CN107037113A - 一种用于检测血清中20种元素的icpms检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供测定血清中20种元素的方法及配套试剂盒,该试剂盒主要用于电感耦合等离子质谱仪(ICP‑MS)测定血清中20种元素含量时所需样品前处理及质量控制,包括稀释液、含20种微量元素的标准溶液、质控品、内标储备液等。该试剂盒所需样品的前处理简单,成本低廉、准确度和精密度高及稳定性好,适合于临床高通量样本的检测。本发明可用于检测人体血清有毒元素含量、检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测。
Description
技术领域
本发明涉及元素检测领域,为一种全新的试剂盒组成,用于ICP-MS检测人血清中的元素。
背景技术
根据人体内元素含量的多少,矿物质又可以被分为常量元素和微量元素,其中常量元素是指占人体比重超过万分之一的元素,包括钙(Ca)、钠(Na)、磷(P)、钾(K)、镁(Mg)、氯(Cl)和硫(S)等。而微量元素则是指含量处于人体总量的万分之一以下,且日需摄入量低于100mg微量元素。1995年,微量元素中的铜(Cu)、钴(Co)、铬(Cr)、铁(Fe)、氟(F)、碘(I)、锰(Mn)、钼(Mo)、硒(Se)和锌(Zn)等10种元素被FAO/WHO国际组织的专家委员会列为维持人体正常生命活动所不可缺少的必需微量元素,其中Fe又称为半微量元素;硅(Si)、镍(Ni)、硼(B)、钒(V)这四种元素则被列为可能必需微量元素,而铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铝(Al),铊(TI),砷(As)和锡(Sn)等六种元素则被列为具有潜在毒性,但低剂量时可能具有功能作用的微量元素。最后是近年来各国科研工作者所重点研究的对象,如锑(Sb),钨(W),钡(Ba),它们有潜在可能为人体必须的微量元素。
医学研究表明,虽然人体中微量元素的含量不多,但其对人体健康有着至关重要的作用。分子生物学的研究揭示,微量元素通过与蛋白质和其他有机基团结合,形成了酶、激素、维生素等生物大分子,发挥着重要的生理生化功能。微量元素是构成生物体的基本组成要素,其参与多种人体生化反应。微量元素是许多酶的组成成分,或是酶作用的辅助因子,在人体内有不可替代的重要作用。
微量元素是维持人体正常新陈代谢和生命活动的重要物质,具有调节细胞膜的通透性和维持神经肌肉兴奋性的作用,也是反映人体营养状况的重要指标,元素的缺失和富集可以引起多种疾病。微量元素亦是人体组织的重要组成成分,如铁为血红蛋白的重要组成成分,钙、磷、镁为组成牙齿、骨骼的成分,在体内成为某些酶、激素和维生素等的组成部分,研究发现体内50%-70%的酶需要微量元素的参与或激活,如硒是人体内硒谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分,铁参与血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及许多酶的合成,锰是超氧化物歧化酶的重要成分。
微量元素在人体中的作用具有二重性,当它们的摄入不足时,会使有微量元素参与的生理功能无法正常进行,引起人体生理的异常,而当他们摄入过量时,同样会对人体产生损害,导致产生疾病等。某些对人体有益的微量元素,在含量过高时同样会对人体产生毒副作用,如元素硒和铜等。人体摄入过多的某些微量元素,如砷,镉,铅等,会导致人中毒。
长期某些矿物质摄入不足,或人体对其吸收、利用障碍均可引起亚临床缺乏症状甚至缺乏病,如缺铁性贫血、儿童生长发育迟缓、骨质疏松、克山病等,而盲目过量补矿物质或食用污染的食物或饮料均可能引起过量或中毒,如摄入过量钠会增加血液循环的负荷,导致血压上升,久而久之,会引发中风和心血管疾病。
由于微量元素在人体中的作用的二重性,正常人体中对于微量元素是有一定的范围的,若低于或高于此范围提示身体的异常状态。
对于有益元素,钙、镁、铁、锌、硒等,若人血清中的含量低于标准范围,提示该进行相应的补充,或提示与相应疾病如缺铁性贫血、儿童生长发育迟缓、骨质疏松、克山病的相关性。对于有害元素,铅、镉、汞、砷、铊等,若血清中含量超限则提示中毒,必须进行相应的解毒措施。对于与特异性疾病相关的一些微量元素,其含量的变化提示疾病的发展阶段及预后情况。
人体元素分析涉及的生物检材有血液、尿液、头发、骨头和指甲等,其中最常用的是血液。研究表明,机体内含铁Fe、铜Cu、锌Zn总量减少时,均可减弱免疫能力,助长细菌感染,而且感染后的死亡率亦较高等;当部分微量元素(重金属元素)超过一定浓度时,可引起急性中毒或在人体内畜积产生长久的毒害作用。尤其随现今工业的发展,金属污染涉及到了人类活动的各个领域,当各金属元素浓度超过一定生物接触限值时即可引起中毒。研究表明,人体毒物或毒物代谢物的含量测定,是临床上证实毒物中毒的最关键的客观依据,生物材料中有毒物质的增高能说明毒物在体内的过度吸收。因此准确、快速的微量元素分析及检测结果的医学评价,对人体疾病诊断和环境、职业健康研究的生物监测提供有力依据。
此外,在扫毒禁毒中,对于各类新型毒品的微量元素的检测已经成为扫毒禁毒工作中的重点,而对于司法实践工作中,以无机元素毒物投毒和自杀等案件也时有发生,例如在法医学鉴定中,需要准确、快速对中毒原因和中毒程度作出判断,但无机元素目标物的不确定性以及毒物种类的广泛性,导致元素检测存在一定的复杂性,且不同元素的急性中毒可能会出现相似的症状。另外,在体内兴奋剂的检测工作中,由于各种新型兴奋剂具有的代谢快、残留低、难检测的特点,对于超时的代谢后的兴奋剂的微量成分的检测,也一直成为体育界反兴奋剂工作的研究热点。因此,除了疾病诊断和环境、职业病等健康监测工作中,在司法、执法工作以及其他领域中(如反兴奋剂工作)中进行准确、快速的无机元素分析及检测结果,对了解事实真相具有重要意义。
由于血清中含有人体内多种微量元素,血清中元素浓度能够在很大程度上代表人体内元素水平,对其中微量元素含量的检测,在临床上具有重要意义,因此人血液中元素的浓度常作为重要的生物学指标。然而,随着微量元素与疾病关系的日益明确以及人们对健康问题的密切关注,准确、快速、方便的测定人体内微量元素的含量,成为微量元素检测领域急需解决的问题。人体体液中微量元素检测的主要难点在于某些元素的浓度很低,甚至达到ng/L-ug/L级别,而且基体复杂,给检测带来干扰,因此如何准确快速的进行多元素同时测定,是亟待解决的问题。
目前对于元素的检测方法有:原子吸收光谱法(Atomic AbsorptionSpectrometry:AAS)、原子发射光谱法(Atomic Emission Spectrometry:AES)、原子荧光光谱法(Atomic Florescence Spectrometry:AFS)、紫外可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry:UVS)、电感耦合等离子体质谱(inductively coupledplasma-mass spectrometry:ICP-MS)。
表1:几种不同微量元素检测方法的特点比较
血中微量元素的测定常采用原子吸收法(AAS),根据原子化的方式不同,原子吸收光谱法又可以被分为石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)、流动注射-冷蒸汽发生原子吸收光谱法(FI-VGAAS)以及火焰原子吸收光谱法(FAAS)。GF-AAS具有取样量少、前处理简单、灵敏度高、能直接分析固体和高粘度液体试样等优点,适用于生物样品的分析,在实际元素检验工作中被广泛应用,较为严重的基体干扰是其主要缺点,此外,一次只能对一种元素进行检测,耗时较长。FAAS是一种经典的分析技术,具有信号稳定、干扰相对较小、分析速度快、操作简单等优点,在痕量元素检测中多被采用。该方法的主要缺点是不适合测定分解不完全的耐高温元素、碱土金属元素以及共振吸收谱线在远紫外区的元素。FI-VGAAS可用于氢化物或冷蒸汽形成的元素检测,如砷、硒、铋、汞等。
晏晟等[晏晟,李伟新,解原,原子吸收光谱法与ICP-MS法测铊的对比研究,[J],广东化工,2016,9:232-236],原子吸收光谱法与ICP-MS法测定铊,两者准确度和精密度均较高,均能满足地质样品的检测要求。两者比较而言,原子吸收光谱法操作过程较为繁琐,检出限与线性范围均不如ICP-MS,AAS的检出限5ug/L,ICP-MS的检出限为0.024ug/L。原子吸收光谱法的线性范围在0~10mg/L,ICP-MS法的线性范围在0~100ug/L,相关系数r=0.9998。抗干扰能力较ICP-MS更强。ICP-MS的优点在于能够实现多元素的同时测定,操作更为方便快速,适合大批量样品。
电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductively Coupled plasmaAtomicEmission Spectroscopy:ICP-AES),是一种采用电感耦合等离子体作为激发光源以及原子化装置的原子发射光谱的分析检测方法。ICP-AES具有以下优点:1、可以同时测定样品中的多种元素,具有多元素同时检测的能力;2、分析速度快,可在短时间内定量分析多达几十种元素;3、检出限较低,一般为1-10ug/L;4、分析准确度和精密度高,是各种分析方法中所受干扰较小的一种,一般情况下其相对标准偏差≤10%,当分析物浓度超过100倍检出限时,相对标准偏差≤1%。
ICP-AES在实际元素分析检测工作中应用较为广泛,如申治国等[申治国,徐新云,张顺祥,张仁利,何雅青,ICP-AES和ICP-MS法测定血中微量元素[J],现代预防医学,2003,30(5):644-645],用ICP-MS检测学生血中砷、铅、硒、钡、锑、锗,其值在0.004-1.08mg/kg,用ICP-AES检测学生血中铝、钙、铁、钾、镁、锰、铜、锌含量,其值在0.03-1409mg/kg。徐军等[徐军等,ICP-MS/ICP-AES法分析成年男性血清中18种元素含量参照值,广东微量元素科学,2006,13(4):17-23],对于K、Mg、Ca、Na、Fe采用ICP-AES检测,其检出限为0.02-0.60ug/ml,对于As、Cd、Co、Cr采用ICP-MS检测,其检出限为0.005-0.1ng/ml。对于常量元素可以用ICP-AES进行检测,而对于痕量元素,其检测限达不到痕量元素的要求,需用ICP-MS检测。
电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法使用ICP焰炬作为仪器的原子化和离子化装置,将质谱作为检测手段,可对元素周期表中大部分元素进行测定,同时可以满足对测定灵敏度的要求。该方法谱图简单,试样制备和进样技术简单,质量扫描快速,分析速度快,运行周期短,且选择性好,线性范围宽,检出限低,能进行多种元素检测和同位素比测定,是一种前景广阔的痕量(超痕量)无机多元素分析技术,目前已广泛应用于冶金、环境、医学、生物等领域,成为最强有力的元素分析技术,是一种适合检测人体体液样品的分析方法。ICP-MS对大多数金属元素具有ng/L级的检出限,无需富集处理,从而减少了环境对样品的污染,提高了分析方法的可靠性和准确性。
血液的微量元素分析经常作为疾病诊断和环境、职业健康研究的生物监测手段。但是由于微量元素的含量很低,多数元素在ng/L-ug/L级别,而人体血液的基质复杂,给检测过程带来了很多不确定影响因素,因此,在临床上建立一套准确检测血液微量元素的方法具有重要意义。ICP-MS检测人体中微量元素,需要首先对样品进行前处理,由于血清成分复杂,含有蛋白质、无机盐、胆固醇等成分,复杂的基质给测量带来干扰,样品前处理有助于减少基体干扰,并且适当的样品前处理方法可以提高测量准确度。主要前处理方法有灰化和熔融,湿法消解,微波消解以及直接稀释法。样品的处理,既要防止待测痕量组分因挥发逸出或生成难溶化合物或吸附于器壁不易洗脱等原因造成的损失,又要防止前处理过程中引入的污染,还要使最终得到的样品溶液能满足测定条件的要求,如尽可能减少或消除基体干扰等。因此选择适当的样品处理方法对分析工作是十分重要的。
熔融技术多用于含硅较多的样品,由于其采用试剂空白较高,而血清中微量元素含量很低(ug/L~ng/L量级),进而会对微量元素检测造成很大影响,且熔融过程会造成元素的挥发,影响微量元素检测的准确性和可靠性,而灰化法由于器皿在处理过程中会引入较大的干扰,因此血清样品前处理不采用熔融和灰化方法。
湿法消化是在生物样品的痕量元素分析中一种可以使用的方法,虽然痕量元素在消解过程中挥发损失比灰化小,由于血清中微量元素含量很低,其同样会干扰微量元素测定结果,故在血清微量元素检测中同样不宜采用。
微波消解是近年来在生物样品消化方面应用较多,它能够使样品基质中有机物分子破裂,使其转化为澄清透明液体,将大分子转化为无机元素形式存在,有利于ICP-MS进行检测。微波消解的过程中,由于要重复使用石英管或者特氟龙试管,两次消解之间容易引入污染,使微量元素的检测结果偏高。而且在消解过程中,需高温加热,血清样本存在元素损失的可能性。同时应用微波消解对血清样品进行处理,过程繁琐,虽然消解时间短,但消解完成后,冷却时间较长,不利于对大样本量的样品检测。
直接稀释法是通过向样品中加入稀释剂,对稀释后的样品进行直接检测的方法。通过直接稀释法对样品进行前处理,能够很好的避免消解过程中引入的干扰,同时我们采用了较高的稀释倍数,能够一定程度的抑制基体效应,而且,直接稀释法操作简便,能够尽量减少由于前处理过程引起的元素损失,处理样本效率高,能够在短时间内对大量样品进行前处理。
本试剂盒所采用的前处理方法,为直接稀释法处理血清样本,适用于各种型号的ICP-MS仪器平台。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供了一种定量检测血清微量元素的试剂盒和检测方法以及制备方法,可用于同时检测人体血清中20种微量元素(钙44Ca、镁25Mg、铁56Fe、铜63Cu、锌66Zn、硒78Se、钒51V、铬52Cr、锰55Mn、钴59Co、镍58、60Ni、砷75As、钼96、98Mo、镉111Cd、锡118Sn、锑121Sb、钡137Ba、汞201Hg、铊205Tl、铅207、208Pb;选择各内标元素质量数为锗72Ge、铟115In、镥175Lu、铑103Rh)。其中,所述20种元素,既包括人体生长的必需元素(如钙,镁,铬,锰,铁,钴,锌,硒,铜,钼,碘),也包括对人体有害的毒素元素(如砷,镉,汞,铊,铅),还包括成为人体必需的潜在微量元素(如钒,镍,锡,锑,钡)。该试剂盒所需样品用量少,前处理简单,检测周期短、准确度和精密度高、检测稳定性好,适合于高通量样本的检测。
因此,本发明第一目的是提供一种定量检测血清20种微量元素的试剂盒,包括:标准溶液、稀释液、内标储备液、质控品,其中:
(1)标准溶液由含有7点标准曲线浓度的20种元素标准溶液混合而成:对于元素钙Ca、镁Mg,7点标准曲线的浓度为0.1、0.2、0.5、1、5、10、20mg/L;
对于元素铁Fe、铜Cu、锌Zn、硒Se,7点标准曲线的浓度为1、2、5、10、50、100、200ug/L;
对于元素钒V,铬Cr,锰Mn,钴Co,镍Ni,砷As,钼Mo,镉Cd,锡Sn,锑Sb,钡Ba,汞Hg,铊Tl,铅Pb,7点标准曲线的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2ug/L;然后将含有上述1-7点所对应的20种元素分别混合成独立的1管混合液,由此得到7管独立的标准溶液混合液,每管均含有20种元素,另设1管稀释液作为空白管;
(2)血清质控品分别是由20种元素的国家标准物质和牛血清溶液配制而成。
(3)稀释液是含有2%(v/v)硝酸溶液。
(4)内标储备液为铟,锗,镥,铑四种元素,用稀释液配制至浓度为100ug/L。
在一个实施方案中,所述方法还包含用于承载大批量样品的微孔平板。在一个具体实施方案中,所述平板是24孔板。在另一具体实施方案中,所述试剂盒是通过电感耦合等离子质谱系统定量检测血清20种微量元素的试剂盒。
在另一实施方案中,选择各待测元素质量数为钙44Ca、镁25Mg、铁56Fe、铜63Cu、锌66Zn、硒78Se、钒51V、铬52Cr、锰55Mn、钴59Co、镍58、60Ni、砷75As、钼96、98Mo、镉111Cd、锡118Sn、锑121Sb、钡137Ba、汞201Hg、铊205Tl、铅207、208Pb;选择各内标元素质量数为锗72Ge、铟115In、镥175Lu、铑103Rh。
在另一个实施方案中,所述产品还包含用于采血的元素采血管。在一个具体实施方案中,所述元素采血管选自6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plus plastictube with BD HemogardTMclosure,6mL)。
本发明第二目的是利用上述检测产品,来检测人体血清中20种元素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使用元素采血管,连续采集2管血,并弃去第1管血样和保留第2管血样;
(2)将血液静置30min后,离心分离;
(3)取2例1mL上层血清样本,加入1mL内标储备液,用稀释液定容至10mL;
(4)将1g血清质控品,用3mL超纯水混匀20min后,取3例1mL血清质控品,加入1mL内标储备液,用稀释液定容至10mL;
(5)通过标准溶液建立标准曲线,对血清质控品和待测血清样本进行20种元素的ICPMS分析检测;
其中步骤3和步骤4的稀释液是2%(v/v)的硝酸。其中步骤3和步骤4的内标储备液是铟,锗,镥,铑四种元素,用含有2%(v/v)硝酸配制至浓度为100ug/L。
其中,步骤(5)中,首先利用20种元素标准溶液,包括1例空白,7例不同浓度的标准溶液建立标准曲线,然后计算相关系数R2,对待测血清样本进行ICPMS检测,并将所测定值代入标准曲线,计算元素的含量。
在一个实施方案中,所述元素采血管选自6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plus plastic tube with BD HemogardTMclosure,6mL)。
在一个实施方案中,样品准备过程中所使用的试管(优选聚丙烯),均采用10%硝酸浸泡过夜,并用超纯水清洗3遍待用。
在上述任一实施方案中,所述血清是来自人体血清,其中人体血清既包括健康成年人的血清,也包括儿童和孕妇及怀疑中毒的职业人群。
在上述任一实施方案中,在用聚光Expec 7000ICP-MS对各元素的检测中,选择各待测元素质量数为钙44Ca、镁25Mg、铁56Fe、铜63Cu、锌66Zn、硒78Se、钒51V、铬52Cr、锰55Mn、钴59Co、镍58、60Ni、砷75As、钼96、98Mo、镉111Cd、锡118Sn、锑121Sb、钡137Ba、汞201Hg、铊205Tl、铅207、208Pb;选择各内标元素质量数为锗72Ge、铟115In、镥175Lu、铑103Rh。
在另一实施方案中,所述步骤1-4为用于ICP-MS检测的血清前处理方法。
在其他实施方案中,所述检测方法用于检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测。
本发明第三目的提供一种制备上述定量检测血清20种微量元素的试剂盒的方法,步骤包括:
(1)配制微量元素的标准溶液储备液
将钙Ca、镁Mg元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成100mg/L,得到标准溶液储备液1;
将铁Fe、铜Cu、锌Zn、硒Se元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成10mg/L,得到标准溶液储备液2;
将钡Ba,钒V,铬Cr,锰Mn,钴Co,镍Ni,砷As,钼Mo,镉Cd,锡Sn,锑Sb,汞Hg,铊Tl,铅Pb元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成10mg/L,得到标准溶液储备液3,再把储备液3稀释100倍得储备液3-1;
其中,单元素标准液或单标液起始浓度均为1000mg/L;
(2)配制中标液将上述标准溶液储备液1、储备液2、储备液3-1配成混合中标液储备液4、储备液4-1、储备液std7和std4;
(3)配制7点标准曲线的标准溶液:
分别从储备液4中取2.5ml、5ml,并用稀释液补足至9ml配制储备液std5、std6;分别从储备液4-1中取1ml、2ml、5ml,并用稀释液补足至9ml配制储备液std1、std2、std3;
(4)配制内标储备液
将内标元素铟,锗,镥,铑四种元素的单标液加硝酸和超纯水配制成浓度为100ug/L,得到内标储备液,其中四种单元素标准液或单标液起始浓度均为1000mg/L。
(5)配制质控品
测定外购的牛血清中的20种元素,确定其中各待测元素的含量后,根据各元素的血清中微量元素参考值上限加入各元素的标准溶液,直至将牛血清中20种元素的浓度调节至目标浓度,得到血清质控品,并冷冻干燥和灭菌后低温保存
(6)配制稀释液
将原硝酸10mL,加入超纯水定容至500mL,混匀即得稀释液;
(7)产品包装
将所制备的标准溶液、稀释液、内标储备液、质控品独立包装后,灭菌包装成试剂盒,并于低温保存。
在一个实施方案中,所述方法还包含用于承载大批量样品的微孔平板。在一个具体实施方案中,所述平板是24孔板。
在另一个实施方案中,所述产品还包含用于采血的元素采血管。在一个具体实施方案中,所述元素采血管选自6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plus plastictube with BD HemogardTMclosure,6mL)。
本发明第四目的是提供上述试剂盒或上述方法所制备的试剂盒,用于检测血清中微量元素的用途。
在一个实施方案中,所述用途是检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测。
技术效果:
(1)建立了一种适用于ICP-MS检测血清中微量元素的灵敏、特异的前处理试剂盒,受血清中其他成分的干扰较少。
(2)检出限低:本发明在ICPMS的检测平台上,定量检出限在ng/L-ug/L级别,As≤100ng/L;Se≤1ug/L;Pb≤100ng/L;Cu≤100ng/L;Cd≤80ng/L;Tl≤10ng/L;Zn≤1ug/L;Hg≤100ng/L;Co≤20ng/L;Mn≤100ng/L;Mg≤10ng/L;Ca≤100ng/L;Fe≤1ug/L;V≤100ng/L;Cr≤100ng/L;Ni≤1ug/L;Mo≤100ng/L;Sn≤100ng/L;Sb≤80ng/L;Ba≤100ng/L。
(3)专属性强:ICP-MS检测是基于元素的质核比,因此本发明对于血清中的微量元素检测专属性强,定量准确。
(4)简便安全:样品前处理简单、操作简单安全、谱图解析及数据统计对人员要求低。
(5)快速:质量扫描快速,分析速度快,运行周期短,可实现批量处理,可在2分钟内完成1个样本的20种元素的检测。
(6)验证了5种不同的采血管对于采集血液过程中,管材的微量元素含量对于血清检测的影响,并优选采血管使用6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plus plastictube with BD HemogardTMclosure,6mL)。
原理与定义
术语“ICP-MS”是将电感耦合等离子体作为离子源的一种无机多元素分析技术,通常情况下,氩气流由高能的射频能量激发形成等离子体,而被检测的样品通过水溶液的气溶胶的形式进入等离子体中,进行去溶剂化、汽化解离和电离。部分等离子体进入真空系统中,其中的正离子被按照质荷比进行分离。电感耦合等离子体质谱通常情况下是由样品引入系统、离子源、接口部分、离子聚焦系统、质量分析器、检测系统这几部分组成,此外,仪器中还配备真空系统、供电系统以及用于仪器控制与数据处理的计算机系统。
术语“元素采血管”是专用于采集生物血液或生物流体(组织液、尿液等)的专用管,该采血管通常由特殊的材料聚丙烯制成,管壁经过特殊工艺处理,极度光滑,以避免血细胞或待测样品液的附壁,减少标本体外溶血,其材质应当不含任何由管壁硅化而带入的外来元素。
术语“检测产品”,指用于检测人体血清中元素的任何常规产品,包括:检测试剂、检测芯片(如固体芯片、液体芯片等)、检测载体,以及检测试剂盒等。
术语“元素”指具有相同的核电荷数(即核内质子数)的一类原子的总称。在人体中,同一元素存在着不同质子数的情况,例如C12、C14。本发明中对于检测元素同位素的选择,参考以下2个标准:选择相对丰度较高的同位素,选择相对干扰(氧化物,多原子等质谱干扰)较小的同位素。以Se元素为例,Se存在同位素77、78、80、82,相对丰度较高的是78和80两个同位素,而80同位素存在Ar双原子的干扰,会严重影响检测结果,因此,选择78同位素作为检测对象。
附图说明
图1为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中镁(Mg)的标准曲线。
图2为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钙(Ca)的标准曲线。
图3为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钒(V)的标准曲线。
图4为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铬(Cr)的标准曲线。
图5为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中锰(Mn)的标准曲线。
图6为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铁(Fe)的标准曲线。
图7为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钴(Co)的标准曲线。
图8为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中镍(Ni)的标准曲线。
图9为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铜(Cu)的标准曲线。
图10为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中锌(Zn)的标准曲线。
图11为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中砷(As)的标准曲线。
图12为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中硒(Se)的标准曲线。
图13为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钼(Mo)的标准曲线。
图14为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中镉(Cd)的标准曲线。
图15为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中锡(Sn)的标准曲线。
图16为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中锑(Sb)的标准曲线。
图17为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钡(Ba)的标准曲线。
图18为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中汞(Hg)的标准曲线。
图19为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铊(Tl)的标准曲线。
图20为电感耦合等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铅(Pb)的标准曲线。
具体实施方式
为了更好地说明本发明,下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一:元素采血管的选择
目前,商业可购买采血管包括:
No.1:规格Vacutainer Trace Element Serum,BD公司,型号368380。
No.2:规格Vacutainer Serum,BD公司,型号367812。
No.3:规格Z Serum Sep Clot Activator,Greiner Bio One公司,型号454067CN。
No.4:规格Z Serum Clot Activator,Greiner Bio One公司,型号454204。
No.5:规格Vacutainer SST II Advance,BD公司,型号367957。
术语“微量元素采血管”是指用于容纳血样或生物组织的特殊采血管。虽然理论上采血管材质应当不含任何由管壁硅化而带入的外来元素,但在实际生产过程中,由于材质、加工设备以及空气环境等,并不能完全避免引入外来元素。在实验过程中,虽然可以通过阴性或阳性对照来消除背景元素,但发明人发现由于部分微量元素的可检测值已经低于背景元素值,因此并非所有的微量元素采血管都适合本发明。鉴于本发明之前未有针对商业上的采血管的背景微量元素的相关报道,因此,发明人通过以下预备试验,对比以上5种血清采血管,使用10%HNO3溶液或水作为浸出液,确定最适宜的采血管。
ICP-MS检测5种采血管中的20种元素(包含:铝、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼、镉、锡、锑、钡、钨、汞、铊和铅,与本发明的20种元素相比,少钙和镁,增加钨)实验:
1仪器及工作参数
本文采用Agilent 8800ICP-QQQ仪器(安捷仑公司,美国)进行元素分析,仪器配备360个样本的Agilent SPS 4自动进样器(安捷伦公司,美国),仪器的基本参数设置如表1所示。
表2ICPMS 8800仪器参数设置
Table 2Instrumental settings
由于碰撞反应池对于减少干扰,提高检测限有明显帮助,因此,对于硒元素我们采用H2模式,对于元素钒,铬,锰,铁,钴,镍,铜,锌,我们采用He模式,元素砷采用O2模式,其余元素采用标准模式。
2样品处理
对于5种不同的血液采集管,我们每种型号各取12只,向其中6只采血管注入与其额定容量相等容积的超纯水,向另外6只采血管注入与其额定容量相等容积的10%HNO3。然后将采集管置于混匀器上,室温下混匀1小时。混匀后,用移液枪移取4mL浸出液至离心管,加入1mL内标,1mL硝酸,定容至10mL。
3试剂与标准溶液
实验所用超纯水由Milli Q超纯水仪制备(Millipore公司,奥地利),硝酸(≥65%,p.a.,ISO,Roth,Karlsruhe,德国),硝酸经过低沸点蒸馏进行纯化。实验所用单标液,铝、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼、镉、锡、锑、钡、钨、汞、铊和铅(1000mg/L,Rosa,美国),混标液(ICP multi-element standard solution VI,Merck,德国),天然水1640a(NIST,Gaithersburg,美国)包含有15种元素的标定值。
4样品测定
标准曲线用单标液混合进行配制,对于血液中含量较高的元素铁,铜,锌,硒,钡,7点标准曲线的浓度为1,2,5,10,50,100,200ug/L,对于其余血液中含量较低的元素,7点标准曲线的浓度为0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1,2ug/L。内标选择铟,锗,镥,铑四种元素,检测溶液中的最终浓度为10ug/L。
在ICP-MS优化的条件下,对处理好的样品中的20种元素进行测定,仪器根据7点标准溶液自动建立标准曲线,并计算出被测样本的浓度。
5结果与讨论
5.1仪器检出限和准确度
10%硝酸作为空白溶液,同时测定这20种元素的系列标准溶液,得到元素的线性回归方程和相关系数。通过连续测量4次空白溶液,以其的平均值加上3倍标准偏差作为仪器的检出限。为了检测标准曲线的准确性,我们采用NIST 1640a天然水作为标准物质,其标定元素含量范围,本方法检出值及相对标准偏差如表3所示。
由表3可知,本方法中所检测的20种元素信号值与浓度均呈现出良好的线性,相关系数均在0.9991以上。本方法检出限低,对于元素钴,钼,镉,锡,锑,钡,钨,汞,铊和铅,检测限低于0.01μg/L;对于元素钒,铬,锰,镍,铜,砷和硒,检测限低于0.1μg/L;对于元素铝,铁,锌检测限低于1ug/L。本方法的背景等效浓度低,对于元素钴,钼,镉,锑,钡,钨,铊和铅,背景等效浓度低于0.01ug/L;对于元素钒,锰,砷,硒,锡和汞,背景等效浓度低于0.1ug/L;对于元素铝,铬,铁,镍,铜和锌,背景等效浓度低于1ug/L,说明在该测量条件下,有非常好的抑制背景干扰的能力。本方法对标准物质(天然水)的检测结果良好,元素铝,锰,铁,锌,硒,镉,钡,铊和铅的测量值均在天然水的标定范围之内,元素钒,钴,铜,砷和钼的测量值与标定值的相对标准偏差RSD小于5%,元素铬,镍,锑的测量值与标定值的相对标准偏差RSD小于10%。
5.2样品分析
根据上述所列的仪器条件和方法,对5种采血管中的20种元素进行了测定,测定结果如表4所示。
为了进一步对比采血管中元素的浓度是否会对血液元素分析造成影响,我们总结了文献中提到的人体血液(血清、血浆、全血)元素检测的含量范围,以此作为判断采血管中的元素含量是否会对检测结果造成影响的基础。人体血液(血清、血浆、全血)元素的含量范围如表3所示。
表3仪器的检测限、背景等效浓度,天然水检测结果,文献中元素参考值和两种血清采血管元素检测值
表4 5种采血管中20种元素含量
发明人经过比较,浸出液中(包括H2O和10%HNO3作为溶剂)各种元素的含量由低到高为:
采血管1<采血管2<采血管5<采血管4<采血管3
根据人体血液(血清、血浆、全血)微量元素含量的参考范围,我们详细分析了5种采血管中微量元素含量可能对检测结果造成的影响。我们将采血管中微量元素含量低于文献中血液(血清、血浆、全血)微量元素含量最小值10%的,作为确定能够检测该种元素的采血管;介于文献中血液微量元素含量最小值10%和最大值10%之间的,作为潜在可检测该种元素的采血管;高于血液微量元素含量最大值的10%的,作为不可检测该种元素的采血管。由此,我们制作了表5。
表5 5种不同采血管对20种微量元素的分析能力
注:√表示采血管中元素含量低于文献中人体血液微量元素最小值的10%
O表示采血管中元素含量介于文献中人体血液微量元素最小值的10%和最大值的10%之间
空白表示采血管中元素含量大于文献中人体血液微量元素最大值的10%
试管中的微量元素含量采用纯水浸出液的检测值
由表5可知,血清微量元素采血管中,采血管1能够完全满足种11种元素的检测要求,而采血管1中的元素铝、铬、锰、钴、镍和钡的含量会一定程度上受到采血管中微量元素含量的影响,元素锑和钨在采血管1中含量相对较高,会显著影响血清微量元素的检测结果。
由表3可知,采血管1和采血管3对实际血清样本检测结果的影响,采血管1的检测结果中几乎所有微量元素含量都低于采血管3的检测结果,尤其是铝,钒,铬,锰,砷,锡,锑等几种元素,说明在实际采血过程中,采血管的选择对微量元素检测结果影响很大。
因此,本发明元素采血管优选使用6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPCPlus plastic tube with BD HemogardTMclosure,6mL)。
实施例二:试剂盒的生产及检测要求:
标准溶液的配制:
1标准物质:单标液,钙、镁、铁、铜、锌、硒、钒、铬、锰、钴、镍、砷、钼、镉、锡、锑、钡、汞、铊、铅(1000mg/L,国家有色金属及电子材料分析测试中心)
2配制中标液:硝酸、纯化水、已有的标准溶液
3目标浓度标准溶液的配制:
标准溶液中各元素的目标浓度:
4.稀释液的配制:原硝酸:超纯水=2:98(v/v),即得2%硝酸溶液。
5.内标储备液的制备方法是:称取一定质量的铟,锗,镥,铑的单标液与2%硝酸配制成浓度为100ug/L的内标储备液。
6.质控品的配制:测定外购的牛血清中的20种元素,确定其中各待测元素的含量。根据各元素的血清中微量元素参考值上限加入各元素的标准溶液,将牛血清中20种元素的浓度调节至目标浓度,混匀30min(摇匀),离心去除纤维沉淀物。3ml/瓶分装。冷冻干燥:-70℃预冷冻过夜,冷冻干燥机中干燥3-4天。样品冻干后立即盖紧瓶盖。60Co辐射灭菌,辐射剂量为2*105rad。2-8℃保存,备用。
此试剂盒中的血清质控品为本公司自制,其中的各待测元素含量更接近人体的含量水平。
7.试剂盒检测要求
(1)外观物理性状:产品拥有24人份/盒,96人份/盒2种规格。产品外包装清洁,无污渍,密封良好,内外包装浓度标识相符,内容物齐全,构造完整。液体内容物清澈无沉淀及絮状物,冻干粉为浅黄色粉末。
(2)装量
试剂装量应不少于标示装量或规定限。
(3)准确度:
用质控参考品对试剂(盒)进行测试,平行检测20人份,检测结果应与标定值一致,相对偏差应不超过±10%。
(4)检出限
用样本稀释液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果,计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD。
(5)精密度
(5.1)重复性
同一批次的某一个检测试剂盒对检测范围内某个浓度的质控品进行重复检测至少20次,计算20次测量结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数,变异系数CV(%)≤5%。
(5.2)批内(瓶间)差(适合冻干的质控品)
用已知浓度的质控样品对该批号的1个待检试剂盒重复测试10次,计算结果的均值(2)和标准差(SD2)。根据公式CV=SD/M×100%计算瓶间差的变异系数(CV),批内瓶间差均应不大于5%。
(5.3)试剂盒批间差
三个批次的检测试剂对检测范围内某个已知浓度的质控品(中阳性或强阳性)各重复检测10次,计算30次测量结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数,变异系数CV(%)值应≤20%。
(6)稳定性
(6.1)效期稳定性:生产企业应规定产品的有效期。取到有效期后的样品检测,准确度应符合技术要求。
(6.2)热稳定性试验:
取同一批号的产品,37℃放置20天,对最低检出限、准确度、精密度进行检验,检测结果应符合要求。冻干品应同时进行复溶稳定性试验,复溶后放置到有效期末,产品性能应符合线性区间、准确度的技术要求。
实施例三:健康人血清中20种元素的ICP-MS检测
采集健康人的空腹静脉血,按照本发明中的试剂盒的检测程序,利用电感耦合离子体质谱仪对血清中的20种元素(包含:铝、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼、镉、锡、锑、钡、钙、汞、铊、铅和镁)检测的实验:
1仪器及工作参数
采用CLIN-ICP-QMS进行元素分析,仪器的调谐液为10ppb Li、Co、In、Ba、Ce、U,仪器的基本参数设置如表6所示。
表6CLIN-ICP-QMS仪器参数设置
由于碰撞反应池对于减少干扰,提高检测限有明显帮助,因此对于待测的20种元素我们采用氦气的碰撞池模式。
2样品处理:
利用本发明中制备的试剂盒中的内标储备液、稀释液、血清质控品,按要求程序进行血样及质控品的前处理制备。
用专用的元素采血管(368380-BDSPC Plus plastic tube with BDHemogardTMclosure,6mL),普通针头,每人采2管血,第一管血不要,第二管用来分析。将血液静置30min。将采血管放置在离心机上,4000转/分,离心10分钟,常温。取2例1mL上层血清样本,加入1mL内标储备液,用2%(v/v)的稀释液将血清样本稀释至10ml。
使用环境温度10~30℃,取1g质控品复溶至超纯水3mL中,混匀20分钟。取3例1mL血清质控品,加入1mL内标储备液,用2%(v/v)的稀释液将血清质控品稀释至10ml。
本前处理过程对于离心后的血清可在10分钟内进行处理并进样分析,制样简单,快速,易于大批量的操作。
3样品测定:
利用本发明中制备的试剂盒中的标准溶液,包括1例空白,7例不同浓度的标准溶液建立标准曲线。对于元素钙和镁,7点标准曲线的浓度为0.1,0.2,0.5,1,5,10,20mg/L,对于元素铁,铜,锌,硒,7点标准曲线的浓度为1,2,5,10,50,100,200ug/L,对于其他元素,7点标准曲线的浓度为0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1,2ug/L。产品基质2%HNO3溶液。内标选择铟,锗,镥,铑四种元素,检测溶液中的最终浓度为10ug/L。
在ICP-MS优化的条件下,先进标准溶液,仪器根据7点标准溶液自动建立标准曲线,然后对空白溶剂、血清质控品和待测样本若干进行20种元素的检测,仪器根据标准溶液建立的标准曲线计算出被测样本的浓度。检测结果的定量分析,根据混合元素标准溶液中待测元素信号和内标信号的比值和混合元素标准溶液中待测元素的浓度绘制标准曲线,标准曲线需满足R2>0.999。利用样品中待测元素信号和内标信号的比值定量样品中待测元素的含量。各元素的标准曲线见(图1-图20)。利用样品中待测元素信号和内标信号的比值定量样品中待测元素的含量。
4仪器检出限:
根据上述所列的仪器条件和方法,空白溶液为2%硝酸,连续测量11次空白溶液,4个平行样,以其3倍标准偏差作为该方法的检出限。
说明在该测量条件下,有非常好的抑制背景干扰的能力。
5.血清质控品分析
根据上述所列的仪器条件和方法,对血清质控品进行了测定,测定结果的准确度和精密度如下:
对于血清质控品中的各元素,其检出值均在标准值范围内,精密度在20%的范围内,即本发明对于各元素的检测真实可信。
实施例四、健康人血清的检测
根据上述所列的仪器条件和方法,对100例健康人血清进行了测定,根据测定结果并结合大量文献数据,初步确定人血清中20种元素的含量范围:
把待测样本中的各元素含量值,与以上标准进行对比,可以初步推断人体中20种元素的水平是否在正常范围内,及时实施相应的治疗及保健措施。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种定量检测血清20种微量元素的试剂盒,包括:标准溶液、稀释液、内标储备液、质控品,其中:
(1)标准溶液由含有7点标准曲线浓度的20种元素标准溶液混合而成:对于元素钙Ca、镁Mg,7点标准曲线的浓度为0.1、0.2、0.5、1、5、10、20mg/L;
对于元素铁Fe、铜Cu、锌Zn、硒Se,7点标准曲线的浓度为1、2、5、10、50、100、200ug/L;
对于元素钒V,铬Cr,锰Mn,钴Co,镍Ni,砷As,钼Mo,镉Cd,锡Sn,锑Sb,钡Ba,汞Hg,铊Tl,铅Pb,7点标准曲线的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2ug/L;然后将含有上述1-7点所对应的20种元素分别混合成独立的1管混合液,由此得到7管独立的标准溶液混合液,每管均含有20种元素,另设1管稀释液作为空白管;
(2)血清质控品分别是由20种元素的国家标准物质和牛血清溶液配制而成;
(3)稀释液是含有2%(v/v)硝酸溶液;
(4)内标储备液为铟,锗,镥,铑四种元素,用稀释液配制至浓度为100ug/L。
2.权利要求1的试剂盒,其中所述试剂盒还包含用于承载大批量样品的微孔平板以及用于采血的元素采血管,并且所述试剂盒是通过电感耦合等离子质谱系统或Clin-ICPMS-Ⅰ系统定量检测血清20种微量元素的试剂盒。
3.权利要求1或2的试剂盒,其中所述试剂盒是通过电感耦合等离子质谱系统定量检测血清20种微量元素的试剂盒,并且选择各待测元素质量数为钙44Ca、镁25Mg、铁56Fe、铜63Cu、锌66Zn、硒78Se、钒51V、铬52Cr、锰55Mn、钴59Co、镍58、60Ni、砷75As、钼96、98Mo、镉111Cd、锡118Sn、锑121Sb、钡137Ba、汞201Hg、铊205Tl、铅207、208Pb;选择各内标元素质量数为锗72Ge、铟115In、镥175Lu、铑103Rh。
4.权利要求3的试剂盒,其中所述元素采血管选自6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plus plastic tube with BD HemogardTM closure,6mL)。
5.通过权利要求1-4的试剂盒来检测人体血清中20种元素的方法,包括以下步骤:
(1)使用元素采血管,连续采集2管血,并弃去第1管血样和保留第2管血样;
(2)将血液静置30min后,离心分离;
(3)取2例1mL上层血清样本,加入1mL内标储备液,用稀释液定容至10mL;
(4)将1g血清质控品,用3mL超纯水混匀20min后,取3例1mL血清质控品,加入1mL内标储备液,用稀释液定容至10mL;
(5)通过标准溶液建立标准曲线,对血清质控品和待测血清样本进行20种元素的ICPMS分析检测;
其中步骤3和步骤4的稀释液是2%(v/v)的硝酸;
其中步骤3和步骤4的内标储备液是铟,锗,镥,铑四种元素,用含有2%(v/v)硝酸配制至浓度为100ug/L;
其中,步骤(5)中,首先利用20种元素标准溶液,包括1例空白,7例不同浓度的标准溶液建立标准曲线,然后计算相关系数R2,对待测血清样本进行ICPMS检测,并将所测定值代入标准曲线,计算元素的含量。
6.权利要求5的试剂盒,其中样品准备过程中所使用的试管(优选聚丙烯),均采用10%硝酸浸泡过夜,并用超纯水清洗3遍待用;所述步骤1-4为用于ICP-MS检测的血清前处理方法。
7.一种制备上述定量检测血清20种微量元素的试剂盒的方法,步骤包括:
(1)配制微量元素的标准溶液储备液:
将钙Ca、镁Mg元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成100mg/L,得到标准溶液储备液stock solution 1;
将铁Fe、铜Cu、锌Zn、硒Se元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成10mg/L,得到标准溶液储备液stock solution 2;
将钡Ba,钒V,铬Cr,锰Mn,钴Co,镍Ni,砷As,钼Mo,镉Cd,锡Sn,锑Sb,汞Hg,铊Tl,铅Pb元素的单元素标准液或单标液等量混合稀释成10mg/L,得到标准溶液储备液stock solution3,再把stock solution 3稀释100倍得stock solution 3-1;
其中,单元素标准液或单标液起始浓度均为1000mg/L;
(2)配制中标液将上述标准溶液储备液stock solution 1、stock solution 2、stocksolution 3-1配成混合中标液stock solution 4、stock solution 4-1、std7和std4;
(3)配制7点标准曲线的标准溶液:
分别从stock solution 4中取2.5ml、5ml,并用稀释液补足至9ml配制std5、std6;分别从stock solution 4-1中取1ml、2ml、5ml,并用稀释液补足至9ml配制std1、std2、std3;
(4)配制内标储备液
将内标元素铟,锗,镥,铑四种元素的单标液加硝酸和超纯水配制成浓度为100ug/L,得到内标储备液,其中四种单元素标准液或单标液起始浓度均为1000mg/L。
(5)配制质控品
测定外购的牛血清中的20种元素,确定其中各待测元素的含量后,根据各元素的血清中微量元素参考值上限加入各元素的标准溶液,直至将牛血清中20种元素的浓度调节至目标浓度,得到血清质控品,并冷冻干燥和灭菌后低温保存;
(6)配制稀释液
将原硝酸10mL,加入超纯水定容至500mL,混匀即得稀释液;
(7)产品包装
将所制备的标准溶液、稀释液、内标储备液、质控品独立包装后,灭菌包装成试剂盒,并于低温保存。
8.权利要求7的方法,其中所述方法还包含用于承载大批量样品的微孔平板,其中所述产品还包含用于采血的元素采血管,优选6mL的蓝盖采血管(368380-BDSPC Plusplastic tube with BD HemogardTM closure,6mL)。
9.通过权利要求1-4的试剂盒或权利要求5-8所制备的试剂盒,用于检测血清中微量元素的用途。
10.权利要求9的用途,其中所述用途是检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测。
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