CN111830115A - 一种含蛋白生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种含蛋白生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含蛋白生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测方法，所述银离子富集方法包括以下步骤：S1、在生物基质样本中加入硝酸溶液I，使体系的pH值为4.0～6.5；S2、加入硝酸溶液II，使体系的pH值为1.0～3.0；其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的浓度分别为0.5％～2.0％；所述生物基质样本的体积大于所述硝酸溶液I的体积；所述生物基质样本的体积小于所述硝酸溶液II的体积。所述银离子定量试剂盒包括硝酸溶液I、硝酸溶液II、蛋白溶液、银标准品、银质控品和铟内标品；其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的浓度分别为0.5％～2.0％。

Description

一种含蛋白生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种含蛋白生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测方法。
背景技术
银离子具有杀菌作用，以银离子为治疗成分的药物主要包括敷料、搽剂、凝胶剂等，多用于表面杀菌、物理中和、烧伤治疗。银离子的杀菌机理主要是通过游离的Ag+结合细胞等微生物中蛋白质的自由疏基(-SH)，改变蛋白表面电荷，使蛋白质变性而凝固，破坏细胞合成酶活性，细胞因丧失分裂增殖能力而死亡。银离子与蛋白的结合是可逆的，当菌体失去活性后，银离子又从菌体中游离出来，重复进行杀菌活动，因此银离子药物的抗菌效果持久，细菌耐药性低。考虑到大剂量或长期使用银离子药物，会引起重金属的蓄积并引发急性或慢性中毒，因此大部分的银离子药物的使用浓度趋近于痕量(低至μg/ml或ng/ml)，这无疑对银离子浓度的检测灵敏度和准确性提出了挑战。
关于银离子浓度测定，中国发明专利201110204651.9公布了一种用于含纳米银及离子银溶液检测试剂盒，具体公开了将银离子与氯化钠中的氯离子发生化学反应，形成氯化银沉淀，通过检测该沉淀的含量来间接检测银离子的浓度，定量浓度不低于0.1μg/ml。该方法无需重大精密设备，但操作精密度和准确性尚未可知，无法适用于复杂生物基质中的痕量银离子浓度测定，还有部分公开专利报道基于TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)显色技术来定量分析银离子，但对于复杂基质的适用性显然不足。基于银离子的无机金属元素特性，相对于原子吸收光谱法(atomic absorptionspectrometry，AAS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)，目前常用的银离子检测技术为电感耦合等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS)，ICP-MS具有灵敏度高、测量线性范围宽(10-6～10-12g/ml)等优点(张素静，卓先义，马栋.血液和尿液中元素ICP-MS分析研究进展[J].2012,28(6):456-463)。但是，经过40余年的实际应用，ICP-MS在测定痕量无机金属元素时也暴露出一些不足：易受谱线干扰、基体干扰和物理干扰，影响其分析结果的准确性，因此，在测定复杂基质样品时需要对样品进行前处理并优化检测条件。
ICP-MS检测无机金属元素时，常常应用于土壤、化妆品、水体、农作物、食品等基质中的诸如铁、锰、铜、锌、镉、镍、汞、砷等含量研究。这类基质的特征是蛋白含量低、基体干扰较小、目标待测金属元素易于分离。随着银离子药物的研发和应用增长，利用ICP-MS检测生物基质中的银离子含量成为了迫切需求，而如何有效的排除或降低生物基质对银离子检测的干扰，是开发相关检测方法和产品首先需要解决的问题。
生物基质是指从生命体获得的基质，包括血液(血清、血浆)和脑脊液等液体。生物基质由于其组成成分复杂，在检测过程中通常存在基质效应，影响检测的准确性。其中，血液属于生物蛋白基质，血液是多种有机组分(红细胞和白细胞，血小板)和无机离子(钠、钾、钙、氯及其它)组成的复杂溶液，采集后的血液经抗凝或非抗凝处理，分别获得血浆、血清，它们含有丰富的白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原，银离子等金属元素难以被生物降解，却非常容易与这些蛋白质结合，可以保护低浓度的银离子不被容器表面非特异性吸附，但普通分离技术难以快速解聚，导致回收率低而影响整体待测物的定量准确度。
基于上述ICP-MS检测银离子的技术优势和难点，对于生物基质样本中的元素检测，恰当的前处理方法可以减少系统堵塞、消除基体干扰等，前处理的目的主要是将生物基质中的银离子进行富集，提高检测准确度。因此，开发合适的待测物生物基质样本前处理方法和银离子富集方法是十分必要的。
目前，对于生物蛋白基质，如血液基质(血浆，血清等)，待测金属离子的前处理方式包括消解法、直接稀释法。消解法使用强酸或强碱，在加热条件下破坏样品中的有机物或还原性物质。常用硝酸、盐酸、高氯酸、硫酸、过氧化氢或它们的混合液作为消解试剂，硝酸产生的多原子离子较少、谱干扰少，过氧化氢分解产生水，样品消解彻底，因此在血液基质的消解时，硝酸和过氧化氢是首选消解剂。但往往存在过度消解，使得硝酸离子的信号严重压制目标待测离子信号。直接稀释法是用稀释剂稀释样品，常用稀释剂有稀硝酸、碱性溶液(如氨溶液)，乙二胺四乙酸(EDTA)。直接稀释法操作简单，可处理大量样品，稀释后可直接检测，可有效降低外界污染概率，但直接稀释法不可能完全消除基质的干扰，测定时难以获得良好的准确度。因此，上述前处理方法和银离子富集方法主要存在银离子富集前处理效果不佳，基质中银离子的富集效率不高，难以达到全部解吸附的理想效果。
上述前处理方法的主要缺陷在于：第一，处理方法简单：针对血清样本中的银离子富集前处理，多采用硝酸一步直接稀释法的方式，或者蛋白沉淀的方式，前者在酸液过浓时容易降解蛋白为肽段，引起肽段和金属离子的进一步吸附而产生明显的基质效应，在酸液过稀时又难以完全解离掉蛋白-金属螯合物；后者处理时，银离子往往会与蛋白一同沉淀，银离子损失增加；第二，银离子富集前处理效果不佳：针对血清样本中的银离子富集前处理，以硝酸直接稀释来解聚蛋白-银离子螯合物，忽略了解离后的银离子仍有部分会与管壁聚合，也忽视了pH的阶段变化带来的不同解离/解吸附效果，同时也没注重保护游离型银离子再与容器管壁结合的潜在干扰。部分报道用微波消解法搭配稀硝酸来解聚蛋白-银离子螯合物，但是微波消解法处理后，银离子响应较低，平行性较差。使得血清中银离子ICP-MS定量的准确度不佳。这类前处理的结果往往导致比较明显的残留效应，既影响了不同浓度标准品之间的真实测值，又产生了高浓度样本对低浓度样本的残留干扰，使得银离子的实测定量结果精密度和重现性较低，难以适用于银离子药物的药代动力学PK/PD定量研究。因此，开发一种改进的生物基质中银离子富集的方法及其试剂盒具有十分重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种生物基质中银离子富集方法——“分步稀释法”，能够通过“分步稀释法”提高生物基质中银离子的富集效率，用于生物基质样本中的银离子解聚和解吸附，解决基质中的银离子富集效率不高的问题。
本发明还提出一种含蛋白生物基质中银离子定量试剂盒。
本发明还提出一种含蛋白生物基质中银离子定量检测方法。
根据本发明的第一方面实施例的生物基质中银离子富集方法，包括以下步骤：
S1、在生物基质样本中加入硝酸溶液I，使体系的pH值为4.0～6.5；
S2、加入硝酸溶液II，使体系的pH值为1.0～3.0；
其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的质量浓度分别为0.5％～2.0％；
所述生物基质样本的体积大于所述硝酸溶液I的体积，
所述生物基质样本的体积小于所述硝酸溶液II的体积。
根据本发明实施例的银离子富集方法，至少具有如下有益效果：本发明通过“分步稀释法”巧妙优选少量稀硝酸(呈一定低倍率)、大量稀硝酸(呈一定高倍率)分步开展与材料管壁、与基质中蛋白等不同结合形式的银离子提取；通过硝酸浓度的变化，特别是硝酸体积的变化，来充分提取与容器管壁、与蛋白基质结合的银离子，从而实现对生物基质中银离子进行高效富集。
根据本发明的一些实施方式，所述生物基质为血液、淋巴液和脑脊液中的至少一种。本发明的方案适用于大多数的生物基质，特别是含有蛋白的生物基质。其中，血液包括全血、血清和血浆。优选地，所述生物基质为血清。在本发明中，未处理的血浆的pH为6.5～8.0。
根据本发明的一些实施方式，所述硝酸溶液I的质量浓度为0.5％～1.0％；优选地，所述硝酸溶液I的质量浓度为0.7％。
根据本发明的一些实施方式，所述硝酸溶液II的质量浓度为1.0％～2.0％；优选地，所述硝酸溶液II的质量浓度为1.0％。
根据本发明的一些实施方式，所述硝酸溶液II的浓度高于硝酸溶液I的浓度。
根据本发明的一些实施方式，所述生物基质样本与所述硝酸溶液I的体积比为(3～8)：1；优选地，所述生物基质样本和所述硝酸溶液I的体积比为(4～6)：1；更优选地，体积比为5：1。
根据本发明的一些实施方式，所述生物基质样本与所述硝酸溶液II的体积比为1：(10～20)；优选地，所述生物基质样本与所述硝酸溶液II的体积比为1：(12～18)；更优选地，体积比为1：15。
进一步地，所述银离子富集方法还包括以下步骤：采用分离技术，步骤S3得到的溶液转移到低吸附容器中，进样检测。
优选地，所述分离技术为震荡；所述震荡时间为3min。
根据本发明的一些实施方式，具体包括以下步骤：
1)首先将血清样本与少量稀硝酸经一定比例混合(不超过待处理血清样本初始体积，最优体积比例为血清：稀硝酸＝5:1，稀硝酸最优浓度为0.7％)，改变血清pH值为弱酸性(pH值为4.0～6.5)，解吸附容器管壁上的银离子，并解聚部分与蛋白结合的银离子；
2)再通过加入适当倍率的稀硝酸(最优体积比例为血清:稀硝酸＝1:15，稀硝酸最优浓度为1.0％)，改变血清的pH为酸性(pH值为1.0～3.0)，完全解聚蛋白-银离子螯合物，形成类似硝酸银之类的易溶解型硝酸盐，此外解离后的蛋白因为空间位阻来阻断银离子与管壁的再吸附，获得全部游离型银离子；
3)最后采用适当分离技术(最优分离方式为震荡，时间最优为3min)，将存在于倍率稀硝酸体系的游离型银离子转移到低吸附容器中，进样检测。
根据本发明的第二方面实施例的银离子定量试剂盒，包括硝酸溶液I、硝酸溶液II、银标准品、银质控品和铟内标品；其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的浓度分别为0.5％～2.0％；所述硝酸溶液II的浓度高于硝酸溶液I的浓度。
根据本发明实施例的银离子定量试剂盒，至少具有如下有益效果：本发明的试剂盒优化了稳定的定量方法参数结果，获得了定量试剂盒所需的合理线性范围、标准品和质控品设定，验证了定量灵敏度、准确度和精密度、稳定性、干扰试验等各项性能，并初步应用到少量实际生物基质样本中的定量测试与评估，这些工作符合质量标准，具备了定量试剂盒产品的初步雏形，开发出的适用于生物基质的银离子定量试剂盒具有重大的市场前景和价值。
根据本发明的一些实施方式，所述银离子定量试剂盒通过ICP-MS检测，所述银标准品包含：1)银标准曲线工作液浓度：300、600、1200、2400、4800、7200、10000ng·mL-1，溶剂为0.7％硝酸(含铟内标1000ng·mL-1)；2)银标准血清样品浓度：15、30、60、120、240、360、500ng·mL-1，溶剂为临床收集的健康受试者血清；
所述银质控品包含：1)银质控工作液：300、700、3000、5000、7600ng·mL-1，溶剂为0.7％硝酸(含铟内标1000ng·mL-1)；2)银质控血清样品：15、35、150、250、380ng·mL-1，溶剂为临床收集的健康受试者血清。进一步地，所述硝酸溶液I的浓度为0.7％；所述硝酸溶液II的浓度为1.0％。
进一步地，所述银标准品的储备液浓度为1000μg·mL-1；
进一步地，所述铟内标的工作液浓度为1000ng·mL-1，溶剂为0.7％硝酸。
根据本发明的一些实施方式，所述银离子定量试剂盒的使用方法包括检测试剂和样本的配制、标准曲线绘制和样本检测等。
进一步地，ICP-MS检测试剂和样本的配制方法具体如下：
银标准曲线工作液：300ng·mL-1(STD1)、600ng·mL-1(STD2)、1200ng·mL-1(STD3)、2400ng·mL-1(STD4)、4800ng·mL-1(STD5)、7200ng·mL-1(STD6)、10000ng·mL-1(STD7)，溶剂为0.7％硝酸(含内标)；
银标准血清样品：0ng·mL-1(S0)、15ng·mL-1(S1)、30ng·mL-1(S2)、60ng·mL-1(S3)、120ng·mL-1(S4)、240ng·mL-1(S5)、360ng·mL-1(S6)、500ng·mL-1(S7)，溶剂为临床收集的健康受试者血清；
银质控工作液：300ng·mL-1(SLLOQ)、700ng·mL-1(SLQC)、3000ng·mL-1(SLMQC)、5000ng·mL-1(SHMQC)、7600ng·mL-1(SHQC)，溶剂为0.7％硝酸(含内标)；
银质控血清样品：15ng·mL-1(LLOQ)、35ng·mL-1(LQC)、150ng·mL-1(LMQC)、250ng·mL-1(HMQC)、380ng·mL-1(HQC)，溶剂为临床收集的健康受试者血清；
铟内标工作液：1000ng·mL-1，溶剂为0.7％硝酸。
进一步地，使用的ICP-MS检测参数为：ICP-MS质谱仪(7900型，Agilent)，离子源为ICP，雾化室温度设定为2℃，载体流速设定为15L·min-1，采样深度为8mm，单个峰采集点数为3，提升时间为20s，稳定时间为10s，待测物原子采集质量银为107，内标物原子采集质量铟为115，积分时间均为0.1s，外壁洗针方式为用5％硝酸溶液清洗30s，内壁洗针方式为先用0.5％硝酸溶液清洗10s，再用超纯水清洗50s。
根据本发明的第三方面实施例的银离子定量检测方法，包括将含蛋白生物基质样本进行前处理得到待测样本和通过检测设备对所述待测样本进行定量检测的步骤，其中，所述前处理包括以下步骤：
S01、在样本中加入硝酸溶液I，使体系的pH值为4.0～6.5；
S02、加入硝酸溶液II，使体系的pH值为1.0～3.0；
S03、分离并转移，得到待进样检测样本。
根据本发明的银离子定量检测方法，至少具有如下有益效果：使用经优化后“分步稀释法”前处理的含蛋白生物基质样本，进行银离子的定量检测，可以实现银离子回收率保持在100％±10％，准确度和精密度达标。解决了含蛋白生物基质样本中银离子与管壁非特异性吸附、硝酸直接解吸附不能保证准确度的技术问题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中“分步稀释法”富集血清中银离子的基本原理图；
图2为本发明实施例3中血清样本中银离子ICP-MS定量标准曲线图；
图3为本发明实施例3中全血稳定性考察0h与2h对比验证图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的创新在于：提供了一种高效的银离子富集方法，主要可针对含蛋白生物基质(如血液、血清等)，通过“分步稀释法”，提高对生物基质中银离子的整体回收率和定量效果。
本发明中，由于血清pH为中性，存在大量的HSA等蛋白质，因此收集血清的容器在蛋白质的介入下，除了少部分银离子非特异性吸附容器管壁外，绝大部分银离子往往与蛋白产生稳定的蛋白-金属螯合物，一般加入酸液来做解聚处理。但往往难以有效且高效解离与蛋白质结合的银离子等金属物质，并且不能确保解聚后的银离子不再与容器管壁吸附。血清中的银离子经简单硝酸解聚后，往往难以有效且高效解离与蛋白质结合的银离子等金属物质，且解聚后的银离子进入仪器有很强的记忆效应和残留效应，因为进样系统和管路等的非特异性吸附导致方法重现性不好，响应不稳定，多数为物理干扰(基体效应，与样品中的粘性，盐，溶剂，阴离子存在形式有关)。基于上述现有技术不足，本发明创造了“分步稀释法”富集血清样本中的银离子。
本发明采用的银离子富集方法为“分步稀释法”，主要是通过巧妙优选少量稀硝酸(呈一定低倍率)、大量稀硝酸(呈一定高倍率)分步开展与材料管壁、与基质中蛋白等不同结合形式的银离子提取；通过硝酸浓度的变化，特别是硝酸体积的变化，来充分提取与容器管壁、与蛋白基质结合的银离子，从而实现对生物基质中银离子进行高效富集。该“分步稀释法”富集血清中的银离子的基本原理如图1所示，具体步骤和作用原理如下：
1)首先将血清样本与少量稀硝酸经一定比例混合(不超过待处理血清样本初始体积，最优体积比例为血清：稀硝酸＝5:1，稀硝酸最优浓度为0.7％)，改变血清pH值为弱酸性(pH在4.0～6.5范围内均具有较好的效果，本实施例中的pH为5.9)，解吸附容器管壁上的银离子，并解聚部分与蛋白结合的银离子；
2)再通过加入适当倍率的稀硝酸(最优体积比例为血清:稀硝酸＝1:15，稀硝酸最优浓度为1.0％)，改变血清的pH为1.5(pH在1.0～3.0范围内均具有较好的效果，当pH为1.5左右时，蛋白-银离子的解聚效果最优)，完全解聚蛋白-银离子螯合物，形成类似硝酸银之类的易溶解型硝酸盐，此外解离后的蛋白因为空间位阻来阻断银离子与管壁的再吸附，获得全部游离型银离子；
3)最后采用适当分离技术(最优分离方式为震荡，时间最优为3min)，将存在于倍率稀硝酸体系的游离型银离子转移到低吸附容器中，进样检测。
本发明利用银离子在pH为中性、弱酸性、酸性中与容器介质、蛋白基质结合作用力不同的原理，创造了“分步稀释法”。巧妙优选少量稀硝酸(呈一定低倍率)、大量稀硝酸(呈一定高倍率)分步开展与材料管壁、与基质中蛋白等不同结合形式的银离子提取。通过硝酸浓度的变化，特别是硝酸体积的变化，来充分提取与容器管壁、与蛋白基质结合的银离子，分步骤实现解吸附和解聚，并辅助使用低吸附材质(优选为高密度聚丙烯EP管)，以实施例结果证明了本前处理方法的银离子ICP-MS定量结果准确度高，操作精密度高，平行性良好。
实施例1血液样本中银离子富集方法
血液样本的前处理方法(“分步稀释法”)，包括以下具体步骤：
取空白血清200μL，加入40μL 0.7％硝酸(含1000ng·mL-1内标物质铟)，混合均匀后，再加入2760μL 1％硝酸，振荡3min，吸取100μL至高密度聚丙烯EP管中，18000g离心5min。
本发明通过“分步稀释法”富集血清中的银离子，先通过加入不超过待处理血清样本初始体积的少量稀硝酸，解吸与容器管壁非特异性吸附的银离子，然后加入大量的稀硝酸(体积倍率在10倍以上)改变pH，从而实现蛋白-银离子螯合物的充分解聚。优化了解吸附时的少量稀硝酸比例、解聚时的大量稀硝酸比例，具体优化的结果参见相关原理介绍中的最优参数。
经“分步稀释法”处理的含银离子溶液，转移到低吸附的容器中(最优的低吸附容器为高密度聚丙烯材质)，可有效避免富集出的游离型银离子再吸附到容器管壁上，影响最终回收率。
经优化后“分步稀释法”前处理的血清样本，开展ICP-MS定量检测银离子，可以实现银离子回收率保持在100％±10％，准确度和精密度达标。解决了血清样本中银离子与管壁非特异性吸附、硝酸直接解吸附不能保证准确度的技术问题。
实施例2ICP-MS定量试剂盒及其使用方法
1、试剂盒组成：银标准品，银质控品，铟内标品，高密度聚丙烯EP管，硝酸溶液I(0.7％)，硝酸溶液II(1％)。
试剂盒的使用和工作液配制浓度如下：银标准品储备液(CSS)：1000μg·mL-1，
银标准曲线工作液：300ng·mL-1(STD1)、600ng·mL-1(STD2)、1200ng·mL-1(STD3)、2400ng·mL-1(STD4)、4800ng·mL-1(STD5)、7200ng·mL-1(STD6)、10000ng·mL-1(STD7)，溶剂为0.7％硝酸(含内标)。
银标准血清样品：0ng·mL-1(S0)、15ng·mL-1(S1)、30ng·mL-1(S2)、60ng·mL-1(S3)、120ng·mL-1(S4)、240ng·mL-1(S5)、360ng·mL-1(S6)、500ng·mL-1(S7)，溶剂为临床收集的健康受试者血清。
银质控工作液：300ng·mL-1(SLLOQ)、700ng·mL-1(SLQC)、3000ng·mL-1(SLMQC)、5000ng·mL-1(SHMQC)、7600ng·mL-1(SHQC)，溶剂为0.7％硝酸(含内标)。
银质控血清样品：15ng·mL-1(LLOQ)、35ng·mL-1(LQC)、150ng·mL-1(LMQC)、250ng·mL-1(HMQC)、380ng·mL-1(HQC)，溶剂为临床收集的健康受试者血清。
铟内标工作液：1000ng·mL-1，溶剂为0.7％硝酸。
本实施例的剂盒使用的ICP-MS检测参数为：ICP-MS质谱仪(7900型，Agilent)，离子源为ICP，雾化室温度设定为2℃，载体流速设定为15L·min-1，采样深度为8mm，单个峰采集点数为3，提升时间为20s，稳定时间为10s，待测物原子采集质量银为107，内标物原子采集质量铟为115，积分时间均为0.1s，外壁洗针方式为用5％硝酸溶液清洗30s，内壁洗针方式为先用0.5％硝酸溶液清洗10s，再用超纯水清洗50s。
本发明所述试剂盒包含了定量结果判断标准：相关系数r2≥0.9801或r≥0.9900；校正标样的回算浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少75％的校正标样且最少6个浓度水平应符合上述标准。
2、试剂盒规定的血清前处理方法(同实施例1中的前处理方法)
取空白血清200μL，加入40μL 0.7％硝酸(含1000ng·mL-1内标物质铟)，混合均匀后，再加入2760μL 1％硝酸，振荡3min，吸取100μL至高密度聚丙烯EP管中，18000g离心5min。
3、试剂盒中银标准曲线溶液配制
取银标准溶液(国家有色金属电子材料分析测试中心，标定浓度为1000μg·mL-1)适量至聚丙烯EP管中，室温保存，作为储备液CSS。然后以0.7％硝酸为溶剂，经过系列稀释，得到7个银标准曲线工作液，浓度分别为300ng·mL-1(STD1)、600ng·mL-1(STD2)、1200ng·mL-1(STD3)、2400ng·mL-1(STD4)、4800ng·mL-1(STD5)、7200ng·mL-1(STD6)、10000ng·mL-1(STD7)。
以临床收集的健康受试者血清为溶剂，将银标准曲线工作液按1:20，做进一步系列稀释，得到7个银标准血清样品，浓度分别为15ng·mL-1(S1)、30ng·mL-1(S2)、60ng·mL-1(S3)、120ng·mL-1(S4)、240ng·mL-1(S5)、360ng·mL-1(S6)、500ng·mL-1(S7)，此外，增加0ng·mL-1(S0，正常人血清中不添加银标准曲线工作液)的空白对照，这些系列稀释后的含生物基质样品，作为定量标准品曲线的x轴标准品浓度。
银标准曲线溶液的配制，经历了储备液→标准曲线工作液→标准血清样品的阶段稀释，溶剂分别变化为6.3％硝酸→0.7％稀硝酸→血清，0.7％的稀硝酸既可以维持溶液体系为弱酸性，防止银离子吸附容器管壁，又可以适当的解聚银离子和蛋白聚合物。该处理避免了从较高浓度的硝酸直接过渡到生物基质引起的pH值剧烈变化而导致的银离子非特异性吸附，保证标准品的回收率和准确性，还可以降低每次稀释的跨度(不超过100倍)，有效提高人员操作重复性和准确度。
4、试剂盒中银质控溶液配制
取银标准溶液(国家有色金属电子材料分析测试中心，标定浓度为1000μg·mL-1)适量至聚丙烯EP管中，室温保存，作为储备液QSS。然后以0.7％硝酸为溶剂，经过系列稀释，得到5个银质控工作液，浓度分别为300ng·mL-1(SLLOQ)、700ng·mL-1(SLQC)、3000ng·mL-1(SLMQC)、5000ng·mL-1(SHMQC)、7600ng·mL-1(SHQC)。
以临床收集的健康受试者血清为溶剂，将银质控工作液按1:20，做进一步系列稀释，得到5个银质控血清样品，浓度分别为15ng·mL-1(LLOQ)、35ng·mL-1(LQC)、150ng·mL-1(LMQC)、250ng·mL-1(HMQC)、380ng·mL-1(HQC)，这些系列稀释后的含生物基质样品，作为定量质控标准品浓度。
银质控溶液的配制，经历了储备液→质控工作液→质控血清样品的阶段稀释，溶剂分别变化为6.3％硝酸→0.7％稀硝酸→血清，0.7％的稀硝酸既可以维持溶液体系为弱酸性，防止银离子吸附容器管壁，又可以适当的解聚银离子和蛋白聚合物。该处理避免了从较高浓度的硝酸直接过渡到生物基质引起的pH值剧烈变化而导致的银离子非特异性吸附，保证标准品的回收率和准确性，还可以降低每次稀释的跨度(不超过100倍，20倍以内稀释为最佳)，有效提高人员操作重复性和准确度。
5、试剂盒中内标工作液配制
取铟标准溶液(国家有色金属电子材料分析测试中心，标定浓度为1000μg·mL-1)适量至聚丙烯EP管中，室温保存，作为储备液ISS。然后用0.7％硝酸溶液稀释，得到铟内标过渡液(10000ng·mL-1)。继续用0.7％硝酸溶液稀释，得到铟内标工作液(1000ng·mL-1)。
6、试剂盒的结果计算与统计方式
进样到质谱系统分析，记录待测物与内标的响应，并计算待测药物与内标的响应比值。以银与内标的响应比值(Y)为纵坐标，以系列标准血清样品浓度(X)为横坐标，使用权重因子(1/X2)，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血清样品中待测物与内标的响应比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
本发明的试剂盒，至少具有如下有益效果：本发明在方法参数优化和验证结果的基础上，实现开发定量试剂盒的目标。本发明实验人员通过大量实验摸索，优化了稳定的定量方法参数结果，获得了定量试剂盒所需的合理线性范围、标准品和质控品设定，验证了定量灵敏度、准确度和精密度、稳定性、干扰试验等各项性能，并初步应用到少量实际生物基质样本中的定量测试与评估，这些工作符合质量标准，具备了定量试剂盒产品的初步雏形。
目前市场上的已有银离子定量试剂盒以检测水质和土壤基质为主，缺少对于生物基质相关定量检测的产品，非生物基质的银离子定量试剂盒无法用于生物基质样本的检测，因此，开发适用于不同生物基质的银离子定量试剂盒具有重大的市场前景和价值。
实施例3试剂盒相关指标验证试验
1、标准曲线绘制
按照实施例2中试剂盒的方法配置标准曲线血清系列浓度样品和质控样品。进样到质谱系统分析，记录待测物与内标的响应，并计算待测物质与内标的响应比值。以银与内标的响应比值(Y)为纵坐标，以系列标准血清样品浓度(X)为横坐标，使用权重因子(1/X2)，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血清样品中待测物与内标的响应比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
血清中银离子的定量标曲见图2，结果表明，本发明的试剂盒在15～500ng·mL-1范围内的线性方程为y＝0.0063X+1.3076E-004，r为0.9999，满足线性接受标准，线性定量效果良好。
2、高脂、溶血的基质效应评价
取6份不同来源的空白血清，质控工作溶液(SLQC、SHQC)分别用上述6份不同来源的空白血清基质配制样品，分别在低、高浓度下考察基质效应，每个来源的基质各浓度平行配制3份样品，配制方法如下：加质控工作液10μL、加入190μL空白血清，加入1000ng·mL-1内标工作液40μL，再加入1.0％硝酸2760μL，振荡3min。进样到质谱系统分析。分别得到银的响应(B1)和铟的响应(B2)。
分别取1份来源的空白高脂血清、空白溶血血清，质控工作溶液(SLQC、SHQC)分别用这2份来源的空白高脂血清基质配制样品，分别在低、高浓度下考察基质效应，每个浓度平行配制3份样品，配制方法如下：加质控工作液10μL、加入1000ng·mL-1内标工作液40μL，分别加入190μL空白高脂血清、190μL空白溶血血清，再加入1.0％硝酸2760μL，振荡3min。进样到质谱系统分析。分别得到银的响应(C1、D1)和铟的响应(C2、D2)。
取质控工作液(SLQC、SHQC)10μL，分别加入1000ng·mL-1内标工作液40μL，加入超纯水190μL，再加入1.0％硝酸2760μL，振荡3min，进样到质谱系统分析，分别得到银的响应(E1)和铟的响应(E2)。各浓度平行配制3份。
空白正常血清基质效应：计算待测物的基质因子B1/E1，计算内标的基质因子B2/E2。空白血清作为基质的经内标归一化的基质因子(B1/E1)/(B2/E2)。
空白溶血血清基质效应：计算待测物的基质因子D1/E1，计算内标的基质因子D2/E2。空白溶血血清作为基质的经内标归一化的基质因子(D1/E1)/(D2/E2)。
空白高脂血血清基质效应：计算待测物的基质因子C1/E1，计算内标的基质因子D2/E2。空白高脂血血清作为基质的经内标归一化的基质因子(C1/E1)/(C2/E2)。
接受标准：同一浓度的样品，经内标归一化的基质因子的变异系数小于15％。
本发明的验证实验统计见表1和表2：
表1低浓度质控在正常血清、溶脂、溶血中的基质效应评价
Figure BDA0002524150740000131
表2高浓度质控在正常血清、溶脂、溶血中的基质效应评价
Figure BDA0002524150740000132
Figure BDA0002524150740000141
结果表明，本试剂盒在正常血清、溶血血清、高脂血清中的待测物基质效应，通过高低2种质控浓度统计评价，经内标归一化的基质因子的变异系数分别为3.70％、5.42％，均符合接受标准。
该复杂人血清样本(溶血、溶脂)的考察结果说明：在复杂高脂、高血红蛋白基质环境下的银离子经过本发明的“分步稀释法”，测定比值与正常血清基质环境下的银离子提取效率是一致的。因此，本发明的银离子富集方法和ICP-MS银离子定量试剂盒可以有效解决银离子与蛋白、脂质结合而导致定量结果偏低、残留的问题，具有显著的技术创新优势和实际应用价值。
3、全血稳定性评价
采用新鲜全血作为全血稳定性考察基质，配制低浓度(15ng·mL-1，LQC)、高浓度(380ng·mL-1，HQC)质控浓度的全血样品，在水浴锅中(36.5℃±5℃)孵育30分钟)。再于室温放置约0h、2h后，以1200g在2～8℃下离心15min，得到血清基质，分别按照“实施例1血液样本中银离子富集方法”的所述方法处理富集银离子，进样到质谱系统分析，记录待测物和内标的响应值。
接受标准：质控低、高浓度样品在放置0h、2h后离心，进样得到的待测物与内标响应比值进行比对，偏差绝对值应在15％之内，相同浓度待测物/内标的响应比值变异系数±15％之内。
本发明的验证实验统计见图3。结果表明，本试剂盒经过全血中处理0h、2h，通过高低2种质控浓度统计评价，待测物与内标响应比值的偏差绝对值在0.01％～7.75％，全血中不同浓度不同放置时间之间的测值变异系数CV％在0.66％～3.81％之间，均符合接受标准。
该全血中银离子稳定性考察结果说明：在完全按照临床待测样本的情况下，本发明的银离子富集方法可以有效准确的完成含银药物中的银离子前处理富集提取，通过本试剂盒检测可以实现银离子的准确定量，基本不受处理时间的延长而影响。本发明的方法和试剂盒产品均具有显著的技术创新优势和实际应用价值。
本发明实验人员前期按照文献等报道的一步稀释法，以及更换不同酸性溶剂，验证了更换酸性溶剂操作，或者一步稀释的处理，仍然有准确度低、质谱响应低、对仪器雾化室造成吸附和干扰的局限。
通过与直接稀释法比较，本发明使用的生物基质前处理和银离子富集方法能够显著降低管壁吸附和银离子残留效应，提高ICP-MS定量检测银离子的精确性和准确度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种含蛋白生物基质中银离子富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在生物基质样本中加入硝酸溶液I，使体系的pH值为4.0～6.5；
S2、加入硝酸溶液II，使体系的pH值为1.0～3.0；
其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的浓度分别为0.5％～2.0％；
所述生物基质样本的体积大于所述硝酸溶液I的体积；
所述生物基质样本的体积小于所述硝酸溶液II的体积。
2.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述含蛋白生物基质包括血清、血浆、淋巴液和脑脊液中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述硝酸溶液I的质量浓度为0.5％～1.0％；优选地，所述硝酸溶液I的质量浓度为0.7％。
4.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述硝酸溶液II的质量浓度为1.0％～2.0％；优选地，所述硝酸溶液II的质量浓度为1.0％。
5.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述硝酸溶液II的浓度高于硝酸溶液I的浓度。
6.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述生物基质样本与所述硝酸溶液I的体积比为(3～8)：1；优选地，所述生物基质样本与所述硝酸溶液I的体积比为(4～6)：1；更优选地，体积比为5：1。
7.根据权利要求1所述的银离子富集方法，其特征在于，所述生物基质样本与所述硝酸溶液II的体积比为1：(10～20)；优选地，所述生物基质样本与所述硝酸溶液II的体积比为1：(12～18)；更优选地，体积比为1：15。
8.一种含蛋白生物基质中银离子定量试剂盒，其特征在于，包括硝酸溶液I、硝酸溶液II、银标准品、银质控品和铟内标品；
其中，所述硝酸溶液I和硝酸溶液II的质量浓度分别为0.5％～2.0％；所述硝酸溶液II的浓度高于硝酸溶液I的浓度。
9.根据权利8所述的银离子定量试剂盒，其特征在于，所述银离子定量试剂盒通过ICP-MS检测，所述银标准品包含：1)银标准曲线工作液浓度：300、600、1200、2400、4800、7200、10000ng·mL-1，溶剂为含铟内标1000ng·mL-1的0.7％硝酸；2)银标准血清样品浓度：15、30、60、120、240、360、500ng·mL-1，溶剂为临床收集的健康受试者血清；
所述银质控品包含：1)银质控工作液：300、700、3000、5000、7600ng·mL-1，溶剂为含铟内标1000ng·mL-1的0.7％硝酸；2)银质控血清样品：15、35、150、250、380ng·mL-1，溶剂为临床收集的健康受试者血清。
10.一种含蛋白生物基质中银离子定量检测方法，其特征在于，包括将含蛋白生物基质样本进行前处理得到待测样本和通过检测设备对所述待测样本进行定量检测的步骤，其中，所述前处理包括以下步骤：
S01、在样本中加入硝酸溶液I，使体系的pH值为4.0～6.5；
S02、加入硝酸溶液II，使体系的pH值为1.0～3.0；
S03、分离并转移，得到待检测样本。
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