CN103981259A - 一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属地层水微生物研究领域，为解决现有对环境中微生物多样性的研究存在较大局限性，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分微生物种类等问题，提供一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法。包括煤层水样采集，富集水样中的微生物菌体及提取其总DNA，用特异性引物扩增16SrDNA高变区，通过Illumina测序平台进行测序分析，对测序的原始数据处理后，获得水样中微生物的多样性及丰度。本发明有效检测出样品中丰度低的物种，在煤层水中鉴定的菌种在属水平上多于400个属，在研究煤层水中的微生物种类及丰度中有明显的优越性。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物多样性和物种丰度分析。

Description

一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法

技术领域

本发明属于地层水微生物研究领域，具体为一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法。

背景技术

煤层气（Coalbed gas），俗称瓦斯，是成煤过程中生成、并以吸附和游离状态赋存于煤层及周岩的自储式天然气体，其中CH4的体积分数最高在95%以上。据2006年国家油气资源评价，我国埋深小于2000m的煤层气资源量达到36.81×1012 m³，与我国天然气的远景资源量基本相当。随着国民经济的快速增长，我国对能源的需求日益增多。煤层气作为非常规天然气，是我国天然气资源的重要补充来源。开发和利用煤层气资源，可减少或避免煤矿瓦斯灾害的发生，大幅度降低温室气体的排放，保护生态环境，具有重要的现实意义。

煤层气一般分为生物成因煤层气和热成因煤层气两类。生物成因煤层气是指在微生物作用下，煤中部分有机质转化为以甲烷为主要成分的气体。因此，研究煤层或煤层水中的微生物及其多样性，分析参与煤降解和成气过程中的微生物种类，有助于揭示生物成因煤层气的生成机理，也为煤层气的二次开发利用提供了理论依据。

传统上研究环境中微生物多样性的方法有很多，一般先对微生物进行培养，再通过分子生物学方法，如：末端限制性内切酶片段长度多样性（T-RFLP）、荧光原位杂交（FISH）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）等分析微生物群体的种类。这些技术共有的缺点是在进行检测时，需要样品的量较大，操作繁琐，费时费力，灵敏度低，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分的微生物种类。因此，在研究样品中微生物的多样性方面有很大的局限。而宏基因组学，是以特定生境中的整个微生物群落作为研究的对象，不需对微生物进行分离培养，采用新一代高通量测序技术直接对环境微生物总DNA进行研究，测序数据能很好的满足分析微生物群体物种多样性和物种丰度等要求。

申请号为201110005095.2的专利《一种煤层气田地下水微生物检测方法》通过样品采集、DNA 提取、16S rDNA文库构建以及DGGE 分析，从而对地下水微生物群落结构做出分析。该专利并未提供出具体的实施步骤，通过该种方法，检测出古菌只有产甲烷古菌，且仅有甲烷八叠球菌属和甲烷叶菌属两个属的产甲烷菌；细菌主要为硬壁菌门，变形杆菌门和拟杆菌门。仅揭示出样品中很少一部分的微生物种类。对于样品中丰度较低的物种并没有有效的检测出来。因而导致该分析存在较大的误差，不能全面、精准的揭示生物成因煤层气的生成机理，也不能有效的为煤层气的二次开发利用提供理论依据。

发明内容

本发明为了解决现有对环境中微生物多样性的研究存在较大局限性，需要样品的量较大，操作繁琐，费时费力，灵敏度低，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分的微生物种类等问题，提供了一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法。与传统方法相比，本发明能更准确的分析出煤层水中微生物的多样性和物种丰度。

本发明由如下技术方案实现的：一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，步骤如下：

（1）煤层水样采集：厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，-20^oC密闭保存；

（2）微生物菌体的富集和DNA提取：无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22μm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGA^ò水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA；

（3）用特异性引物扩增16S rDNA V4高变区：设计16S rDNA V4高变区的特异性引物，扩增该高变区DNA片段；

（4）Illumina平台测序分析：用带有Illumina通用接头序列的引物对扩增的高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列；

（5）原始测序数据处理：使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列；根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS等拼接软件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列；

（6）完成物种分类：通过16S rDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。

与现有技术相比：本发明不需要较大量的样品，操作简单，灵敏度高，可以有效的检测出样品中丰度低的物种，应用本发明所述方法在煤层水中鉴定出的菌种种类在属水平上多于400属，而传统方法如DGGE等在分析微生物多样性时，一般仅能分析出几十种微生物，在研究煤层水中的微生物种类及丰度中，具有明显的优越性。

煤层气作为一种清洁能源，利用其补充常规天然气资源的不足已成为共识。生物成因作为煤层气形成的一部分缘由，具有可持续开发利用的特点，也是国内外能源领域研究的热点问题。研究生物因素导致煤层气形成的机理，需要对煤层中微生物有足够的认识，尽可能全面分析相关的微生物种类及丰度，以便于进一步分析这些微生物的生理特性及代谢特征，为明确煤层气形成的生物成因的机理提供理论依据。本发明所介绍的分析方法，能较全面的分析煤层水中微生物的种类及丰度。

附图说明

图1为本发明实施例煤层水中微生物多样性分析流程图；图2为本发明实施例中煤层水微生物总DNA电泳检测图；图3为本发明实施例中读序列在属水平上的分布饼图。

具体实施方式

以下将结合具体实施实例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，具体步骤如下：

（1）煤层水样采集：厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体的体积大于装置体积5-10倍，置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，-20^oC密闭保存；

（2）微生物菌体的富集和DNA提取：为保证提取足量DNA，无菌操作台上将采集的3L水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22μm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；将滤膜剪成宽度1mm的条状，并按重量比为6：3：1的量分为1、2、3三个样品；按照OMEGA^ò水样DNA提取试剂盒的说明，提取三个样品中微生物的总DNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，检测结果如图2所示，所提取的三个样品中1和2的DNA浓度较高，满足实验要求，其中M为λ-Hind III DNA Marker； 

（3）用V4区特异性引物扩增16S rDNA V4高变区：设计16S rDNA V4高变区的通用引物，F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，用TaKaRa公司的Ex Taqò扩增该高变区DNA片段；

（4）Illumina平台测序分析：用对高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列，即测序后获得的DNA序列片段。

（5）原始测序数据处理：使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列。根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS等拼接软件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列；

（6）完成物种分类：通过16S rDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。物种分类可从界、门、纲、目、科、属、种7个层次上进行分析，物种丰度可根据测序结果中物种标签序列的数量计算出。

物种分类结果表明，所检测的煤层水中微生物在属水平上有400多属，其中7个属的丰度占全部物种的81.34%，如图3所示，甲基杆菌属比例最大，占全部微生物种类的24.59%，该类微生物具有甲基营养或甲烷营养特性，因此，部分种群可能与甲烷菌竞争甲基类底物，部分种群可能会利用甲烷做为其生长的碳源或能源；假单胞菌属所占的比例为15.8%，大量的研究证明，假单胞菌属的很多种对含有苯环结构的有机物有很好的降解作用，因此，这类微生物在煤层中可能作用于煤分子的结构或侧链基团，使煤得到部分降解；嗜氢菌属所占的比例为12.36%，此类微生物常以氢气作为底物进行生长代谢，煤层环境中氢气含量低有可能是嗜氢菌属作用的结果；葡萄球菌属所占的比例为11.89%，多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气，有些菌株能分解甘露醇等物质；藏红花黄色线菌属所占的比例为6.18%，多数种群具有产酸的能力；嗜甲基菌属所占的比例为6%，甲醇是此类菌株最常见的碳源和能源来源，甲基胺、甲酸盐、葡萄糖和果糖可作为一些种的碳源和能源，产生极少的酸或不产酸；嗜酸菌属占4.52%的比例，在培养过程中，嗜酸菌属产生大量的酸，同时，该类微生物对酸性环境有较高的耐受性。

除以上丰度较高的微生物以外，还有很多在生物成气过程中起重要作用的微生物被检测到，如：能降解芳烃或烷烃类物质的新鞘胺醇杆菌属，能产氢产乙酸的梭状芽孢杆菌属，产甲烷过程关键的甲烷杆菌属、甲烷短杆菌和甲烷八叠球菌属等。

因此，采用高通量测序的方法能较全面的揭示煤层水中微生物的种类及丰度，通过对测序数据的分析，不但能深入了解降解煤成气过程中的微生物种类，分析生物成因煤层气形成的可能机制，为煤层气的持续开发提供理论依据，而且有助于从煤层这种极端环境中筛选出优良的菌株资源，用于生产高附加值工业产品。

Claims (1)

1.一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，其特征在于：步骤如下：

（1）煤层水样采集：厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，-20^oC密闭保存；

（2）微生物菌体的富集和DNA提取：无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22μm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGA^ò水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA；

（3）用特异性引物扩增16S rDNA V4高变区：设计16S rDNA V4高变区的特异性引物，扩增该高变区DNA片段；

（4）Illumina平台测序分析：用带有Illumina通用接头序列的引物对扩增的高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列;

（5）原始测序数据处理：使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列；根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS拼接软件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列；

（6）完成物种分类：通过16S rDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。