CN104655763B - 一种氟醚菌酰胺残留量的gc-nci-ms测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氟醚菌酰胺残留量的GC‑NCI‑MS测定方法，该方法主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中残留的氟醚菌酰胺含量的方法。用乙腈或含1%乙酸的乙腈溶液均质提取样品中残留的氟醚菌酰胺，C₁₈/PSA固相萃取柱净化浓缩后，气相色谱‑负化学离子源‑质谱（GC‑NCI‑MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为85.0%～91.1%，平均相对标准偏差（RSD）为4.1%～6.6%，检出限低于0.35 μg/kg，具有操作简便、快速、去杂效果好、灵敏度高、特征性强、重复性好、定性定量准确的优点。能满足0.01 mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法

技术领域

本发明涉及一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，更具体地说是采用气相色谱-负化学离子源-质谱(GC-NCI-MS)定性定量测定粮谷、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等动物肌肉及制品等复杂基质的动植物源性食品中残留的氟醚菌酰胺含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

氟醚菌酰胺(LH-2010A)是山东省联合农药工业有限公司于2010年创新合成的一种新型含氟苯甲酰胺类杀菌剂，化学名称为：N-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲基)-2,3,5,6-四氟-4-甲氧基苯甲酰胺，结构式为：

氟醚菌酰胺结构式中含有7个氟原子。氟原子所形成的C-F键键能远大于C-H键，明显增加了有机氟化合物的稳定性和生理活性。含氟有机化合物具有较高的脂溶性和疏水性，能够促进其在生物体内吸收与传递，增强与生物体的结合能力，使生物体的生理作用发生变化。含氟农药同样有这样的功效，含氟农药对病原菌或害虫的抑制或毒杀作用也大大提高。据研究发现，氟醚菌酰胺对棉花立枯病菌、番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌、番茄叶霉病菌、苹果轮纹病菌、马铃薯晚疫病菌、黄瓜靶斑病菌、辣椒疫霉菌、草莓枯萎病菌和稻瘟病菌10种植物病原菌的毒力均较高，可见，氟醚菌酰胺杀菌较为广谱，可以作为一种新型广谱型杀菌剂进行使用，开发应用前景广阔。

随着氟醚菌酰胺的登记、推广和使用，有关氟醚菌酰胺残留消解动态及最终残留量等环境行为的研究势必增加，同时，作为我国主要出口市场的欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L的“一律标准”。

迄今为止，未见国内外有关于食品农产品中氟醚菌酰胺残留量检测方法的报道，配备负化学电离源的气相色谱质谱(GC-NCI-MS)分析食品农产品中农药残留具有很大优势，负化学离子源(NCI源)被称为质谱“软电离源”，对含电负性集团的分析物具有高选择性和高灵敏度，由于其特征性强，利用其进行残留分析时，基质干扰很少，可很准确地对目标物进行定性和定量分析。现各种检测机构和企业均购置了气相色谱-质谱仪(GC-MS)，一般也都配备了负化学离子源(NCI)，现很多类农药均含有电负性基团，有机氯和拟除虫菊酯类农药分子大都含有－F、－Cl、－Br或－COO－等强电负性基团；有机磷农药分子大都含有＝S、－OR、－P、－O－、－Cl、或－P＝O等电负性基团；而近年来开发的新型农药中大多含有－F基团，因此，使用GC-NCI-MS可方便实现多种农药的多残留分析，与GC-NCI-MS相比，能获得更好的抗干扰能力、更低的灵敏度和更好的选择性，氟醚菌酰胺属电负性化合物，由于粮谷、动物源性食品等食品农产品基质比较复杂，须建立净化效果良好的样品前处理方法和仪器分析条件才能满足检测要求，因此，建立气相色谱-负化学离子源-质谱

(GC-NCI-MS)定性和定量分析粮谷和动物源性食品中氟醚菌酰胺残留量的检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中氟醚菌酰胺残留量。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，包括如下步骤：

(1)提取

称取混匀样品于具塞离心管中，加入适量水复苏后，定量加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取，然后加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心。

(2)净化

移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C₁₈/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，浓缩至干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂溶解定容，过膜后，待气相色谱-负化学离子源-质谱(GC-NCI-MS)检测。

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟醚菌酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理时，得样品提取净化残渣，加入适量溶剂和混合标准溶液，涡旋混匀，配制成至少3个浓度的氟醚菌酰胺系列混合标准工作液。

(4)气相色谱-负化学离子源-质谱法(GC-NCI-MS)测定

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行GC-NCI-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入GC-NCI-MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

步骤(1)中样品若为粮谷及动物肝脏等含水量较少的样品，提取前须加适量水充分浸润。

步骤(1)中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时加入乙酸钠盐析。

步骤(2)中进行C₁₈/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。

步骤(4)中气相色谱条件为：色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；进样口温度250℃；载气：He，不分流模式进样，进样量：1μL；恒流模式，流速1.0mL/min；升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min；传输线温度：280℃。

步骤(4)中质谱条件为：离子源温度150℃；四极杆温度150℃；电离模式：负化学电离，即NCI模式，能量70eV；扫描方式：选择离子监测(SIM)模式，溶剂延迟时间为10min，监测的离子为：416、222、380、418。

步骤(4)中测定样液和基质标准工作溶液时，若样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合GC-NCI-MS应用于粮谷、动物源性食品中氟醚菌酰胺定性确证和定量检测，平均回收率为85.0％～91.1％，平均相对标准偏差(RSD)为4.1％～6.6％，检出限低于0.35μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为添加在空白大米基质中的氟醚菌酰胺的GC-NCI-MS选择离子色谱图。

图2为不含氟醚菌酰胺的大米空白样品的GC-NCI-MS选择离子色谱图。

图3为以不含氟醚菌酰胺的大米空白样品为基质配制的氟醚菌酰胺标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器(IKA，Germany)；CR21GⅢ离心机(日立，Japan)；MS3基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；TurboVap LV型样品自动浓缩仪(Caliper，USA)；7890N气相色谱-5977C质谱仪(Agilent，USA)；C₁₈/PSA固相萃取柱(6mL，500mg/500mg)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂

乙腈、丙酮、正己烷(HPLC级，Merke，Germany)；乙酸(HPLC级，CNW，Germany)；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度97.8％，购自山东省联合农药工业有限公司。

实施例1：大米中氟醚菌酰胺残留量的检测

(1)样品前处理

提取

称取经充分混匀的5g大米样品于50mL离心管中，加入5mL水混匀，放置30min，准确加入20mL乙腈，均质提取2min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL乙腈提取液于40℃旋蒸或氮气吹至约1mL，待净化。

净化

用5mL乙腈预洗C₁₈/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，氮气吹干后用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容至1mL，过0.22μm滤膜后，待GC-NCI-MS测定。

(2)标准工作溶液的配制

准确称取25±0.1mg标准品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容得到10.0μg/mL标准中间液；将10μg/mL标准溶液稀释配成5、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL标准溶液。将不含氟醚菌酰胺的大米空白样品按上述前处理步骤处理，得样品提取净化残渣，在此残渣中加入900μL体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂和100μL上述混合标准溶液，涡旋混匀，配成10、20、50、100、200、500μg/L基质标准工作溶液。

(3)气相色谱-负化学离子源-质谱法(GC-NCI-MS)测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入GC-NCI-MS，以外标法进行氟醚菌酰胺含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入GC-NCI-MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

进样口温度：250.0℃，进样模式：不分流进样，进样量：1μL。

载气：He，恒流模式，流速1.0mL/min。

炉箱升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min。

传输线温度：280℃。

其中，质谱参数为：

电离模式：负化学电离，即NCI模式，能量70eV。

离子源温度：150℃；四极杆温度150℃。

扫描方式：选择离子监测(SIM)模式；溶剂延迟时间为10min，SIM监测的离子为：416、222、380、418；定量离子为416。

定性鉴定：在相同的条件下，如果样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表1。

表1大米空白基质中氟醚菌酰胺的标准曲线

名称	保留时间(min)	回归方程	相关系数
				氟醚菌酰胺LH-2010A	17.87	Y＝444.83X-3530.8	0.9995

加标回收率和重复性：

在不含氟醚菌酰胺的大米中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的氟醚菌酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，在3个加标水平上，氟醚菌酰胺的平均回收率为89.3％～91.1％，平均相对标准偏差(RSD)为4.3％～5.2％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表2氟醚菌酰胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟醚菌酰胺基质标准工作溶液注入GC-NCI-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(大米的浓缩倍数为2.0倍)计算检出限，氟醚菌酰胺的检出限为0.35μg/kg。

实施例2：猪肉中氟醚菌酰胺残留量的检测

(1)样品前处理

提取

称取经充分混匀的5g猪肉样品(研磨成面粉)于50mL离心管中，加入20mL水复苏30min后，准确加入20mL含1％乙酸的乙腈溶液，振荡提取20min，超声提取5min，加入3g无水硫酸镁和2g乙酸钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL乙腈提取液于40℃旋蒸或氮气吹至近干，加入1mL乙腈涡旋后，待净化。

净化

用5mL乙腈预洗C₁₈/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，氮气吹干后用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容至1mL，过0.22μm滤膜后，待GC-NCI-MS测定。

(2)标准工作溶液的配制

将1000ng/mL标准储备液用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂稀释成10ng/mL标准中间液，将10μg/mL标准溶液稀释配成5、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL标准溶液。将不含氟醚菌酰胺的猪肉空白样品按上述前处理步骤处理，得样品提取净化残渣，在此残渣中加入900μL体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂和100μL上述混合标准溶液，涡旋混匀，配成10、20、50、100、200、500μg/L基质标准工作溶液。

(3)气相色谱-负化学离子源-质谱法(GC-NCI-MS)测定

操作步骤、色谱和质谱条件与上述猪肉样品中氟醚菌酰胺的测定一致。

定性鉴定：同上述猪肉样品中氟醚菌酰胺的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为

Y＝820.52X-6483，相关系数为0.9993。

加标回收率和重复性：

在不含氟醚菌酰胺的猪肉中加入10、20和200μg/kg 3个浓度水平的氟醚菌酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表3。由表3可以看出，在3个加标水平上，氟醚菌酰胺的平均回收率为85.0％～89.7％，平均相对标准偏差(RSD)为4.1％～6.6％，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表3氟醚菌酰胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟醚菌酰胺基质标准工作溶液注入GC-NCI-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(猪肉的浓缩倍数为2.0倍)计算检出限，氟醚菌酰胺的检出限为0.26μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取

称取混匀样品于具塞离心管中，加适量水后，加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取后，加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心；

(2)净化

移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C₁₈/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，浓缩至干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂溶解定容，过膜后，待气相色谱-负化学离子源-质谱(GC-NCI-MS)检测；

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟醚菌酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化残渣，加入适量溶剂和标准溶液，涡旋混匀，配制成至少3个浓度的氟醚菌酰胺系列标准工作溶液；

(4)测定和结果计算

GC-NCI-MS分析条件为：色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；进样口温度250.0℃；载气：He，不分流模式进样，进样量：1μL；恒流模式，流速1.0mL/min；升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min；传输线温度：280℃；电离模式：负化学电离，即NCI模式，能量70eV；离子源温度150℃；扫描方式：选择离子监测(SIM)模式，监测的离子为：416、222、380、418；

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液进行GC-NCI-MS测定，以标准工作溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入GC-NCI-MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入基质标准工作曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

2.根据权利要求1所述的一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中样品若为粮谷及动物肝脏含水量较少的样品，提取前须加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时需加入乙酸钠盐析。

4.根据权利要求1所述的一种氟醚菌酰胺残留量的GC-NCI-MS测定方法，其特征在于，步骤(2)中进行C₁₈/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。