CN112540115A - 用于检测全血中6种单元素的内标组合溶液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适于检测全血中6种微量元素的简单的内标组合溶液，以及利用该内标校准品使用电感耦合等离子质谱法测定人体全血中6种、甚至9种微量元素的方法，属于生物检测技术领域。该内标校准品由内标元素和稀释剂组成。本发明提供的全血6种微量元素内标校准品，均匀性和稳定性良好，成本低廉，制备方法简单。使用该内标校准品检测人体全血中的微量元素含量，灵敏度高，前处理简单，检测时间短，结果准确，稳定性好，在医药卫生领域将有广阔的应用前景。

Description

用于检测全血中6种单元素的内标组合溶液

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种利用电感耦合等离子体质谱法测定人体全血中Mn元素的内标校准品，以及利用电感耦合等离子体质谱法测定人体全血中Mn元素的方法。

背景技术

根据人体内元素含量的多少，人体内的元素可以被分为常量元素和微量元素，其中常量元素是指占人体比重超过万分之一的元素，包括钙(Ca)、钠(Na)、磷(P)、钾(K)、镁(Mg)、氯(Cl)和硫(S)等，而微量元素则是指含量处于人体总量的万分之一以下，且日需摄入量低于100mg元素。1995年，微量元素中的铜(Cu)、钴(Co)、铬(Cr)、铁(Fe)、氟(F)、碘(I)、锰(Mn)、钼(Mo)、硒(Se)和锌(Zn)等10种元素被FAO/WHO(FoodandAgricultureOrganization/WorldHealth Organization，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织)的专家委员会列为维持人体正常生命活动所不可缺少的必需微量元素。

锰是人体必需的饮食元素。它是许多蛋白质和酶的关键成分，并以辅酶的形式参与多个生物反应。除构成辅酶以外，锰的生理功能还包括：促进骨骼之发育以及生长；维持脑功能之正常运作；维持糖以及脂肪之正常代谢；维持细胞线粒体之完整。人体含有约12毫克的锰，大部分在骨骼中，也常见于肝脏和肾脏。在人脑中，锰与锰金属蛋白结合，常见的有星形胶质细胞中的谷氨酰胺合成酶。美国医学研究所(IOM)设定成人每日锰摄入上限为11mg。锰缺乏比较罕见，但锰摄入过量会导致锰中毒，产生类似于帕金森疾病的症状。

钙是人体内最丰富的金属元素及第五丰富的元素。人体的钙含量约1-1.25kg，占体重1.5-2％，钙原子数目仅次于C、H、O、N四种非金属元素，为身体中含量最多的金属。每千克非脂肪组织中平均约含钙20-25g。体内钙99％以上都分布在骨骼和牙齿中，其余不足1％的钙分布在体液及全身各组织器官中，是多种生理活动的参与者。骨钙的组成主要是羟磷灰石结晶，占骨骼重量40％以上，其次是碳酸盐、柠檬酸盐以及少量氯化物和氟化物的形式。骨钙对维持血钙的浓度极为重要，被称作人体钙元素的“储存库”。血浆中的钙有48％为离子形式，46％与蛋白质结合，3％为复合物形式，还有3％未被确认。血钙的浓度相当稳定，浓度大约为10-11mg/100mL，无年龄、性别差异。血钙由副甲状腺素(PTH)精密控制，使骨钙和血钙处于平衡之中。血钙浓度低，则由骨钙补充；反之，血钙浓度高，则将钙沉积于骨中储存，或经肾脏于尿中排出体外。世界各地区的钙摄取量有很大的差异，欧美等发达国家平均毎人每日摄取850mg，而非洲、拉丁美洲及大部分发展中国家只有344mg，相差一倍以上。因此钙摄取不足在发展中国家是个严重的健康议题。钙离子对神经组织有特殊且重要的影响，如果血钙离子浓度下降，神经组织会过度兴奋，导致手足抽搐；另一方面，高血钙抑制神经兴奋，短期引致尿毒症，如多尿、水肿、头痛、头晕、夜尿、腰痛、眼蒙，长远导致肾结石、骨骼早闭(停高)、肾功能受损及肾衰竭。因此开发测定人体全血中钙元素的内标校准品，以及利用其测定人体全血中钙元素的方法对人体健康有着至关重要的意义。

镁在人体内的含量很丰富，是人体必需的元素之一，镁在生命过程中能够促进骨及细胞形成，催化和激活机体内多种酶，参与体内能量代谢，并在能量的输送、储存中起着关键的作用。镁对神经、肌肉和心脏功能具有重要作用，镁不仅在机体代谢中起着关键作用，而且在心肌收缩和传导性、神经化学传递、骨骼肌兴奋性，以及维持正常Ca2+、K+和Na+浓度也起着重要作用。镁代谢异常与消化系统、肾脏和内分泌等各种疾病关系密切。因而血清镁测定作为临床生化的重要组成部分，在疾病的预防、诊断以及治疗监测中起着重要的作用。

钒在人体内含量极低，体内总量不足1mg。主要分布于内脏，尤其是肝、肾、甲状腺等部位，骨组织中含量也较高。人体对钒的正常需要量为100μg/d。钒在胃肠吸收率仅5％，其吸收部位主要在上消化道。此外环境中的钒可经皮肤和肺吸收入体中。血液中约95％的钒以离子状态(VO2+)与转铁蛋白结合而送输，因此钒与铁在体内可相互影响。钒对骨和牙齿正常发育及钙化有关，能增强牙对龋牙的抵抗力。钒还可以促进糖代谢，刺激钒酸盐依赖性NADPH氧化反应，增强脂蛋白脂酶活性，加快腺苷酸环化酶活化和氨基酸转化及促进红细胞生长等作用。因此钒缺乏时可出现牙齿、骨和软骨发育受阻。肝内磷脂含量少、营养不良性水肿及甲状腺代谢异常等。

铝是人体非必需微量元素。在低剂量时，可能属于人体必需功能的元素，但具有潜在的毒性。铝在一定含量时,生物是可能耐受的,但稍过量,其毒性即增加,最终导致死亡。由于铝在人体摄入后蓄积为血铝，仅有10％～15％可能排泄，大部分会在体内蓄积。铝会与多种蛋白质、酶等人体重要成分结合，影响体内多种生化反应，长期摄入会损伤大脑，导致痴呆，还可能出现贫血、骨质疏松等疾病，尤其对身体抵抗力较弱的老人、儿童和孕妇产生危害，可导致儿童发育迟缓，老年人出现痴呆，孕妇摄入则会影响胎儿发育。研究证实，脑组织对铝元素有亲和性，脑组织中的铝沉积过多，可使人记忆力减退、智力低下、行动迟钝、催人衰老。因此，监测血铝含量对于维护人体健康具有重要的意义。

铬广泛地存在于自然环境中，地壳中铬的平均浓度可以达到125毫克/千克，主要以三价铬和六价铬的形式存在。进入人体的铬被积存在人体组织中，代谢和被清除的速度缓慢。铬进入血液后，主要与血浆中的球蛋白、白蛋白、r-球蛋白结合。六价铬还可透过红细胞膜，15分钟内可以有50％的六价铬进入细胞，进入红细胞后与血红蛋白结合。铬的代谢物主要从肾排出，少量经粪便排出。六价铬对人主要是慢性毒害，它可以通过消化道、呼吸道、皮肤和粘膜侵入人体，在体内主要积聚在肝、肾和内分泌腺中。通过呼吸道进入的则易积存在肺部。六价铬有强氧化作用，所以慢性中毒往往以局部损害开始逐渐发展到不可救药。经呼吸道侵入人体时，开始侵害上呼吸道，引起鼻炎、咽炎和喉炎、支气管炎。

鉴于在人体(尤其是血样)中检测以上6种微量元素具有十分重要的意义，因此需要一种能够准确和灵敏的检测方法。目前，全血中各种元素含量测定的方法有原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)等。其中，根据原子化的方式不同，原子吸收光谱法又可以被分为石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)、流动注射-冷蒸汽发生原子吸收光谱法(FI-VGAAS)以及火焰原子吸收光谱法(FAAS)。GF-AAS具有取样量少、前处理简单、灵敏度高、能直接分析固体和高粘度液体试样等优点，适用于生物样品的分析，在实际元素检验工作中被广泛应用，较为严重的基体干扰是其主要缺点，此外，一次只能对一种元素进行检测，耗时较长。FAAS是一种经典的分析技术，具有信号稳定、干扰相对较小、分析速度快、操作简单等优点，在痕量元素检测中多被采用。该方法的主要缺点是不适合测定分解不完全的耐高温元素、碱土金属元素以及共振吸收谱线在远紫外区的元素。FI-VGAAS可用于氢化物或冷蒸汽形成的元素检测，如砷、硒、铋、汞等。

由于AAS和AFS分析周期长，一次只能检测一种元素，效率低，准确性和线性范围不能涵盖所有的临床元素浓度和易受到机体干扰的影响等原因，限制了其在临床上的应用；而ICP-AES可同时测定许多元素，操作方便，成本低，稳定性好，是临床上常用的检测方法，但其测定过程中需要使用相应的基体改进剂，样品前处理过程繁琐，同时其检出限也无法满足血中重金属元素含量测定的要求。电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是20世纪80年代发展起来的无机元素和同位素分析测试技术，它以独特的接口技术将电感耦合等离子体的高温电离特性与质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种高灵敏度的分析技术。ICP-MS法检测人体微量元素具有灵敏度高、线性范围广和可进行多元素同时检测、样品需用量少等特点，适用于大批量样品的测定，现已被广泛用于地球科学、环境分析、食品科学、石油工业及冶金分析等领域。

研究发现，在人体微量元素检测中，内标校准品对于检测结果的准确性具有至关重要的作用。校准品即校准物，是在校准函数中其值被用作自变量的标准物质，用于校准测量系统或为材料赋值；正确性质控物质是用于评价一种测量系统的测量偏差的标准物质。

中国专利申请“一种血清钙标准物质”(专利申请号：200910237607.0)公开了一种血清钙标准物质，通过如下方法制备：对离体血清进行稀释或钙添加，得到5种不同钙浓度的血清溶液，再分别对所述5种不同钙浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值，得到5种钙浓度的血清钙标准物质。互通性好，均匀性好，-80℃储存条件下稳定性也良好。但是，该发明公开的血清钙标准物质以离体血清为基体，是由来自于不同个体的离体血清混合而成的，配置难度大，操作相对繁琐。因此，需要一种人体微量元素检测内标校准品，提高人体血液中微量元素检测的准确度和稳定性，提高检测精密度，缩短检测时间，降低检测成本。

中国专利申请“电感耦合等离子体质谱法测定人体全血中微量元素的方法”(申请号：201610197111.5)提供了一种电感耦合等离子体质谱法测定人体全血中微量元素的方法。该方法所用内标元素为钪(Sc)、锗(Ge)、钇(Y)、铑(Rh)、铟(In)、铽(Tb)和铋(Bi)等7种内标元素，内标工作溶液以体积分数为0.2％的硝酸作为稀释液稀释配制而成，浓度为20-100μg/L。虽然该方法能在一定程度上完成对多种微量元素的检测，但需要配置7种内标元素，过程繁琐且耗费昂贵的内标品。

中国专利申请“一种测定生物组织及体液中痕量金属含量”(申请号：201810749441x)提供了一种电感耦合等离子体质谱法测定体液中痕量元素的方法。该方法所用内标元素为钪(Sc)、锗(Ge)、钇(Y)、铟(In)、铽(Tb)等5种内标元素，内标工作溶液以体积分数为1％的硝酸作为稀释液稀释配制而成，浓度为1-30000μg/L。虽然该方法只需要配置5种内标元素，但仍然存在过程繁琐且耗费昂贵的内标品的缺陷。

本发明人在先的中国专利申请“一种用于检测血清中20种元素的ICPMS检测试剂盒”(申请号：2016110405291)公开了测定血清中20种元素的方法及配套试剂盒，该试剂盒主要用于电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测定血清中20种元素含量时所需样品前处理及质量控制，包括稀释液、含20种微量元素的标准溶液、质控品、内标储备液。该方法所用内标元素为为锗72Ge、铟115In、镥175Lu、铑103Rh等4种内标元素，内标工作溶液以体积分数为2％的硝酸作为稀释液稀释配制而成，浓度为100μg/L。虽然该方法只需要配置4种内标元素，但仍然耗费过多昂贵的内标品的缺陷，同时为了克服较少的内标元素而带来的灵敏度下降的缺陷，该发明需要绘制复杂的7点标准曲线，分别配制7管独立的标准溶液储备液，然后各自或组合配制混合中标液，配制过程过于繁琐，带来了使用的不便。

发明人在先的中国专利申请“一种测定人体尿液中微量元素的试剂盒”(申请号：2016110348477)公开了测定人体尿液中微量元素的方法及配套试剂盒，包括稀释液、含21种微量元素的标准溶液、质控品、内标储备液等，包括稀释液、含21种微量元素的标准溶液、质控品、内标储备液。该方法所用内标元素为为锗72Ge、铟115In、铑103Rh等3种内标元素。虽然该方法进一步只需要配置3种内标元素，但仍然耗费过多昂贵的内标品的缺陷，同时为了克服较少的内标元素而带来的灵敏度下降的缺陷，该发明需要绘制复杂的7点标准曲线，分别配制7管独立的标准溶液储备液，然后各自或组合配制混合中标液，配制过程过于繁琐，带来了使用的不便。

此外，对于内标样品及数量的选择，田梅等(ICP-MS测量环境样品中铀的非质谱干扰内标校正研究[J].分析试验室，2012，31(8):116-120)认为，ICP-MS优先选择与待测元素质量数、电离能相近的元素作为内标。根据《空气和废气颗粒物中铅等金属元素的测定电感耦合等离子体质谱法》(HJ657—2013)和《水质65种元素的测定电感耦合等离子体质谱法》(HJ700—2014)的要求，“内标元素应根据待测元素同位素的质量大小来选择，一般选用在其质量数±50amu范围内可用的内标元素，其中推荐了65种元素内标物”。然而使用同一内标系统检测多种微量元素时，就必须从各种与待测元素质量数、电离能相近的元素作为内标，导致现行可用的内标组合数量过多，带来了使用的不便。但是，如果只使用过少的内标数量(例如1-2种)，虽然可以减少成本和使用方便，但因为缺少了待测元素质量数相近的必要的内标元素，又存在着灵敏度降低的不足，影响了ICP-MS检测血液微量元素的应用。

基于以上的研究，目前需要一种能够使用更少数量的内标标准品组合，同时能维持灵敏度的检测技术，以实现针对上述6种、甚至更多不同质量大小的微量元素的检测。

发明内容

本发明原理之一在于，在现有的钪(Sc)、锗(Ge)、钇(Y)、铟(In)、铽(Tb)、镥(Lu)、铑(Rh)、铑(Rh)、铽(Tb)、铋(Bi)等较多数量的内标品组合的基础上，优选出仅有钪(Sc)、锗(Ge)的简单元素组合，即可作为6种微量元素的内标校准品。

本发明原理之二在于，在适用于质谱基体溶液的样品溶剂或用于清洗仪器的有机溶剂(例如，乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷等)中，意味地发现选用一定含量比例的异丙醇作为基体溶剂，所配制的内标溶液相比于不使用异丙醇的基体溶剂，或相比于选用其他溶剂(例如甲醇、正丁醇、乙腈等)，能有效的克服基体效应的不利影响，进而增强了待测微量元素的信号检测强度。因此，选用特定比例的异丙醇作为内标品的基体溶液，能够有效提高钪(Sc)、锗(Ge)的简单元素组合的检测灵敏度。进一步地，本发明还测试了不同比例的甲醇、正丁醇、乙腈与异丙醇进行混合，从中优选出最适的混合比例来制备内标品的基体溶液。

本发明原理之三在于，在以上基础上，进一步调整和优化基体溶液的其他组分(硝酸、曲拉通)及其含量比例，从而获得最优化的用于检测6种、甚至更多微量元素的内标校准品系统。

本发明原理之四在于，在以上基础上获得检测体系，进一步测试了fe、co、ni、cu、zn五种元素，验证了本发明的检测体系具有良好的检测效果。

基于以上发明原理，本发明目的之一是提供一种通过ICP-MS检测人体全血六种微量元素的内标组合溶液，其特征在于该内标组合溶液包含内标元素钪(Sc)、锗(Ge)和基体溶液，所述内标元素在基体溶液中的浓度为10-60μg/L，优选20-50μg/L，更优选30-40μg/L。

在一个实施方案中，所述基体溶液包含0.1％-0.5％(V/V)的硝酸，0.1％-0.5％(V/V)的曲拉通，以及用于提高灵敏度的1.5％-3％(V/V)的有机溶剂。

在上述任一的实施方案中，其中所述有机溶剂是异丙醇，其在基体溶液中的含量为2％(V/V)。

在上述任一的实施方案中，其中所述有机溶剂是异丙醇、甲醇、正丁醇、乙腈等，其含量比例为4：2：1：0.5。在优选的实施方案中，所述有机试剂在基体溶液的含量为2％(V/V)。

在上述任一实施方案中，所述内标组合溶液的制备步骤如下：

(1)在干燥无菌的器皿中依次加入基体溶液的3个组分硝酸、曲拉通、异丙醇，在室温下混合均匀；

(2)在步骤(1)得到的基体溶液中进行内标元素添加，使内标元素的浓度为40μg/L。

在一个优选实施方案中，所述锗是国家标准物质研究中心的编号为GSB04-1728-2004的国家标准物质，所述钪是国家标准物质研究中心的编号为GSB04-1750-2004的国家标准物质。

本发明第二目的是提供利用该内标组合溶液来校准ICP-MS微量元素分析仪的方法，步骤包括：

(1)将内标组合溶液放至室温，充分摇匀待用。

(2)检测时，将内标校准品和外标校准品(或质控品、或未知样本)同时进样；

(3)按照仪器操作规程，将微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)各参数调整到最佳状态；

(4)待仪器稳定后，将内标校准品和外标校准品同时进样，外标校准品按顺序(由0号到5号)依次进样，每个样本检测需要消耗内标校准品1mL,每个样本检测3次，取均值；

(5)将外标校准品中待测元素的信号和对应内标校准品元素信号的比值为纵坐标，外标校准品中待测元素的浓度为横坐标，绘制校准的标准工作曲线；

(6)检测待测样本中的微量元素和内标元素的信号，计算二者比值，并在所述校准的标准工作曲线的基础上，计算待测微量元素的浓度。

在一个实施方案中，所述微量元素分析仪为发明人自主研制的Clin-ICP-QMS-I分析仪。

在另一实施方案中，所述步骤(6)中，通过软件计算待测微量元素的浓度。

本发明的第三个目的是提供一种利用ICP-MS微量元素分析仪检测人体全血中六种元素的方法，包括：

(1)收集血液样本；

(2)样本前处理：将血样在稀释液稀释20倍后震荡混匀；

(3)加入质控品进行质量控制：

低浓度质控品：将低质控品放置室温平衡5-10分钟，再精确量取3mL纯化水加入其中，于超声清洗仪中超声4-5分钟至充分溶解，取100μL质控样至装有1.9mL稀释液的离心管中，再用已校验的移液枪移取20μL血样至装有9.98mL稀释液的离心管中，置于漩涡震荡器上充分混匀，待上机检测；

高浓度质控品：将高质控品提前放置室温平衡至充分融化，取100μL质控样至装有1.9mL稀释液的离心管中，再用已校验的移液枪移取20μL血样至装有9.98mL稀释液的离心管中，置于漩涡震荡器上充分混匀，待上机检测。

(4)上机检测

依次将空白试剂、校准溶液、质控血样、样品溶液引入仪器进行测定，在线加入内标溶液，样品溶液和内标液以1:1进样；当各元素校准曲线的相关系数在0.999以上时，方可进行质控血样的检测；当质控血样检测结果的误差在±20％以内，方可继续检测样品溶液。

(5)结果处理

根据混合元素标准溶液中待测元素信号和内标信号的比值和混合元素标准溶液中待测元素的浓度绘制校准曲线y＝ax+b，根据回归方程计算出所测样品中各待测元素含量的质量浓度(μg/L)，

全血中微量元素浓度的计算回归方程为：

ρ(X)＝c·K…………………………(1)

式中：

ρ(X)—全血微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

c—由标准曲线查得的全血微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

K—全血稀释倍数。

技术效果

1.上机检测前的准备工作操作简单，快速(<20min)，降低了因繁琐配制造成的人为操作失误的概率。

2.利用ICP-MS检测方法能够检测自由离子/元素，离子/元素复合物，以及元素总量。检测的元素种类多(283种)，灵敏度高(<0.001-10μg/L)。

3.直接采用标准工作曲线进行测试时，使用内标法进行校正可以获得最佳测试结果。

4.加入内标元素的目的是补偿分析过程中仪器的长期漂移，选择合适的内标元素，可以将测量稳定性提高一个数量级，最终体现在定量结果总体精密度上。

5.使用自主研发的微量元素分析仪，再保留所有ICP-MS检测方法优点的情况下，降低了检测成本。

原理与定义

本发明的原理在于，质谱系统的电感耦合等离子体源由高能的射频能量激发形成等离子体，含待测元素的外标校准品在高温等离子体的作用下，经过蒸发、解离、原子化和电离等过程，形成的一价正离子依次经过锥接口和离子传输系统进入高真空的四级杆快速扫描质谱检测部分。软件中根据混合元素外标校准品中待测元素信号和内标信号的比值及混合元素外标校准品中待测元素的浓度绘制标准曲线，以此对仪器进行校准。

术语“标准品”，即标准物质/标准样品，是一种材料或物质，其一种或多种特性值足够均匀和稳定并被良好确定，用于校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值。

术语“校准品”，即：校准物，是在校准函数中其值被用作自变量的标准物质，用于校准测量系统或为材料赋值；正确性质控物质是用于评价一种测量系统的测量偏差的标准物质。

标准物质有校准和评价测量系统两个主要功能。一种标准物质在一个测量程序或测量系统中即可以用作校准物质，也可以用作正确性质控物质，但不可以同时用作校准物质和正确性质控物质。一般情况下标准物质是指较高级别的标准物质，它们多数是有证标准物质。有证标准物质是附有证书的标准物质，其一种或多种特性值用可建立溯源性的程序确定，使之可溯源至准确复现的表示该特性值的测量单，每种确定的特性值都有给定置信水平的不确定度。可见有证标准物质和标准物质的区别是前者有明确的溯源性和不确定度要求。2007年8月1日我国正式发布和实施的《标准物质标准样品生产者能力认可准则》中对标准物质生产者的组织生产管理、标准物质的赋值及统计方法、不确定度评定、标准物质所须达到的性能指标等提出了较高的要求。

基体效应：通常用基体溶液配制的标准曲线或用基体溶液配制一定浓度的标准溶液，对检测结果进行校正。然而，在实际检测中，即使是同一基体的不同样品，所用的基体产生的基体效应也会有不同，有时甚至相反，尤其是检测生物样品中低分子量和高分子量的微量元素(参考4：稀释法快速测定人体血液和尿液中多种重金属元素)。因此，更有效的方法是尽量采用有效的净化方法，如SPE、液液萃取、GPC、冷冻离心。

附图说明

图1：实施例2中通过本发明测试的全血锰元素的标准曲线。

图2：对照实施例中通过无内标检测全血中的锰元素含量的标准曲线。

图3：对照实施例中通过单内标检测全血锰元素的标准曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的仪器、试剂等如下：

仪器：Clin-ICP-QMS-I微量元素分析仪(北京毅新博创生物科技有限公司)；分析天平(感量：0.0001g)；血液混匀器，摇摆20-80次/分，滚动20-80转/分；移液枪(20-200μL；100-1000μL)；旋涡混合器。

试剂：硝酸；纯化水(实验室自制)；全血样本稀释液、全血锰元素外标校准品、全血锰元素内标校准品、全血锰元素质控品。

硝酸(

分析级，Merck)

纯化水(≥18.2MΩ·cm)

曲拉通，试剂级，阿法埃莎(中国)化学有限公司

异丙醇，色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司

锗Ge、钪Sc单元素标准溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心

实施例一：人体全血锰元素内标校准品的制备

(1)1％HNO₃：量取5mL的HNO₃，用纯化水定容至500mL的容量瓶中，混匀；

(2)样本稀释液配制：量取0.5mL的HNO₃，0.5mL的曲拉通，10mL的异丙醇用纯化水定容至500mL的容量瓶中，混匀；

(3)人体全血锰元素内标校准品配制：将锗Ge和钪Sc单元素标准溶液用1％HNO3先稀释100倍，总体积为10mL，浓度为10mg/L，得到人体全血锰元素内标储备液；再取0.4mL人体全血锰元素内标储备液用样本稀释液稀释100倍，总体积为100mL，浓度为40μg/L，得到人体全血锰元素内标校准品。所有溶液配制均采用体积稀释法。

实施例二：利用内标校准品对微量元素分析仪进行校准

实验目的：利用内标校准品对微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)进行校正优化系统重复性和稳定性。

实验方法：

(1)将内标校准品放至室温(10～30℃)，充分摇匀待用。

(2)检测时，将内标校准品和外标校准品(或质控品、或未知样本)同时进样。

(3)按照仪器操作规程，将微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)各参数调整到最佳状态。待仪器稳定后，将内标校准品和外标校准品同时进样，外标校准品按顺序(由0号到5号)依次进样，每个样本检测需要消耗内标校准品1mL,每个样本检测3次，取均值。软件中根据外标校准品中待测元素的信号和对应内标校准品元素信号的比值为纵坐标，外标校准品中待测元素的浓度为横坐标，绘制工作曲线。其他的未知样本根据样本中待测元素的信号和对应内标校准品元素信号的比值，软件自动计算出对应的浓度。

实验结果：按照上述方法，可以得到如图1所示的标准曲线。

实施例三：116例人体全血样本中锰元素含量的检测

实验方法：

1.样本收集与保存

(1)采血人员采血时尽量不戴乳胶手套，可使用塑料手套，或不戴手套把手清洗干净；采血时彻底清洁静脉穿刺部位的皮肤，按顺序用碘酒、酒精清洁取血区皮肤(须用酒精将碘酒擦拭干净)；(2)使用肝素钠抗凝采血管采集约2mL全血，确保盖紧盖子，立即轻轻颠倒混匀，以避免凝血。如不能2小时内及时送检，应置2～8℃保存，最多不超过14天。

2.样本前处理

稀释20倍：全血样本(＞200μL)经血液混匀器混匀5-8分钟，用已校验的移液枪移取100μL血样至装有1.9mL稀释液的离心管中，置于漩涡震荡器上充分混匀，待上机检测。

3.质量控制

低浓度质控品：将低质控品放置室温平衡5-10分钟，再精确量取3mL纯化水加入其中，于超声清洗仪中超声4-5分钟至充分溶解，取100μL质控样至装有1.9mL稀释液的离心管中，再用已校验的移液枪移取20μL血样至装有9.98mL稀释液的离心管中，置于漩涡震荡器上充分混匀，待上机检测；

高浓度质控品：将高质控品提前放置室温平衡至充分融化，取100μL质控样至装有1.9mL稀释液的离心管中，再用已校验的移液枪移取20μL血样至装有9.98mL稀释液的离心管中，置于漩涡震荡器上充分混匀，待上机检测。

4.上机检测

参照仪器使用说明书，调整仪器至最佳状态。依次将试剂空白、校准溶液、质控血样、样品溶液引入仪器进行测定，在线加入内标溶液，样品溶液和内标液以1:1进样；当各元素校准曲线的相关系数在0.999以上时，方可进行质控血样的检测；当质控血样检测结果的误差在±20％以内，方可继续检测样品溶液。

5.结果处理

根据混合元素标准溶液中待测元素信号和内标信号的比值和混合元素标准溶液中待测元素的浓度绘制校准曲线y＝ax+b，根据回归方程计算出所测样品中各待测元素含量的质量浓度(μg/L)。

例：

全血中锰质量浓度的计算见式(1)：

ρ(Mn)＝c·K…………………………(1)

式中：

ρ(Mn)—全血锰(Mn)的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

c—由标准曲线查得的全血锰的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

K—全血稀释倍数。

在一个具体的实施方案中，所用样本稀释液的组成为：硝酸、曲拉通、异丙醇、纯化水。

6.实验结果：

表1对全血中Mn元素的检测结果

表2医学决定水平处的预期偏倚及其可信区间(95％CI)

对表1数据进行离群值检验和回归分析，没有离群值，回归系数r为0.993。对表1数据进行医学决定水平处的预期偏倚及其95％可信区间(95％CI)分析，结果见表2，检测到Mn元素95％CI均未超出1/2允许误差的限值，因此判定Clin-ICP-QMS-I系统检测有效，并与对照iCAP Q系统等效，但我们使用的国产仪器价格相对进口仪器(iCAP Q)便宜，极大降低了医院和检验机构的运营成本，减少了患者的经济负担。

对照实施例

(一)在无内标的情况下检测全血中的锰元素含量

实验方法：

(1)将没有加入锗Ge和钪Sc单元素的溶液(其余成分与内标标准液相同)作为对照内标校准品待用。

(2)检测时，将对照内标校准品和外标校准品(或质控品、或未知样本)同时进样。

(3)按照仪器操作规程，将微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)各参数调整到最佳状态。待仪器稳定后，将对照内标校准品和外标校准品同时进样，外标校准品按顺序(由0号到5号)依次进样，每个样本检测需要消耗对照内标校准品1mL,每个样本检测3次，取均值。软件中根据外标校准品中待测元素的信号和对照内标校准品元素信号的比值为纵坐标，外标校准品中待测元素的浓度为横坐标，绘制工作曲线。其他的未知样本根据样本中待测元素的信号和对照内标校准品元素信号的比值，软件自动计算出对应的浓度。

实验结果：按照上述方法，可以得到如图2所示的标准曲线。

如图2所示，在无内标元素的情况下，多数点的锰的相对偏差比用内标钪Sc校正后的相对偏差大。

(二)使用内标元素钇(Y)检测全血中的锰元素含量

实验方法：

(1)用元素钇Y替代元素锗Ge和钪Sc作为内标校准品进行配制，将内标校准品放至室温(10～30℃)，充分摇匀待用。

(2)检测时，将内标校准品和外标校准品(或质控品、或未知样本)同时进样。

(3)按照仪器操作规程，将微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)各参数调整到最佳状态。待仪器稳定后，将内标校准品和外标校准品同时进样，外标校准品按顺序(由0号到5号)依次进样，每个样本检测需要消耗内标校准品1mL,每个样本检测3次，取均值。软件中根据外标校准品中待测元素的信号和对应内标校准品元素信号的比值为纵坐标，外标校准品中待测元素的浓度为横坐标，绘制工作曲线。其他的未知样本根据样本中待测元素的信号和对应内标校准品元素信号的比值，软件自动计算出对应的浓度。

实验结果：按照上述方法，可以得到如图3所示的标准曲线。

如图3所示，用钇Y内标的情况下，多数点的锰的相对偏差比用内标钪Sc校正后的相对偏差大。

Claims (9)

1.一种通过ICP-MS检测人体全血六种微量元素的内标组合溶液，其特征在于该内标组合溶液仅包含内标元素钪(Sc)、锗(Ge)和基体溶液，所述内标元素在基体溶液中的浓度为10-60μg/L，所述六种微量元素为镁、铝、钙，钒、铬、锰。

2.权利要求1所述的内标组合溶液，其中所述内标元素在基体溶液中的浓度为20-50μg/L。

3.权利要求2所述的内标组合溶液，其中所述内标元素在基体溶液中的浓度为30-40μg/L。

4.权利要求1-3任一所述的内标组合溶液，其中基体溶液包含0.1％-0.5％(V/V)的硝酸，0.1％-0.5％(V/V)的曲拉通，以及用于提高灵敏度的1.5％-3％(V/V)的有机溶剂。

5.权利要求4所述的内标组合溶液，其中所述有机溶剂是异丙醇，其在基体溶液中的含量为2％(V/V)。

6.权利要求5所述的内标组合溶液，其中所述有机溶剂是异丙醇、甲醇、正丁醇、乙腈等，其含量比例为4：2：1：0.5。

7.权利要求6所述的内标组合溶液，其中所述有机试剂在基体溶液的含量为2％(V/V)。

8.权利要求1-7任一所述内标组合溶液的制备方法，其步骤如下：

(1)在干燥无菌的器皿中依次加入基体溶液的3个组分硝酸、曲拉通、异丙醇，在室温下混合均匀；

(2)在步骤(1)得到的基体溶液中进行内标元素添加，使内标元素的浓度为40μg/L。

9.权利要求8所述的制备方法，其中所述锗是国家标准物质研究中心的编号为GSB04-1728-2004的国家标准物质，所述钪是国家标准物质研究中心的编号为GSB04-1750-2004的国家标准物质。

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