CN110272969A - ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法评价日化品细菌杀灭效果的方法 - Google Patents

ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法评价日化品细菌杀灭效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种日化品细菌杀灭效果的评价方法，检测步骤包括：样品提取及前处理要求；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；中和剂鉴定及杀菌试验；回收液IA测定及其活菌ATP浓度CA和TA推算；杀菌率R及灭菌指数A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的日化品细菌杀灭效果进行精准定量测试。本发明规定中和回收染菌/灭特定时间后的对照样品和试验样品，测定回收液IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的日化品细菌杀灭效果评价的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。

Description

ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法评价日化品细菌杀灭效果 的方法
技术领域
本发明涉及日化品的细菌杀灭效果测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的日化品细菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，属于日化品杀菌效果评价技术领域。
背景技术
近年来，伴随着人们生活水平的提高和消费观念的改变,国内市场对洗涤、洗护等日化用品的需求量逐年递增；据中商产业研究院发布的《2018-2023年中国快消品行业发展前景及投资机会分析报告》显示，目前中国日化品消费市场整体呈现高于GDP增速的持续增长态势。截止2017年，国内日化行业规模为3233亿元，预计2018年将达3457亿元；受消费需求牵引，具备抗菌消毒功能的中高端日化产品市场年复合平均增长率整体保持在10％以上，预计2020年其市场规模接近1000亿。作为与民生息息相关的细分行业,中国日化用品产业现已进入竞争激烈的转型期；相关质检技术和检测效率逐渐提上日程。
目前，国内外抗菌消毒效果评价技术体系主要针对细菌和真菌，各国细菌杀灭效果测试方法原理多基于对细菌进行分离培养的平板计数法，一是日本工业标准提出的浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法。虽然我国已颁布实施GB15981-1995《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》、GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》和QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》、QB/T 2739-2005《洗涤用品常用试验方法滴定分析(容量分析)用试验溶液的制备》等相关标准，但现有检测方法在技术内容和实际应用中存在以下共性问题：一是所涉实验菌种过少，难以满足企业与时俱进的新品研发与质控需求；二是实验过程繁琐，相关操作受实验员专业经验影响，测试误差大，缺乏可比性；三是测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。近年来，在国际细菌检测技术领域ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比ATP检测结果的相关性为98％，准确度高且可实现快速检测；发达国家已将此方法运用于HACCP中。国内ATP相关研究起步较晚，受应用需求牵引，现ATP荧光检测仪已成为中国卫生部门指定的卫生监督和食品安全相关的专用检测设备。当前国外抗菌消毒效果检测技术研究向定量化、快速化和简易化趋势发展，注重检测结果准确性和可比性；已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO 20743:2007-2013《Textiles-Determination ofantibacterial activity of textile products(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO 13629-1:2012《Textiles-Determination of antifungal activity oftextile products.Part1Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其提供的吸收法、转移法和转印法仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料；日化品细菌杀灭效果评估须针对中和效果评价、结果计算公式等关键技术方面形成一整套明确而具体的方法，同时需要提供相关测量不确定度评估。另外，该标准方法杀菌效果表征参数较为单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用杀灭率R。
因此，为抵御国外技术壁垒，规范国内市场秩序，推动产业转型升级，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的日化产品细菌杀灭效果测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可填补国内外相关技术领域空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的日化品细菌杀灭效果进行评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，能够解决日化品乃至其他领域抗菌产品细菌杀灭效果精准定量测试问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种日化品细菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及前处理要求；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；(5)中和剂鉴定及杀菌试验；(6)回收液相对荧光强度值IA测定；(7)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算及杀菌率R和灭菌指数A计算；(8)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的日化品细菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确对照样品和试验样品的提取及前处理等要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛。用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L、8.5×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10-10mol/L、8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L)和1.1×10-11mol/L、1.1×10-10mol/L、1.1×10-9mol/L，并测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA范围为8.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液。在中和剂鉴定结果合格的条件下，向2.6mL各组对照样品和试验样品中分别加入0.4mL菌液并混匀；待杀菌作用持续至规定时间后，用2.7mL中和剂溶液对0.3mL染菌样液进行中和回收，应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值IACij和IATij，根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算相应的活菌ATP浓度CAij和TAij；
在杀菌率R和灭菌指数A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以特定杀菌时间内每件对照样品和试验样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；计算每件日化样品的杀菌率Rij及灭菌指数Aij，并以每组样品Rij和Aij的算术平均值为其杀菌率Ri和灭菌指数Ai；对三组样品的Ri或Ai取算术平均值，得到每批日化样品的杀菌率R或灭菌指数A；同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定日化品细菌杀灭效果分级判定标准；当某组(件)日化样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品细菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标曲法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的细菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品细菌杀灭效果评价结果。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计作为测试设备，达到了活菌ATP浓度测定和日化品细菌杀灭效果检测的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，避免了传统平皿培养法普遍存在的较大误差；能够确保检测结果的定量化，同时大幅度提高检测数据的准确性；检测技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据ATP荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌ATP浓度对数值lgCA─相对荧光强度对数值lgIA标准曲线；构建了日化品细菌杀灭效果评价ATP生物荧光实时定量分析方法的数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取杀菌率R及灭菌指数A作为相关性能评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行操作繁、误差大、周期长的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的ATP荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了日化品细菌杀灭效果评价的精准化和定量化并具备良好的重现性和可比性；同时大幅度缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgCA、lgIA线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了菌悬液活菌浓度表征、测定方法及中和剂鉴定试验，明确了对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收液相对荧光强度值IA作为结果评价形式来计算并判定杀菌率R或灭菌指数A，并通过组内及组间变异系数C·V考察测量不确定度，在技术上具有一定的前瞻性。
(5)可操作性：ATP荧光光度计价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的以样品杀菌前后活菌ATP浓度变化为重点的日化品细菌杀灭效果评价的ATP荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平微生物实验人员，有利于促进成果转化和推广应用。
(6)普适性：因ATP普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑日化品细菌杀灭效果评价技术实现普适化，同时可对消毒剂、一次性卫生用品等产品领域细菌杀灭效果检测技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的样品提取及前处理要求，按下述步骤进行：
(1)对照样品：以试验菌种培养液作为对照样品，其用量、数量及标准硬水稀释操作等与待测试验样品相同；
(2)试验样品：具有特殊卫生功效的洗涤用品、洁肤用品等日化产品；每个菌种使用的3组杀菌试验样品取自同一生产批号的不同运输包装,每组样品取自同一运输包装中的3件最小销售包装(样品量不少于10g)；单次中和剂鉴定试验需用3件同一运输包装中的最小销售包装样品(样品量不少于10g)；3次中和试验所用样品分别取自同一生产批号的不同运输包装。试验前用无菌标准硬水将对照样品和试验样品分别稀释至产品说明书规定浓度的7.69倍，未明示的浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品作用浓度分别为1:100和1:5；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、漂渍液、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用浓度为1:100；直接喷洒型硬表面清洁用品使用原液，浓缩型样品作用浓度为1:100。每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-13mol/L～10-7mol/L；(37±1)℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率(30～50)kHz的超声波清洗器；转速(300～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；酒精灯；分度值1mm的直尺；℃±0.2℃的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔；
(4)试剂：以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；将0.034g氯化钙、0.139g氯化镁溶于1000mL水中，配制成硬度342mg/L的标准硬水；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测日化样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液中，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC 14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散。然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代；
(3)菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d。试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物；
(4)菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀。将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度9.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止；
所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)标准系列溶液确定和ATP生物荧光测试样制备：用试验菌种培养液将1.0×10- 3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L、8.5×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10-10mol/L、8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L)和1.1×10-11mol/L、1.1×10-10mol/L、1.1×10-9mol/L并混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL的ATP标准系列溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.9mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲液并混匀；再将0.1mL不同浓度的混合溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样；
(2)相对荧光强度值IA测定：根据本专利中相对荧光强度值IA测定方法，以试验菌种培养液作为空白样液验证仪器及试剂组本底后；按照浓度CA从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(3)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以ATP标准系列溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其相应的ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(4)接种菌液的活菌ATP浓度CA标定：按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，对经麦氏比浊法初筛后细菌总量为9.0×108CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定其活菌ATP浓度CA。经试验菌种培养液调整，得到CA范围为8.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液；
所述的中和剂鉴定及杀菌试验，按下述步骤进行：
(1)中和剂鉴定试验：先将1mL试验样品与9mL中和剂溶液混合，作用10min形成中和产物溶液；并对试验分组：用灭菌移液枪将0.4mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装六支含2.6mL试验样品(1#、2#)、2.6mL中和剂溶液(3#、7#)、2.6mL中和产物溶液(4#)、2.6mL试验菌种培养液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使各组溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.3mL各组混匀液分装六支含2.7mL试验菌种培养液(1#、5#、7#)、2.7mL中和剂溶液(2#、3#)、2.7mL中和产物溶液(4#)的无菌试管中，并将1.5mL试验菌种培养液与1.5mL中和剂溶液加入同一支无菌试管中，作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后将其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述7组回收液的相对荧光强度值；同时将第7#组回收液的测定值记为IA0。
(2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组与第7#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5≈IA0，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明本次试验中和效果合格。
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为 mol/L；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距。
重复上述中和剂鉴定试验，如果连续三次中和效果评价均合格，则所选中和剂的种类及浓度可用于待测日化样品细菌杀灭效果试验；
(3)杀菌试验：用灭菌移液枪将每组2.6mL对照样品和试验样品分装无菌试管中，在(20±1)℃恒温水浴中(皂类样品30℃)保温(5±0.5)min后，向试管内滴加0.4mL接种菌液，迅速混匀并按照产品说明书标注的作用时间开始计时。未明示时间的硬表面清洁用品(直接喷洒型及浓缩型)作用5min；浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品分别作用15min和5min；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用20min(漂渍液作用5min)。待杀菌作用持续至规定时间后，用灭菌移液枪移取0.3mL各组染菌混匀液，分装含2.7mL灭菌中和剂溶液的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，充分中和后将其作为待测样品的回收液；
所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照相关仪器使用说明校准本底值)；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为回收液的IA测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IA)；
所述的回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀菌率R和灭菌指数A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后回收液的活菌ATP浓度CA和TA。相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌ATP浓度CA及TA)见公式(2)～(7)：
式中：
CA—3组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CAi—每组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA—3组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TAi—每组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
(2)杀菌率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的杀菌率Rij、每组及每批样品的杀菌率Ri和R分别按照公式(8)、(9)、(10)计算：
式中：
Rij—每件日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ri—每组日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批日化样品的杀菌率，％；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(3)灭菌指数A计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的灭菌指数Aij、每组及每批样品的灭菌指数Ai和A分别按照公式(11)、(12)、(13)计算:
式中：
Aij—每件日化样品的灭菌指数；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ai—每组日化样品的灭菌指数，样品组别i＝1,2,3；
A—每批日化样品的灭菌指数；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)数据修约要求：在标定ATP标准系列溶液的浓度以及接种菌液、样品回收活菌的ATP浓度CA时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定；当CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值取整数，杀菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字，灭菌指数Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(5)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的组内/组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于日化品细菌杀灭效果测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。相关计算见公式(14)～(16)：
式中：
μCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
所述的日化样品细菌杀灭效果的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用杀菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无细菌杀灭作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有细菌杀灭作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品细菌杀灭作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品细菌杀灭作用极强；
如果采用灭菌指数A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无细菌杀灭作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有细菌杀灭作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品细菌杀灭作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品细菌杀灭作用极强；
(2)当某组(件)日化样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品细菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的细菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品细菌杀灭效果评价结果；
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以由三氯卡灵作为抗菌剂加工而成的强效漂渍液样品细菌杀灭效果评价为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品提取及前处理要求
1.1对照样品：以试验菌种培养液作为对照样品，其用量、数量及标准硬水稀释操作等与待测试验样品相同。
1.2试验样品：具有特殊卫生功效的洗涤用品、洁肤用品等日化产品；每个菌种使用的3组杀菌试验样品取自同一生产批号的不同运输包装,每组样品取自同一运输包装中的3件最小销售包装(样品量不少于10g)；单次中和剂鉴定试验需用3件同一运输包装中的最小销售包装样品(样品量不少于10g)；3次中和试验所用样品分别取自同一生产批号的不同运输包装。试验前用无菌标准硬水将对照样品和试验样品分别稀释至产品说明书规定浓度的7.69倍，未明示的浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品作用浓度分别为1:100和1:5；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、漂渍液、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用浓度为1:100；直接喷洒型硬表面清洁用品使用原液，浓缩型样品作用浓度为1:100。每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-13mol/L～10-7mol/L；(37±1)℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率(30～50)kHz的超声波清洗器；转速(300～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉。
2.3材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；酒精灯；分度值1mm的直尺；℃±0.2℃的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔。
2.4试剂：以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；将0.034g氯化钙、0.139g氯化镁溶于1000mL水中，配制成硬度342mg/L的标准硬水；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测日化样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2。
2.6ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液中，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备
3.1试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC 14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散。然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代。
3.3菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d。试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物。
3.4菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀。将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度9.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止。
(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定
4.1标准系列溶液确定和ATP生物荧光测试样制备：用试验菌种培养液将1.0×10- 3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L、8.5×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10-10mol/L、8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L)和1.1×10-11mol/L、1.1×10-10mol/L、1.1×10-9mol/L并混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL的ATP标准系列溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.9mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲液并混匀；再将0.1mL不同浓度的混合溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。
4.2相对荧光强度值IA测定：根据本专利中相对荧光强度值IA测定方法，以试验菌种培养液作为空白样液验证仪器及试剂组本底后；按照浓度CA从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值。
4.3ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以ATP标准系列溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其相应的ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效。
4.4接种菌液的活菌ATP浓度CA标定：按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，对经麦氏比浊法初筛后细菌总量为9.0×108CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定其活菌ATP浓度CA。经试验菌种培养液调整，得到CA范围为8.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液。
(5)中和剂鉴定及杀菌试验
5.1中和剂鉴定试验：先将1mL试验样品与9mL中和剂溶液混合，作用10min形成中和产物溶液；并对试验分组：用灭菌移液枪将0.4mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装六支含2.6mL试验样品(1#、2#)、2.6mL中和剂溶液(3#、7#)、2.6mL中和产物溶液(4#)、2.6mL试验菌种培养液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使各组溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.3mL各组混匀液分装六支含2.7mL试验菌种培养液(1#、5#、7#)、2.7mL中和剂溶液(2#、3#)、2.7mL中和产物溶液(4#)的无菌试管中，并将1.5mL试验菌种培养液与1.5mL中和剂溶液加入同一支无菌试管中，作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后将其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述7组回收液的相对荧光强度值；同时将第7#组回收液的测定值记为IA0。
5.2中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组与第7#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5≈IA0，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明本次试验中和效果合格。
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为 mol/L；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距。
重复上述中和剂鉴定试验，如果连续三次中和效果评价均合格，则所选中和剂的种类及浓度可用于待测日化样品细菌杀灭效果试验。
5.3杀菌试验：用灭菌移液枪将每组2.6mL对照样品和试验样品分装无菌试管中，在(20±1)℃恒温水浴中(皂类样品30℃)保温(5±0.5)min后，向试管内滴加0.4mL接种菌液，迅速混匀并按照产品说明书标注的作用时间开始计时。未明示时间的硬表面清洁用品(直接喷洒型及浓缩型)作用5min；浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品分别作用15min和5min；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用20min(漂渍液作用5min)。待杀菌作用持续至规定时间后，用灭菌移液枪移取0.3mL各组染菌混匀液，分装含2.7mL灭菌中和剂溶液的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，充分中和后将其作为待测样品的回收液。
(6)回收液相对荧光强度值IA测定
6.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照相关仪器使用说明校准本底值)。
6.2回收液相对荧光强度值IA测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样。向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为回收液的IA测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IA)。
(7)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀菌率R和灭菌指数A计算
7.1回收液活菌ATP浓度CA和TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后回收液的活菌ATP浓度CA和TA。相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌ATP浓度CA及TA)见公式(2)～(7)：
式中：
CA—3组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CAi—每组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA—3组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TAi—每组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3。
7.2杀菌率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的杀菌率Rij、每组及每批样品的杀菌率Ri和R分别按照公式(8)、(9)、(10)计算：
式中：
Rij—每件日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ri—每组日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批日化样品的杀菌率，％；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
7.3灭菌指数A计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的灭菌指数Aij、每组及每批样品的灭菌指数Ai和A分别按照公式(11)、(12)、(13)计算:
式中：
Aij—每件日化样品的灭菌指数；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ai—每组日化样品的灭菌指数，样品组别i＝1,2,3；
A—每批日化样品的灭菌指数；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
7.4数据修约要求：在标定ATP标准系列溶液的浓度以及接种菌液、样品回收活菌的ATP浓度CA时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定；当CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值取整数，杀菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字，灭菌指数Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字。
7.5测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的组内/组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于日化品细菌杀灭效果测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。相关计算见公式(14)～(16)：
式中：
μCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3。
(8)结果评价
8.1参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用杀菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无细菌杀灭作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有细菌杀灭作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品细菌杀灭作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品细菌杀灭作用极强；
如果采用灭菌指数A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无细菌杀灭作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有细菌杀灭作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品细菌杀灭作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品细菌杀灭作用极强。
8.2当某组(件)日化样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品细菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的细菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品细菌杀灭效果评价结果。
本实施例所用实验室生物安全资质、仪器设备、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)实验室生物安全资质
在机构注册号为CNAS BL0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备
2.1二级生物安全柜：Thermo Scientific 1300系列二级B2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)。
2.2超净工作台：美国品牌Thermo ScientificTMHeraguardTM、型号ECO的超净工作台，内部宽×深×高＝920mm×585mm×645mm；空气流速为0.15m/s～0.25m/s和0.36m/s～0.45m/s。
2.3ATP生物荧光快速检测系统：美国Hygiena公司的便携式system SURE ATP荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；ATP含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0CFU/ml，RLU读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％。
2.4恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号WS-380H、容积380L、控温范围(0℃～50℃)±0.8℃、控湿范围(30～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱。
2.5恒温水浴箱：上海基玮试验仪器设备有限公司型号DK-S420的电热恒温水槽，容积15L，控温范围(5～99.9)℃±0.5℃，定时范围1min～999min。
2.6压力蒸汽灭菌器：日本Sanyo公司型号MLS-3780的高压灭菌器，容积75L，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235MPa，定时范围(1～250)min。
2.7低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号DW-HL398的超低温冷冻储存箱，有效容积398L，存储温度-10℃～-86℃。
2.8冰箱：东莞市昊欣仪器设备有限公司型号HXL-25-250AD的低温箱超低温冰箱，其冷藏箱(2～10)℃±0.1℃，冷冻箱(-30～20)℃±0.1℃。
2.9电子天平：日本岛津型号AUX220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.10超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号YQ-120C的超声波清洗机，容量3.2L，超声频率40KHz/28KHz/25KHz，定时范围1min～30min/99min。
2.11旋涡振荡器：美国品牌Coleparmer Votex-Genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.12pH计：上海精密仪器仪表有限公司型号MP512-03的精密pH计，量程范围(-2.000～19.999)pH±0.002pH，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.13电炉：常州德科仪器有限公司型号DLD-1KW的1KW封闭式调温电炉。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
三磷酸腺苷二钠标准品及配制ATP荧光试剂缓冲溶液、ATP裂解液、ATP提取液和ATP荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国Amresco品牌。
(5)标准菌株
大肠埃希氏菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用ATP荧光光度计经lgCA-lgIA标准曲线法对抗菌漂渍液样品的细菌杀灭效果进行评价，作用浓度为1:100，作用时间为5min；选择5g/L硫代硫酸钠溶液作为中和剂，可有效中和待测漂渍液样品对试验菌种的残留作用。相关中和剂鉴定、杀菌试验数据和杀菌效果评价及测量不确定度计算结果分别见表1～表3(志贺氏菌和沙门氏菌的检测结果分别与大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的检测结果接近)。
表1中和剂鉴定试验数据及组间误差率计算结果
表2杀菌试验数据及杀菌率R、灭菌指数A计算结果
表3相对荧光强度值测量不确定度计算结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种日化品细菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及前处理要求；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；(5)中和剂鉴定及杀菌试验；(6)回收液相对荧光强度值IA测定；(7)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算及杀菌率R和灭菌指数A计算；(8)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的日化品细菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确对照样品和试验样品的提取及前处理等要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛，用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10-9mol/L、8.5×10- 8mol/L、8.5×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10-10mol/L、8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L)和1.1×10-11mol/L、1.1×10-10mol/L、1.1×10-9mol/L，并测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA范围为8.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液，在中和剂鉴定结果合格的条件下，向2.6mL各组对照样品和试验样品中分别加入0.4mL菌液并混匀；待杀菌作用持续至规定时间后，用2.7mL中和剂溶液对0.3mL染菌样液进行中和回收，应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值IACij和IATij，根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算相应的活菌ATP浓度CAij和TAij；
在杀菌率R和灭菌指数A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以特定杀菌时间内每件对照样品和试验样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；计算每件日化样品的杀菌率Rij及灭菌指数Aij，并以每组样品Rij和Aij的算术平均值为其杀菌率Ri和灭菌指数Ai；对三组样品的Ri或Ai取算术平均值，得到每批日化样品的杀菌率R或灭菌指数A；同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定日化品细菌杀灭效果分级判定标准；当某组(件)日化样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品细菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标曲法测得的杀菌率或灭菌指数，如果前后两组(件)日化样品的细菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品细菌杀灭效果评价结果。
2.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的样品提取及前处理要求，按下述步骤进行：
(1)对照样品：以试验菌种培养液作为对照样品，其用量、数量及标准硬水稀释操作等与待测试验样品相同；
(2)试验样品：具有特殊卫生功效的洗涤用品、洁肤用品等日化产品；每个菌种使用的3组杀菌试验样品取自同一生产批号的不同运输包装,每组样品取自同一运输包装中的3件最小销售包装(样品量不少于10g)；单次中和剂鉴定试验需用3件同一运输包装中的最小销售包装样品(样品量不少于10g)；3次中和试验所用样品分别取自同一生产批号的不同运输包装，试验前用无菌标准硬水将对照样品和试验样品分别稀释至产品说明书规定浓度的7.69倍，未明示的浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品作用浓度分别为1:100和1:5；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、漂渍液、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用浓度为1:100；直接喷洒型硬表面清洁用品使用原液，浓缩型样品作用浓度为1:100，每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
3.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-13mol/L～10-7mol/L；(37±1)℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；2℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率(30～50)kHz的超声波清洗器；转速(300～3000)r/min的旋涡振荡器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；酒精灯；分度值1mm的直尺； 的温度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔；
(4)试剂：以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；将0.034g氯化钙、0.139g氯化镁溶于1000mL水中，配制成硬度342mg/L的标准硬水；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测日化样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；
沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；
大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；
ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液中，混匀后室温静置15min，3h内使用。
4.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC 8739；金黄色葡萄球菌ATCC 6538；沙门氏菌ATCC14028；志贺氏菌CMCC 51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散，然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代；
(3)菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d，试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物；
(4)菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀，将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度9.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止。
5.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)标准系列溶液确定和ATP生物荧光测试样制备：用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L、8.5×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10-10mol/L、8.5×10-9mol/L、8.5×10-8mol/L)和1.1×10-11mol/L、1.1×10-10mol/L、1.1×10-9mol/L并混匀，然后，用灭菌移液枪将0.1mL的ATP标准系列溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.9mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲液并混匀；再将0.1mL不同浓度的混合溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样；
(2)相对荧光强度值IA测定：根据本专利中相对荧光强度值IA测定方法，以试验菌种培养液作为空白样液验证仪器及试剂组本底后；按照浓度CA从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(3)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以ATP标准系列溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其相应的ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(4)接种菌液的活菌ATP浓度CA标定：按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，对经麦氏比浊法初筛后细菌总量为9.0×108CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定其活菌ATP浓度CA，经试验菌种培养液调整，得到CA范围为8.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液。
6.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的中和剂鉴定及杀菌试验，按下述步骤进行：
(1)中和剂鉴定试验：先将1mL试验样品与9mL中和剂溶液混合，作用10min形成中和产物溶液；并对试验分组：用灭菌移液枪将0.4mL接种菌液(与lgCA-lgIA曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装六支含2.6mL试验样品(1#、2#)、2.6mL中和剂溶液(3#、7#)、2.6mL中和产物溶液(4#)、2.6mL试验菌种培养液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使各组溶液充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.3mL各组混匀液分装六支含2.7mL试验菌种培养液(1#、5#、7#)、2.7mL中和剂溶液(2#、3#)、2.7mL中和产物溶液(4#)的无菌试管中，并将1.5mL试验菌种培养液与1.5mL中和剂溶液加入同一支无菌试管中，作为第6#组试验样液，1000r/min振摇各组试管10min后将其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IA测定方法，测定并记录上述7组回收液的相对荧光强度值；同时将第7#组回收液的测定值记为IA0；
(2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IA1≥0、IA6＝0，第2#～5#回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IA2≥0且IA2＜IA3、IA2＜IA4、IA2＜IA5；第3#、4#、5#组与第7#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IA3≈IA4≈IA5≈IA0，其按照公式(1)计算得到的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率Δ≤10％；说明本次试验中和效果合格；
式中：
Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌ATP浓度CA3、CA4、CA5组间误差率，％；
IA3、IA4、IA5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU；
—第3#、4#、5#组回收液的活菌平均ATP浓度，其数值为 mol/L；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
重复上述中和剂鉴定试验，如果连续三次中和效果评价均合格，则所选中和剂的种类及浓度可用于待测日化样品细菌杀灭效果试验；
(3)杀菌试验：用灭菌移液枪将每组2.6mL对照样品和试验样品分装无菌试管中，在(20±1)℃恒温水浴中(皂类样品30℃)保温(5±0.5)min后，向试管内滴加0.4mL接种菌液，迅速混匀并按照产品说明书标注的作用时间开始计时，未明示时间的硬表面清洁用品(直接喷洒型及浓缩型)作用5min；浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品分别作用15min和5min；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用20min(漂渍液作用5min)，待杀菌作用持续至规定时间后，用灭菌移液枪移取0.3mL各组染菌混匀液，分装含2.7mL灭菌中和剂溶液的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，充分中和后将其作为待测样品的回收液。
7.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL试验菌种培养液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中并充分混匀，然后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为空白测试平行样，向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照相关仪器使用说明校准本底值)；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将0.1mL回收液、0.8mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，充分混匀后将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，静置5min～30min，作为ATP荧光测试平行样，向三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为回收液的IA测定值(或使用仪器配套试剂盒，按照使用说明书要求，直接上机测定回收液三个平行样的相对荧光强度值IA)。
8.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀菌率R和灭菌指数A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后回收液的活菌ATP浓度CA和TA，相关计算(使用仪器配套试剂盒时，根据其实际进样量推算1mL回收液的活菌ATP浓度CA及TA)见公式(2)～(7)：
式中：
CA—3组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CAi—每组对照样品染菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA—3组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TAi—每组试验样品杀菌特定时间后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
(2)杀菌率R计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的杀菌率Rij、每组及每批样品的杀菌率Ri和R分别按照公式(8)、(9)、(10)计算：
式中：
Rij—每件日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ri—每组日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批日化样品的杀菌率，％；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(3)灭菌指数A计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的灭菌指数Aij、每组及每批样品的灭菌指数Ai和A分别按照公式(11)、(12)、(13)计算:
式中：
Aij—每件日化样品的灭菌指数；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
Ai—每组日化样品的灭菌指数，样品组别i＝1,2,3；
A—每批日化样品的灭菌指数；
CAij—每件对照样品染菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
TAij—每件试验样品杀菌特定时间后回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件对照样品染菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
—每件试验样品杀菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)数据修约要求：在标定ATP标准系列溶液的浓度以及接种菌液、样品回收活菌的ATP浓度CA时，参考GB 4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定；当CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值取整数，杀菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字，灭菌指数Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(5)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和试验样品染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的组内/组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于日化品细菌杀灭效果测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％，相关计算见公式(14)～(16)：
式中：
μCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
μT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的算术平均值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σCi—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σTi—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σC—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；
σT—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的标准偏差；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；ATP测试平行样编号k＝1,2,3。
9.根据权利要求1所述的日化品细菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用杀菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜90％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R＜80％)，样品无细菌杀灭作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌80％≤Rij/Ri/R＜90％)，样品具有细菌杀灭作用；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌90％≤Rij/Ri/R＜99％)，样品细菌杀灭作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Rij/Ri/R≥99％)，样品细菌杀灭作用极强；
如果采用灭菌指数A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜1.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A＜0.5)，样品无细菌杀灭作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌0.5≤Aij/Ai/A＜1.0)，样品具有细菌杀灭作用；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌1.0≤Aij/Ai/A＜2.0)，样品细菌杀灭作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时(金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Aij/Ai/A≥2.0)，样品细菌杀灭作用极强；
(2)当某组(件)日化样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品细菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数，如果前后两组(件)日化样品的细菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品细菌杀灭效果评价结果。
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