CN106290181A

CN106290181A - 一种血清碘定量测定试剂盒

Info

Publication number: CN106290181A
Application number: CN201610560902.XA
Authority: CN
Inventors: 申红梅; 陆征; 张亚平; 纪晓红; 姜鹏; 刘颖; 刘丽香
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: CN106290181B

Abstract

本发明公开了一种血清碘定量测定试剂盒，其是利用酸消解方法消化血清样品然后利用碘对砷铈氧化还原反应的催化作用,通过测定反应体系中Ce⁴⁺吸光度值的变化，利用碘浓度与吸光度值的对数呈线性关系计算碘含量。本试剂盒的建立主要包括消解条件的选择、反应体系的确定、方法验证等三个方面的工作，克服了现有方法试剂配制复杂、污染环境、损害检测者健康、仪器昂贵等缺点。本方法主要用于检测人体及动物血清中碘的含量，便于在我国省级、地市级和县区级疾病预防控制部门和各级医疗机构开展，能够满足疾病控制及临床上个体碘营养评价的需求。

Description

一种血清碘定量测定试剂盒

技术领域

本发明涉及一种定量测定试剂盒，特别涉及一种血清碘定量测定试剂盒，属于应用技术领域中的定量检测类产品。

背景技术

目前，寻求检测个体碘营养水平的人群日益增多，临床上暂时采用的方法是评价一次随意尿样来检测碘水平，但尿碘只能反映体内碘的排出量，并不能代表被甲状腺利用的具有生物活性的碘离子水平，血清碘浓度才能真实地反映机体的碘营养状况。

目前，文献中描述的血清碘定量测定方法有很多，如温和酸消化法测血清总碘含量(胡梅，泽仁拥西等，中国地方病学杂志.2000，19(1)：71-72.)，该方法利用硝酸和氯酸于110℃-115℃消化血清2.5h，然后利用碘对砷铈氧化还原反应的催化作用，通过测定反应体系中吸光度值的变化，利用碘浓度与吸光度值的对数呈线性关系求出碘含量；氯酸法用于血清碘测定的方法学研究(王欣，刘源，孙晓军等，中国卫生检验杂志.2006，16(8)：916-918.)，该方法利用氯酸先于100℃预热10min后升温至130℃消化血清1h,后利用碘对砷铈氧化还原反应的催化作用，通过测定反应体系中吸光度值的变化，利用碘浓度与吸光度值的对数呈线性关系求出碘含量；ICP-MS分析人血清中微量元素(沈雅珍,徐子刚,华伟民等，广东微量元素科学，1996，3(6)：51-55.)，该方法采用多元素内标法校正基体效应引起的误差,加入内标元素Sc、In，分别校正质量数<100和100～180的元素测定，并对一些元素选取其同位素峰测定，以避开多原子离子等的质谱干扰，样品制备为血清样2ml，加入内标元素，用1％稀硝酸稀释至5ml，其中包括血清碘测定。目前，国内外有部分大医院采用ICP-MS方法测定血清碘含量。

这些方法存在以下问题：

(1)温和酸法消化血清需要用到硝酸，硝酸消化后的分解产物对下一步测定存在一定的干扰。

(2)温和酸法、氯酸法测血清碘均需用到氯酸，但是氯酸配制过程较为复杂、易受到污染，如果不严格按照方法配制，氯酸浓度可能达不到要求，并且存放过程易分解，而且氯酸配制过程对于实验人员的健康有损害。

(3)前述两种方法在配制亚砷酸溶液时所需有毒试剂三氧化二砷较多。

(4)ICP-MS法测血清碘所需实验仪器较为昂贵，实验操作及数据分析需相关专业技术人员进行，难于在基层推广应用；血清用量较大，一般为0.5-2ml。

本项目组自主研制了一种新的血清中碘的酸消化定量测定方法，该方法具有易于操作、检测数据可信度高、稳定性好、污染低、血清用量少等优点。鉴于市场上没有血清碘定量检测的相关产品，本项目组在自主研制的血清碘定量测定方法的基础上，研发了一种血清碘定量测定试剂盒。

发明内容

针对现有问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于测定血清中碘含量的试剂盒。本发明的目的在于通过该试剂盒，对血清进行消化，然后利用碘对砷铈氧化还原反应的催化作用,通过测定反应体系中Ce⁴⁺吸光度值的变化，利用碘浓度与吸光度值的对数呈线性关系计算碘含量，克服了现有血清碘定量测定方法试剂配制复杂、易污染、易分解、危险性试剂用量多、实验仪器昂贵、所需血清量较多的缺点。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：

一种血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：100μg/mL的碘标准储备溶液、70％～72％的高氯酸(消解液R₁)、2.0mol/L氯酸钠溶液(消解液R₂)、0.025mol/L的亚砷酸溶液(还原剂R₃)及Ce⁴⁺浓度为0.025mol/L的硫酸铈铵溶液(氧化剂R₄)。

所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测人体或动物体血清中碘含量。

所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于血清碘含量测定的方法为：

(1)采集不少于2mL血液，室温静置0.5h，于3000r/min离心10min，分离出血清，严密封口，保存；

(2)利用100μg/mL的碘标准储备溶液制备不同浓度的碘标准使用系列溶液；

(3)取0.1mL不同浓度的碘标准使用系列溶液及血清样于玻璃试管，各管分别加入70％～72％的高氯酸和2.0mol/L氯酸钠溶液，混匀后，置于消化控温加热装置中，消化，冷却至室温；

(4)向各管分别加入0.025mol/L的亚砷酸溶液，充分混匀后，静置15min，使其温度达到平衡；

(5)秒表计时，依序每管间隔相同时间，向各管分别加入Ce⁴⁺浓度为0.025mol/L的硫酸铈铵溶液，立即混匀；

(6)待标准系列中碘浓度最高的管的吸光度值达到0.10左右，依序每管间隔相同时间，于400nm波长下，以纯水作参比，测定各管吸光度值；

(7)以碘浓度为横坐标，吸光度值的对数为纵坐标绘制标准曲线；

(8)用最小二乘法进行线性回归，得回归方程。

所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，步骤(3)中，消化控温加热装置温度为130℃±2℃；步骤(5)及步骤(6)中间隔的时间为20～30s。

本试剂盒应用过程中所涉及的化学方程式如下：

消化阶段：

加入亚砷酸溶液：

IO₃ ^-+3AsO₃ ^3-→I^-+3AsO₄ ^3-

加入硫酸铈铵溶液：

本发明所用高氯酸为直接购买的试剂，氯酸钠溶液配制简单，存放时间较长并较为稳定；测定过程所需亚砷酸溶液及硫酸铈铵溶液浓度相对现有技术均有较大程度降低，减少了对环境的污染以及对实验人员的危害；检测所需血清量较少；检测结果准确度较高；适合大批量血清样品的检测。

本试剂盒的研发，满足了临床上个体碘营养评价以及疾病预防控制部门中血清碘定量测定的需求，为进一步制定血清碘正常值标准提供定量测定基础，进而解决碘缺乏病防治的重要问题，逐步实现因地制宜、分类指导、科学补碘的防治策略，助力实现因人而异、知情选择的补碘方式。同时，本试剂盒也可以用于科研工作中动物血清碘含量的检测，为科研工作中有关血清碘定量检测提供便捷的方法。因此，本产品的研发具有较大的社会效益。

附图说明

图1为本发明血清中碘定量测定试剂盒的示意图。

图2为本发明标准曲线图，横坐标为碘的浓度(μg/L)，纵坐标为吸光度值的对数。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本产品试剂配制用纯水符合GB/T 6682中二级水规格。

实施例1一种血清碘定量测定的试剂盒制备

1、100μg/mL的碘标准储备溶液的配制

准确称取经105～110℃烘干至恒重的碘酸钾0.1686g于烧杯中，用纯水溶解后定量转移入1000mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，避光保存。

应用碘标准储备溶液配制的标准系列溶液，在检测时有较好的线性关系及吸光度值范围，能够满足人体及动物血清碘含量的检测。

2、70％～72％的高氯酸(消解液R₁)及2.0mol/L氯酸钠溶液(消解液R₂)的配制

2.1消解液选择

血清与其他样品相比，其基底成分复杂，无机离子含量广泛，蛋白质含量高。因此消解液的选择对产品的研发尤为重要。通过查阅有关文献及相关知识，本项目组人员试验了多种消解液，包括过硫酸铵和硫酸锌、盐酸与双氧水和过硫酸铵、硝酸和双氧水、硝酸和高氯酸、氯酸钠和盐酸、氯酸钠和硫酸、氯酸钠与硫酸和氯化钠、氯酸钠与硫酸和硫酸锌、氯酸钠与高氯酸和硫酸锌、氯酸钠与硝酸和硫酸锌、氯酸钠和高氯酸等10余种组合消化剂。

经过对各种试剂的浓度及用量、消化温度及时间的综合调整，以消化得到清亮无色溶液为消化终点，对整个消解过程进行探究。发现采用70～72％的高氯酸(消解液R₁)0.5ml、2.0mol/L的氯酸钠溶液(消解液R₂)0.6ml于130℃条件下对血清进行消化2h，得到的消化效果最好。

2.2消解液配制

消解液R₁(高氯酸)：直接购买，70％～72％，优级纯；

消解液R₂(氯酸钠溶液)[c(NaClO₃)＝2.0mol/L]：称取106.5g分析纯的氯酸钠，加入450mL纯水溶解，再加纯水稀释至500mL，避光保存。

3、0.025mol/L的亚砷酸溶液(还原剂R₃)及0.025mol/L的硫酸铈铵溶液(氧化剂R₃)的配制

3.1还原剂与氧化剂的选择

还原剂(亚砷酸溶液)、氧化剂(硫酸铈铵溶液)的浓度及用量将影响所检测血清碘含量的准确性，对实验人员危害和环境污染的大小。因此对亚砷酸、硫酸铈铵溶液浓度及用量的要求是既要减少三氧化二砷的用量，又要得出较好的检测结果。在其他条件相同的情况下，砷铈催化反应的程度受反应温度和时间的影响，温度太高，使反应速度过快而影响结果的准确度；温度过低，反应速度又太慢，使检测效率降低。

在15℃～30℃的稳定温度下，经过对亚砷酸、硫酸铈铵溶液浓度及用量的调整，得出：还原剂R₃(亚砷酸溶液)3.0ml，氧化剂R₄(硫酸铈铵溶液)0.6ml，待标准系列溶液中300μg/L浓度试管吸光度值达到0.10左右时，400nm波长处测定。该反应体系满足要求。

3.2还原剂R₃与氧化剂R₄的配制

还原剂R₃(亚砷酸溶液)[c(H₃AsO₃)＝0.025mol/L]：称取2.5g分析纯的三氧化二砷、3.0g分析纯的氢氧化钠于1L的烧杯中，加纯水约30mL搅拌至全部溶解，向烧杯中加纯水约500mL，并加入40.0g优级纯的氯化钠，搅拌至完全溶解，再缓慢加入200mL硫酸溶液(2.5mol/L)，至室温后用纯水稀释至1L，储于棕色瓶，避光保存。加入氯化钠的目的在于，使测定体系有较高浓度的Cl^-，以掩盖和抑制血清样中Cl^-及其量的变异，包括样品管血清基体成分氯化物盐量与标准管之间的差异，对测定结果的影响，保障血清碘定量测定的准确度和精密度

硫酸溶液[c(H₂SO₄)＝2.5mol/L]：取140mL优级纯浓硫酸缓慢加入到700mL纯水中，边加边搅拌，冷却后用纯水稀释至1L。

氧化剂R₄(硫酸铈铵溶液)[c(Ce⁴⁺)＝0.025mol/L]：称取14.9g分析纯的硫酸铈铵[Ce(NH₄)₄(SO₄)₄]或16.7g四水合硫酸铈铵[Ce(NH₄)₄(SO₄)₄·4H₂O]溶于700mL已经配置好的2.5mol/L硫酸溶液，用纯水稀释至1L，储于棕色瓶，避光保存。

制备所得试剂盒如图1所示。

实施例2实验仪器与设备

1、恒温消解仪(控温点精度130℃±2℃，孔间温差≤1℃)

2、分光光度计

3、玻璃试管：15mm×100mm或15mm×120mm

4、秒表

实施例3试剂盒性能指标考察

依据《GB/T 210.5-2008职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质的测定方法》对本发明的血清中碘的定量测定的试剂盒的方法特性进行测定，测定结果如下：

1.制备如实施例1所述的试剂盒。

2.样品采集和保存

使用一次性真空采血管采集不少于2mL血液，室温静置0.5h后，于3000r/min离心10min,分离出血清置于具塞聚乙烯塑料管中，严密封口以防水分蒸发。在室温(20℃)下可保存7天，在4℃下可保存2个月，密封后冷冻(-20℃)至少可保存3个月。血液样品或血清样品在现场采集、运输和保存过程中应避免与加碘物品接触。

3.标准使用系列溶液的配制

3.1碘标准中间溶液(10μg/mL)：吸取10.00mL碘标准储备溶液置于100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，此溶液1mL含碘10mg。储于具塞严密的棕色瓶，可保存1个月。

3.2碘标准使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘标准中间溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分别置于100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，此标准系列溶液的碘浓度分别为0，50，100，150，200，250，300μg/L。于400nm波长下，用1cm比色杯，以纯水作参比，测定各管的吸光度值A。

4.标准曲线线性范围及相关性

本方法标准曲线的横坐标为碘标准液的浓度(μg/L)，纵坐标为吸光度A的对数，线性范围为0～300μg/L，在此范围内，标准曲线连续平行测定6次，分别计算每条曲线各点测得的平均吸光度、变异系数及相关系数，最终制得一条标准曲线，测定结果见表1及图1。

表1标准曲线线性范围及相关性

5.检出限

根据国际理论化学与应用化学联合会(IUPAC)的规定，用式C_L＝C_D+3σ计算检出限，以空白值测定不少于10次所得的σ值，乘以3倍得出检出限。本方法取样量0.10ml，重复检测空白管的吸光度值(n＝10)，检出限为4.7μg/L。

6.精密度

在标准曲线范围内，测定低、中、高3种碘浓度的血清样品，每次测定3个平行样，重复测定6次，其变异系数均<5％，符合生物样品的测定要求。测定结果见表2。

表2血清中碘的测定精密度实验结果

7.准确度

对低、中、高3种浓度的血清进行加标回收实验，每次测定3个平行样求平均值，重复测定3次，平均回收率分别为96.2％、98.9％、98.5％，其中，回收率＝(加标样品测定值-样品测定值)/加标量*100％，回收率范围94.5％～101.5％，总平均回收率97.9％，符合生物样品的测定要求。测定结果见表3。

表3血清中碘的测定加碘标回收率实验结果

8.干扰实验

分别在100μg/L、200μg/L碘标准溶液中加入不同浓度的碘干扰物质进行干扰实验。结果为，1L中分别含有11g/L NaCl，1.5g/L HPO₄ ^2-，700mg/L KNO₃，200mg/L Ca²⁺、365mg/L Mg²⁺、2mg/L F^-、2mg/L Fe²⁺、2mg/L Zn²⁺、2mg/L Cu²⁺、0.05mg/L Hg²⁺、2g/L甘氨酸、10g/L葡萄糖、3g/L尿素、30mg/L抗坏血酸、100g/L蛋白时，均不干扰测定，表明本方法具有较强的抗干扰能力。

9.试剂稳定性

9.1取同一批次生产的“血清碘定量检测试剂盒”6盒，于常温保存；

9.2每个月取一盒本产品，对近期(7天内)采集的血清进行测定，同时进行方法特性实验验证；

9.3结果显示：常温保存6个月内检测血清碘结果准确且方法特性测定实验数据一致并符合《GB/T 210.5-2008职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质的测定方法》中的测定要求。

实施例4试剂盒用于血清中碘含量定量测定

1.制备如实施例1所述的试剂盒。

2.样品采集和保存

3.标准使用系列溶液的配制

3.2碘标准使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘标准中间溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分别置于100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，此标准系列溶液的碘浓度分别为0，50，100，150，200，250，300μg/L。

4.血清碘含量的检测分析步骤

4.1分别取0.10mL碘标准使用系列溶液及血清样(如果血清样的碘浓度超过标准曲线的碘浓度范围，则纯水稀释后取样)各置于玻璃试管中，各管加入0.5mL消解液R₁、0.6mL消解液R₂，混匀后置于130℃的消化控温加热装置中，消化120min，取下冷却至室温。以下分析4.2～4.4，可在15℃～30℃之间一个稳定的温度环境下(室温或控温)进行，要求温度波动不超过±0.3℃。

4.2各管加入3.0mL还原剂R₃，充分混匀后放置15min，使其温度达到平衡，将标准系列管按碘浓度由高至低顺序排列。

4.3秒表计时，依顺序每管间隔30s向各管准确加入0.60mL氧化剂R₄，立即混匀。

4.4待第一管(即标准系列中加300μg/L碘浓度管)的吸光度值达到0.10左右时，依顺序每管间隔同样时间30s于400nm波长下，用1cm比色杯，以纯水作参比，测定各管的吸光度值。

4.5标准曲线绘制：以碘浓度为横坐标，吸光度值对数为纵坐标绘制标准曲线。

5.结果计算

5.1标准曲线法：

以测得的血清样品管的吸光度值在标准曲线上查得所测样品的碘浓度C，再按(5.3)计算血清中的碘浓度。

5.2回归方程法：

碘质量浓度C(μg/L)与吸光度值A的对数值成线性关系：见式(1)，按式(1)求出标准曲线的回归方程，将样品管的吸光度值代入式(1)，求出所测样品中碘质量浓度，再按(5.3)式(2)计算血清中碘的质量浓度。

C＝a+b lgA(或C＝a+b lnA)……………(1)

式中：

C—碘标准使用系列溶液(或所测样品)中碘的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

A—碘标准使用系列溶液(或所测样品)测定的吸光度值；

a—标准曲线回归方程的截距；

b—标准曲线回归方程的斜率。

5.3血清中碘浓度：

按式(2)计算：

ρ(I)＝C×K………………………………………(2)

式中：

ρ(I)—血清中碘浓度，单位为微克每升(μg/L)；

C—由标准曲线查得的或由标准曲线回归方程计算得的所测样品中碘浓度，单

位为微克每升(μg/L)；

K—血清样稀释倍数。

血清样品检测时，按照4.5进行标准曲线作图，如图2所示，碘质量浓度C(μg/L)与吸光度值A的对数值的线性方程为：C＝53.307-264.43lgA。采集185例人体血清样品，利用如实施例1所述的试剂盒采用上述使用方法进行检测，依照5.1或5.2所示的计算方法，检测结果为：血清碘含量范围为36～97μg/L，与世界卫生组织、美国梅奥医学中心和奎斯特诊断公司三家国际知名实验室提供的电感耦合等离子体质谱法测定的碘代谢指标的参考值范围基本一致，实验结果见表4。

表4电感耦合等离子体质谱法测定的血清碘国际参考范围

上述实施例仅用于说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行的修饰或改变，仍由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：100μg/mL的碘标准储备溶液、70％～72％的高氯酸、2.0mol/L氯酸钠溶液、0.025mol/L的亚砷酸溶液及Ce⁴⁺浓度为0.025mol/L的硫酸铈铵溶液。

2.如权利要求1所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测人体或动物体血清中碘含量。

3.如权利要求1所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于血清碘含量测定的方法为：

(6)待标准系列中碘浓度最高的管的吸光度值达到0.10，依序每管间隔相同时间，于400nm波长下，以纯水作参比，测定各管吸光度值；

(8)用最小二乘法进行线性回归，得回归方程。

4.如权利要求3所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，步骤(3)中，消化控温加热装置温度为130℃±2℃。

5.如权利要求3所述的血清碘定量测定的试剂盒，其特征在于，步骤(5)及步骤(6)中间隔的时间为20～30s。