CN104655764B - 一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的lc-ms/ms测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，用乙腈或含1%乙酸的乙腈溶液均质提取样品中残留的氟醚菌酰胺，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷键合相（C₁₈）基质分散净化后，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为92.0%～96.2%，平均相对标准偏差（RSD）为4.0%～5.5%，检出限低于0.16μg/kg，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法

技术领域

本发明涉及一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，更具体地说是采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定性定量测定蔬菜和水果中残留的氟醚菌酰胺含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

氟醚菌酰胺(LH-2010A)是山东省联合农药工业有限公司于2010年创新合成的一种新型含氟苯甲酰胺类杀菌剂，化学名称为：N-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲基)-2,3,5,6-四氟-4-甲氧基苯甲酰胺，结构式为：

氟醚菌酰胺结构式中含有7个氟原子。氟原子所形成的C-F键键能远大于C-H键，明显增加了有机氟化合物的稳定性和生理活性。含氟有机化合物具有较高的脂溶性和疏水性，能够促进其在生物体内吸收与传递，增强与生物体的结合能力，使生物体的生理作用发生变化。含氟农药同样有这样的功效，含氟农药对病原菌或害虫的抑制或毒杀作用也大大提高。据研究发现，氟醚菌酰胺对棉花立枯病菌、番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌、番茄叶霉病菌、苹果轮纹病菌、马铃薯晚疫病菌、黄瓜靶斑病菌、辣椒疫霉菌、草莓枯萎病菌和稻瘟病菌10种植物病原菌的毒力均较高，可见，氟醚菌酰胺杀菌较为广谱，可以作为一种新型广谱型杀菌剂进行使用，开发应用前景广阔。

随着氟醚菌酰胺的登记、推广和使用，有关氟醚菌酰胺残留消解动态及最终残留量等环境行为的研究势必增加，同时，作为我国主要出口市场的欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L的“一律标准”。

迄今为止，未见国内外有关于食品农产品中氟醚菌酰胺残留量检测方法的报道，使用LC-MS/MS测定食品农产品中农药残留具有快速、简便、灵敏度高等优点，因此建立简便、快速、准确、耐用、能准确定性和定量分析蔬菜和水果中氟醚菌酰胺残留量的LC-MS/MS检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，包括如下步骤：

(1)提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质提取1min，加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，振荡后离心。

(2)净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡离心，过膜后，待液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测；

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟醚菌酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的氟醚菌酰胺系列混合标准工作液；

(4)液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

步骤(1)中样品若为脱水蔬菜和水果，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

步骤(1)中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤(2)中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。

步骤(4)中液相色谱的流动相为：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。

步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

时间(min)

5mmol/L乙酸铵的水溶液(％)

乙腈(％)

0	80-98	2-20
			0.5	80-98	2-20
2.0	2-10	90-98
			5.0	2-10	90-98
5.2	80-98	2-20
			8.0	80-98	2-20

步骤(4)中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱(ESI)检测，电喷雾电压为-3500至-4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气和鞘气均为氮气，干燥气温度为300℃，干燥气流速为5.0L/min，鞘气温度为250℃，鞘气流速为11.0L/min，喷嘴电压500V。

步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)负离子扫描模式；氟醚菌酰胺的母离子为414.4～415.4，子离子分别为163.3～164.3和178.4～179.4。

步骤(4)中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合LC-MS/MS应用于蔬菜和水果中氟醚菌酰胺定性确证和定量检测，平均回收率为92.0％～96.2％，平均相对标准偏差(RSD)为4.0％～5.5％，检出限低于0.16μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为添加在空白苹果基质中的5.0ng/mL氟醚菌酰胺标液的LC-MS/MS多反应监测色谱图。

图2为不含氟醚菌酰胺的苹果空白样品的LC-MS/MS多反应监测色谱图。

图3为以不含氟醚菌酰胺的苹果空白样品为基质配制的氟醚菌酰胺标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器(IKA，Germany)；CR21GⅢ离心机(日立，Japan)；MS3基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；1290快速高效液相色谱-6460三重四极杆质谱仪(Agilent，USA)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂(40～60μm)、十八烷基硅烷键合相(C₁₈)净化剂(40～60μm)均购于美国安捷伦科技有限公司；

试剂：乙腈(HPLC级，Merke，Germany)；乙酸(HPLC级，CNW，Germany)；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度97.8％，购自山东省联合农药工业有限公司。

实施例1：苹果中氟醚菌酰胺残留量的检测

(1)样品前处理

称取经充分混匀的苹果10.0g于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mgC₁₈和50mgPSA的离心管中，涡旋1min，7000r/min离心5min。取上清液过0.22μm滤膜后，待测定。

(2)标准工作溶液的配制

准确称取适量标准品于容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；称取10g苹果空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

(3)液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行氟醚菌酰胺含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，EclipseplusC₁₈，2.1mm×100mm，粒径1.8μm；

流动相：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

时间(min)	5mmol/L乙酸铵的水溶液(％)	乙腈(％)
			0	95	5
0.5	95	5
			2.0	5	95
5.0	5	95
			5.2	95	5
8.0	95	5

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测(MRM)负离子扫描；

电喷雾电压：-4000V；

雾化气压力：275.9kPa；喷嘴电压500V；

干燥气：氮气，300℃，流速为5.0L/min；

鞘气：氮气，250℃，流速为11.0L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3苹果空白基质中氟醚菌酰胺的标准曲线

名称

保留时间(min)

回归方程

相关系数

氟醚菌酰胺LH-2010A

3.05

Y＝1732.7X+366.01

0.9996

加标回收率和重复性：

在不含氟醚菌酰胺的苹果中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的氟醚菌酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，氟醚菌酰胺的平均回收率为92.9％～96.2％，平均相对标准偏差(RSD)为4.0％～5.2％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4实施例1中氟醚菌酰胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟醚菌酰胺基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(苹果的浓缩倍数为0.5倍)计算检出限，氟醚菌酰胺的检出限为0.029μg/kg。

实施例2：脱水青椒中氟醚菌酰胺残留量的检测

(1)样品前处理

称取经充分混匀的脱水青椒2.0g于50mL离心管中，加入5mL水复苏30min后，准确加入20mL含1％乙酸的乙腈溶液，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁、2g乙酸钠和2mL水，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mgC₁₈和50mgPSA的离心管中，涡旋1min，7000r/min离心5min。取上清液过0.22μm滤膜后，待LC-MS/MS测定。

标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与上述苹果样品中氟醚菌酰胺的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为Y＝1455.5X+307.45，相关系数为0.9996。

加标回收率和重复性：

在不含氟醚菌酰胺的脱水青椒中加入50、100和200μg/kg3个浓度水平的氟醚菌酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在3个加标水平上，氟醚菌酰胺的平均回收率为92.0％～95.3％，平均相对标准偏差(RSD)为4.0％～5.5％，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表5氟醚菌酰胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟醚菌酰胺基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(脱水青椒的浓缩倍数为0.1倍)计算检出限，氟醚菌酰胺的检出限为0.16μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取

称取蔬菜和水果样品于具塞离心管中，加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质提取1min，加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁振荡后离心；

(2)净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡离心，过膜后，待液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测；

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟醚菌酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的氟醚菌酰胺系列标准工作液；

(4)测定和结果计算

LC-MS/MS的液相色谱分析条件为：填料为C₁₈的色谱柱，柱温为30℃；进样体积为5μL；流动相为：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：

时间(min) 5mmol/L乙酸铵的水溶液(％) 乙腈(％) 0 80-98 2-20 0.5 80-98 2-20 2.0 2-10 90-98 5.0 2-10 90-98 5.2 80-98 2-20 8.0 80-98 2-20

质谱条件为：电喷雾质谱检测；电喷雾电压为-3500至-4500V；雾化气压力为275.9kPa；干燥气和鞘气均为氮气；干燥气温度为300℃；干燥气流速为5.0L/min；鞘气温度为250℃，鞘气流速为11.0L/min，喷嘴电压500V；多反应监测(MRM)负离子扫描模式；氟醚菌酰胺的母离子为414.4～415.4，子离子分别为163.3～164.3和178.4～179.4；

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟醚菌酰胺的色谱峰面积，代入基质标准曲线，得到样品液中氟醚菌酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟醚菌酰胺残留量。

2.根据权利要求1所述的一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中蔬菜和水果样品若为脱水样品，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时需加入乙酸钠盐析。

4.根据权利要求1所述的一种果蔬中氟醚菌酰胺残留的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(2)中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每毫升提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。