CN110940766A

CN110940766A - 一种鱼肉中土腥味物质的测定方法

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Publication number: CN110940766A
Application number: CN201911190645.5A
Authority: CN
Inventors: 张艳红; 李德祥; 张凤枰; 邹昌健
Original assignee: Sichuan Will Test Technology Ltd By Share Ltd; Tongwei Co Ltd
Current assignee: Sichuan Will Test Technology Ltd By Share Ltd; Tongwei Co Ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，该测定方法是以顺式‑十氢‑1‑萘酚溶液为内标制备的鱼肉为样品，采用顶空固相微萃取法提取样品中的土臭味素和2‑甲基异莰醇，再通过气相色谱质谱联用法进行的测定过程。采用顶空固相微萃取法提取鱼肉中的土腥味物质，以顺式‑十氢‑1‑萘酚为内标，气相色谱质谱联用法进行定性和定量测定，旨在建立鱼肉中土臭味素和2‑甲基异莰醇的检测方法，为养殖水产品异味物质脱除提供检测方法依据。

Description

一种鱼肉中土腥味物质的测定方法

技术领域

本发明是一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，具体涉及鱼肉中土腥味物质土臭味素和2-甲基异莰醇的提取、富集及检测方法，属于食品检测领域。

背景技术

水产品是人类食品中优质动物蛋白的主要来源之一。我国是水产养殖第一大国，2018年全国水产品总产量为6457.66万吨，其中养殖产量为4991.06万吨。然而，部分养殖水产品的异味令消费者很难接受，是困扰水产养殖业已久的问题，直接影响到水产品的消费和养殖经济效益。据研究报道，土臭味素（土臭素）和2-甲基异莰醇是易引起水产品肉质产生异味最常见的两种化合物，是放线菌、蓝藻、蛋白细菌和真菌等微生物的次级代谢产物在萜烯合成酶的作用下产生的，参与这些生物合成的酶和基因最早是在链霉菌上发现的，后来也在蓝藻中发现了^[1~3]。研究表明，人体对土臭味素和2-甲基异莰醇的嗅觉阈值分别为0.9μg/kg和0.6μg/kg^[4,5]，水体中4~10ng/L的土臭味素和9~42ng/L的2-甲基异莰醇就能够使水体及水产品产生异味，当鱼肉组织中的这两种化合物浓度超过0.7μg/kg时，这样的鱼类就不再适合零售^[6]。国内外相关从业者采用臭氧、乙酸、暂养等方法脱除或降低养殖水产品中的土腥味物质^[7-11]。

目前，有关土臭味素和2-甲基异莰醇的检测方法主要为气相色谱质谱联用法，GB/T 32470-2016规定了顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法测定生活饮用水及其水源水中的土臭味素和 2-甲基异莰醇。报告^[13]记载了采用自动固相微萃取-气相色谱质谱联用法对饮用水中土臭味素和2-甲基异莰醇的高灵敏度检测，2-甲基异莰醇和土臭味素的方法检出限（MDL）分别可达到0.1343ppt和0.0937ppt，方法定量限（MQL）分别为0.4029ppt和0.2811ppt。

由于鱼肉组织成分复杂，其中挥发性风味物质种类多，土腥味物质作为一类影响鱼肉品质的挥发性成分，具有提取和吸附难度大，干扰物质繁多，样品基质复杂的特点，检测难度较大。现有技术中，针对鱼肉组织中土臭味素和2-甲基异莰醇的提取和检测方法，如文献^[14-16]报道的采用微波蒸馏－固相微萃取－气相色谱质谱联用法测定鲶鱼、罗非鱼肌肉中的土臭味素和 2-甲基异莰醇，但由于微波蒸馏提取过程复杂、操作要求高，不易标准化，重复性、稳定性差。又如E.D. Ruan^[17]采用SBSE-TD-GC-MS（搅拌棒吸收萃取－热脱附－气相色谱质谱联用仪）测定大西洋鲑肌肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇含量，该方法需要用到热脱附装置，仪器投入大，土臭味素加标回收率达93~96%，但2-甲基异莰醇加标回收率仅为23~30%，2-甲基异莰醇回收率太低、不满足检测要求。

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发明内容

为准确测定水产品中的土臭味素和2-甲基异莰醇含量，本发明的目的在于提供一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，采用顶空固相微萃取法提取鱼肉中的土腥味物质，以顺式-十氢-1-萘酚为内标，气相色谱质谱联用法进行定性和定量测定，旨在建立鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测方法，为养殖水产品异味物质脱除提供检测方法依据。

本发明通过下述技术方案实现：一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：该测定方法是以顺式-十氢-1-萘酚溶液为内标制备的鱼肉为样品，采用顶空固相微萃取法提取样品中的土臭味素和2-甲基异莰醇，再通过气相色谱质谱联用法进行的测定过程。

所述样品制备包括：将鱼肉、顺式-十氢-1-萘酚溶液、水混合后，经均质、破碎而制备得到样品。

采用顶空固相微萃取法提取前，对其使用的萃取头进行老化，老化时间0.5~2 h，温度250℃。

采用顶空固相微萃取法提取时，控制搅拌速度为800~1200r/min，萃取时间为30~40min。

采用顶空固相微萃取法提取结束后，对萃取头进行解吸，解吸时间5~10min，解吸后通过气相色谱质谱联用法进行测定。

所述气相色谱质谱联用法的检测条件满足以下指标：

色谱柱：HP-5 ms 弹性毛细管柱，柱温程序升温至250 ℃，进样口温度：250~260℃，载气：He，流量1.0~2.0mL/ min，解吸温度250℃，解吸时间5~10min，不分流模式进样；

传输线温度260~270℃，离子源温度230℃ ，四极杆温度150℃，电子能量70eV，扫描方式：SIM 选择性离子扫描，土臭味素扫描离子为：125、112、97，2-甲基异莰醇的扫描离子为：135、108、95，顺式-十氢-1-萘酚的扫描离子为：136、94、121。

进一步的，所述气相色谱质谱联用法的检测条件满足以下指标：

色谱柱：HP-5 ms 弹性毛细管柱，柱温程序升温至250 ℃，进样口温度：250℃，载气：He，流量1.0mL/ min，解吸温度250℃，解吸时间5min，不分流模式进样；

传输线温度260℃；离子源温度230℃ ；四极杆温度150℃；电子能量70eV；扫描方式：SIM 选择性离子扫描，土臭味素扫描离子为：125、112、97，2-甲基异莰醇的扫描离子为：135、108、95，顺式-十氢-1-萘酚的扫描离子为：136、94、121。

配置土臭味素和2-甲基异莰醇的标准工作溶液后，绘制标准工作曲线，对测定结果进行分析，得到样品中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明方法采用顶空固相微萃取提取鱼肉中的土腥味物质，避免了因采用微波微波蒸馏萃取时对前处理操作要求较高以及重复性、稳定性差的缺陷，称取样品后加入适当体积的超纯水均质，可将鱼肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇全部溶解于水相中，再经固相微萃取对目标物进行提取和富集，该前处理操作简单，具有良好的重现性，可满足对鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测需求。

（2）本发明在提取前后，均需对萃取头进行处理，提取前采用老化处理方式，以确保脱去可能吸附的挥发性成分，提高检测的准确性；提取后采用解吸处理，将目标化合物在气化室气化，供气相色谱质谱分析检测。

（3）本发明方法以顺式-十氢-1-萘酚溶液为内标，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法对鱼肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇进行提取和测定，经试验证明，该测定方法中，土臭味素的加标回收率为68.7~78.0%，2-甲基异莰醇的加标回收率62.7~74.0%。

（4）采用本发明方法对土臭味素和2-甲基异莰醇分别进行检出限和2-甲基异莰醇实验，当信噪比S/N>3时，其检出限分别为0.018μg/kg 和0.023μg/kg，当信噪比S/N>10时，其定量限分别为0.059μg/kg和0.076μg/kg。

附图说明

图1为草鱼样品总离子流图。

图2为不同定量方法对实验效果的影响（n=3）

图3为不同吸附时间对实验效果的影响（n=3）

图4为不同处理温度对实验效果的影响（n=3）

图5为土臭味素、2-甲基异莰醇和顺式-十氢-1-萘酚（内标）总离子流图（5.0ng/mL）。

具体实施方式

下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

从已知研究报道了解到，鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的提取方式主要有微波蒸馏－固相微萃取和顶空固相微萃取，微波蒸馏提取需对微波萃取功率、微波蒸馏时间和载气气流等参数进行考察确认[13-15]，由于微波萃取所用的仪器大多为家用微波炉，不同品牌和型号的微波炉使用功率不一致，很难统一微波萃取功率和固化实验条件。鱼肉中有70~80%的水分，微波萃取时，鱼肉中的水分气化为水蒸气，在载气的吹扫和冷凝水的冷却下，水蒸气在管道中冷凝下来，堵塞了冷凝管，影响土臭味素和2-甲基异莰醇的提取和收集，导致回收率偏低，因此，微波蒸馏萃取对前处理操作要求较高，重复性、稳定性差。为此，本发明方法选择顶空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基异莰醇，称取样品后加入等体积的超纯水均质，将鱼肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇全部溶解于水相中，再经固相微萃取对目标物进行提取和富集，该前处理操作简单，具有良好的重现性，可满足对鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测需求。

本发明所述测定方法具体概括如下：

仪器：7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，G1701EA质谱工作站：美国 Agilent 公司；T10 均质仪，德国 IKA 公司；SPME 手柄、65 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国 Sigma-Aldrich 公司；DF-Ⅱ 集热式磁力加热搅拌器，金坛市医疗仪器厂；40mL顶空瓶，上海安谱科学仪器有限公司；LD6100-1 电子天平，沈阳龙腾电子有限公司。

试剂：100 μg/mL土臭味素和2-甲基异莰醇混和标准溶液，顺式-十氢-1-萘酚标准物质，美国Sigma-aldrich公司；水为Milli- Q Gradient 去离子水。

材料：于成都白家水产品批发市场购买鲫鱼、乌鱼、罗非鱼和斑点叉尾鮰作为试验材料，随机取10尾，均为健康鲜活个体，样品采集后立即装袋、充氧，0.5 h后运送到实验室，致死后，分别取鱼体肌肉部分，去皮后切成 2～3 cm 肉片，用均质仪打成肉糜，置于密封袋中，并于-80 ℃ 超低温冰箱中冷冻保存，分析时取出流水解冻后使用。

（1）样品准备

准确称取鱼肉10 g（精确至0.1 g）于40 mL顶空瓶中，加入1 μg/mL顺式-十氢-1-萘酚溶液10 μL作为内标，加入10 mL一级水，用均质器均质3 min，完全破碎，制备得到样品，将样品放入微型搅拌子，备用。

（2）顶空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基异莰醇

萃取头老化：第一次使用DVB/CAR/PDMS萃取头时，需要置于气相色谱进样口处于250℃下老化 2 h（氮气保护下）；以后使用时需于250 ℃下处理30 min，以确保脱去可能吸附的挥发性成分。

SPME 提取：将装有样品的顶空瓶置于磁力搅拌台上，于60 ℃水浴中平衡10 min，将SPME针管插入顶空瓶中（含50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，使用前于250 ℃下处理30 min，以确保脱去可能吸附的挥发性成分），固定萃取头在顶空瓶中的位置，搅拌速度为800~1200r/min，优选1000 r/min，顶空萃取30~40min后取出，优选30 min，迅速插入到气相色谱仪的进样口，解吸5~10min，优选5 min，使SPME纤维头涂膜吸附的挥发性成分在高温下迅速热解吸，即可通过GC-MS进行分析鉴定。

（3）土臭味素和2-甲基异莰醇标准工作溶液

称取10 g一级水于40 mL顶空瓶中，加入1ug/mL的顺式-十氢-1-萘酚溶液10 μL作为内标，再加入10 mL一级水，加入土臭味素和2-甲基异莰醇标准品浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL，分别进样测定。

（4）仪器工作条件

色谱柱：HP-5 ms 弹性毛细管柱（ 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm）；程序升温：柱初60 ℃，保持4 min，然后以8.5 ℃ /min 升至200 ℃，保持15min，以20 ℃ /min 升至250℃，保持2min；进样口温度：250~260℃，载气：He，流量1.0~2.0mL/ min，解吸温度250℃，解吸时间5~10min，不分流模式进样。

在一个实施例中，仪器工作条件还可进一步限定如下：

进样口温度250 ℃；载气：He，流量1. 0 mL/ min；解吸温度250 ℃，解吸时间5 min，不分流模式进样；传输线温度260 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70eV。

（5）校正工作曲线绘制和样品分析

按照上述色谱质谱条件和方法，进行GC-MS分析，以标准溶液中被测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分的浓度和内标浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，在相同的条件下测定样品，从校准曲线上求得样品中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。

下面通过对实际样品的测定来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

实际样品的测定：

在水产市场上购买鲫鱼、乌鱼、罗非鱼、草鱼、花鲢、鲤鱼和武昌鱼进行土臭味素和2-甲基异莰醇测定实验，采用上述测定方法，涉及的可调整的参数条件选择如下：

步骤（2）中，老化温度、搅拌速度、顶空萃取时间、解析时间等均按优选方案进行选择。步骤（3）中，进样口温度250 ℃；载气：He，流量1. 0 mL/ min；解吸温度250 ℃，解吸时间5min，不分流模式进样；传输线温度260 ℃；离子源温度230 ℃ ；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV。

每个样品重复测定三次，结果见下表1，实际样品检测总离子流图见图1。

表1 实际样品测定结果

以下是对本发明方法进行的试验验证：

（一）定量方法的选择

由于土臭味素和2-甲基异莰醇为半挥发性物质，不稳定，易损失。本实施例采用外标法和内标法（添加顺式-十氢-1-萘酚内标）进行回收率试验，并进行比较，结果见图2。

外标法具体步骤是：称取10g一级水于40mL顶空瓶中，再加入10ml一级水，加入土臭素和2-甲基异莰醇标准溶液浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL各1.0mL，分别进行固相微萃取并进样测定，以目标化合物的浓度为横坐标，各浓度响应峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。在相同的条件下测定样品，从校准曲线上求得样品中土臭素和2-甲基异莰醇的含量。

内标法具体步骤是：称取10g一级水于40mL顶空瓶中，加入10uL 1ug/mL的顺式-十氢-1-萘酚作为内标，再加入10ml一级水，加入土臭素和2-甲基异莰醇标准溶液浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL各1.0mL，分别进行固相微萃取并进样测定。以标准溶液中被测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分的浓度和内标浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，在相同的条件下测定样品，从校准曲线上求得样品中土臭素和2-甲基异莰醇的含量。

由图2可以知道，外标法的回收率为40.6~46.7%，内标法的回收率为70.6~72.3%，内标法的回收率明显高于外标法，因此，选用内标法对鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的测定进行定量。

（二）固相微萃取条件的选择和优化

以50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS为试验用萃取头。萃取温度均设置为60 ℃，平衡10 min后，吸附时间选取20 min、30 min、40 min，考察土臭味素和2-甲基异莰醇的加标回收率，萃取结果见图3。结果表明，30 min、40 min吸附时间的回收率明显高于20 min，30 min和40min的回收率相接近，综合比较，萃取时间选择30 min为最佳。

萃取温度对萃取结果有以下两方面影响，一方面温度升高有利于土臭味素和2-甲基异莰醇的挥发，增加吸附量；另一方面，温度升高时，其余干扰物质吸附增加，从而减少目标化合物吸附量。选取萃取时间为30 min，设置40 ℃、60 ℃、80 ℃对实验结果的影响，以考察土臭味素和2-甲基异莰醇的加标回收率，萃取结果见图4。结果表明，萃取温度为60 ℃时，加标回收率最高。

（三）线性范围考察

土臭味素和2-甲基异莰醇标准品浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、100 ng/mL，顺式-十氢-1-萘酚（内标）的浓度均为10 ng/mL时进样测定，以标准溶液中被测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分的浓度和内标浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，得到土臭味素和2-甲基异莰醇的回归方程和相关系数见下表2，GC-MS总离子流图见图5，相关系数（R）均大于0.999，线性良好。

表2 土臭味素和2-甲基异莰醇的线性范围、回归方程和相关系数

（四）精密度试验

对鲫鱼、乌鱼、罗非鱼和叉尾鮰四个样品进行精密度试验，结果见下表3，4个样品中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测结果相对标准偏差（RSD）均小于5%，说明本发明方法重现性好。

表3 精密度试验结果

（五）回收率试验

对鲫鱼和罗非鱼进行加标试验，并计算回收率，结果见下表4。从表4可以看出，土臭味素的加标回收率为68.67~78.00%，2-甲基异莰醇的加标回收率62.67~74.00%，相对标准偏差为均小于10%，由此可见该方法能较准确测定鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。

表4 回收率试验结果

（六）方法检出限和定量限

对土臭味素和2-甲基异莰醇分别进行检出限和2-甲基异莰醇实验，当信噪比S/N>3时，其检出限分别为0.018μg/kg 和0.023μg/kg，当信噪比S/N>10时，其定量限分别为0.059μg/kg和0.076μg/kg。

（七）结论

由于鱼肉中挥发性风味物质成分复杂、种类繁多，风味物质的检测一直备受关注。土腥味物质作为一类影响鱼肉品质的挥发性成分，提取和吸附难度大，干扰物质繁多，样品基质复杂，其检测难度较大。该方法选用固相微萃取技术作为前处理方法，可以根据目标物性质有效的吸附挥发性成分，减少目标物的损失，且该前处理方法简单，不使用有机溶剂，不对环境造成污染。该方法称取样品后加入等体积的超纯水均质，将鱼肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇溶解于水相中，经固相微萃取对目标物进行提取和富集。同时该方法通过加入内标物来定量，提高该方法的回收率和准确性。再通过GC-MS来定量分析，可减少在检测过程中其他风味成分对土臭味素和2-甲基异莰醇的干扰，达到完好的分离，避免定性不准确和定量引起的偏差。该方法土臭味素的加标回收率为68.7~78.0%，2-甲基异莰醇的加标回收率62.7~74.0%，且该方法的精密度均小于5%，相对标准偏差均小于10%，证明该方法可满足鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇同时检测要求，可为鱼肉中异味物质脱除提供科学、准确的检测方法依据。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：该测定方法是以顺式-十氢-1-萘酚溶液为内标制备的鱼肉为样品，采用顶空固相微萃取法提取样品中的土臭味素和2-甲基异莰醇，再通过气相色谱质谱联用法进行的测定过程。

2.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：所述样品制备包括：将鱼肉、顺式-十氢-1-萘酚溶液、水混合后，经均质、破碎而制备得到样品。

3.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：采用顶空固相微萃取法提取前，对其使用的萃取头进行老化，老化时间0.5~2 h，温度250℃。

4.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：采用顶空固相微萃取法提取时，控制搅拌速度为800~1200r/min，萃取时间为30~40min。

5.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：采用顶空固相微萃取法提取结束后，对萃取头进行解吸，解吸时间5~10min，解吸后通过气相色谱质谱联用法进行测定。

6.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：所述气相色谱质谱联用法的检测条件满足以下指标：

7.根据权利要求6所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：所述气相色谱质谱联用法的检测条件满足以下指标：

8.根据权利要求1所述的一种鱼肉中土腥味物质的测定方法，其特征在于：配置土臭味素和2-甲基异莰醇的标准工作溶液后，绘制标准工作曲线，对测定结果进行分析，得到样品中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。