CN109856260A - 一种肉类食品中n-二甲基亚硝胺的检测方法 - Google Patents

Abstract

本法发明公开了一种肉类食品中N‑二甲基亚硝胺的检测方法，包括如下步骤：S1.取待测样品，加入正己烷‑乙腈‑水，振荡、离心，弃去正己烷层；S2.向S1的溶液中加入二氯甲烷、无水硫酸钠，振荡、离心，取有机层于浓缩瓶，接收瓶中加入冰水，350～360 mbar、34～36℃条件下旋蒸除去二氯甲烷，若剩余溶液大于1mL，加入二氯甲烷继续旋蒸至剩余溶液约0.5～1mL；S3.将S2残余物移出，依次以少量乙腈、乙腈饱和的正己烷和的正己烷清洗S2浓缩瓶，洗涤液与S2残余物混匀，离心，弃去正己烷层，将乙腈层定容即得待测样液，上GC‑MS测定。本发明所使用的前处理方法易于操作，可有效除去待测样品中的高油脂，同时通过改进浓缩条件，NDMA的回收率得到显著改善。

Description

一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，更具体地，涉及一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法。

背景技术

亚硝胺类几乎可以引发人体所有脏器肿瘤，其中以消化道癌最为常见。主要来自化肥的应用，亚硝胺类化合物普遍存在于谷物、牛奶、干酪、烟酒、熏肉、烤肉、海鱼、罐装食品以及饮水中。国内外对亚硝胺的检测研究比较也比较多。对于腌制水产品、儿童乳胶质谱、饮用水、香肠、水果、香烟、啤酒、化妆品等类型的样品中的亚硝胺均有研究。测定亚硝胺的检测器包括质谱检测器、三重四级杆、热能分析仪、氮磷检测器等。样品的提取方式有水蒸气蒸馏法、乙腈提取、二氯甲烷提取、固相萃取等常见的提取方式。对于亚硝胺的净化主要是使用层析柱、固相萃取柱和液液萃取进行净化。

在多数文献里，亚硝胺类化合物测定的前处理多是采用液液萃取、浓缩检测，由于N-二甲基亚硝胺(NDMA)有一定的水溶性而且挥发性比较高，加标回收率多在40％～90％之间，近年来也有固相微萃取、液液微萃取等提取浓缩手段应用于亚硝胺的提取浓缩，但目前净化方法应用最广泛的是固相萃取法。对亚硝胺的衍生化再检测也有过研究，但步骤较为繁琐。多数亚硝胺检测的提取净化方法过于复杂。CN201310349755.8公开了一种利用超声提取快速测定肉制品中二甲基亚硝胺的方法，该方法简单，耗时短，但是却缺少足够的净化手段，在遇到高脂的肉类样品时使浓缩步骤难以进行。另外由于NDMA在实验过程中的主要损失步骤是浓缩步骤，现有技术采用的浓缩手段容易导致NDMA损失大、准确度下降等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有中缺少足够的净化手段，在遇到高脂样品时在浓缩步骤难以进行及现有技术采用的浓缩手段容易导致NDMA损失大、准确度下降等问题，提供一种用于肉类食品中N-二甲基亚硝胺检测的样品前处理方法。

本发明的第二个目的是提供一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于肉类食品中N-二甲基亚硝胺检测的样品前处理方法，包括如下步骤：

S1.取待测样品，加入正己烷、乙腈、水，振荡、离心，弃去正己烷层；

S2.向S1的溶液中加入二氯甲烷、无水硫酸钠，振荡、离心，取有机层于浓缩瓶，接收瓶中加入冰水，350～360mbar、34～36℃条件下旋蒸除去二氯甲烷，若剩余溶液大于1mL，加入二氯甲烷继续旋蒸至剩余溶液约0.5～1mL；

S3.将S2残余物移出，依次以少量乙腈、乙腈饱和的正己烷和的正己烷清洗S2浓缩瓶，洗涤液与S2残余物混匀，离心，弃去正己烷层，将乙腈层定容即得待测样液。

本发明通过以正己烷-乙腈-水进行除脂，除去大部分非极性杂质；其中，乙腈和后续的二氯甲烷主要对肉类食品中N-二甲基亚硝胺进行提取，正己烷主要用于除去肉类食品中的油脂，通过加入一定的水，来替代部分乙腈，可以更好的实现分层效果，使得含有油脂的正己烷层被更好的去除，然后再利用无水硫酸钠来除水；另外，为解决NDMA在浓缩过程中损失过多的缺陷，利用压力控制与混合溶剂旋蒸来降低NDMA在浓缩过程中的损失；最后再通过S3的净化步骤，使乙腈易于定容。

优选地，所述待测样品与乙腈、二氯甲烷的质量体积比为：每10g样品中加入5mL乙腈、15mL二氯甲烷。

优选地，S1或S2所述振荡为200～400r/min振摇10～30min。

优选地，S1、S2或S3所述离心为3000～5000r/min离心4～6min。

优选地，S2所述有机层的体积为乙腈和二氯甲烷总体积的一半。

优选地，所述浓缩瓶为鸡心瓶。

上述任一所述样品前处理方法在肉类食品中N-二甲基亚硝胺检测中的应用也在本发明保护范围内。

一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法，包括如下步骤：

S1.配置不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液；

S2.按上述任一方法制备待测样品溶液；

S3.取待测样品溶液进行GC-MS测定，得到待测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；同时以相同的检测条件检测步骤S1配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，获得标准品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；以N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰制作得到N-二甲基亚硝胺标准曲线；根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按以下公式计算得到肉类食品中N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为：

X＝C×V/(m×f)

其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中N-二甲基亚硝胺的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品定容体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g，f是中间稀释因子，f＝2。

优选地，所述色谱条件为：色谱柱：DB-1701色谱柱30m×250μm×0.25μm；进样口温度：200℃；进样量：2μL；进样模式：脉冲不分流进样，进样脉冲压力：25psi，截止时间0.75min；载气类型：氦气(99.999％)；载气流量：恒流1mL/min；传输线温度：270℃；程序升温：初始温度40℃，保持1min，以30℃/min升至120℃，保持0.5min，以20℃/min升至270℃，保持3min。

优选地，所述质谱条件为：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描模式：SIM；参数：定量离子m/z＝74，定性离子m/z＝42，定性离子m/z＝43。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的样品前处理前处理方法易于操作，可有效除去待测样品中的高油脂，同时通过改进的浓缩条件，NDMA的回收率得到显著改善。

(2)本发明检测方法NDMA在10ng/mL～500ng/mL范围内成线性，线性相关系数0.99997。加标量在4μg/kg～80μg/kg范围内回收率在62.8％～91.8％，精密度5.6％；在称样量为10g，稀释倍数为2，定容体积为1mL条件下检出限为1.01μg/kg，定量限为3.36μg/kg。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。以下为本发明具体实施方式用到的仪器和试剂：乙腈、二氯甲烷、超纯水、无水硫酸钠、NDMA标准物质、GC-MS、R-210旋转蒸发仪、离心机。

实施例1一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法

一、方法

1、标准溶液的配置

将NDMA用乙腈配成10μg/mL的标准储备液。再用乙腈配成响应浓缩的标准工作液上机测定。标准工作液浓度为：10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。

2、样品前处理

称取10g腊肉样品于50mL离心管中，加入5mL乙腈与10mL水，加入20mL正己烷，在摇床上以300r/min振摇20min，以4000r/min离心5min，弃去正己烷层。

向离心管中加入15mL二氯甲烷与10g无水硫酸钠，在摇床上以300r/min振摇20min，以4000r/min离心5min，取10mL有机层(约含2.5mL乙腈、7.5mL二氯甲烷)于鸡心瓶中。在旋蒸蒸发仪的接收瓶中加入约50mL冰水，在350mbar、35℃的条件下旋蒸除去二氯甲烷，若剩余溶液大于1mL，加入二氯甲烷继续旋蒸至剩余溶液约0.5～1mL。

转移残余物至5mL离心管中，依次以少量乙腈、1mL乙腈饱和的正己烷、1mL乙腈饱和的正己烷清洗鸡心瓶，洗涤液移入5mL离心管中，涡旋混匀后以4000r/min离心5min，弃去正己烷层，将乙腈层定容至1mL，上GC-MS测定。

3、样品定性和定量检测

将标准溶液和样品溶液按照以下GC-MS工作参数进行测定；

(1)色谱参数

色谱柱：DB-1701色谱柱30m×250μm×0.25μm；进样口温度：200℃；进样量：2μL；进样模式：脉冲不分流进样，进样脉冲压力：25psi，截止时间0.75min；载气类型：He(99.999％)；载气流量：恒流1mL/min；传输线温度：270℃；程序升温：初始温度40℃，保持1min，以30℃/min升至120℃，保持0.5min，以20℃/min升至270℃，保持3min。

(2)质谱参数

离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描模式：SIM；参数：定量离子m/z＝74，定性离子m/z＝42，定性离子m/z＝43。

检测方法：

取2μL待测样品溶液进行GC-MS测定，得到待测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；同时以相同的检测条件检测步骤S1配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，获得标准品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；以N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰制作得到N-二甲基亚硝胺标准曲线；根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按以下公式计算得到肉类食品中N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为：

X＝C×V/(m×f)

其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中N-二甲基亚硝胺的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品定容体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g，f是中间稀释因子，f＝2。

二、结果

1、样品前处理的选择

(1)提取溶剂选择

将NDMA标准溶液配成数份200ng/mL溶液，溶剂分别为乙腈、二氯甲烷。

取数份200ng/mL NDMA的乙腈溶液1mL，分别加入1mL饱和食盐水、正己烷、食用油，涡旋离心后取乙腈层与正己烷层上机，与100ng/mLNDMA乙腈溶液做对比，结果如表1所示：

表1 NDMA在不同体系中的浓度及分成情况

其中乙腈-正己烷体系乙腈体积大约增加至1.2mL，NDMA理论浓度由200ng/mL降低至166.7ng/mL。由这个实验可以得出在乙腈-饱和食盐水体系中，NDMA大部分处于乙腈层，在乙腈-正己烷体系中NDMA处于乙腈层，在乙腈-食用油体系中NDMA处于乙腈层。

另外，取两份NDMA二氯甲烷溶液200ng/mL各1mL，一份加入饱和食盐水，一份直接加入1mL纯水。涡旋离心后取二氯甲烷层上机，与200ng/mLNDMA二氯甲烷溶液作对比，后结果显示加入饱和食盐水的二氯甲烷层NDMA测出值为188.2ng/mL，加入纯水的二氯甲烷层NDMA测出值为162.5ng/mL。

对比乙腈为溶剂与二氯甲烷为溶剂的NDMA峰形，在200ng/mL时，二氯甲烷为溶剂峰高约为4.7×10⁴，乙腈为溶剂时峰高约为6.5×10⁴。因此以乙腈为溶剂可以获得更优秀的检出限。

(2)浓缩方式的选择

取数份200ng/mL NDMA的二氯甲烷标准溶液1mL，分别以氮吹浓缩至约0.5mL、氮吹刚干、氮吹干后继续吹30s、旋蒸至约0.5mL、旋蒸刚干、旋蒸干后继续旋蒸30s，用二氯甲烷定容至1mL，上机与100ng/mLNDMA的二氯甲烷溶液对比，结果表2所示：

表2不同浓缩方式对NDMA的影响

由该实验可以看出NDMA的二氯甲烷溶液在浓缩过程中会有损失，在氮吹的情况下NDMA挥发较少，但是氮吹干后NDMA会以很快的速度挥发。而在旋蒸过程中NDMA会随着二氯甲烷一起挥发，但是旋蒸干后NDMA的含量基本保持不变。因此，选择旋蒸作为浓缩方式。

(3)浓缩参数优化

选择不同的旋蒸的压力和水浴的温度，测试其对其对NDMA回收率的影响，结果如表3所示：当旋蒸压力为350mbar，水浴温度为35℃时，NDMA回收率最高。因此选择旋蒸压力为350mbar，水浴温度为35℃为本发明检测方法的最终参数。

表3浓缩参数对NDMA回收率的影响

同时，在旋蒸结束除去二氯甲烷后，以乙腈为溶剂，继续测试旋蒸时间对结果的影响，其结果如表4所示：

表4除去二氯甲烷后继续旋蒸对NDMA浓度的影响

旋蒸时间(min)	1	3	5	7	10
						测定浓度(ng/mL)	204.9	202.0	200.8	217.1	225.6

结果表明在设定值350mbar，水浴温度35℃条件下，二氯甲烷除完后NDMA几乎不会继续挥发。

2、方法评价

(1)标准曲线

在上述仪器方法的条件下建立标准曲线，结果表明，NDMA在10ng/mL～500ng/mL范围内线性良好，具体结果如表5所示：

表5本发明NDMA检测方法标准曲线的线性范围

(2)精密度

称取6份样品按上述前处理方法处理后上机，精密度测试结果如表6所示

表6本发明NDMA检测方法的精密度

(3)准确度

称取6份样品按上述前处理方法处理后上机，准确度测试结果如表7所示：

表7本发明NDMA检测方法的准确度

(4)检出限

在样品中加标，按照前处理方式进行实验，上机之后测定计算信噪比，称样量为10g，稀释倍数f＝2，定容体积V＝1mL，以3倍信噪比确定检出限，10倍信噪比确定定量限。其结果如表8所示：

表8本发明NDMA检测方法的检出限

综上所述，本发明检测方法NDMA在10ng/mL～500ng/mL范围内成线性，线性相关系数0.99997。加标量在4μg/kg～80μg/kg范围内回收率在62.8％～91.8％，精密度5.6％。在称样量为10g，稀释倍数为2，定容体积为1mL条件下检出限为1.01μg/kg，定量限为3.36μg/kg。

Claims (6)

1.一种用于肉类食品中N-二甲基亚硝胺检测的样品前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.取待测样品，加入正己烷、乙腈、水，振荡、离心，弃去正己烷层；

S2.向S1的溶液中加入二氯甲烷、无水硫酸钠，振荡、离心，取有机层于浓缩瓶，接收瓶中加入冰水，350～360 mbar、34～36℃条件下旋蒸除去二氯甲烷，若剩余溶液大于1mL，加入二氯甲烷继续旋蒸至剩余溶液约0.5～1mL；

S3.将S2残余物移出，依次以少量乙腈、乙腈饱和的正己烷和的正己烷清洗S2浓缩瓶，洗涤液与S2残余物混匀，离心，弃去正己烷层，将乙腈层定容即得待测样液。

2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述待测样品与乙腈、二氯甲烷的质量体积比为：每10g样品中加入5mL乙腈、15mL二氯甲烷。

3.权利要求1～3任一项所述样品前处理方法在肉类食品中N-二甲基亚硝胺检测中的应用。

4.一种肉类食品中N-二甲基亚硝胺的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.配置不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液；

S2.按权利要求1或2所述方法制备待测样品溶液；

S3.取待测样品溶液进行GC-MS测定，得到待测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；同时以相同的检测条件检测步骤S1配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，获得标准品溶液的总离子流色谱图、定量离子色谱图；以N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰制作得到N-二甲基亚硝胺标准曲线；根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按以下公式计算得到肉类食品中N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为：

X=C×V/（m×f）；

其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中N-二甲基亚硝胺的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品定容体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g，f是中间稀释因子，f=2。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱：DB-1701色谱柱30m×250μm×0.25μm；进样口温度：200℃；进样量：2μL；进样模式：脉冲不分流进样，进样脉冲压力：25psi，截止时间0.75min；载气类型：氦气（99.999%）；载气流量：恒流1mL/min；传输线温度：270℃；程序升温：初始温度40℃，保持1min，以30℃/min升至120℃，保持0.5min，以20℃/min升至270℃，保持3min。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描模式：SIM；参数：定量离子m/z=74，定性离子m/z=42，定性离子m/z=43。