CN104502515B - 一种四氯虫酰胺残留量的lc-ms/ms测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，该方法主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中残留的四氯虫酰胺含量的方法。用乙腈或含1%乙酸的乙腈溶液均质提取样品中残留的四氯虫酰胺，C18/PSA固相萃取柱净化后，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为84.9%～93.6%，平均相对标准偏差（RSD）为4.1%～6.5%，检出限低于0.69μg/kg，具有操作简便、快速、去杂效果好、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，更具体地说是采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定性定量测定粮谷、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等动物肌肉及制品等复杂基质的动植物源性食品中残留的四氯虫酰胺含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。
背景技术
双酰胺类杀虫剂是近年来全球热门的杀虫剂产品，可广泛应用于水稻、蔬菜、棉花等作物的害虫控制，具有低毒、环境安全、高活性等优点，包括氯虫苯甲酰胺、氰虫酰胺、氟虫双酰胺等品种，四氯虫酰胺(SYP-9080)是由中化集团下属沈阳化工研究院研发、中化农化有限公司经营的新产品，我国首个具有自主知识产权的双酰胺类杀虫剂，已获得国家农业部的临时登记。
四氯虫酰胺(SYP-9080)属于鱼尼丁受体激活剂类杀虫剂，其通过与害虫体内鱼尼丁受体结合，打开钙离子通道，使储存在细胞内的钙离子持续释放到肌浆中，钙离子和肌浆中基质蛋白结合，引起肌肉持续收缩。昆虫体症状表现为抽搐、拒食，最终死亡。四氯虫酰胺为低毒、广谱杀虫剂，对鳞翅目害虫均具有很好的活性。防治对象包括稻纵卷叶螟、二化螟、小菜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、甘蔗螟、小卷蛾、食心虫等。
随着四氯虫酰胺的登记、推广和使用，有关四氯虫酰胺残留消解动态及最终残留量等环境行为的研究势必增加，同时，作为我国主要出口市场的欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L的“一律标准”。
迄今为止，未见国内外有关于食品农产品中四氯虫酰胺残留量检测方法的报道，使用LC-MS/MS测定食品农产品中农药残留具有快速、简便、灵敏度高等优点，由于粮谷、动物源性食品等食品农产品基质比较复杂，须建立净化效果良好的样品前处理方法才能满足检测要求，因此建立简便、快速、准确、耐用、能准确定性和定量分析蔬菜和水果中四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中四氯虫酰胺残留量。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，包括如下步骤：
(1)提取
称取粉碎样品于具塞离心管中，加入适量水复苏后，定量加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取，然后加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心。
(2)净化
移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C18/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，用乙腈定容，取定容液过膜后，待液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测；
(3)标准工作溶液的配制
将不含四氯虫酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少3个浓度的四氯虫酰胺系列混合标准工作液；
(4)液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中四氯虫酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中四氯虫酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中四氯虫酰胺残留量。
步骤(1)中样品若为粮谷及动物肝脏等含水量较少的样品，提取前须加适量水充分浸润。
步骤(1)中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时加入乙酸钠盐析。
步骤(2)中进行C18/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。
步骤(4)中液相色谱的流动相为：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。
步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 5mmol/L乙酸铵的水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 70-98 | 2-30 |
| 0.5 | 70-98 | 2-30 |
| 2.0 | 2-10 | 90-98 |
| 5.0 | 2-10 | 90-98 |
| 5.2 | 70-98 | 2-30 |
| 8.0 | 70-98 | 2-30 |
步骤(4)中液相色谱的色谱柱填料为C18，柱温为30℃。
步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱(ESI)检测，电喷雾电压为-3500至-4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。
步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)负离子扫描模式；四氯虫酰胺的母离子为535.3～536.3，子离子分别为499.2～502.2和201.4～202.4。
步骤(4)中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。
本发明的有益效果在于：
本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合LC-MS/MS应用于粮谷、动物源性食品中四氯虫酰胺定性确证和定量检测，平均回收率为84.9％～93.6％，平均相对标准偏差(RSD)为4.1％～6.5％检出限低于0.69μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
附图说明
图1为添加在空白猪肉基质中的10.0ng/mL四氯虫酰胺标液的LC-MS/MS多反应监测色谱图。
图2为不含四氯虫酰胺的猪肉空白样品的LC-MS/MS多反应监测色谱图。
图3为以不含四氯虫酰胺的猪肉空白样品为基质配制的四氯虫酰胺标准工作曲线。
具体实施方式
现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。
实施例中使用的仪器与试剂
T18Basic均质器(IKA，Germany)；CR21GⅢ离心机(日立，Japan)；MS3基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；TurboVapLV型样品自动浓缩仪(Caliper，USA)；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪(Agilent，USA)；C18/PSA固相萃取柱(6mL，500mg/500mg)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。
试剂：乙腈(HPLC级，Merke，Germany)；乙酸(HPLC级，CNW，Germany)；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
标准物质：纯度95.5％，购自中化农化有限公司。
实施例1：猪肉中四氯虫酰胺残留量的检测
(1)样品前处理
提取
称取经充分混匀的5g猪肉样品于50mL离心管中，加入5mL水混匀，放置30min，准确加入20mL乙腈，均质提取2min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL乙腈提取液于40℃旋蒸或氮气吹至约1mL，待净化。
净化
用5mL乙腈预洗C18/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，用乙腈定容至10mL，将净化定容液过0.22μm滤膜后，待LC-MS/MS测定。
(2)标准工作溶液的配制
准确称取适量标准品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；称取10g猪肉空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。
(3)液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行四氯虫酰胺含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中四氯虫酰胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中四氯虫酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中四氯虫酰胺残留量。
其中色谱条件为：
色谱柱：Agilent，EclipseplusC18，2.1mm×100mm，粒径3.5μm；
流动相：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈；
流速：0.3mL/min；
进样量：5μL；
柱温：30℃；
梯度洗脱程序如表1。
表1：实施例1的梯度洗脱程序
| 时间(min) | 5mmol/L乙酸铵的水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0.5 | 90 | 10 |
| 2.0 | 5 | 95 |
| 5.0 | 5 | 95 |
| 5.2 | 90 | 10 |
| 8.0 | 90 | 10 |
其中，质谱参数为：
扫描方式：多反应离子监测(MRM)负离子扫描；
电喷雾电压：-4000V；
雾化气压力：275.9kPa；
干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；
MRM检测参数见表2。
表2：实施例1的MRM检测参数
*为定量离子对。
定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表1。
表1猪肉空白基质中四氯虫酰胺的标准曲线
| 名称 | 保留时间(min) | 回归方程 | 相关系数 |
| 四氯虫酰胺SYP-9080 | 2.93 | Y＝711.4X-341.01 | 0.9997 |
加标回收率和重复性：
在不含四氯虫酰胺的猪肉中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的四氯虫酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，在3个加标水平上，四氯虫酰胺的平均回收率为84.9％～93.6％，平均相对标准偏差(RSD)为4.1％～6.5％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表2四氯虫酰胺的回收率和重复性(n＝6)
检出限：
将不同浓度的四氯虫酰胺基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(猪肉的浓缩倍数为0.2倍)计算检出限，四氯虫酰胺的检出限为0.69μg/kg。
实施例2：大米中四氯虫酰胺残留量的检测
样品前处理
提取
称取经充分混匀的5g大米样品(研磨成面粉)于50mL离心管中，加入20mL水复苏30min后，准确加入20mL含1％乙酸的乙腈溶液，振荡提取20min，超声提取5min，加入3g无水硫酸镁和2g乙酸钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL提取液于40℃旋蒸或氮气吹至近干，加入1mL乙腈涡旋后，待净化。
净化
用5mL乙腈预洗C18/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，用乙腈定容至10mL，过0.22μm滤膜后，待LC-MS/MS测定。
标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与上述猪肉样品中四氯虫酰胺的测定一致。
线性关系：
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为
Y＝824.38X-225.73，相关系数为0.9995。
加标回收率和重复性：
在不含四氯虫酰胺的大米中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的四氯虫酰胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表3。由表3可以看出，在3个加标水平上，四氯虫酰胺的平均回收率为85.2％～92.5％，平均相对标准偏差(RSD)为4.7％～6.2％，说明本发明方法的回收率高，重复性好。
表3四氯虫酰胺的回收率和重复性(n＝6)
检出限：
将不同浓度的四氯虫酰胺基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(大米的浓缩倍数为0.2倍)计算检出限，四氯虫酰胺的检出限为0.38μg/kg。
以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取
称取混匀样品于具塞离心管中，加适量水后，加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取后，加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心；
(2)净化
移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C18/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，用乙腈定容，取定容液过膜后，待液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测；
(3)标准工作溶液的配制
将不含四氯虫酰胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少3个浓度的四氯虫酰胺系列标准工作液；
(4)测定和结果计算
LC-MS/MS的液相色谱分析条件为：填料为C18的色谱柱，柱温为30℃；进样体积为5μL；流动相为：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：
质谱条件为：电喷雾质谱检测；电喷雾电压为-3500至-4500V；雾化气压力为275.9kPa；干燥气为氮气；干燥气温度为350℃；干燥气流速为10.0L/min；多反应监测(MRM)负离子扫描模式；四氯虫酰胺的母离子为535.3～536.3，子离子分别为499.2～502.2和201.4～202.4；
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中四氯虫酰胺的色谱峰面积，代入基质标准工作曲线，得到样品液中四氯虫酰胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中四氯虫酰胺残留量。
2.根据权利要求1所述的一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中样品若为粮谷及动物肝脏样品，提取前须加适量水充分浸润。
3.根据权利要求1所述的一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时需加入乙酸钠盐析。
4.根据权利要求1所述的一种四氯虫酰胺残留量的LC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(2)中进行C18/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。
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