CN110272945A - ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌陶瓷抗真菌性能的方法 - Google Patents

ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌陶瓷抗真菌性能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗菌陶瓷抗真菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液活菌CA标定；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IA测定及活菌ATP浓度CA和TA推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的陶瓷抗真菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h/48h后对照样品和抗菌样品，测定其IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的陶瓷抗真菌性检测的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，将以先进检测技术支撑产品质量提升。

Description

ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌陶瓷抗真菌性能 的方法
技术领域
本发明涉及抗菌陶瓷的抗真菌性能测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌陶瓷抗真菌性能进行精准定量检测的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，属于陶瓷抗菌功能检测技术领域。
背景技术
中国陶瓷生产历史悠久，陶瓷年产量约占世界总产量的90％，年出口量逾40亿件；其中日用陶瓷、建筑陶瓷、卫生陶瓷分别占据世界总产量的65％、60％和40％，但陶瓷总产值却仅为世界总产值的10％，产品科技含量低导致的同质化竞争愈演愈烈。近年来，采用新型抗菌技术改造传统陶瓷生产工艺已成为国内优势陶企转型发展的主攻方向，抗菌技术在陶瓷产业的应用和普及势不可挡，抗菌功能成为陶瓷产品极具特色的一个“卖点”；但现有检测技术的滞后却严重制约着产业发展。
目前，国内外抗菌材料性能检测技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗真菌效果测试方法原理多基于对白色念珠菌进行分离培养的平板计数法，鲜有涉及霉菌者；其中适用白色念珠菌测试的一是日本工业标准提出的浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法；五是日本企业针对光催化型抗菌制品研发的盖玻片法。虽然我国已颁布实施《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》、GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》和QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》等相关标准，但其规定的测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。另外，多年来国际防霉效果评价技术体系基本源自美标、日标和欧标，国外所涉标准方法主要包括土埋培养法、琼脂平板法、湿室培养法等；我国基于平皿培养法和悬挂法，先后制定GB/T 1741-2007《漆膜耐霉菌性测定法》、GB/T 24346-2009《纺织品防霉性能的评价》、FZ/T 60030-2009《家用纺织品防霉性能测试方法》、GB/T 24128-2009《塑料防霉性能试验方法》、QB/T 4199-2011《皮革防霉性能测试方法》、HG/T 4301-2012《橡胶防霉性能测试方法》、LY/T 2230-2013《人造板防霉性能评价》等标准；但有关陶瓷抗真菌性能检测方法标准尚属空白。由于霉菌孢子生长过程中形成的菌丝体无法准确计数，只能进行定性判定，无法定量测试；且因霉菌生长周期较长，培养时间至少2周～4周，导致测试周期较长，时间及经济成本高。无论针对白色念珠菌还是霉菌，现有标准方法的实验过程繁琐，技术难度较高；相关操作受人为因素影响大，使得测试误差大，缺乏可比性。近年来，在国际细菌检测技术领域ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比检测结果相关性为98％，准确度高且可实现快速检测。国外抗菌材料性能检测技术研究领域针对当前定量化、快速化和简易化发展趋势，已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO 20743:2007-2013《Textiles-Determination of antibacterial activity of textile products(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO 13629-1:2012《Textiles-Determination of antifungalactivity of textile products.Part1Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料，在活菌回收方式、接种菌液浓度、试验有效条件等关键技术方面不适用于具有非吸水性硬质表面且对照样真菌增长值＜0的陶瓷、玻璃等无机非金属材料；同时未提供测量不确定度评估。另外，该标准方法相关抗菌性能表征参数较为单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用抗菌率R。
因此，为促进产品更新换代，推动产业转型升级，规范国内市场秩序，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的抗菌陶瓷抗真菌性能测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可有效填补国内外相关技术领域空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌陶瓷抗真菌性能进行检测的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，能够解决抗菌陶瓷乃至其他产品领域抗菌材料及制品抗真菌性能精准定量测试问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，包括：(1)样品制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌陶瓷抗真菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确对照样品和抗菌样品的数量、尺寸及吸水率要求，对样品进行灭菌和吸水处理；将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定。然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和2.1×10-9mol/L、2.1×10-8mol/L、2.1×10-7mol/L，测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。同时，用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA范围为5.0×10-7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液。然后，向各组样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液，采用4.6mL洗脱液立即对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IAC0ij、IAT0ij，并根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算其活菌ATP浓度CAOij和TAOij。同时，在95％RH±2％RH的湿度条件下，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(30±2)℃(白色念珠菌)培养24h±2h或(28±2)℃(霉菌)培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定其回收液的相对荧光强度值IACtij、IATtij，推算相应的活菌ATP浓度CAtij和TAtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以0h接触及24h或48h培养条件下每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其经24h或48h培养后的真菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌陶瓷样品的抗菌率R和抗菌活性值A为三组样品Ri和Ai的算术平均值；同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗真菌性能分级判定标准；当某组(件)抗菌陶瓷样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗真菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组(件)抗菌陶瓷样品抗真菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌陶瓷样品抗真菌性能的评价结果。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计作为测试设备，能够精准快速测定陶瓷样品培养特定时间后回收的活菌量，达到了陶瓷抗真菌性能检测的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，突破了传统平皿培养法的霉菌定性分析局限；实现了检测结果定量化，并大幅度提高检测数据准确性；检测技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据ATP荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌ATP浓度对数值lgCA─相对荧光强度对数值lgIA标准曲线；构建了抗菌陶瓷抗真菌性能ATP生物荧光实时定量分析方法的数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取抗菌率R及抗菌活性值A为相关性能评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行操作繁、周期长、霉菌非定量的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的ATP荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了陶瓷抗真菌性能检测结果的精准化和定量化并具备良好的重现性和可比性；同时大幅度缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgCA、lgIA线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了白色念珠菌和霉菌孢子悬液活菌浓度测定方法和陶瓷样品前处理方式，明确对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收液活菌相对荧光强度值IA作为结果评价形式来计算并判定抗菌率R或抗菌活性值A，通过组内及组间变异系数C·V考察测量不确定度，技术具有一定前瞻性。
(5)可操作性：ATP荧光光度计价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的美蓝染色后血球计数活菌浓度测定法和陶瓷抗真菌性能ATP荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平微生物实验人员，有利于促进成果转移转化和推广应用。
(6)普适性：因ATP普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑陶瓷抗真菌性能检测技术实现普适化，同时可对塑料、玻璃等产品领域抗真菌性能检测技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的样品制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)对照样品：除未添加任何抗菌成分外，对照样品类别、原料及工艺与待测抗菌陶瓷样品完全相同；其中抗菌试验表面带釉，另一面无釉。日用陶瓷样品中骨质瓷和细瓷厚度不大于6mm，吸水率≤0.5％；普瓷厚度不大于8mm，吸水率≤1.0％；炻器和精陶厚度不大于10mm，其中炻器吸水率≤5.0％；精陶吸水率≤17.0％。卫生陶瓷样品厚度为6mm～10mm，瓷质吸水率≤0.5％，8.0％≤陶质吸水率＜15.5％；建筑陶瓷样品厚度不大于10mm，瓷质吸水率≤0.5％、炻瓷吸水率0.5％～3％、炻质吸水率6％～10％、陶质吸水率≥10％。样品尺寸为(50±2)mm×(50±2)mm，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和24h或48h培养试验各用3组，每组5件样品；
(2)抗菌样品：釉层添加抗菌剂或表面施涂抗菌层的陶瓷样品，另一面无釉；其厚度、吸水率以及规格尺寸、数量等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
(3)样品前处理：实验前将各组对照样品和抗菌样品在无菌水中浸泡24h，待其坯体及釉层充分吸收水分后；再用70％的乙醇溶液中浸泡5min，并在超净工作台上用无菌水充分清洗样品以去除乙醇。然后，用灭菌干纱布吸干样品表面多余水分，将其釉面向上放入无菌平皿中备用；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-6mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；
(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；70％的乙醇溶液；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；
(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用；
所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数，按下述步骤进行：
(1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；
(2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；
(3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL；
所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和2.1×10-9mol/L、2.1×10-8mol/L、2.1×10-7mol/L并充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样；
(2)空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂。3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(3)ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(5)接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定相应的活菌ATP浓度CA。经察氏培养液调整，得到CA范围为5.0×10-7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液，测定并记录0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值IA0；
所述的样品接种、培养及洗脱回收，按下述步骤进行：
(1)样品接种培养：在无菌平皿底部放入大小适中的多层灭菌纱布，将10mL灭菌生理盐水倾注于纱布上使其刚好浸水饱和；将6组24h或48h接触样品置于无菌纱布上，6组0h接触样品置于未放纱布的无菌平皿内。用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与曲线lgCA-lgIA标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面。盖上皿盖，用医用胶带将装有6组24h或48h接触样品的平皿密封；在(95±2)％RH的湿度条件下，(30±2)℃培养24h±2h(白色念珠菌)或(28±2)℃培养48h±2h(霉菌)；
(2)洗脱回收：6组0h接触样品接种白色念珠菌或霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并将洗液移入无菌试管中(用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将其移入试管)，3000r/min振摇试管2min；充分混匀后将其作为待测样品回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)。各组经24h或48h培养后的样品采用与0h接触样品相同洗脱方式回收真菌；
所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值；
所述的回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及抗菌率R或抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌ATP浓度CA及TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算各组样品经0h接触及24h或48h培养后回收液的活菌ATP浓度CA及TA。相关计算公式见式(1)～式(12)：
式中：
CA0和CAt—3组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CA0i和CAti—每组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA0和TAt—3组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TA0i和TAti—每组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触的对照样品回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经24h或48h培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CAtij≥0.1×CA0ij。则当3组0h接触对照样品回收液的相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效；
(3)真菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后，真菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度数值，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；
CAtij和TAtij—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌陶瓷样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(6)数据修约要求：采用血球计数板标定白色念珠菌或霉菌孢子悬液的活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度和接种菌液、样品回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触和24h/48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；真菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，回收液相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于陶瓷抗真菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
所述的抗菌陶瓷样品抗真菌性能的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无抗真菌作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有抗真菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品抗真菌作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品抗真菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品抗真菌作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无抗真菌作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有抗真菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品抗真菌作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品抗真菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品抗真菌作用极强；
(2)当某组(件)抗菌陶瓷样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗真菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组抗菌陶瓷样品抗真菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌陶瓷样品抗真菌性能的评价结果。
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以釉层添加了纳米银系抗菌剂加工而成的抗菌卫生陶瓷样品的抗真菌性能检测为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品制备及前处理
1.1对照样品：除未添加任何抗菌成分外，对照样品类别、原料及工艺与待测抗菌陶瓷样品完全相同；其中抗菌试验表面带釉，另一面无釉。日用陶瓷样品中骨质瓷和细瓷厚度不大于6mm，吸水率≤0.5％；普瓷厚度不大于8mm，吸水率≤1.0％；炻器和精陶厚度不大于10mm，其中炻器吸水率≤5.0％；精陶吸水率≤17.0％。卫生陶瓷样品厚度为6mm～10mm，瓷质吸水率≤0.5％，8.0％≤陶质吸水率＜15.5％；建筑陶瓷样品厚度不大于10mm，瓷质吸水率≤0.5％、炻瓷吸水率0.5％～3％、炻质吸水率6％～10％、陶质吸水率≥10％。样品尺寸为(50±2)mm×(50±2)mm，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和24h或48h培养试验各用3组，每组5件样品。
1.2抗菌样品：釉层添加抗菌剂或表面施涂抗菌层的陶瓷样品，另一面无釉；其厚度、吸水率以及规格尺寸、数量等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
1.3样品前处理：实验前将各组对照样品和抗菌样品在无菌水中浸泡24h，待其坯体及釉层充分吸收水分后；再用70％的乙醇溶液中浸泡5min，并在超净工作台上用无菌水充分清洗样品以去除乙醇。然后，用灭菌干纱布吸干样品表面多余水分，将其釉面向上放入无菌平皿中备用。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-6mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉。
2.3材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表。
2.4试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；70％的乙醇溶液；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL。
2.6ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备
3.1试验菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌。
3.3菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液。
3.4菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。
(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数
4.1美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀。
4.2血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子。
4.3活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL。
(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定
5.1ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和2.1×10-9mol/L、2.1×10-8mol/L、2.1×10-7mol/L并充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样。
5.2空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂。3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)。
5.3ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值。
5.4ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)。当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效。
5.5接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定相应的活菌ATP浓度CA。经察氏培养液调整，得到CA范围为5.0×10-7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液，测定并记录0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值IA0。
(6)样品接种、培养及洗脱回收
6.1样品接种培养：在无菌平皿底部放入大小适中的多层灭菌纱布，将10mL灭菌生理盐水倾注于纱布上使其刚好浸水饱和；将6组24h或48h接触样品置于无菌纱布上，6组0h接触样品置于未放纱布的无菌平皿内。用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与曲线lgCA-lgIA标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面。盖上皿盖，用医用胶带将装有6组24h或48h接触样品的平皿密封；在(95±2)％RH的湿度条件下，(30±2)℃培养24h±2h(白色念珠菌)或(28±2)℃培养48h±2h(霉菌)。
6.2洗脱回收：6组0h接触样品接种白色念珠菌或霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并将洗液移入无菌试管中(用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将其移入试管)，3000r/min振摇试管2min；充分混匀后将其作为待测样品回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)。各组经24h或48h培养后的样品采用与0h接触样品相同洗脱方式回收真菌。
(7)回收液相对荧光强度值IA测定
7.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值。
7.2回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值。
(8)回收液活菌的TP浓度CA和TA推算以及抗菌率R或抗菌活性值A计算
8.1回收液活菌ATP浓度CA及TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算各组样品经0h接触及24h或48h培养后回收液的活菌ATP浓度CA及TA。相关计算公式见式(1)～式(12)：
式中：
CA0和CAt—3组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CA0i和CAti—每组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA0和TAt—3组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TA0i和TAti—每组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5。
8.2试验有效条件
如果每件0h接触的对照样品回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经24h或48h培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CAtij≥0.1×CA0ij。则当3组0h接触对照样品回收液的相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效。
8.3真菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后，真菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度数值，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
8.4抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；
CAtij和TAtij—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
8.5抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌陶瓷样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率。
8.6数据修约要求：采用血球计数板标定白色念珠菌或霉菌孢子悬液的活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度和接种菌液、样品回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和抗菌样品经0h接触和24h/48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；真菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字。
8.7测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，回收液相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于陶瓷抗真菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％。
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
(9)结果评价
9.1参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无抗真菌作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有抗真菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品抗真菌作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品抗真菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品抗真菌作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无抗真菌作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有抗真菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品抗真菌作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品抗真菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品抗真菌作用极强。
9.2当某组(件)抗菌陶瓷样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗真菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组抗菌陶瓷样品抗真菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌陶瓷样品抗真菌性能的评价结果。
本实施例所用实验室生物安全资质、仪器设备、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)实验室生物安全资质
在机构注册号为CNAS BL0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备和试验器材
2.1二级生物安全柜：Thermo Scientific 1300系列二级B2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)。
2.2超净工作台：美国品牌Thermo ScientificTMHeraguardTM、型号ECO的超净工作台，内部宽×深×高＝920mm×585mm×645mm；空气流速为0.15m/s～0.25m/s和0.36m/s～0.45m/s。
2.3ATP生物荧光快速检测系统：美国Hygiena公司的便携式system SURE ATP荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；ATP含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0CFU/ml，RLU读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％。
2.4生物光学显微镜：具备10倍宽视场可调目镜以及4倍、10倍、20倍、40倍和100倍平场消色差物镜的奥林巴斯BX43三目研究级生物显微镜。
2.5恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号WS-380H、容积380L、控温范围(0～50)℃±0.8℃、控湿范围(30～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱。
2.6恒温振荡器：上海一恒型号WS-380H、控温范围(4～65)℃±0.1℃、振荡频率(40～300)r/min、定时范围(1～99)h。
2.7冷冻离心机：北京新诺立华仪器有限公司型号DL7M-12L的立式冷冻离心机，转速8000r/min±20r/min，相对离心力12300×g；容量14400ml，定时范围1s～99h59min99s，控温范围(-20～40)℃±1℃，离心管规格Ф74mm×168mm。
2.8压力蒸汽灭菌器：日本Sanyo公司型号MLS-3780高压灭菌器，容积75L，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235MPa，定时器(1～250)min。
2.9低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号DW-HL398的超低温冷冻储存箱，有效容积398L，存储温度-10℃～-86℃。
2.10冰箱：东莞市昊欣仪器设备有限公司型号HXL-25-250AD的低温箱超低温冰箱，其冷藏箱(2～10)℃±0.1℃，冷冻箱(-30～20)℃±0.1℃。
2.11电子天平：日本岛津型号AUX220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.12超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号YQ-120C的超声波清洗机，容量3.2L，超声频率40KHz/28KHz/25KHz，定时范围1min～30min/99min。
2.13旋涡振荡器：美国品牌Coleparmer Votex-Genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.14pH计：上海精密仪器仪表有限公司型号MP512-03的精密pH计，量程范围(-2.000～19.999)pH±0.002pH，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.15电炉：常州德科仪器有限公司型号DLD-1KW的1KW封闭式调温电炉。
2.16血球计数板：上海求精规格为25×16的血球计数板。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
4.1 0.1％的吕氏碱性美蓝染色液：购自上海心语生物科技有限公司。
4.2三磷酸腺苷二钠标准品及配制ATP荧光试剂缓冲溶液、ATP裂解液、ATP提取液和ATP荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国Amresco品牌。
(5)标准菌株
白色念珠菌ATCC 10231购自中国医学真菌保藏管理中心；黑曲霉ATCC 16404、球毛壳霉ATCC 6205、产黄青霉ATCC 9179购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用ATP荧光光度计经lgCA-lgIA标准曲线法对抗菌卫生陶瓷样品的抗真菌性能进行检测，相关检测数据及测量不确定度计算结果分别见表1～表4。
表1相对荧光强度测定值及抗菌率R、抗菌活性值A计算结果(白色念珠菌)
表2相对荧光强度值测量不确定度计算结果(白色念珠菌)
表3相对荧光强度测定值及抗菌率R、抗菌活性值A计算结果(霉菌)
表4相对荧光强度测量不确定度计算结果(霉菌)
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，包括：(1)样品制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌陶瓷抗真菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值IA测定中：
明确对照样品和抗菌样品的数量、尺寸及吸水率要求，对样品进行灭菌和吸水处理；将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定，然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和2.1×10-9mol/L、2.1×10-8mol/L、2.1×10-7mol/L，测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，同时，用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA范围为5.0×10- 7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液，然后，向各组样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液，采用4.6mL洗脱液立即对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IAC0ij、IAT0ij，并根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算其活菌ATP浓度CAOij和TAOij，同时，在95％RH±2％RH的湿度条件下，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(30±2)℃(白色念珠菌)培养24h±2h或(28±2)℃(霉菌)培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定其回收液的相对荧光强度值IACtij、IATtij，推算相应的活菌ATP浓度CAtij和TAtij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以0h接触及24h或48h培养条件下每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其经24h或48h培养后的真菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌陶瓷样品的抗菌率R和抗菌活性值A为三组样品Ri和Ai的算术平均值；同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗真菌性能分级判定标准；当某组(件)抗菌陶瓷样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗真菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)抗菌陶瓷样品抗真菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌陶瓷样品抗真菌性能的评价结果。
2.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的样品制备及前处理，按下述步骤进行：
(1)对照样品：除未添加任何抗菌成分外，对照样品类别、原料及工艺与待测抗菌陶瓷样品完全相同；其中抗菌试验表面带釉，另一面无釉，日用陶瓷样品中骨质瓷和细瓷厚度不大于6mm，吸水率≤0.5％；普瓷厚度不大于8mm，吸水率≤1.0％；炻器和精陶厚度不大于10mm，其中炻器吸水率≤5.0％；精陶吸水率≤17.0％，卫生陶瓷样品厚度为6mm～10mm，瓷质吸水率≤0.5％，8.0％≤陶质吸水率＜15.5％；建筑陶瓷样品厚度不大于10mm，瓷质吸水率≤0.5％、炻瓷吸水率0.5％～3％、炻质吸水率6％～10％、陶质吸水率≥10％，样品尺寸为(50±2)mm×(50±2)mm，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和24h或48h培养试验各用3组，每组5件样品；
(2)抗菌样品：釉层添加抗菌剂或表面施涂抗菌层的陶瓷样品，另一面无釉；其厚度、吸水率以及规格尺寸、数量等与对照样品相同，每组抗菌样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
(3)样品前处理：实验前将各组对照样品和抗菌样品在无菌水中浸泡24h，待其坯体及釉层充分吸收水分后；再用70％的乙醇溶液中浸泡5min，并在超净工作台上用无菌水充分清洗样品以去除乙醇，然后，用灭菌干纱布吸干样品表面多余水分，将其釉面向上放入无菌平皿中备用。
3.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-6mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；
(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；70％的乙醇溶液；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；
(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；
ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；
ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；
ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；
ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
4.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h，霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；
(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用，霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用，霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。
5.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数，按下述步骤进行：
(1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；
(2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作，用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内，当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；
(3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子，若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液，对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值，当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数，然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：
(1)ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10- 3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和2.1×10-9mol/L、2.1×10-8mol/L、2.1×10-7mol/L并充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样；
(2)空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样，然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(3)ATP标准溶液相对荧光强度值IA测定：按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液的三个测试平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂；3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以各浓度ATP标准溶液三个平行样相对荧光强度值的算术平均值为其IA测定值；
(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立：以不同浓度ATP标准溶液的相对荧光强度对数值lgIA作为横坐标，以其ATP浓度对数值lgCA为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线；并应用最小二乘拟合法推导得出曲线的线性方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和相关系数RA0 2(高浓度)、RA 2(低浓度)，当RA0 2及RA 2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利所做的测定有效；
(5)接种菌液活菌ATP浓度CA标定：用察氏培养液对活菌含量CB为1.0×108CFU/mL～5.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA；根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算并标定相应的活菌ATP浓度CA，经察氏培养液调整，得到CA范围为5.0×10-7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液，测定并记录0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度值IA0。
7.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的样品接种、培养及洗脱回收，按下述步骤进行：
(1)样品接种培养：在无菌平皿底部放入大小适中的多层灭菌纱布，将10mL灭菌生理盐水倾注于纱布上使其刚好浸水饱和；将6组24h或48h接触样品置于无菌纱布上，6组0h接触样品置于未放纱布的无菌平皿内，用灭菌移液枪向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL接种菌液(与曲线lgCA-lgIA标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，0℃±1℃保存，2h内使用)，用L棒(附着接种菌液但不挂滴)将菌液涂抹均匀，使其覆盖样品整个表面，盖上皿盖，用医用胶带将装有6组24h或48h接触样品的平皿密封；在(95±2)％RH的湿度条件下，(30±2)℃培养24h±2h(白色念珠菌)或(28±2)℃培养48h±2h(霉菌)；
(2)洗脱回收：6组0h接触样品接种白色念珠菌或霉菌后，立即用灭菌移液枪吸取4.6mL洗脱液(即察氏培养液)，在平皿内反复冲洗每个样品接种表面至少4次，充分洗脱并将洗液移入无菌试管中(用移液枪头反复吹吸平皿内霉菌洗液，直至菌苔被打散后再将其移入试管)，3000r/min振摇试管2min；充分混匀后将其作为待测样品回收液(若回收液不足4.9mL，添加洗脱液至4.9mL)，各组经24h或48h培养后的样品采用与0h接触样品相同洗脱方式回收真菌。
8.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IA测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：按照lgCA-lgIA标准曲线建立时空白本底校准方法，用察氏培养液替代0.05％的润湿剂水溶液，测定仪器和试剂组本底值；
(2)回收液相对荧光强度值IA测定：如本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，再滴加5.0mL的ATP提取试剂并混匀；室温静置10min，用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样，向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IA并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IA测定值。
9.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及抗菌率R或抗菌活性值A计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌ATP浓度CA及TA推算
根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，推算各组样品经0h接触及24h或48h培养后回收液的活菌ATP浓度CA及TA，相关计算公式见式(1)～式(12)：
式中：
CA0和CAt—3组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
CA0i和CAti—每组0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；bA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA在纵轴截距；
TA0和TAt—3组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
TA0i和TAti—每组0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
(2)试验有效条件
如果每件0h接触的对照样品回收液与0.3mL接种菌液经4.6mL洗脱液稀释后1min内的相对荧光强度测定值接近，即每件经24h或48h培养后的对照样品回收液相对荧光强度测定值的对数即CAtij≥0.1×CA0ij，则当3组0h接触对照样品回收液的相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V≤10％时(所涉计算公式见本专利相关测量不确定度要求)，按照本专利方法进行的测定有效；
(3)真菌增长值Fij、Gij计算
每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后，真菌增长值Fij、Gij分别按照公式(13)、(14)计算：
式中：
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
CA0ij和CAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
TA0ij和TAtij—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收活菌的平均ATP浓度数值，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(4)抗菌率R计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌率Rij、每组及每批样品的抗菌率Ri和R分别按照公式(15)、(16)、(17)计算：
式中：
Rij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ri—每组抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
R—每批抗菌陶瓷样品的抗菌率，％；
CAtij和TAtij—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后回收活菌的平均ATP浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件抗菌样品和对照样品经24h或48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(5)抗菌活性值A计算
试验有效条件下，每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值Aij、每组及每批样品的抗菌活性值Ai和A分别按照公式(18)、(19)、(20)计算：
式中：
Aij—每件抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
Ai—每组抗菌陶瓷样品的抗菌活性值，样品组别i＝1,2,3；
A—每批抗菌陶瓷样品的抗菌活性值；
Fij和Gij—每件对照样品和抗菌样品经24h或48h培养后的真菌增长值，样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后对照样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
和—每件0h接触和经24h或48h培养后抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值，RLU；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；
aA—低浓度标准曲线lgCA-lgIA斜率；
(6)数据修约要求：采用血球计数板标定白色念珠菌或霉菌孢子悬液的活菌含量CB以及对ATP标准溶液的浓度和接种菌液、样品回收液的活菌ATP浓度CA进行标定时，参考GB4789.2—2016中有关菌落数的数据修约规定，当CB小于100CFU/mL或CA小于100mol/L时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL或CA不小于100mol/L时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，对照样品和抗菌样品经0h接触和24h/48h培养后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，抗菌率Rij、Ri、R计算结果取三位有效数字；真菌增长值Fij、Gij和抗菌活性值Aij、Ai、A计算结果取两位有效数字；
(7)测量不确定度：本专利方法主要通过计算对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，回收液相对荧光强度测定值组内及组间变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)，判断将ATP生物荧光分析法应用于陶瓷抗真菌性能测试的重现性；规定组内及组间变异系数C·V≤10％；
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(21)、(22)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液相对荧光强度测定值的算术平均值 及分别按照公式(23)、(24)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
每组0h接触的5件对照样品、5件抗菌样品以及经24h或48h培养后的5件对照样品、5件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(25)和(26)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
3组0h接触的15件对照样品、15件抗菌样品以及经24h或48h培养后的15件对照样品、15件抗菌样品，其回收液的相对荧光强度测定值的标准偏差 及分别按照公式(27)和(28)计算(样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3,4,5；ATP测试平行样编号k＝1,2,3；式中和分别为每组对照样品和抗菌样品经0h接触及24h或48h培养后，各平行样的相对荧光强度测定值)：
10.根据权利要求1所述的抗菌陶瓷抗真菌性能的检测方法，其特征在于，所述的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如采用抗菌率R作为相关性能评价指标：当Rij/Ri/R＜80％时，样品无抗真菌作用；当80％≤Rij/Ri/R＜90％时，样品具有抗真菌作用；当90％≤Rij/Ri/R＜99％时，样品抗真菌作用适中；当99％≤Rij/Ri/R＜99.9％时，样品抗真菌作用较强；当Rij/Ri/R≥99.9％时，样品抗真菌作用极强；
如采用抗菌活性值A作为相关性能评价指标：当Aij/Ai/A＜0.5时，样品无抗真菌作用；当0.5≤Aij/Ai/A＜1.0时，样品具有抗真菌作用；当1.0≤Aij/Ai/A＜2.0时，样品抗真菌作用适中；当2.0≤Aij/Ai/A＜3.0时，样品抗真菌作用较强；当Aij/Ai/A≥3.0时，样品抗真菌作用极强；
(2)当某组(件)抗菌陶瓷样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗真菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组抗菌陶瓷样品抗真菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌陶瓷样品抗真菌性能的评价结果。
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