CN111122463A - 一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法。本发明克服了现有方法中使用剧毒试剂的缺点，采用氯酸钠‑硫酸溶液在110℃条件下消解血清样品，利用碘催化亚硝酸钠与硫氰酸铁的还原反应，测量Fe(SCN)6 3‑的浓度变化速度与碘含量成正比；精密控制反应温度和反应时间，测量剩余的Fe(SCN)6 3‑的吸光度，碘含量与吸光度的对数成线性关系。该方法的建立可进一步满足群众逐渐增加的了解碘营养水平的需求，为碘缺乏病防治监测和碘营养评价的血清碘检测增添有力的方法手段，具有重要的公共卫生现实意义和实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的检测方法，特别涉及一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法，属于检测技术领域。
背景技术
我国发布的血清碘标准检验方法《WS/T572-2017血清中碘的测定-砷铈催化分光光度法》，该方法为酸消解-砷铈催化分光光度法，该法测定前需对样品加氯酸钠及浓高氯酸消解剂做130℃热消解120min的前处理，消解过程有较多游离氯气等刺激气体逸出需通风排毒设备，其分析速度较慢，光度测定操作需严格的控制砷铈反应温度和反应时间。另一方面，该方法使用剧毒试剂三氧化二砷(俗称砒霜)。由于目前公安部门强化了对采购剧毒试剂资质的严格审查和限制，造成应用砷铈催化光度标准方法所需的三氧化二砷试剂在相当一部分实验室难于获得；且应用该方法后，含砷废液若未经专门处理有对环境污染的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法中使用剧毒试剂的缺点，从而提供一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法，采用氯酸钠-硫酸溶液在110℃条件下消解血清样品，利用碘催化亚硝酸钠与硫氰酸铁的还原反应，测量Fe(SCN)6 3-的浓度变化速度与碘含量成正比；精密控制反应温度和反应时间，测量剩余的Fe(SCN)6 3-的吸光度，碘含量与吸光度的对数成线性关系。该方法的建立可进一步满足群众逐渐增加的了解碘营养水平的需求，为碘缺乏病防治监测和碘营养评价的血清碘检测增添有力的方法手段，具有重要的公共卫生现实意义和实际应用价值。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明提供一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法，所述方法不用于疾病的诊断，包括以下步骤：
(1)样品采集和保存
使用一次性真空采血管采集适量血液于具塞离心管中，室温静置0.5h，于3000r/min离心5min，严密封口以防水分蒸发，得到血清样品；
(2)样品前处理
准备多支消解管于消解管架上作为标准系列管，用移液器分别加入或配置10μL不同浓度的碘标准溶液；再准备多支消解管作为样品管，用移液器分别加入10μL血清样品；然后用移液器分别向各消解管中加入50μL氯酸钠-硫酸溶液作为消解剂，混匀后置于110℃的血碘测定消解仪上消解120min，取下冷却至室温；
(3)样品测定
采用分光光度计测量法：用移液器分别向各消解管中加入200μL硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液作为还原剂，充分混匀后放置于超级水浴上于32.0℃保持15min，秒表计时，将标准系列管按碘浓度由高至低顺序排列，依顺序每管间隔相同时间，用移液器向各管加入50μL硫酸铁铵-硝酸溶液，立即混匀；然后测量蒸馏水的光强度；待最高碘浓度的标准系列管的反应时间达到15min，此时吸光度值大约达到0.10，将样品管插入光路，依顺序每管间隔相同时间，于460nm波长下，以蒸馏水作参比，测量吸光度值。
(4)血清碘离子浓度计算
以碘离子浓度为横坐标，吸光度值的对数为纵坐标得到直线回归方程，再根据血清样品所测吸光度值使用下式计算得到样品中的碘离子浓度：Cx(μg/L)＝a+bX；
式中：
A---吸光度；
X---样本测量的pA值；X＝-lg(A)
a---直线回归截距；
b---直线回归斜率；
最后将各样品管所计算出的碘离子浓度取平均值，即得到最终检测结果。
优选的，步骤(1)中所述的氯酸钠-硫酸溶液中，氯酸钠浓度为0.4g/mL，硫酸浓度为2.7mol/L。
优选的，步骤(1)中所述的氯酸钠-硫酸溶液是通过以下方法配置：先量取250mL蒸馏水于500mL容量瓶中，缓缓加入18mol/L的硫酸250mL，混匀，放置冷却后定容，制成9.0mol/L的硫酸溶液；再量取200mL蒸馏水加入至500mL容量瓶中，加入200g氯酸钠，摇动放置，溶解，缓慢加入制备得到的9.0mol/L的硫酸150mL，混匀，定容。
优选的，步骤(2)中准备至少6只消解管作为所述的标准系列管，碘标准溶液的浓度分别为：250μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L和0μg/L，用于制作直线回归方程。
优选的，步骤(2)中准备至少3只消解管作为所述的样品管，用于多次测量取平均值。
优选的，步骤(2)中所述的硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液中，硫氰酸钾浓度为0.26g/L，亚硝酸钠浓度为8g/L，氯化钠浓度为30g/L。
优选的，步骤(2)中所述的硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液是通过以下方法配置：先称取9.7g硫氰酸钾于1L棕色容量瓶中，定容，制成0.10mol/L的硫氰酸钾溶液；再称取8g亚硝酸钠和30g氯化钠于另一1L棕色容量瓶中，加入蒸馏水约600mL，摇匀，加入27.3mL制备得到的0.10mol/L硫氰酸钾溶液，定容。
优选的，步骤(2)中所述的硫酸铁铵-硝酸溶液中，硫酸铁铵浓度为0.019mol/L，硝酸浓度为4mol/L。
优选的，步骤(2)中所述的硫酸铁铵-硝酸溶液是通过以下方法配置：称取5.0g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)212H2O]于1L棕色容量瓶中，加入200mL蒸馏水，加入16mol/L的硝酸250mL，定容。
优选的，步骤(3)中每管间隔的时间为30s。
本发明所应用的原理：
采用氯酸钠-硫酸溶液在110℃条件下消解血清样品，利用碘催化亚硝酸钠与硫氰酸铁的还原反应，测量Fe(SCN)63-的浓度变化速度与碘含量成正比；精密控制反应温度和反应时间，测量剩余的Fe(SCN)6 3-的吸光度，碘含量与吸光度的对数成线性关系。
2Fe(SCN)63-+2I-→2Fe2++12SCN-+I2
I2+NO2-+2OH-→2I-+NO3-+H2O
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1L中分别含有10g/LNaCl、、200mg/LK+、200mg/LCa2+、200mg/LMg2+、、1.5mg/L Fe2+、1.5mg/L Zn2+、1.5mg/L Cu2+、0.05mg/L Hg2+、2g/L甘氨酸、10g/L葡萄糖、100mg/L抗坏血酸、时，均不干扰测定。
线性范围0～250μg/L，相关系数r≥0.999；取样量为10μL，检测限4.7μg/L；精密度：测定低、中、高3种不同碘含量的血清样品，其批内变异系数(CV)分别为0.5％、0.9％、0.7％(n＝6)，批间变异系数(CV)分别为1.0％、0.3％、0.5％(n＝6)，；准确度：测定低、中、高3种不同碘含量的血清样品，平均加标回收率分别为100.8％、101.5％、103.1％(n＝3)，总平均回收率101.8％(范围99.6％～108.5％)。本测定方法精密、准确，重现好，所需仪器操作简单易行，适用于疾病防控、临床诊断及科研工作中血清碘的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例
1.原理：采用氯酸钠-硫酸溶液在110℃条件下消解血清样品，利用碘催化亚硝酸钠与硫氰酸铁的还原反应，测量Fe(SCN)6 3-的浓度变化速度与碘含量成正比；精密控制反应温度和反应时间，测量剩余的Fe(SCN)6 3-的吸光度，碘含量与吸光度的对数成线性关系。
2Fe(SCN)6 3-+2I-→2Fe2++12SCN-+I2
I2+NO2-+2OH-→2I-+NO3 -+H2O
2.主要仪器
2.1 DTD8640血碘测定消解仪(孔间温差≤1℃，靖江市爱可锐分析仪器有限公司)，消解孔径8.3mm，64孔。包括消解管架2个。
2.2 8640血碘测定消解管(外径8mm×内径6mm×高40mm，石英玻璃，血碘测定专用)，100支。
2.3 MU-2血碘测定超级水浴(控温精度±0.2℃，靖江市爱可锐分析仪器有限公司)。
2.4 紫外分光光度计。
3.试剂配制
3.1实验用水应符合GB/T6682中二级水规格；本方法所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂；本方法中的定容均使用蒸馏水。
3.2硫酸溶液(9.0mol/L)：量取250mL蒸馏水于500mL容量瓶中，缓缓加入18mol/L的硫酸250mL，混匀，放置冷却后定容。于4℃冰箱冷冻2小时。
3.3氯酸钠-硫酸溶液(消解剂)：量取200mL蒸馏水加入至500mL容量瓶中，加入200g氯酸钠，摇动放置，溶解。缓慢加入150mL硫酸(3.2)，混匀，定容。不小于4mL分装。
3.4硫氰酸钾溶液[c(KSCN)＝0.10mol/L](指示剂)：称取9.7g硫氰酸钾于1L棕色容量瓶中，定容，置冰箱中可保存6个月。
3.5硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液(还原剂)：称取8g亚硝酸钠和30g氯化钠于1L棕色容量瓶中，再加入蒸馏水约600mL，摇匀，加入27.3mL硫氰酸钾溶液(3.4)，定容。
3.6硫酸铁铵-硝酸溶液(氧化剂)：称取5.0g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O]于1L棕色容量瓶中，加入200mL蒸馏水，加入16mol/L的硝酸250mL，定容，置冰箱中可保存6个月。
3.7碘标准储备溶液[c(I-)＝100mg/L]：国家标准物质研究中心，市售。
3.8碘标准溶液[c(I-)＝250μg/L]：吸取2.500mL碘标准储备溶液(3.7)于1L容量瓶中，加1mL硫酸溶液(3.2)，定容。此溶液1mL含250ng碘。置冰箱中可保存1年。不小于0.5mL分装。
4.样品采集和保存
使用一次性真空采血管采集0.5mL血液于1mL具塞离心管中，室温静置0.5h，于3000r/min离心5min，严密封口以防水分蒸发，得到血清样品。在室温(20℃)下可保存7d，在4℃下可保存2个月，密封后冷冻(-20℃)至少可保存3个月。血液样品或血清样品在现场收集、运输和保存过程中应避免与加碘物品接触。
5.样品前处理
准备6支8640血碘测定消解管(2.2)于消解管架上作为标准系列管，用10μL移液器分别加入10μL、8μL、6μL、4μL、2μL和0μL的碘标准溶液(3.8)，再用蒸馏水补足10μL，分别命名为S5、S4、S3、S2、S1和S0；再准备3支8640血碘测定消解管(2.2)作为样品管，分别命名为样品1、样品2和样品3，用10μL移液器分别加入10μL血清样品(如果血清样品的碘浓度超过标准曲线的碘浓度范围，则加入2.0μL血清样品，计算结果乘10/2＝5)；然后用50μL移液器分别向全部9支消解管(2.2)中加入50μL消解剂(3.3)，混匀后置于110℃的血碘测定消解仪(2.1)上消解120min，取下冷却至室温。上述步骤所涉及的配置表请参见表1。
表1 标准系列管和样品管配制表
6.样品测定
采用分光光度计测量法(配备8640消解管测量架)：用200μL移液器分别向各消解管中加入200μL还原剂(3.5)，充分混匀后放置于MU-2血碘测定超级水浴上于32.0℃保持15min，秒表计时，将标准系列管按碘浓度由高(S5)至低(S0)顺序排列，依顺序每管间隔30s，用50μL移液器向各管加入50μL硫酸铁铵-硝酸溶液(3.6)，立即混匀。然后测量蒸馏水的光强度。待最高碘浓度的标准系列管(即标准系列中250μg/L碘浓度的S5管)的反应时间达到15min，此时吸光度值大约达到0.10，将样品管插入光路，依顺序每管间隔30s，于460nm波长下，以蒸馏水作参比，测量吸光度值。
7.血清碘含量计算
先根据标准系列管的血清碘含量和所测吸光度值得到直线回归方程，再根据血清样品所测吸光度值使用下式计算得到样品中的碘离子浓度：Cx(μg/L)＝a+bX；
式中：
A---吸光度；
X---样本测量的pA值；X＝-lg(A)
a---直线回归截距；
b---直线回归斜率；
最后将各样品管所计算出的碘离子浓度取平均值，即得到最终检测结果。
试验例1确定干扰因素、
《WS/T 416-2013干扰实验指南》是适用于临床实验室对临床检验定量方法进行干扰实验评价的标准，本试剂盒干扰实验的干扰物种类及加入量参考《WS/T 416-2013干扰实验指南》中常见内源性干扰物的建议实验浓度及《WS/T 572-2017血清中碘的测定-砷铈催化分光光度法》中的所列的抗干扰数据，分别在50μg/L、150μg/L的碘标准溶液中加入不同浓度的实验干扰物，结果为：1L中分别含有10g/LNaCl、、200mg/LK+、200mg/LCa2+、200mg/LMg2+、、1.5mg/L Fe2+、1.5mg/LZn2+、1.5mg/L Cu2+、0.05mg/L Hg2+、2g/L甘氨酸、10g/L葡萄糖、100mg/L抗坏血酸、时，均不干扰测定。
试验例2 对试剂盒进行稳定性、准确性等方法特异性验证。
1.标准曲线线性范围及相关性
本方法标准曲线的横坐标为碘标准液的浓度(μg/L)，纵坐标为吸光度A的对数值，线性范围为0～250μg/L，在此范围内，标准曲线连续平行测定6次，分别计算每条曲线各点测得的平均吸光度、变异系数及相关系数，结果如下：
表2.标准曲线线性范围
2.检出限
按方法检出限由空白值的3倍标准差计算，本方法取样量0.01ml，重复检测空白管的吸光度值(n＝10)，检出限为4.7μg/L(1.56*3＝4.7)。
3.精密度
3.1批内精密度测定：选取低、中、高3种碘浓度的血清样品，各采用本方法同批次各测定3个平行样求平均值。变异系数(CV)范围为0.5％～0.7％，平均为0.7％。结果如下：
表3 血清样测定批内精密度实验结果(μg/L)
3.2批间精密度测定：选取低、中、高3种碘浓度的血清样品，各采用本方法每批次各测定3个平行样求平均值，重复测定6批次。变异系数(CV)范围为0.3％～1.0％，平均为0.6％。结果如下：
表4 血清样测定批间精密度实验结果(μg/L，n＝6)
4.准确度
对低、中、高3种不同碘浓度水平的血清样，采用本方法进行加标回收实验，每次测定3个平行样后求平均值，重复测定3次。其中，回收率＝(加标样品测定值-样品测定值)/加标量*100％，回收率范围99.6％～108.5％，总平均回收率101.8％，符合生物样品的测定要求。测定结果如下：
表5 不同碘浓度血清样加标回收率实验结果
试验例2
将本发明实施例的检测方法与现行标准法(WS/T 572-2017)进行对比试验，结果如下表2所示。
表6 本发明实施例1的检测方法与现行标准法的对比
Claims (10)
1.一种用于个体碘营养评价的微量血清样本中碘离子的无砷检测方法，所述方法不用于疾病的诊断，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品采集和保存
使用一次性真空采血管采集适量血液于具塞离心管中，室温静置0.5h，于3000r/min离心5min，严密封口以防水分蒸发，得到血清样品；
(2)样品前处理
准备多支消解管于消解管架上作为标准系列管，用移液器分别加入或配置10μL不同浓度的碘标准溶液；再准备多支消解管作为样品管，用移液器分别加入10μL血清样品；然后用移液器分别向各消解管中加入50μL氯酸钠-硫酸溶液作为消解剂，混匀后置于110℃的血碘测定消解仪上消解120min，取下冷却至室温；
(3)样品测定
采用分光光度计测量法：用移液器分别向各消解管中加入200μL硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液作为还原剂，充分混匀后放置于超级水浴上于32.0℃保持15min，秒表计时，将标准系列管按碘浓度由高至低顺序排列，依顺序每管间隔相同时间，用移液器向各管加入50μL硫酸铁铵-硝酸溶液，立即混匀；然后测量蒸馏水的光强度；待最高碘浓度的标准系列管的反应时间达到15min，此时吸光度值大约达到0.10，将样品管插入光路，依顺序每管间隔相同时间，于460nm波长下，以蒸馏水作参比，测量吸光度值。
(4)血清碘离子浓度计算
以碘离子浓度为横坐标，吸光度值的对数为纵坐标得到直线回归方程，再根据血清样品所测吸光度值使用下式计算得到样品中的碘离子浓度：Cx(μg/L)＝a+bX；
式中：
A---吸光度；
X---样本测量的pA值；X＝-lg(A)
a---直线回归截距；
b---直线回归斜率；
最后将各样品管所计算出的碘离子浓度取平均值，即得到最终检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的氯酸钠-硫酸溶液中，氯酸钠浓度为0.4g/mL，硫酸浓度为2.7mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的氯酸钠-硫酸溶液是通过以下方法配置：先量取250mL蒸馏水于500mL容量瓶中，缓缓加入18mol/L的硫酸250mL，混匀，放置冷却后定容，制成9.0mol/L的硫酸溶液；再量取200mL蒸馏水加入至500mL容量瓶中，加入200g氯酸钠，摇动放置，溶解，缓慢加入制备得到的9.0mol/L的硫酸150mL，混匀，定容。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中准备至少6只消解管作为所述的标准系列管，碘标准溶液的浓度分别为：250μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L和0μg/L，用于制作直线回归方程。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中准备至少3只消解管作为所述的样品管，用于多次测量取平均值。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液中，硫氰酸钾浓度为0.26g/L，亚硝酸钠浓度为8g/L，氯化钠浓度为30g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硫氰酸钾-亚硝酸钠-氯化钠溶液是通过以下方法配置：先称取9.7g硫氰酸钾于1L棕色容量瓶中，定容，制成0.10mol/L的硫氰酸钾溶液；再称取8g亚硝酸钠和30g氯化钠于另一1L棕色容量瓶中，加入蒸馏水约600mL，摇匀，加入27.3mL制备得到的0.10mol/L硫氰酸钾溶液，定容。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硫酸铁铵-硝酸溶液中，硫酸铁铵浓度为0.019mol/L，硝酸浓度为4mol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硫酸铁铵-硝酸溶液是通过以下方法配置：称取5.0g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2 12H2O]于1L棕色容量瓶中，加入200mL蒸馏水，加入16mol/L硝酸250ml，定容。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每管间隔的时间为30s。
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