CN106755269A - 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法 - Google Patents

一种煤地质微生物形态和数量的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106755269A
CN106755269A CN201611133359.1A CN201611133359A CN106755269A CN 106755269 A CN106755269 A CN 106755269A CN 201611133359 A CN201611133359 A CN 201611133359A CN 106755269 A CN106755269 A CN 106755269A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coal
sample
bottle
geomicrobiology
sampling
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611133359.1A
Other languages
English (en)
Inventor
赵娜
王江泽
韩作颖
谭凯丽
宋燕莉
赵晗
郭鑫
牛江露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANXI LANYAN COALBED METHANE GROUP CO Ltd
Easy Peace Blue-Flame Coal And Coal Bed Gas Gong Cai Technology Co Ltd
Original Assignee
SHANXI LANYAN COALBED METHANE GROUP CO Ltd
Easy Peace Blue-Flame Coal And Coal Bed Gas Gong Cai Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANXI LANYAN COALBED METHANE GROUP CO Ltd, Easy Peace Blue-Flame Coal And Coal Bed Gas Gong Cai Technology Co Ltd filed Critical SHANXI LANYAN COALBED METHANE GROUP CO Ltd
Priority to CN201611133359.1A priority Critical patent/CN106755269A/zh
Publication of CN106755269A publication Critical patent/CN106755269A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/64—Geomicrobiological testing, e.g. for petroleum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Paleontology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及一种微生物检测方法，具体属于一种煤地质微生物形态和数量的检测方法。解决煤地质微生物厌氧取样技术手段无法完全避免掺入杂质，对微生物样品观察检测造成干扰，难以区分样品杂质和微生物菌体等问题，包括如下步骤：1）煤样或水样采集,2）微生物菌体的收集,3）菌体前处理：（4）荧光显微镜分析,（5）微生物形态分析，（6）微生物数量分析。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物形态和数量的分析。

Description

一种煤地质微生物形态和数量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种微生物检测方法，具体属于一种煤地质微生物形态和数量的检测方法。
背景技术
目前，在煤地质微生物形态观察和数量研究方面，多采用直接观察法和MPN计数法，该方法难以避免杂质的影响，同时，很多煤地质微生物不可培养，无法用MPN计数法计算数量，且不准确。不能真实反映微生物的形态和数量及其活性。使用荧光显微镜进行微生物数量和大小的观察计算是本领域的常用方法之一。主要操作方法是对微生物进行荧光染色，然后再利用荧光显微镜在一定波长下照射使其发光，然后进行计数。例如量取一定量的水样（1毫升），用吖啶橙（4-7滴）染色（3-5分钟），抽滤，将滤膜放置于荧光显微镜下检测，对所拍照片进行直接计数。对于普通的微生物，这种操作办法效果很好。但是对于长期存在于煤矿中的微生物，绝大多数都为厌氧微生物，在采样过程中要绝对避免接触氧气和其他环境，否则会引起这些厌氧微生物大量消失以及混入其他微生物，从而影响计数准确性。
发明内容
本发明为解决煤地质微生物厌氧取样技术手段无法完全避免掺入杂质，对微生物样品观察检测造成干扰，难以区分样品杂质和微生物菌体等问题，提供一种煤地质微生物形态和数量的检测方法。
本发明的技术方案是，一种煤地质微生物形态和数量的检测方法，包括如下步骤：
1）煤样或水样采集,
2）微生物菌体的收集,
3）菌体前处理：厌氧条件下，将备用滤膜上菌体，用去氧无菌水洗下来，制成菌悬液。根据观察目的不同，加入特定荧光染色剂（DAPI），低速震荡培养，待染色剂与微生物反应,
（4）荧光显微镜分析：将反应好的微生物样品，适量滴在载玻片上，进行镜检,
（5）微生物形态分析：使用Image pro Plus软件测量菌体大小体积,
（6）微生物数量分析：将制备好的染色菌液，取适量滴入细胞计数板内，在荧光显微镜下镜检，统计计算出数量。
本发明通过水样或煤样的隔绝氧气的采集等加工手段，能够确保煤矿中的煤样或水样中的厌氧微生物不被破坏，且不混入地面的杂菌，因而能明显观察出样品中微生物的菌体形态，准确测量出其大小，较精确计算出其数量，在研究煤地质微生物菌体形态数量中有明显的优越性。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物形态和数量的分析。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程图；
图2为水样采样瓶的构造；
图3为煤样采样罐的构造；
图4为抽滤装置构造；
图中：1-出气液管、2-进气液管、3-瓶体、4-还原剂、5-瓶底、6-出气口、7-催化剂、8-罐盖、9-罐体、10-进气口一、11-进气口二、12-待滤样品瓶、13-夹子、14-联通器、15-锥形废液瓶、16-抽气口、17-微孔滤膜。
具体实施方式
如图1所示意，一种煤地质微生物形态和数量的检测方法，包括如下步骤：
1）煤样或水样采集,
2）微生物菌体的收集,
3）菌体前处理：厌氧条件下，将备用滤膜上菌体，用去氧无菌水洗下来，制成菌悬液。根据观察目的不同，加入荧光染色剂DAPI（即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。），低速震荡培养，待染色剂与微生物反应,
（4）荧光显微镜分析：将反应好的微生物样品，适量滴在载玻片上，进行镜检,
（5）微生物形态分析：使用Image pro Plus软件测量菌体大小体积,
（6）微生物数量分析：将制备好的染色菌液，取适量滴入细胞计数板内，在荧光显微镜下镜检，统计计算出数量。
所述步骤（1）中，
水样采集过程，使用水样取样瓶，取样前将取样瓶进行高温高压灭菌，在无菌工作台内，用氮气置换瓶体内空气，将配制好的新鲜还原剂溶液（还原剂为L-半胱氨酸和或碳酸氢钠）装入底部，然后从进液口灌入水样，将水样与还原剂混匀，取回待用。
煤样采样过程：使用煤样取样罐，取样前将取样罐进行高温高压灭菌，将催化剂钯粒装在罐盖底部（催化剂钯粒是干性的，可将罐体内残留少量空气催化成厌氧气体，催化剂的种类名称），从进气口一通入氮气置换罐体内空气，从下至上，能充分置换气体，取样时，将煤样装入罐体内，盖好罐盖，再通入氮气充分置换罐体，取回待用。
如图2所示意，所述的水样取样瓶构造是，瓶体3，瓶体3上口封闭，瓶体3下设有可拆卸的还原剂瓶底5，在瓶口处设有进气液管2和出气液管1，所述的进气液管2下口比出气液管1下口低。
使用方法：用氮气从置换瓶体内空气，从进气液管2送入氮气，使瓶内空气从出气液管1排出，完成置换过程。
将配制好的新鲜还原剂溶液装入底部。取样时从进液口灌入水样，将水样与还原剂混匀，取回待用。使用结束后打开还原剂瓶底5，将还原剂取出即可。
如图3所示意，所述的煤样取样罐的构造是，罐体9，罐体下方设有进气口10一，罐体9上方设有罐盖8，罐盖8内装有催化剂7，穿过罐盖8设有出气口6。
使用方法：将催化剂7装在罐盖8底部（催化剂是干性的，可将罐体内残留少量空气催化成厌氧气体），从下部的进气口一10缓慢通入氮气置换罐体内空气，从下至上，能充分置换气体。取样时，将煤样装入罐体9内，盖好罐盖8，再通入氮气充分置换罐体9，取回待用。使用时取少量煤样后，按照上述方法通入氮气，可保证剩余煤样依然保持厌氧状态，继续使用。
所述的步骤（2）微生物菌体的收集方法,具体如下
操作前进行高温高压灭菌，在超净工作台内，放好微孔滤膜，进气口二连接氮气阀，真空连接好，对过滤装置进行预抽过程，使得整个装置充满氮气，保持厌氧环境，预抽后，加入待滤样，进气口二依然连接氮气阀，开始抽滤工作，完毕后取微孔滤膜待用。
所述待滤样为采集到的水体菌水样，
所述的待滤样为采集到的煤体菌水样，制备方法是采集到的煤样在厌氧条件下，研磨细，加入去氧无菌水，震荡摇匀，静置，取上清液。
如图4所示意，所述收集装置的构造，锥形废液瓶15，联通器14，待滤样品瓶12，待滤样品瓶12和锥形废液瓶15通过联通器14连接，在联通器14一侧设有抽气口16，在待滤样品瓶12上方设有进气口二11，在待滤样品瓶12和联通器14之间设有微孔滤膜17，并且通过夹子13固定。

Claims (8)

1.一种煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是包括如下步骤：
1）煤样或水样采集，
2）微生物菌体的收集，
3）菌体前处理：厌氧条件下，将备用滤膜上菌体，用去氧无菌水洗下来，制成菌悬液，
根据观察目的不同，加入荧光染色剂DAPI（即4',6-二脒基-2-苯基吲哚），低速震荡培养，待染色剂与微生物反应，
（4）荧光显微镜分析：将反应好的微生物样品，适量滴在载玻片上，进行镜检，
（5）微生物形态分析：使用Image pro Plus软件测量菌体大小体积，
（6）微生物数量分析：将制备好的染色菌液，取适量滴入细胞计数板内，在荧光显微镜下镜检，统计计算出数量。
2.根据权利要求1所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是所述步骤（1）中，
水样采集过程，使用水样取样瓶，取样前将取样瓶进行高温高压灭菌，在无菌工作台内，用氮气置换瓶体内空气，将配制好的新鲜还原剂溶液装入底部，然后从进液口灌入水样，将水样与还原剂混匀，取回待用，
煤样采样过程：使用煤样取样罐，取样前将取样罐进行高温高压灭菌，将催化剂装在罐盖底部，从进气口一通入氮气置换罐体内空气，从下至上，能充分置换气体，取样时，将煤样装入罐体内，盖好罐盖，再通入氮气充分置换罐体，取回待用。
3.根据权利要求2所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是，所述的水样取样瓶构造是，瓶体（3），瓶体（3）上口封闭，瓶体（3）下设有可拆卸的还原剂瓶底（5），在瓶口处设有进气液管（2）和出气液管）（1），所述的进气液管（2）下口比出气液管（1）下口低。
4.根据权利要求2所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是所述的煤样取样罐的构造是，罐体（9），罐体（9）下方设有进气口一（10），罐体（9）上方设有罐盖（8），罐盖（8）内装有催化剂（7），穿过罐盖（8）设有出气口（6）。
5.根据权利要求1所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是，所述的步骤（2）微生物菌体的收集方法,具体如下
操作前进行高温高压灭菌，在超净工作台内，放好微孔滤膜，进气口二连接氮气阀，真空连接好，对过滤装置进行预抽过程，使得整个装置充满氮气，保持厌氧环境，预抽后，加入待滤样，进气口依然连接氮气阀，开始抽滤工作，完毕后取微孔滤膜待用，
所述待滤样为采集到的水体菌水样；所述的待滤样为采集到的煤体菌水样，制备方法是采集到的煤样在厌氧条件下，研磨细，加入去氧无菌水，震荡摇匀，静置，取上清液。
6.根据权利要求5所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是，所述收集装置的构造，锥形废液瓶（15），联通器（14），待滤样品瓶（12），待滤样品瓶（12）和锥形废液瓶（15）通过联通器（14）连接，在联通器（14）一侧设有抽气口（16），在待滤样品瓶（12）上方设有进气口二（11），在待滤样品瓶（12）和联通器（14）之间设有微孔滤膜（17），并且通过夹子（13）固定。
7.根据权利要求2所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是还原剂为L-半胱氨酸和或碳酸氢钠。
8.根据权利要求2所述的煤地质微生物形态和数量的检测方法，其特征是催化剂为钯粒。
CN201611133359.1A 2016-12-10 2016-12-10 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法 Pending CN106755269A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611133359.1A CN106755269A (zh) 2016-12-10 2016-12-10 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611133359.1A CN106755269A (zh) 2016-12-10 2016-12-10 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106755269A true CN106755269A (zh) 2017-05-31

Family

ID=58875912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611133359.1A Pending CN106755269A (zh) 2016-12-10 2016-12-10 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106755269A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110404674A (zh) * 2019-08-08 2019-11-05 青岛新正锂业有限公司 一种锂电池正极材料中磁性物质的去除方法及检测方法
CN116626001A (zh) * 2023-05-24 2023-08-22 中国矿业大学 一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586406A (zh) * 2011-01-12 2012-07-18 中国科学院研究生院 一种煤层气田地下水微生物检测方法
CN103451089A (zh) * 2013-08-30 2013-12-18 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 煤层厌氧微生物培育与测定装置
CN103981259A (zh) * 2014-05-06 2014-08-13 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法
CN105802957A (zh) * 2016-05-30 2016-07-27 山西大学 一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法
CN205719633U (zh) * 2016-04-22 2016-11-23 易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司 井下微生物取样装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586406A (zh) * 2011-01-12 2012-07-18 中国科学院研究生院 一种煤层气田地下水微生物检测方法
CN103451089A (zh) * 2013-08-30 2013-12-18 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 煤层厌氧微生物培育与测定装置
CN103981259A (zh) * 2014-05-06 2014-08-13 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法
CN205719633U (zh) * 2016-04-22 2016-11-23 易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司 井下微生物取样装置
CN105802957A (zh) * 2016-05-30 2016-07-27 山西大学 一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张玉燕等: "伊犁盆地蒙其古尔铀矿床微生物作用与成矿关系研究", 《铀矿地质》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110404674A (zh) * 2019-08-08 2019-11-05 青岛新正锂业有限公司 一种锂电池正极材料中磁性物质的去除方法及检测方法
CN110404674B (zh) * 2019-08-08 2021-04-20 青岛新正锂业有限公司 一种锂电池正极材料中磁性物质的去除方法及检测方法
CN116626001A (zh) * 2023-05-24 2023-08-22 中国矿业大学 一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法
CN116626001B (zh) * 2023-05-24 2024-04-05 中国矿业大学 一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101819200B (zh) 微生物检测装置、检测方法、以及用于该装置的试样容器
CN102636545B (zh) 一种水质综合毒性生物预警装置
CN106520552B (zh) 一种细胞培养生物反应器
CN106755269A (zh) 一种煤地质微生物形态和数量的检测方法
CN108614091A (zh) 一种土壤重金属淋滤实验系统
CN208648879U (zh) 一体化mbr污水处理装置
CN102520154B (zh) 一种检测环境中二恶英类物质的方法
CN102243243A (zh) 一种新型的痰样本自动处理仪
JP3137396B2 (ja) サンプリング装置
CN101481651B (zh) 金属纳米材料毒性检测板及其检测方法
CN205981349U (zh) 一种测定集气袋中沼气体积的简易装置
CN202710513U (zh) 一种水质综合毒性生物预警装置
CN105510543A (zh) 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法
CN107447023A (zh) 一种荧光原位杂交联合流式细胞术检测污水处理系统中聚磷菌的方法
CN107523472A (zh) 抗菌和可循环利用的细胞捕获装置及其循环方法
CN206350950U (zh) 一种污水悬浮物多级模块化过滤装置
CN207567086U (zh) 一种非接触式连续生物淋滤赤泥的装置
CN202482329U (zh) 一种神经干细胞连续灌注培养系统
CN107034266A (zh) 用于检测伤口感染病原菌的引物组合及集成装置
CN204981852U (zh) 一种专用于大水面养殖塘口乳酸菌扩培和使用装置
CN210894389U (zh) 一种用于粪便标本检测的液路系统
CN107739836A (zh) 一种非接触式连续生物淋滤赤泥的装置及方法
CN113138261A (zh) 一种淡水河流水源污染检测方法
CN206863011U (zh) 一种肉类有害物检测装置
CN202676590U (zh) 一种含氰化物水质自动分析系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170531

RJ01 Rejection of invention patent application after publication