CN105510543A - 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法 - Google Patents

一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105510543A
CN105510543A CN201510847527.2A CN201510847527A CN105510543A CN 105510543 A CN105510543 A CN 105510543A CN 201510847527 A CN201510847527 A CN 201510847527A CN 105510543 A CN105510543 A CN 105510543A
Authority
CN
China
Prior art keywords
water
pseudorasbora parva
cell
offset plate
pseudorasbora
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510847527.2A
Other languages
English (en)
Inventor
刘薇
张洲
张新
赵璐璐
杨京亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN201510847527.2A priority Critical patent/CN105510543A/zh
Publication of CN105510543A publication Critical patent/CN105510543A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，属于化学品安全性评价和环境监测领域。包括步骤如下：(1)用待测水样暴露处理麦穗鱼；(2)取暴露处理后的麦穗鱼肝细胞进行单细胞凝胶电泳实验，检测并统计细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩，并绘制剂量-效应曲线。通过与空白对照和阳性对照的比较，以及剂量-效应关系，判断受试样品的遗传毒性。本发明的检测方法可以灵敏、快速判断化学物的遗传毒性,并为化学品遗传毒性评价和环境遗传毒性监测提供了一种基于我国本土物种的检测方法。

Description

一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法
技术领域
本发明提供了一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，属于化学品安全性评价和环境监测领域。
背景技术
遗传毒性测试和评估方法已列入新药研究、环境监测、农药开发、化学物质与食品安全性评价、新型材料研制等涉及人体健康或环境风险评价的规定试验检测项目。由于生物物种具有地域性，使用国际标准模式物种进行环境监测和化学品安全性评价，并不能充分保护我国本土生物。因此，我国新化学物质登记法规中规定，进行新化学物质申报时必须提供在中国境内用中国的供试生物完成的生态毒理学测试数据。对于排水和环境水体进行毒性监测，也非常必要采用本土物种。麦穗鱼(Pseudorasboraparva)属鲤科，麦穗鱼属，在国内分布广泛，是江河、湖泊、池塘等水体中常见的小型鱼类，具有适应性广、繁殖力强、易于培养等特点。目前利用麦穗鱼进行毒性评价主要用于测试急性毒性，或利用麦穗鱼微核实验评价遗传毒性。尚无利用麦穗鱼彗星实验评价遗传毒性的方法。
彗星实验，即单细胞凝胶电泳实验，是一种检测真核生物细胞DNA损伤的常用方法，可以对遗传毒物引起的DNA损伤进行定性和半定量的测试，与传统的遗传毒性测试方法如微核试验、Ames实验等相比，具有灵敏、快速的优点。人用药品注册技术规定国际协调会议(ICH)2012年修订的药物评价指南中将组织彗星实验纳入遗传毒性评价中。经济合作与发展组织(OECD)已颁布体内碱性彗星试验指南。因此利用彗星实验进行遗传毒性检测具有良好的可行性和应用前景。
发明内容
本发明根据彗星实验用于遗传毒性评价的灵敏、快速、简便的特点，以及化学品安全性评价对于使用本土生物的规定，提出了一种利用中国本土淡水生物麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法。
本发明的技术方案：
一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，步骤如下：
(1)试验鱼准备：将麦穗鱼在温度21-23℃、光暗比14h:10h曝气水驯养7天；得到平均体长2.6-2.8cm和平均体重0.3-0.5g的麦穗鱼；
(2)设置空白对照组、阳性对照组和待测组水样，暴露处理麦穗鱼；每2L水中暴露5条麦穗鱼，暴露处理前一天停止喂食，暴露期间不喂食；
所述的空白对照组水样为曝气水；
所述的阳性对照组水样为用曝气水配制的浓度为0-30mg/L的浓度梯度的重铬酸钾溶液，或用曝气水配制的浓度为0-5μg/L的浓度梯度的4-硝基喹啉-1-氧化物溶液；
所述的待测组水样是用曝气水配制的目标化学物溶液、经过过滤的环境水样或其他可溶于水中的环境样品；
(3)将麦穗鱼分别暴露在步骤(2)的三种水样中96h，取出麦穗鱼，冰上解剖取出肝脏组织，用于单细胞凝胶电泳；
所述的单细胞凝胶电泳步骤如下：
1)制备单细胞悬浮液：取麦穗鱼肝脏组织，用PBS缓冲液冲洗肝脏组织，4℃条件下加入0.4mL解冻的胰蛋白酶，将肝脏组织分解为单细胞，加入0.8mL杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)终止消化，用200目的钢丝网过滤，将滤液进行离心处理，去上清液，加入DMEM，调整悬浮液中细胞密度为106～107个/ml，制得麦穗鱼肝细胞单细胞悬浮液；
2)制作单细胞电泳胶板：将加热溶化后的0.5wt％标准熔点琼脂糖快速铺在载玻片上，4℃下冷却凝固，制成第一层胶板；按照体积比3:1将0.35wt％低熔点琼脂糖和单细胞悬浮液混合铺在第一层胶板上，4℃下冷却凝固，制得双层胶板；
3)裂解细胞：将双层胶板浸入裂解液中，4℃下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液；
4)DNA解旋：将步骤3)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4℃下避光放置20min；
5)电泳：将步骤4)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min。
(4)染色：单细胞凝胶电泳结束后用蒸馏水冲洗双层胶板，用Tris-HCl缓冲液浸泡双层胶板15min，反复2次；避光晾干，Gelred染色；
(5)镜检和分析：用显微镜观察经过步骤(4)处理后的细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩进行统计分析。
所述的裂解液为2.5mol/LNaCl、0.1mol/LNa2EDTA、10mmol/LTris-HCl和1wt％十二烷基肌氨酸钠，调整pH＝10，使用前加1wt％TritonX-100和10wt％二甲基亚砜(DMSO)。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.4mol/L，pH为7.5。
本发明的有益效果：选择中国本土淡水生物麦穗鱼，通过彗星实验对化学品或环境水体进行遗传毒性检测，相比于使用国际标准模式生物，使用本土物种能够更充分评价中国本土生物健康风险；同时用于化学品和实际环境水体的遗传毒性监测，可以更全面评价环境污染对于水生生物的健康风险；用麦穗鱼进行彗星实验评价遗传毒性，相比于用麦穗鱼进行微核试验，更为灵敏、快速。
附图说明
图1为不同浓度K2Cr2O7对麦穗鱼DNA损伤。
图2为不同浓度4-NQO对麦穗鱼DNA损伤。
图3为不同稀释浓度水样对麦穗鱼DNA损伤。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例
采集浑河某断面水样，用玻璃纤维滤膜过滤后，用于麦穗鱼暴露；用重铬酸钾(K2Cr2O7)和4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)作为阳性对照，评价该水样对麦穗鱼的遗传毒性。
本具体实施例采用如下步骤：
(1)麦穗鱼在实验室内驯养一周，驯养期间死亡率低于5％，暴露前一天停止喂食，选择体长、体重接近的同一批麦穗鱼用于实验；
(2)用曝气一天以上自来水，配制麦穗鱼暴露水样：阳性对照化学物，K2Cr2O7浓度梯度为2.5mg/L、5mg/L、10mg/L，4-NQO浓度梯度为0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L；待测环境水样，用玻璃纤维滤膜过滤后，用曝气自来水稀释，浓度梯度60％、80％、100％；
(3)用空白对照(曝气自来水)、阳性对照和待测水样暴露处理麦穗鱼96h，2L水样中暴露5条麦穗鱼，光暗比14h：10h，温度21-23℃；
(4)暴露结束后，将麦穗鱼置于冰上解剖取肝脏组织；
(5)制作单细胞电泳胶板：取450μL加热溶化后的0.5wt％正常熔点琼脂糖，快速铺在载玻片上，4℃下冷却凝固，制成第一层胶板；将450μL0.35wt％低熔点琼脂糖和150μL单细胞悬浮液混合，取100μL混合液铺在第一层胶板上，4℃下冷却凝固，制得双层胶板；
(6)裂解细胞：将步骤(5)得到的双层胶板浸入裂解液中，4℃下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液；
(7)DNA解旋：步骤(6)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4℃下避光放置20min；
(8)电泳：将步骤(7)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min；
(9)染色：电泳结束后用蒸馏水冲洗胶板，用Tris-HCl缓冲液，浸泡双层胶板15min，反复2次；避光晾干，Gelred染色；
(10)镜检和分析：用荧光倒置显微镜，观察细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩进行统计分析。
结果说明：图1和图2分别是用麦穗鱼彗星实验评价K2Cr2O7和4-NQO的遗传毒性，在K2Cr2O7浓度为5mg/L和4-NQO浓度为0.5μg/L时检测出显著的遗传毒性效应。图3是用麦穗鱼彗星实验检测浑河某断面水样遗传毒性，该水样在稀释浓度为60％时对麦穗鱼产生了显著的遗传毒性。综上，麦穗鱼进行彗星实验能快速、灵敏的评价化学品的遗传毒性以及监测环境样品的遗传毒性。

Claims (4)

1.一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)试验鱼准备：将麦穗鱼在温度21-23℃、光暗比14h:10h曝气水驯养7天，得到平均体长2.6-2.8cm和平均体重0.3-0.5g的麦穗鱼；
(2)设置空白对照组水样、阳性对照组水样和待测组水样，暴露处理麦穗鱼；每2L水中暴露5条麦穗鱼，暴露处理前一天停止喂食，暴露期间不喂食；
所述的空白对照组水样为曝气水；
所述的阳性对照组水样为用曝气水配制的浓度为0-30mg/L的浓度梯度的重铬酸钾溶液，或用曝气水配制的浓度为0-5μg/L的浓度梯度的4-硝基喹啉-1-氧化物溶液；
所述的待测组水样是用曝气水配制的目标化学物溶液、经过过滤的环境水样或其他溶于水中的环境样品；
(3)将麦穗鱼分别暴露在步骤(2)的三种水样中96h，取出麦穗鱼，冰上解剖取出肝脏组织，用于单细胞凝胶电泳；
(4)染色：单细胞凝胶电泳结束后用蒸馏水冲洗双层胶板，用Tris-HCl缓冲液浸泡双层胶板15min，反复2次；避光晾干，Gelred染色；
(5)镜检和分析：用显微镜观察经过步骤(4)处理后的细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩统计分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞凝胶电泳步骤如下：
1)制备单细胞悬浮液：取麦穗鱼肝脏组织，用PBS缓冲液冲洗肝脏组织，4℃条件下加入0.4mL解冻的胰蛋白酶，将肝脏组织分解为单细胞，加入0.8mL杜尔伯科改良伊格尔培养基终止消化，用200目的钢丝网过滤，将滤液进行离心处理，去上清液，加入DMEM，调整悬浮液中细胞密度为106～107个/ml，制得麦穗鱼肝细胞单细胞悬浮液；
2)制作单细胞电泳胶板：将加热溶化后的0.5wt％标准熔点琼脂糖快速铺在载玻片上，4℃下冷却凝固，制成第一层胶板；按照体积比3:1将0.35wt％低熔点琼脂糖和单细胞悬浮液混合铺在第一层胶板上，4℃下冷却凝固，制得双层胶板；
3)裂解细胞：将双层胶板浸入裂解液中，4℃下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液；
4)DNA解旋：将步骤3)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4℃下避光放置20min；
5)电泳：将步骤4)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.4mol/L，pH为7.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的裂解液为2.5mol/LNaCl、0.1mol/LNa2EDTA、10mmol/LTris-HCl和1wt％十二烷基肌氨酸钠，调整pH＝10，使用前加1wt％TritonX-100和10wt％DMSO。
CN201510847527.2A 2015-11-27 2015-11-27 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法 Pending CN105510543A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510847527.2A CN105510543A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510847527.2A CN105510543A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105510543A true CN105510543A (zh) 2016-04-20

Family

ID=55718671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510847527.2A Pending CN105510543A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105510543A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108169440A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 浙江海洋大学 一种新的水污染生物监测方法
CN110470520A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种彗星实验中的换液方法
CN111122530A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 自然资源部第一海洋研究所 一种油基钻屑遗传毒性的检测方法
CN112782144A (zh) * 2021-01-21 2021-05-11 长沙学院 一种基于dna损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101975814A (zh) * 2010-10-11 2011-02-16 国家海洋局第一海洋研究所 海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法
CN102128872A (zh) * 2010-12-09 2011-07-20 济南市供排水监测中心 一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法
CN102175828A (zh) * 2011-01-20 2011-09-07 济南市供排水监测中心 一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101975814A (zh) * 2010-10-11 2011-02-16 国家海洋局第一海洋研究所 海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法
CN102128872A (zh) * 2010-12-09 2011-07-20 济南市供排水监测中心 一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法
CN102175828A (zh) * 2011-01-20 2011-09-07 济南市供排水监测中心 一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周敏: "麦穗鱼对人工湿地系统净化效果的指示作用", 《中国优秀论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
张海艳等: "2种常用药物对麦穗鱼的急性毒性和SDS对麦穗鱼的遗传毒性", 《贵州农业科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108169440A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 浙江海洋大学 一种新的水污染生物监测方法
CN108169440B (zh) * 2017-12-14 2020-11-10 浙江海洋大学 一种水污染生物监测方法
CN110470520A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种彗星实验中的换液方法
CN111122530A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 自然资源部第一海洋研究所 一种油基钻屑遗传毒性的检测方法
CN112782144A (zh) * 2021-01-21 2021-05-11 长沙学院 一种基于dna损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
da Costa Araújo et al. Hepatotoxicity of pristine polyethylene microplastics in neotropical physalaemus cuvieri tadpoles (Fitzinger, 1826)
Manzano et al. Evaluation of the genotoxicity of waters impacted by domestic and industrial effluents of a highly industrialized region of São Paulo State, Brazil, by the comet assay in HTC cells
CN105510543A (zh) 一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法
CN104379760B (zh) 用于流式细胞术的样品制备
CN106644656A (zh) 苏木素‑伊红一步染色法
CN105784820B (zh) 一种丝网印刷碳电极的适配体传感器用于检测微囊藻毒素的方法
CN102175828B (zh) 一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法
CN103018225A (zh) 一种渗滤液及其污染水体中重金属生物可用性的判断方法
CN103499675A (zh) 利用斑马鱼监测生活污水毒性的方法
Resende et al. Diatom ecological preferences in a shallow temperate estuary (Ria de Aveiro, Western Portugal)
CN106568824A (zh) 复合重金属胁迫下贻贝dna损伤的检测方法
CN106501474A (zh) 微宇宙周期生物量测算污染物生态毒性效应阈值浓度方法
Golmarvi et al. Influence of physico-chemical factors, zooplankton species biodiversity and seasonal abundance in anzali international wetland, iran
Pociecha et al. Is zooplankton an indicator of the water trophic level in dam reservoirs?
Rychtecký et al. Spatio-temporal study of phytoplankton cell viability in a eutrophic reservoir using SYTOX Green nucleic acid stain
CN103472194B (zh) 一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法
CN106018688B (zh) 一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法
CN106047849A (zh) 一种固定的微生物体系及其制备方法和水体毒性的检测方法
CN103276042B (zh) 一种检测水中有机污染物遗传毒性的方法
Tauro et al. Diatom percolation through soils: a proof of concept laboratory experiment
CN104849271A (zh) 一种基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法
Arnaudova et al. Selected hematological indices of freshwater fish from Studen Kladenetsh Reservoir
CN103940789B (zh) 水毒性检测中发光细菌荧光行为的规范和数值解析
Sevindik et al. The Effects of certain physical and chemical variables on the succession of the phytoplankton in the shallow cagis pond (Balıkesir, Turkey)
Buesing et al. Growth and production of litter-associated bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160420