CN110514625A - 一种人体血清叶酸的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人体血清叶酸的测定方法，包括实验用水的制备、叶酸标准液配制、鼠李糖乳杆菌生长培养基配制、鼠李糖乳杆菌的制备、检测培养基配制、血清叶酸检测；本发明采用活性炭吸附水中的有机杂质，可以达到消除干扰的目的；叶酸的化学性质不稳定，容易被氧化，在生长和检测培养基中添加抗坏血酸作为抗氧化剂，使溶血液中的氧分尽量降低，从而增加脱氧血红蛋白的含量，达到保护叶酸的作用；检测时细胞培养板用封口膜封闭，有助于鼠李糖乳杆菌的生长，也能防止水分蒸发和叶酸的氧化；本发明简便易行、价格低廉、且灵敏度高，更适合大规模人群的叶酸筛查需要。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种人体血清叶酸的测定方法。
背景技术
叶酸是机体所需要的重要营养素，属于水溶性维生素，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。最早，叶酸在临床上主要用于治疗和预防巨幼细胞性贫血、预防胚胎神经管畸形。目前，临床上常用的叶酸检测样本主要是血清叶酸检测和红细胞叶酸检测2种。血清叶酸水平是反映近期叶酸摄入量的指标，临床上也可将其用于具有细胞贫血的病因诊断。红细胞叶酸最能反映叶酸的长期储存情况，红细胞叶酸偏低，则提示叶酸长期缺乏。
测量人体内叶酸水平的检测方法主要有:微生物法、化学发光测定法、同位素放射免疫法、气相色谱-质谱法、聚合酶链-限制性片段长度多态性测定法、离子捕获法以及最新被提出的叶酸衍生物的质谱法，其中化学发光测定法是在临床上使用最为广泛的一种方法。高效液相色谱法的特点是测定结果准确、操作简便、省时省力、分析速度快、分离效果好，是近年来发展速度较快的测定叶酸的方法，分析操作方法和所用药品分析相似，适合检测纯品，但分析成本高，液相色谱仪价格及日常维护费用贵。化学发光法采用竞争结合受体测定的基本原理，将叶酸结合蛋白作为免疫反应的基础。该方法具有快捷、简便的特点，该方法易于实现自动化、结果重复性较好，可同时用于血清和红细胞叶酸测定，对血清叶酸的测定无需前期处理，对于红细胞叶酸的测定，需要在测定之前对全血样本进行处理，使红细胞溶解，同时将红细胞中的多谷氨酸叶酸转变为单谷氨酸形式。但是需要昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较为复杂；另外，酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大。而微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的叶酸，这是微生物法区别于其他方法的最大特点及优势，但传统微生物法也存在一些缺陷：比如叶酸容易被氧化、检测时背景较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人体血清叶酸的测定方法，提高叶酸检测的准确性，同时降低检测成本。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种人体血清叶酸的测定方法，包括如下步骤：
(1)实验用水的制备：1L去离子水中加入4g活性炭粉末，搅拌30s，G4砂芯漏斗抽滤去除活性炭粉末，得到实验用水；
(2)叶酸标准液配制：称取200mg叶酸标准品，用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，吸取1mL上述溶液，再用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，再吸取1mL，用0.01mol/L氨水溶解并定容至25mL；用0.01mol/L氨水调零，比色杯光径1cm，比色波长256nm，根据紫外吸光度值，计算该溶液的叶酸浓度，然后根据实际测定浓度，用0.5％抗坏血酸钠溶液将其分别稀释为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ug/L共7种标准溶液；
(3)鼠李糖乳杆菌生长培养基配制：称取4.7g叶酸培养基干粉、抗坏血酸钠0.05g、氯霉素0.02g、硫酸锰0.01g放入200mL烧杯中，加100uL待标定的叶酸标准溶液(浓度200ug/L)和100mL实验用水，混匀后加热至沸腾，然后高压灭菌，121℃20min，得到生长培养基，冷却后按10mL分装，-20℃冻存，用于菌种的制备；
(4)鼠李糖乳杆菌的制备：将鼠李糖乳杆菌接种于生长培养基中，37℃培养箱内培养24h，2000r/min离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，混匀后离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，37℃培养箱内培养24h，取对数生长期菌液与80％甘油按1:1比例混合，混匀后分装于2mL冷冻管，-20℃冻存；
(5)检测培养基配制：称取7.05g叶酸培养基干粉、氯霉素0.003g、硫酸锰0.015g放入200mL烧杯中，加入100mL实验用水，加热至沸腾，冷却后加入75mg抗坏血酸钠、500uL鼠李糖乳杆菌溶液，混匀；
(6)血清叶酸检测：将血清用0.5％抗坏血酸钠稀释20倍在细胞培养板中，分别加入叶酸标准溶液，空白孔加浓度为0.0ug/L的标准溶液100uL，样品孔加稀释后的待检血清100uL，在空白孔内加入5uL浓度为3％的叠氮钠溶液，向所有检测孔中加入200uL检测培养基，封口膜封堵细胞培养板，将细胞培养板置37℃孵育36h后，混匀，撕开封口膜，静置5min，于酶标仪590nm比浊测定，选择合适的标准曲线拟合方式计算待检血清的叶酸浓度。
本发明具有有益效果：本发明采用活性炭吸附水中的有机杂质，可以达到消除干扰的目的；叶酸的化学性质不稳定，容易被氧化，在生长和检测培养基中添加抗坏血酸作为抗氧化剂，使溶血液中的氧分尽量降低，从而增加脱氧血红蛋白的含量，达到保护叶酸的作用；检测时细胞培养板用封口膜封闭，有助于鼠李糖乳杆菌的生长，也能防止水分蒸发和叶酸的氧化；本发明简便易行、价格低廉、且灵敏度高，更适合大规模人群的叶酸筛查需要。
附图说明
图1为本发明实施例1叶酸测定的检测标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种人体血清叶酸的测定方法，包括如下步骤：
(1)实验用水的制备：1L去离子水中加入4g活性炭粉末，搅拌30s，G4砂芯漏斗抽滤去除活性炭粉末，得到实验用水；
(2)叶酸标准液配制：称取200mg叶酸标准品，用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，吸取1mL上述溶液，再用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，再吸取1mL，用0.01mol/L氨水溶解并定容至25mL；用0.01mol/L氨水调零，比色杯光径1cm，比色波长256nm，根据紫外吸光度值，计算该溶液的叶酸浓度，然后根据实际测定浓度，用0.5％抗坏血酸钠溶液将其分别稀释为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ug/L共7种标准溶液；
(3)鼠李糖乳杆菌生长培养基配制：称取4.7g叶酸培养基干粉、抗坏血酸钠0.05g、氯霉素0.02g、硫酸锰0.01g放入200mL烧杯中，加100uL待标定的叶酸标准溶液(浓度200ug/L)和100mL实验用水，混匀后加热至沸腾，然后高压灭菌，121℃20min，得到生长培养基，冷却后按10mL分装，-20℃冻存，用于菌种的制备；
(4)鼠李糖乳杆菌的制备：将鼠李糖乳杆菌接种于生长培养基中，37℃培养箱内培养24h，2000r/min离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，混匀后离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，37℃培养箱内培养24h，取对数生长期菌液与80％甘油按1:1比例混合，混匀后分装于2mL冷冻管，-20℃冻存；
(5)检测培养基配制：称取7.05g叶酸培养基干粉、氯霉素0.003g、硫酸锰0.015g放入200mL烧杯中，加入100mL实验用水，加热至沸腾，冷却后加入75mg抗坏血酸钠、500uL鼠李糖乳杆菌溶液，混匀；
(6)血清叶酸检测：将血清用0.5％抗坏血酸钠稀释20倍在细胞培养板中，分别加入叶酸标准溶液，空白孔加浓度为0.0ug/L的标准溶液100uL，样品孔加稀释后的待检血清100uL，在空白孔内加入5uL浓度为3％的叠氮钠溶液，向所有检测孔中加入200uL检测培养基，封口膜封堵细胞培养板，将细胞培养板置37℃孵育36h后，混匀，撕开封口膜，静置5min，于酶标仪590nm比浊测定，选择合适的标准曲线拟合方式计算待检血清的叶酸浓度，标准曲线见图1，相关性良好。
实施例2
一种人体血清叶酸的测定方法，包括如下步骤：
(1)实验用水的制备：1L去离子水中加入4g活性炭粉末，搅拌30s，G4砂芯漏斗抽滤去除活性炭粉末，得到实验用水；
(2)叶酸标准液配制：称取200mg叶酸标准品，用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，吸取1mL上述溶液，再用0.01mol/L氨水溶解并定容至1L，再吸取1mL，用0.01mol/L氨水溶解并定容至25mL；用0.01mol/L氨水调零，比色杯光径1cm，比色波长256nm，根据紫外吸光度值，计算该溶液的叶酸浓度，然后根据实际测定浓度，用0.5％抗坏血酸钠溶液将其分别稀释为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ug/L共7种标准溶液；
(3)鼠李糖乳杆菌生长培养基配制：称取4.7g叶酸培养基干粉、没食子酸丙酯0.05g、氯霉素0.02g、硫酸锰0.01g放入200mL烧杯中，加100uL待标定的叶酸标准溶液(浓度200ug/L)和100mL实验用水，混匀后加热至沸腾，然后高压灭菌，121℃20min，得到生长培养基，冷却后按10mL分装，-20℃冻存，用于菌种的制备；
(4)鼠李糖乳杆菌的制备：将鼠李糖乳杆菌接种于生长培养基中，37℃培养箱内培养24h，2000r/min离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，混匀后离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，37℃培养箱内培养24h，取对数生长期菌液与80％甘油按1:1比例混合，混匀后分装于2mL冷冻管，-20℃冻存；
(5)检测培养基配制：称取7.05g叶酸培养基干粉、氯霉素0.003g、硫酸锰0.015g放入200mL烧杯中，加入100mL实验用水，加热至沸腾，冷却后加入75mg没食子酸丙酯、500uL鼠李糖乳杆菌溶液，混匀；
(6)血清叶酸检测：将血清用0.5％没食子酸丙酯稀释20倍在细胞培养板中，分别加入叶酸标准溶液，空白孔加浓度为0.0ug/L的标准溶液100uL，样品孔加稀释后的待检血清100uL，在空白孔内加入5uL浓度为3％的叠氮钠溶液，向所有检测孔中加入200uL检测培养基，封口膜封堵细胞培养板，将细胞培养板置37℃孵育36h后，混匀，撕开封口膜，静置5min，于酶标仪590nm比浊测定，选择合适的标准曲线拟合方式计算待检血清的叶酸浓度。
实施例3
取高、中、低3种叶酸浓度的血清样本(24ug/L、12ug/L、6ug/L)，实施例1用本法连续测定10次，见表1，测定的平均值分别为23.65、11.95、5.96ug/L，批内变异系数为2.3％、2.9％、3.9％；实施例2用本法连续测定10次，见表2，测定的平均值分别为23.6、11.97、5.94ug/L，批内变异系数为2.5％、2.5％、4.2％；
表1
| 高浓度样本 | 中浓度样本 | 低浓度样本 | |
| 第一次 | 23.6 | 12.2 | 6.5 |
| 第二次 | 23.2 | 12.3 | 5.9 |
| 第三次 | 23.4 | 11.2 | 5.2 |
| 第四次 | 23.5 | 11.6 | 6.2 |
| 第五次 | 22.9 | 12.1 | 6.7 |
| 第六次 | 24.3 | 11.7 | 6.1 |
| 第七次 | 24.1 | 11.8 | 5.2 |
| 第八次 | 23.5 | 12.1 | 5.6 |
| 第九次 | 24.8 | 12.2 | 5.1 |
| 第十次 | 23.2 | 12.3 | 5.8 |
| 平均值 | 23.65 | 11.95 | 5.96 |
| 批内变异系数 | 2.3％ | 2.9％ | 3.9％ |
表2
取已测得叶酸含量为23.65、11.95、5.96ug/L的血清样本各200uL，分别加入浓度为400、200、100ug/L叶酸标准液10uL，混匀后进行回收试验，回收率分别为99.1％、101.1％、99.5％；取已测得叶酸含量为23.6、11.97、5.94ug/L的血清样本各200uL，分别加入浓度为400、200、100ug/L叶酸标准液10uL，混匀后进行回收试验，回收率分别为99.5％、102.1％、99.3％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种人体血清叶酸的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)实验用水的制备：去离子水中加入活性炭粉末，搅拌均匀，抽滤去除活性炭粉末，得到实验用水；
(2)叶酸标准液配制：称取叶酸标准品，用氨水溶解并用实验用水定配制不同浓度的标准品溶液；
(3)鼠李糖乳杆菌生长培养基配制：称取叶酸培养基干粉、抗氧化剂、氯霉素、硫酸锰放入烧杯中，加待标定的叶酸标准溶液和实验用水，混匀后加热至沸腾，然后高压灭菌，得到生长培养基，冷却后分装，-20℃冻存，用于菌种的制备；
(4)鼠李糖乳杆菌的制备：将鼠李糖乳杆菌接种于生长培养基中，37℃培养箱内培养24h，2000r/min离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，混匀后离心2-3min，弃去上清液，加入生长培养基，37℃培养箱内培养24h，取对数生长期菌液与80％甘油按1:1比例混合，混匀后分装于2mL冷冻管，-20℃冻存；
(5)检测培养基配制：称取叶酸培养基干粉、氯霉素、硫酸锰放入烧杯中，加入实验用水，加热至沸腾，冷却后加入抗氧化剂、鼠李糖乳杆菌溶液，混匀；
(6)血清叶酸检测：将血清用抗氧化剂稀释20倍在细胞培养板中，分别加入叶酸标准溶液，空白孔加浓度为0的标准溶液、浓度为3％的叠氮钠溶液，样品孔加稀释后的待检血清，向所有检测孔中加入检测培养基，封口膜封堵细胞培养板，将细胞培养板置37℃孵育36h后，混匀，撕开封口膜，静置5min，于酶标仪590nm比浊测定，选择合适的标准曲线拟合方式计算待检血清的叶酸浓度。
2.根据权利要求1所述的一种人体血清叶酸的测定方法，其特征在于，叶酸标准溶液的浓度为分别0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ug/L。
3.根据权利要求1所述的一种人体血清叶酸的测定方法，其特征在于，所述抗氧化剂为抗坏血酸钠或没食子酸丙酯。
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