CN116626001B - 一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面吸附率的方法，属于煤层气生物工程技术领域。将硫酸盐还原菌SRB培养至对数生长期，将培养好的SRB菌液置于厌氧环境，采用正交试验设计法优化荧光分光光度计的测试体系，然后将制备好的样品置于密闭比色皿，采用荧光分光光度计测定荧光强度，通过SRB菌株标准曲线、生长曲线和在褐煤表面吸附率的测定进行方法验证。其避免了环境中氧气对厌氧微生物的损害，解决了煤微细颗粒干扰吸附测定的问题，提高了样品测量的特异性和准确度，实现了使用荧光分光光度法快速测定硫酸盐还原菌对煤的吸附率，具有操作简单、快速、准确的优点，具有广泛的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，属于煤层气生物工程技术领域。
背景技术
煤层气生物工程技术是通过往煤层中注入激活剂或者微生物来产生以甲烷为主要成分的气体的生物增采技术，具有很好的应用前景。煤的生物产气环境中，微生物为了从煤中获取能源底物会选择性吸附到煤表面形成生物膜，其吸附成膜是微生物启动煤厌氧降解产气的先决条件，也是煤厌氧降解产气过程中的关键环节，通过调控微生物在煤表面的吸附率，可以促进煤的生物产气量。
硫酸盐还原菌是煤厌氧降解产气体系中重要的功能微生物种群，在煤厌氧降解生物产气前可以在煤表面形成生物膜，改变煤的表面性质，影响煤表面有机成分含量及物质结构，为体系中其他产甲烷功能菌提供丰富的前体物质，在产气体系中发挥关键作用。改变煤表面吸附微生物的数量，可以影响煤的厌氧降解产气效率。因此，如何快速准确测定微生物在煤表面的吸附率对了解煤表面生物膜的形成过程，强化煤层气的产生效率具有重要意义。
目前表征微生物在矿物表面吸附的方法有比浊法、茚三酮比色法，分光光度计法等，这些方法主要用来检测好氧微生物在矿物表面的吸附。而煤生物厌氧降解产气体系中的微生物均是厌氧微生物，对氧气敏感，并且煤经微生物厌氧降解后会形成微米级的煤颗粒，这会对传统的测定好氧微生物在矿物表面吸附率的方法造成干扰。所以，需要开发一种能适合测定厌氧微生物如硫酸盐还原菌在煤表面吸附率的方法。
通过特异性的荧光染料与微生物结合可避免煤颗粒对吸光度的干扰。但是，荧光测定体系的准确度会受到多种因素影响，为了提高其准确度，需要开发出合适的测试体系。
为了解决测定厌氧微生物硫酸盐还原菌在煤表面吸附率问题，本发明通过正交试验法优化了荧光分光光度法的测试体系，通过SRB菌株标准曲线、生长曲线和在褐煤表面吸附率的测定进行方法验证，表明该方法具有特异性强、准确度和精密度都较高的优点。
发明内容
针对现有技术的不足之处，提供一种具有特异性强、准确度和精密度都较高优点的基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，通过厌氧环境下制备样品减少氧气对微生物的损害，采用正交实验法对荧光测试体系进行优化提高准确度，通过建立荧光强度与细胞量的关系来计算吸附率，适合测定厌氧微生物在煤表面的吸附率，为解决煤厌氧降解生物产气体系中调控微生物的吸附率来强化产气提供方法支持。
为实现上述技术目的，本发明的一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面吸附率的方法，步骤如下：
步骤1、用改良的Postgate培养基将硫酸盐还原菌SRB培养至对数生长期，得到SRB培养液；
步骤2、综合考虑试验控制参数对荧光分光强度的影响，根据实际需要确定各因素的水平数；设计正交试验控制的各因素的水平数包括：菌液量、荧光染料用量、表面活性剂添加量和染色时间；荧光染料为吖啶橙，表面活性剂为十二烷基磺酸钠；
步骤3、根据步骤2中确定的各因素的水平数来选择对应的正交表，正交表为根据正交原理设计的已规范化的表格；由于荧光强度值反映了SRB在煤表面的吸附程度，因此以荧光强度值作为正交试验的分析指标；
步骤4、根据步骤3中选择的正交表进行正交试验，根据正交表中规定的各因素水平组合得到不同的实验组进行试验，并使用荧光分光光度计检测各实验组的荧光强度值；
步骤5、对步骤4中检测得到的荧光强度值按步骤3中所选择的正交表进行分析，确定各因素对正交试验结果影响的大小和最佳因素水平组合，最佳因素水平组合即为使用荧光分光光度计测定SRB荧光强度值的最佳试验参数；
步骤6、对步骤5中获取的最佳试验参数进行验证，通过在最佳正交试验参数条件下绘制SRB生长过程中细菌浓度与荧光强度随时间的变化曲线，验证在最佳正交试验参数下以荧光强度计算SRB浓度的准确性，将步骤1中对数生长期的SRB培养液按照10％接种量接种到新的厌氧培养瓶中进行培养，每隔24h取出1.5mL样品，共取10次，按照步骤5中确定的最佳正交试验参数测定所有样品中SRB的荧光强度，同时用血细胞计数板法计数分析取出的所有样品中SRB的细胞浓度；以时间为横坐标，菌体浓度和荧光强度为纵坐标，在同一坐标轴内建立荧光强度随时间变化曲线及SRB的细胞浓度随时间变化的生长曲线，直观反映荧光强度与SRB的细胞浓度变化的对应关系；
步骤7、绘制荧光强度值随SRB细胞浓度变化的标准曲线：取步骤1中对数生长期的SRB培养液9份，体积分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用无菌水定容到5mL，根据步骤5中获取的最佳试验参数测定9个样品的荧光强度，同时用血细胞计数板法计数分析培养液中SRB的细胞浓度，根据这9个样品的SRB细胞浓度及对应的荧光强度值绘制出SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线，并计算出标准曲线的拟合公式；
步骤8、根据步骤5中获取的最佳试验参数，测定对数生长期SRB培养液的初始荧光强度值，在厌氧环境中向厌氧培养瓶空瓶中加入对数生长期的SRB培养液，并加入经过破碎、烘干的煤颗粒样品，混合均匀，煤颗粒样品和SRB细胞液样品的添加比例为1/25g/mL；
步骤9、将装有SRB培养液和煤颗粒样品的厌氧培养瓶放入恒温水浴振荡器中；恒温水浴振荡器的转速设定120rpm、温度设定30℃；每隔10min从恒温水浴振荡器中取1.5mL溶液在厌氧环境中静置5min，总共取9次，根据步骤5中确定的最佳试验参数，利用荧光分光光度计测定9次不同样品的荧光强度值，根据步骤7中得到的SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线的拟合公式计算细胞浓度，根据细胞浓度变化量计算SRB的吸附率。
进一步，硫酸盐还原菌培养液为使用改良的Postgate培养基培养的含硫酸盐还原菌的菌液；改良的Postgate培养基配方为：每1L去离子水中加入1.0g NH4Cl、0.5g Na2SO4、0.5gKH2PO4、0.1g CaCl2·2H2O、2.0g MgSO4·7H2O、4.0g的60％乳酸钠、1.0g酵母提取物混合构成。
进一步，硫酸盐还原菌使用的改良的Postgate培养基配置完成后用浓度为1mol/L的HCl或NaOH调节pH值至7.0-7.2；在每1L培养基中加入1.2g半胱氨酸盐酸盐保持改良的Postgate培养基的还原态，1mL质量分数为0.1％的刃天青钠溶液作为氧化还原指示剂；培养基使用高压灭菌锅于121℃下灭菌20min。
进一步，测定SRB培养液荧光值时使用密闭比色皿，为带塞石英荧光比色皿。
进一步，对利用荧光分光光度法测定SRB在煤表面吸附率的方法进行试验参数优化：利用正交表考察了四个因素对荧光强度的影响，四个因素分别为：菌液用量、十二烷基磺酸钠用量、吖啶橙用量、染色时间，因素水平设置为菌液用量0.5mL、1mL、1.5mL，十二烷基磺酸钠用量0.6mL、0.8mL、1mL，吖啶橙用量0.6mL、0.8mL、1mL，染色时间10min、15min、20min。
进一步，染色结束后将染色液转移到密闭比色皿中，使用荧光分光光度计测定荧光强度。
进一步，煤样颗粒的粒径为0.080mm～0.200mm，通过将煤样破碎后过80目和190目标准分样筛即可得到。
进一步，步骤6、7、8、9中荧光分光光度法测定条件与步骤5中确定的最佳试验参数条件相同。
进一步，步骤7中得到的SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线的拟合公式为正比例函数，因此根据菌体浓度-荧光强度标准曲线计算细胞浓度从而计算吸附率，计算公式为：
Q为吸附率，n0为吸附前菌悬液的荧光强度，n为吸附后菌悬液荧光强度。
与现有技术相比，本发明具有下列特点和有益效果：
本方法通过在厌氧环境下对待测样品进行处理，使用荧光分光光度法并控制吖啶橙与十二烷基磺酸钠用量对硫酸盐还原菌的荧光值进行测定。通过使用密闭比色皿可以保持在检测过程中的厌氧环境，维持厌氧菌活性，结合血细胞计数板法绘制标准曲线，可实现硫酸盐还原菌在煤表面吸附率的快速测定。该方法可实现对厌氧环境中微生物数量的快速检测，并保持微生物活性，适用于多种类型的厌氧微生物，具有操作简便、快速、准确等优点。
附图说明
图1.为本发明中SRB的细胞浓度和荧光强度随时间的变化曲线示意图；
图2为本发明中以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌培养体系中菌液浓度的标准曲线；
其中R2＝0.90455为线性相关系数的平方，以菌体浓度(107个/mL)为纵坐标，以荧光强度为横坐标；
图3为本发明中硫酸盐还原菌在白音华褐煤表面吸附率随时间变化关系图。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步描述；下面给出的实施例拟以对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明的内容是：一种以荧光分光光度法测定厌氧环境下硫酸盐还原菌(sulfatereducing bacteria,SRB)在煤表面吸附率的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)用改良的Postgate培养基将硫酸盐还原菌培养至对数生长期，用无菌一次性针筒取出硫酸盐还原菌菌液，采用显微计数法分析细胞的初始浓度，
(2)为优化荧光测试体系，采用正交试验法优化四个主要影响因素(菌液用量、十二烷基磺酸钠用量、吖啶橙用量、染色时间)的水平取值，因素水平设置为菌液用量0.5mL、1mL、1.5mL，十二烷基磺酸钠用量0.6mL、0.8mL、1mL，吖啶橙用量0.6mL、0.8mL、1mL，染色时间10min、15min、20min，得到的最佳条件组合为菌液用量1.5mL、十二烷基磺酸钠用量0.6mL、吖啶橙用量0.8mL、染色时间10min。因素水平表如表1所示。
表1.正交试验因素水平表
(3)根菌所选取的因素和水平，确定试验的正交试验方案和结果如表2所示。
表2.正交试验结果
(4)正交试验的结果分析表如表3所示。
表3.正交试验方差分析表
(5)由表2可知，荧光分光光度计法快速测定活菌数的最佳条件组合为A3B1C2D1，即菌液用量1.5mL、十二烷基磺酸钠用量0.6mL、吖啶橙用量0.8mL、染色时间10min，各因素对荧光强度影响主次顺序为：十二烷基磺酸钠﹥吖啶橙﹥时间﹥菌液。由表3的方差分析结果进一步可以看出十二烷基磺酸钠和吖啶橙对测定效果影响显著。
(6)在厌氧手套箱中，将对数生长期的SRB培养液按照10％接种量接种到新的厌氧培养瓶中，接种完成后进行SRB细胞培养，每隔24h取出1.5mL样品，按照步骤7中最优条件测定样品中细胞的荧光强度；同时用血细胞计数板法计数分析培养液中SRB的细胞浓度；以时间为横坐标，菌体浓度和荧光强度为纵坐标，在同一坐标轴内建立荧光强度随时间变化曲线及SRB细胞浓度随时间变化的生长曲线，验证荧光强度与细胞浓度变化的对应关系。
(7)在厌氧手套箱中，取0.5～1.5mL培养至对数生长期的SRB菌液于试管中，使用无菌水进行稀释得到不同浓度的母液，终体积为5mL。
(8)在厌氧手套箱中，取1.5mL步骤(6)中硫酸盐还原菌稀释液，使用密闭比色皿按照(5)中测试体系测定菌液荧光强度。同时，利用血细胞计数板法计算菌体浓度，绘制菌体浓度-荧光强度标准曲线。
(9)硫酸盐还原菌培养液离心后弃去上清液，用100mL无菌水重悬菌体，测定初始荧光值。用研磨机破碎得到粒径为0.080mm～0.200mm的煤样，烘干。在厌氧手套箱中，将煤样与50mL硫酸盐还原菌重悬液加入厌氧培养瓶。
(10)在120rpm、30℃恒温水浴振荡器中进行吸附实验。每隔10min取2mL反应液，在厌氧手套箱中静置，取上清液1.5mL使用(5)中最最优体系测定荧光强度，按照(8)中方法得到细胞量，根据溶液体系中细胞量的变化情况计算吸附率。
其中，步骤(1)中硫酸盐还原菌培养液为使用改良的Postgate培养基培养的含硫酸盐还原菌的菌液。
步骤(1)中硫酸盐还原菌使用的改良的Postgate培养基配置完成后用HCl和NaOH调节pH值至7.0-7.2。在每1L培养基中需加入1.2g半胱氨酸盐保持培养基的还原态，使用1mL刃天青钠作为氧化还原指示剂。
步骤(2)中密闭比色皿为带塞石英荧光比色皿。
步骤(2)中荧光分光光度法的测试方法为：吸取菌液1.5mL于开口容器中(如小烧杯)，依次加入十二烷基磺酸钠0.6mL、吖啶橙0.8mL，磷酸盐缓冲溶液定容到4.0mL。加入吖啶橙的同时开始计时，染色时间10min，染色过程中，不断震荡溶液并保持避光。染色结束后，立即取0.5mL溶液用0.22μm滤膜减压过滤，随后用3mL无菌水将滤膜上的菌体清洗下来，转移到密闭比色皿中，使用荧光分光光度计测定534nm处荧光强度。
步骤(3)中，煤样破碎后使用80目和190目标准分样筛筛选即得到粒径为0.080mm～0.200mm的煤样。
步骤(4)中，反应液即含有硫酸盐还原菌与煤样的待测溶液。
步骤(4)中，荧光分光光度法测定条件与步骤(2)中相同。根据标准曲线可计算菌液浓度，故吸附率的计算可用下式：
Q为吸附率，n0为吸附前菌悬液的荧光强度，n为吸附后菌悬液荧光强度。
试剂及配置步骤为：
1)改良的Postgate培养基(临时配置并灭菌)
具体配方为：NH4Cl 1.0g/L、Na2SO4 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、MgSO4·7H2O 2.0g/L、60％乳酸钠4.0g/L、酵母提取物1.0g/L。
2)调节pH值所用HCl与NaOH均为1mol/L
3)半胱氨酸盐添加量：1.2g/L
4)刃天青钠指示剂：1g/L
准确称取0.010g刃天青钠粉末于小烧杯中，用少量纯水溶解，无损失的转移至10mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，配制好后4℃避光保存。
4)1×10-4mol/L吖啶橙溶液
购自上海生工：准确称取0.0265g吖啶橙于小烧杯中，用少量纯水溶解，无损失的转移至1000mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，配置好后4℃避光保存。
5)1％十二烷基磺酸钠溶液
购自上海生工：准确称取1g十二烷基磺酸钠于小烧杯中，用少量纯水溶解，无损失的转移至100mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，配置好后常温避光保存。
6)磷酸盐缓冲溶液(已过滤除菌)
配置所用的装置：YQX-Ⅱ型厌氧手套箱，F-2700型荧光分光光度计，3.5mL石英荧光带塞比色皿，FW100研磨机。
实施例1
在厌氧手套箱中，取0.5～4.5mL硫酸盐还原菌培养液于试管中，使用无菌水进行稀释，终体积为5mL。取1.5mL硫酸盐还原菌稀释液，根据荧光分光光度法，使用密闭比色皿测定菌液荧光强度。同时，利用血细胞计数板法计算菌体浓度，绘制菌体浓度-荧光强度标准曲线。为硫酸盐还原菌浓度-荧光强度标准曲线，菌体浓度与荧光强度呈正相关性，如图1所示。将培养至对数生长期后期的硫酸盐还原菌培养液在10000rpm、4℃离心10min，弃上清液，用100mL无菌水将菌体重悬，再用荧光分光光度法测定荧光强度。用研磨机将白音华褐煤破碎后，过80目和190目标准分样筛，取中间粒径(0.080mm～0.200mm)的煤样70℃烘干备用。在100mL厌氧瓶中先加入2g烘干后的煤样，然后加入50mL菌悬液，在120rpm、30℃恒温水浴振荡器中进行吸附实验。每隔固定时间取2mL反应液，静置后取上清液测定荧光强度，并计算吸附率。硫酸盐还原菌在白音华褐煤表面吸附率随时间变化关系图，如图2所示，60min后硫酸盐还原菌在煤表面吸附达到饱和状态，吸附率为55％，如图3所示。
实施例2
在厌氧手套箱中，取0.5～4.5mL硫酸盐还原菌培养液于试管中，使用无菌水进行稀释，终体积为5mL。取1.5mL硫酸盐还原菌稀释液，根据荧光分光光度法，使用密闭比色皿测定菌液荧光强度。同时，利用血细胞计数板法计算菌体浓度，绘制菌体浓度-荧光强度标准曲线。将培养至对数生长期后期的硫酸盐还原菌培养液在10000rpm、4℃离心10min，弃上清液，用100mL无菌水将菌体重悬，再用荧光分光光度法测定荧光强度。用研磨机将蒙东褐煤破碎后，过80目和190目标准分样筛，取中间粒径(0.080mm～0.200mm)的煤样70℃烘干备用。在100mL厌氧瓶中先加入2g烘干后的煤样，然后加入50mL菌悬液，在120rpm、30℃恒温水浴振荡器中进行吸附实验。每隔固定时间取2mL反应液，静置后取上清液测定荧光强度，并计算吸附率。标准曲线与吸附曲线同上述实施例，省略。
在厌氧手套箱中，取0.5～4.5mL硫酸盐还原菌培养液于试管中，使用无菌水进行稀释，终体积为5mL。取1.5mL硫酸盐还原菌稀释液，根据荧光分光光度法，使用密闭比色皿测定菌液荧光强度。同时，利用血细胞计数板法计算菌体浓度，绘制菌体浓度-荧光强度标准曲线。将培养至对数生长期后期的硫酸盐还原菌培养液在10000rpm、4℃离心10min，弃上清液，用100mL无菌水将菌体重悬，再用荧光分光光度法测定荧光强度。用研磨机将胜利5号褐煤破碎后，过80目和190目标准分样筛，取中间粒径(0.080mm～0.200mm)的煤样70℃烘干备用。在100mL厌氧瓶中先加入2g烘干后的煤样，然后加入50mL菌悬液，在120rpm、30℃恒温水浴振荡器中进行吸附实验。每隔固定时间取2mL反应液，静置后取上清液测定荧光强度，并计算吸附率。标准曲线与吸附曲线同上述实施例，省略。
在厌氧手套箱中，取0.5～4.5mL硫酸盐还原菌培养液于试管中，使用无菌水进行稀释，终体积为5mL。取1.5mL硫酸盐还原菌稀释液，根据荧光分光光度法，使用密闭比色皿测定菌液荧光强度。同时，利用血细胞计数板法计算菌体浓度，绘制菌体浓度-荧光强度标准曲线。将培养至对数生长期后期的硫酸盐还原菌培养液在10000rpm、4℃离心10min，弃上清液，用100mL无菌水将菌体重悬，再用荧光分光光度法测定荧光强度。用研磨机将胜利6号褐煤破碎后，过80目和190目标准分样筛，取中间粒径(0.080mm～0.200mm)的煤样70℃烘干备用。在100mL厌氧瓶中先加入2g烘干后的煤样，然后加入50mL菌悬液，在120rpm、30℃恒温水浴振荡器中进行吸附实验。每隔固定时间取2mL反应液，静置后取上清液测定荧光强度，并计算吸附率。标准曲线与吸附曲线同上述实施例，省略。
Claims (9)
1.一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面吸附率的方法，其特征步骤如下：
步骤1、用改良的Postgate培养基将硫酸盐还原菌SRB培养至对数生长期，得到SRB培养液；
步骤2、综合考虑试验控制参数对荧光分光强度的影响，根据实际需要确定各因素的水平数；设计正交试验控制的各因素的水平数包括：菌液量、荧光染料用量、表面活性剂添加量和染色时间；荧光染料为吖啶橙，表面活性剂为十二烷基磺酸钠；
步骤3、根据步骤2中确定的各因素的水平数来选择对应的正交表，正交表为根据正交原理设计的已规范化的表格；由于荧光强度值反映了SRB在煤表面的吸附程度，因此以荧光强度值作为正交试验的分析指标；
步骤4、根据步骤3中选择的正交表进行正交试验，根据正交表中规定的各因素水平组合得到不同的实验组进行试验，并使用荧光分光光度计检测各实验组的荧光强度值；
步骤5、对步骤4中检测得到的荧光强度值按步骤3中所选择的正交表进行分析，确定各因素对正交试验结果影响的大小和最佳因素水平组合，最佳因素水平组合即为使用荧光分光光度计测定SRB荧光强度值的最佳试验参数；
步骤6、对步骤5中获取的最佳试验参数进行验证，通过在最佳正交试验参数条件下绘制SRB生长过程中细菌浓度与荧光强度随时间的变化曲线，验证在最佳正交试验参数下以荧光强度计算SRB浓度的准确性，将步骤1中对数生长期的SRB培养液按照10％接种量接种到新的厌氧培养瓶中进行培养，每隔24h取出1.5mL样品，共取10次，按照步骤5中确定的最佳正交试验参数测定所有样品中SRB的荧光强度，同时用血细胞计数板法计数分析取出的所有样品中SRB的细胞浓度；以时间为横坐标，菌体浓度和荧光强度为纵坐标，在同一坐标轴内建立荧光强度随时间变化曲线及SRB的细胞浓度随时间变化的生长曲线，直观反映荧光强度与SRB的细胞浓度变化的对应关系；
步骤7、绘制荧光强度值随SRB细胞浓度变化的标准曲线：取步骤1中对数生长期的SRB培养液9份，体积分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用无菌水定容到5mL，根据步骤5中获取的最佳试验参数测定9个样品的荧光强度，同时用血细胞计数板法计数分析培养液中SRB的细胞浓度，根据这9个样品的SRB细胞浓度及对应的荧光强度值绘制出SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线，并计算出标准曲线的拟合公式；
步骤8、根据步骤5中获取的最佳试验参数，测定对数生长期SRB培养液的初始荧光强度值，在厌氧环境中向厌氧培养瓶空瓶中加入对数生长期的SRB培养液，并加入经过破碎、烘干的煤颗粒样品，混合均匀，煤颗粒样品和SRB细胞液样品的添加比例为1/25g/mL；
步骤9、将装有SRB培养液和煤颗粒样品的厌氧培养瓶放入恒温水浴振荡器中；恒温水浴振荡器的转速设定120rpm、温度设定30℃；每隔10min从恒温水浴振荡器中取1.5mL溶液在厌氧环境中静置5min，总共取9次，根据步骤5中确定的最佳试验参数，利用荧光分光光度计测定9次不同样品的荧光强度值，根据步骤7中得到的SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线的拟合公式计算细胞浓度，根据细胞浓度变化量计算SRB的吸附率。
2.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：硫酸盐还原菌培养液为使用改良的Postgate培养基培养的含硫酸盐还原菌的菌液；改良的Postgate培养基配方为：每1L去离子水中加入1.0g NH4Cl、0.5gNa2SO4、0.5g KH2PO4、0.1g CaCl2·2H2O、2.0g MgSO4·7H2O、4.0g的60％乳酸钠、1.0g酵母提取物混合构成。
3.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：硫酸盐还原菌使用的改良的Postgate培养基配置完成后用浓度为1mol/L的HCl或NaOH调节pH值至7.0-7.2；在每1L培养基中加入1.2g半胱氨酸盐酸盐保持改良的Postgate培养基的还原态，1mL质量分数为0.1％的刃天青钠溶液作为氧化还原指示剂；培养基使用高压灭菌锅于121℃下灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：测定SRB培养液荧光值时使用密闭比色皿，为带塞石英荧光比色皿。
5.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：对利用荧光分光光度法测定SRB在煤表面吸附率的方法进行试验参数优化：利用正交表考察了四个因素对荧光强度的影响，四个因素分别为：菌液用量、十二烷基磺酸钠用量、吖啶橙用量、染色时间，因素水平设置为菌液用量0.5mL、1mL、1.5mL，十二烷基磺酸钠用量0.6mL、0.8mL、1mL，吖啶橙用量0.6mL、0.8mL、1mL，染色时间10min、15min、20min。
6.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：染色结束后将染色液转移到密闭比色皿中，使用荧光分光光度计测定荧光强度。
7.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：煤颗粒样品的粒径为0.080mm～0.200mm，通过将煤样破碎后过80目和190目标准筛即可得到。
8.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：步骤6、7、8、9中荧光分光光度法测定条件与步骤5中确定的最佳试验参数条件相同。
9.根据权利要求1所述的一种以荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法，其特征在于：步骤7中得到的SRB细胞浓度与荧光强度值的标准曲线的拟合公式为正比例函数，因此根据菌体浓度-荧光强度标准曲线计算细胞浓度从而计算吸附率，计算公式为：
Q为吸附率，n0为吸附前菌悬液的荧光强度，n为吸附后菌悬液荧光强度。
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