2.16血球计数板：上海求精规格为25×16的血球计数板。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
4.1 0.1％的吕氏碱性美蓝染色液：购自上海心语生物科技有限公司。
4.2三磷酸腺苷二钠标准品及配制ATP荧光试剂缓冲溶液、ATP裂解液、ATP提取液和ATP荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国Amresco品牌。
(5)标准菌株
白色念珠菌ATCC 10231购自中国医学真菌保藏管理中心；黑曲霉ATCC 16404、球毛壳霉ATCC 6205、产黄青霉ATCC 9179购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用ATP荧光光度计经lgCA-lgIA标准曲线法对13α-(N,N-二甲基氨基)乙氨基苦参碱消毒液样品的真菌杀灭效果进行检测，其10min内对白色念珠菌和霉菌杀灭率达99.9％的最低有效浓度分别为113g/L和105g/L。选择含10g/L卵磷脂、35g/L甘氨酸、100g/L吐温(80)的TPS溶液作为中和剂，可有效中和待测消毒液样品对指示菌种的残留作用；相关中和剂鉴定、定量悬液试验数据和消毒效果评价、测量不确定度计算结果分别见表1～表3。
表1中和剂鉴定试验数据及组间误差率计算结果
表2定量悬液试验数据及杀灭率Rijt、灭菌指数Aijt计算结果
表3消毒效果评价及相对荧光强度值测量不确定度计算结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及消毒剂最低有效浓度确定；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)中和剂鉴定及定量悬液试验；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算及杀灭率R和灭菌指数A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀灭率R或灭菌指数A表征的液体消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确样品提取要求，确定消毒剂10min内抑杀指示菌的最低有效浓度，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定，然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液梯度稀释为高、低浓度标准系列溶液：3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L、3.0×10-5mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-5mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为3.0×10-8mol/L、3.0×10- 7mol/L、3.0×10-6mol/L)和1.5×10-9mol/L、1.5×10-8mol/L、1.5×10-7mol/L，测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算其活菌ATP浓度CA；经调整得到CA为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L的接种菌液，然后，以待测消毒剂的最低有效浓度进行中和剂鉴定试验，确定中和剂种类及浓度；同时将4.41mL各浓度试验样液和对照样液置于(20±2)℃水浴中并使其与0.49mL接种菌液混合；待灭菌作用持续t1、t2、t3、t4四段不同时间后，将0.49mL染菌样液分别与4.41mL中和剂溶液混合，中和作用进行10min后将其混匀液作为回收液；应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值IATij(t1)、IATij(t2)、IATij(t3)、IATij(t4)和IACij(t1)、IACij(t2)、IACij(t3)、IACij(t4)，并根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算相应的活菌ATP浓度TAij(t1)、TAij(t2)、TAij(t3)、TAij(t4)和CAij(t1)、CAij(t2)、CAij(t3)、CAij(t4)；
在杀灭率R或灭菌指数A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，针对t1、t2、t3、t4四段不同的灭菌时间，以每次定量悬液试验中各浓度试验样液及对照样液回收活菌的相对荧光强度测定值作为基础数据；计算其对真菌的杀灭率Rij(t1)、Rij(t2)、Rij(t3)、Rij(t4)或灭菌指数Aij(t1)、Aij(t2)、Aij(t3)、Aij(t4)，并取其五次试验的算术平均值作为相应浓度待测液体消毒剂样品在相同灭菌时间内对真菌的杀灭率Rj(t1)、Rj(t2)、Rj(t3)、Rj(t4)或灭菌指数Aj(t1)、Aj(t2)、Aj(t3)、Aj(t4)；同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果判定中：
参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的在特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格，当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。
2.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的样品提取及最低有效浓度确定，按下述步骤进行：
(1)对照样品：以察氏培养液作为对照样品；
(2)试验样品：从某生产批号1个完整运输包装中随机抽取1件最小销售包装的液体消毒剂样品，用于中和剂鉴定和定量悬液试验；每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
(3)消毒剂样品最低有效浓度的确定：按照待测消毒剂样品使用说明书标注的有效浓度范围，将其用无菌水稀释为高、中、低三个适宜浓度；用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的稀释液分装三支无菌试管，并向各试管中分别滴加0.49mL接种菌液；3000r/min振摇试管30s后，将其置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后开始计时，使消毒剂对真菌的杀灭作用持续10min；然后，以其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录回收液的相对荧光强度值，同时，以4.41mL察氏培养液作为对照样品重复上述杀菌试验及回收液IA测定过程；并依据本专利中杀灭率R计算公式，对不同浓度稀释液的杀灭率进行计算；若某浓度杀灭率R为99.9％，则将此浓度设定为待测消毒剂样品的最低有效浓度。
3.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-5mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；
(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；小牛血清；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于氯型消毒剂)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于非氧化型消毒剂)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于氧型消毒剂)等(或针对待测消毒剂样品类型，选择其它相适用的中和剂)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
4.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)指示菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h，霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；
(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用，霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用，霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。
5.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数，按下述步骤进行：
(1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；
(2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作，用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内，当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；
(3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子，若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液，对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值，当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数，然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10- 3mol/L的ATP标准原液梯度稀释为高、低浓度标准系列溶液：3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L、3.0×10-5mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-5mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为3.0×10-8mol/L、3.0×10-7mol/L、3.0×10-6mol/L)和1.5×10- 9mol/L、1.5×10-8mol/L、1.5×10-7mol/L并充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样；
(2)空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样，然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(3)ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(5)接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定其相对荧光强度值IA，然后，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA，经察氏培养液调整，得到CA范围为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L的接种菌液。
7.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的中和剂鉴定及定量悬液试验，按下述步骤进行：
(1)中和剂鉴定试验：选取作用10min抑杀指示菌99.9％的消毒剂最低有效浓度作为中和剂鉴定试验的样液浓度，并将1mL试验样液与9mL中和剂溶液混合；作用10min形成中和产物后，进行试验分组如下：将0.49mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支指示菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)分装五支含4.41mL试验样液(1#、2#)、4.41mL中和产物溶液(3#)、4.41mL察氏培养液(4#)、4.41mL中和剂溶液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使其溶液充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.49mL各组混匀液分装五支含4.41mL察氏培养液(1#、3#、4#、5#)、4.41mL中和剂溶液(2#)的无菌试管中，同时将另外一支无菌试管中的4.9mL察氏培养液作为第6#组试验样液，1000r/min振摇各组试管10min后，将其混匀液作为试验样液的回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述6组回收液相对荧光强度值；
(2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明所选中和剂种类可用于待测液体消毒剂样品真菌杀灭效果试验，并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度后重复上述中和剂鉴定试验，确定消毒剂试验浓度对应的中和剂浓度；
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
(3)定量悬液试验：按照待测消毒剂使用说明中标注的有效浓度和作用时间范围，用无菌水将其稀释为高、中、低三个适宜浓度：C1、C2、C3，其中C2＝2C1、C3＝2C2；同时选取四段不同的灭菌时间t1、t2、t3、t4，其中t1＝0.5t2、t3＝1.5t2、t4＝2t2，然后，用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的试验样液分装三支无菌试管中；并置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后，分别滴加0.49mL接种菌液，3000r/min振摇试管30s后开始记时，当灭菌作用持续至设定的t1、t2、t3、t4四段不同时间后，用灭菌移液枪将0.49mL不同浓度的混匀液分装三支含4.41mL中和剂溶液的无菌试管中，3000r/min振摇试管30s并开始记时，待中和作用持续10min后，将其混匀液作为各浓度试验样液的回收液，然后，用察氏培养液替代试验样液重复上述试验；
试验重复5次；
然后，将小牛血清加入菌悬液中，使其最终血清含量为10％并确保接种菌液CB为1.0×10-6mol/L～5.0×10-6mol/L，重复上述定量悬液试验5次；确定待测液体消毒剂样品在有机物存在的条件下，对真菌具备消毒效果的有效浓度和时间。
8.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min，用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样，向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值。
9.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算及杀灭率R和灭菌指数A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液的活菌ATP浓度CA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算每次不同浓度的试验样液及对照样液经t1～t4四段灭/染菌时间后，回收液的活菌ATP浓度CA和TA，相关计算见公式(2)～(9)：
式中：
TAij(t1)、TAij(t2)、TAij(t3)、TAij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IATij(t1)、IATij(t2)、IATij(t3)、IATij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
CAij(t1)、CAij(t2)、CAij(t3)、CAij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IACij(t1)、IACij(t2)、IACij(t3)、IACij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
(2)杀灭率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率Rij(t1)、Rij(t2)、Rij(t3)、Rij(t4)；以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的杀灭率Rj(t1)、Rj(t2)、Rj(t3)、Rj(t4)分别按照公式(10)～(17)计算：
式中：
Rij(t1)、Rij(t2)、Rij(t3)、Rij(t4)—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
Rj(t1)、Rj(t2)、Rj(t3)、Rj(t4)—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
CAij(t1)、CAij(t2)、CAij(t3)、CAij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
TAij(t1)、TAij(t2)、TAij(t3)、TAij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IATij(t1)、IATij(t2)、IATij(t3)、IATij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IACij(t1)、IACij(t2)、IACij(t3)、IACij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(3)灭菌指数A的计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数Aij(t1)、Aij(t2)、Aij(t3)、Aij(t4)；以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的灭菌指数Aj(t1)、Aj(t2)、Aj(t3)、Aj(t4)分别按照公式(18)～(25)计算：
Aij(t1)＝lgCAij(t1)-lgTAij(t1)＝aA×(lgIACij(t1)-lgIATij(t1))………………………(18)
Aij(t2)＝lgCAij(t2)-lgTAij(t2)＝aA×(lgIACij(t2)-lgIATij(t2))………………………(19)
Aij(t3)＝lgCAij(t3)-lgTAij(t3)＝aA×(lgIACij(t3)-lgIATij(t3))………………………(20)
Aij(t4)＝lgCAij(t4)-lgTAij(t4)＝aA×(lgIACij(t4)-lgIATij(t4))………………………(21)
式中：
Aij(t1)、Aij(t2)、Aij(t3)、Aij(t4)—每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
Aj(t1)、Aj(t2)、Aj(t3)、Aj(t4)—相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
CAij(t1)、CAij(t2)、CAij(t3)、CAij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；其中样品组别i＝1,2,3,4,5；
TAij(t1)、TAij(t2)、TAij(t3)、TAij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IATij(t1)、IATij(t2)、IATij(t3)、IATij(t4)—每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
IACij(t1)、IACij(t2)、IACij(t3)、IACij(t4)—每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度、接种菌液和回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，试验样液及对照样液经四段灭/染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，对真菌的杀菌率计算结果取三位有效数字，灭菌指数计算结果取两位有效数字；
(5)测量不确定度：本专利方法通过计算5次定量悬液试验中不同浓度的试验样液和对照样液经四段不同的灭/染菌时间后，其回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)；判断将ATP生物荧光分析法应用于液体消毒剂真菌杀灭效果测试的重现性，规定变异系数C·V≤10％，相相关计算见公式(26)～(33)：
式中：
μTj(t1)、μTj(t2)、μTj(t3)、μTj(t4)—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值IATijk(t1)、IATijk(t2)、IATijk(t3)、IATijk(t4)的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3；
σTj(t1)、σTj(t2)、σTj(t3)、σTj(t4)—经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值IATijk(t1)、IATijk(t2)、IATijk(t3)、IATijk(t4)的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3；
μCj(t1)、μCj(t2)、μCj(t3)、μCj(t4)—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值IACijk(t1)、IACijk(t2)、IACijk(t3)、IACijk(t4)的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3；
σCj(t1)、σCj(t2)、σCj(t3)、σCj(t4)—经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值IACijk(t1)、IACijk(t2)、IACijk(t3)、IACijk(t4)的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。
10.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的结果判定，按下述步骤进行：
参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的在特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格，当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。
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