CN107525866B - 一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β‑受体激动剂类瘦肉精的方法。它涉及一种DPX枪头式分散固相微萃取柱(DPX tips^TM)，能够匹配各种手动及自动移液系统，能够快速、高效的完成肉类样品处理及萃取，可完美地弥补传统样品处理费时费力、增加仪器损耗等缺点。简便快捷的固相萃取法，与液相色谱‑质谱(HPLC‑MS)分析相结合，可在10分钟内同时完成96‑384个样品的纯化，并可实现动物源性食品中多种β‑受体激动剂类瘦肉精的高通量快速定性、定量检测。

Description

一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激 动剂类瘦肉精的方法

技术领域

本发明属于食品添加剂检测领域，具体涉及一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取动物源食品中瘦肉精的方法，以及适用的定量检测方法。

背景技术

我国是养猪业大国，生猪出栏量每年约为6.4亿头，猪肉总产量已居世界首位。但由于我国生猪养殖水平总体较低、养殖用药生产和使用管理还不完善，养殖过程违法违规用药问题仍较突出，特别是非法使用“瘦肉精”问题曾在国内外造成了巨大负面影响，由此造成的食品安全问题也引起了国内外高度关注。

“瘦肉精”严格意义上是指一类β-受体激动剂类药物。β-受体激动剂(β-agonists)是一类人工合成肾上腺受体激动剂，包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等十几种化合物。β-受体激动剂在动物体内能减缓或减少脂肪沉积，增加肌肉蛋白沉淀，提高动物胴体瘦肉率、增重和提高饲料转化率，促进动物生长及缩短动物的生长期，故而当用于牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂时，会提高其瘦肉率，故而俗称为“瘦肉精”。但研究发现，长期使用瘦肉精会使其在动物体内蓄积，人类食用含瘦肉精超过安全值的动物肌肉或内脏后，会出现心室早搏、四肢、脸、颈部骨骼肌震颤、心悸、精神紧张、代谢紊乱、头疼、肌肉疼痛、头晕、恶心、呕吐、四肢无力、发烧、战栗等症状，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒，甚至危及生命。由于其严重的危害性，世界各国都禁止其应用于食源性动物。

我国相关法律法规也严禁在生猪等食源性动物养殖过程中使用β-受体激动剂类药物。但是在我国生猪养殖过程中使用各种β-受体激动剂类药物曾一度长时间成为行业潜规则。多年以来，我国相继发生多起较大规模瘦肉精中毒事件。我国在2009年底建立了利用LC-MS/MS监测低残留水平瘦肉精克伦特罗的方法(检测限0.05μg/kg)，但因屠宰管理、养殖用药以及样品代表性差等问题，2010年以来我国出口日本等国家的猪肉制品仍多次被检出克伦特罗残留。

为此，鉴于国内养殖业大环境的实际状况，为保障肉类产品的质量安全，从根本上杜绝β-受体激动剂类药物残留在动物体内，我们必须建立一套保障我国肉类产品质量安全的β- 受体激动剂类药物残留控制体系，并且对完善法律法规是十分必要的。猪肉是世界范围消耗最大的食品，因此对猪肉中β-受体激动剂类药物的检测是世界范围质量监测部门的首要任务。

目前，β-受体激动剂类药物残留的检测方法包括：高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography,HPLC)，气相色谱-质谱法(Gas ChromatographMass Spectrometer, GC-MS)，液相色谱-质谱法(Liquid Chromatography MassSpectrometer,LC-MS)或液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)，毛细管电泳电气化学检测法(Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection,CE-ECD)和免疫测定法(Enzyme Immunoassay,EIA)。其中， LC-MS/MS因其在定量分析中的灵敏度及选择性最高，进而是目前主要使用的分析方法。然而，此方法需要复杂的样品前处理过程以减少基质效应，因此检测时间长、耗时。

鉴于此，研究人员研发出若干种样品前处理方法及产品，如基于固相萃取技术(Solid-Phase Extraction,SPE)而改良的QuEChERS方法(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)，Oasis HLB固相萃取小柱以及MCX SPE固相萃取小柱。这些方法同样存在各种各样的不足，比如需要大量的样品及有机溶剂、操作过程复杂且耗时、不能与自动化系统兼容等等。

发明内容

本发明是在传统SPE的基础上建立了一种枪头式分散固相微萃取枪头(Dispersive pipette extraction,DPX tips)技术，枪头中填加的松散树脂能够通过简单的吸打过程完成样品的萃取，随着液体样品的流动，松散的树脂与待测物可通过液体湍流作用最大化地与结合(图1)。且待测物回收率高，样品纯净、检测灵敏度有很大的提高。DPXtips可与包括 Hamilton,Integra,Tecan,Agilent,Gerstel等主要品牌的全自动移液系统兼容，操作简便，省时，适用性强，可同时大批量进行样品处理及检测，更易在分析实验室推广使用。

本发明的目的是建立一种快速定性、定量分析猪肉中10种β-受体激动剂类药物的方法，包括西马特罗(Cimaterol)，特布他林(Terbutaline)，沙丁胺醇(Salbutamol)，异克舒令(Isoxsuprine)，莱克多巴胺(Ractopamine)，西布特罗(Cimbuterol)，克仑特罗(Clenbuterol)，溴布特罗(Brombuterol)，玛布特罗(Mabuterol)及马贲特罗(Mapenterol)。本发明方法使样品的使用量降到最小，并联合使用Integra Viaflo96或Hamilton

自动移液系统对样品进行萃取，即可在5分钟内完成96个样品的处理，达到快速、高通量样品处理、检测的目的。

本发明的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱快速检测瘦肉精含量的样品前处理方法，其包括下列步骤：

一、取待检测样品，加入水或缓冲液，漩涡振荡并于4℃孵育过夜；

二、均质后加入乙腈，漩涡振荡后进行离心，分层后收集上清液；将上清液蒸发干燥，溶解于水中获得预处理样品；

三、上述预处理样品通过固相微萃取柱进行萃取，依次用甲醇、水润洗；

四、通过吸打的过程将预处理样品上柱；

五、依次用水、体积百分含量为1～3％甲酸/水溶液及体积百分含量为100％甲醇洗涤微萃取柱；

六、用配制的质量体积百分含量为3～7％NH₄OH/甲醇溶液洗脱，获得样品洗脱液；

七、将样品洗脱液蒸发干燥，溶解于含体积百分含量为0.1～0.3％甲酸以及体积百分含量为3～7％甲醇的水溶液中，得到所需的待测样液；所述的固相微萃取柱为DPX-CX枪头分散式固相微萃取柱。

本发明的一种液-质联用快速检测瘦肉精含量的方法，其包括如下步骤：

一、采用上述样品前处理 的方法获得待测样液，备用；

二、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测样液中含有的β-受体激动剂进行检测；

三、所述高效液相色谱的参考检测条件为：

a.色谱柱：C18柱；

b.流动相：A：0.1％甲酸/水，B：0.1％甲酸/乙腈；

c.流速：0.5mL/min；

d.柱温：35℃；

e.进样量：20μL；

四、参考质谱条件为：

a.电喷射电压：4000V；

b.辅助气体压力：8psi；

c.鞘气压力：30psi；

d.喷雾器温度：300℃；

e.毛细管温度：300℃。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的样品前处理方法，利用一种枪头式分散固相微萃取柱将10种β-受体激动剂类药物进行净化，得到除杂后的精制样液，所述样液可通过液-质联用方法进行目标化合物的检测；该方法能够快速将日常动物源食品中可能含有的10种β-受体激动剂类化合物同时提取并检出，以适于对含有一种或多种β-受体激动剂类化合物的动物源食品进行快速、有效检测，较之现有技术本发明前处理方法的提取效率高，操作简单、省时，试剂消耗量小，能够最大程度的对目前可能使用的β-受体激动剂进行监管。

(2)本发明选择的10种β-受体激动剂类药物均含有氨基基团，pKa大于9(图2)。这种结构可通过阳离子交换萃取而获得高的回收率。因此待测物在中性pH值下作为质子化合物，可连接到填料上，在碱存在下可发生去质子化而被洗脱下来。多个洗涤的步骤可去除杂质，因而最大化地降低基质效应。填加有阳离子交换树脂的DPX CX枪头可使吸附与解吸附的效率更高，即能对待测物进行快速地纯化。

(3)DPX枪头与传统的SPE方法原理相似，但其枪头中填加的是松散分散型树脂，通过液体(样品溶液，洗涤液或洗脱液)的流动而与样品充分混合，即可快速地使固相与液相达到充分彻底地吸附混合。在本发明中，这种高效混合可使β-受体激动剂与阳离子交换树脂通过静电吸附作用结合，因而完成高效纯化(>85％)，并使基质效应降低(< 25％)，提高了回收率(>85％)。

(4)LC-MS对肉类的分析中，基质的离子抑制作用是影响检测效率、可重复性和准确性的主要原因。有研究报道，牛肉的基质效应会显著影响其异丙肾上腺素的检测，且即使通过液-固萃取和两次SPE纯化也不会得到改善。如图3所示，本研究的DPC方法其离子抑制作用很低(2～12％)，离子增强在2～25％。另外，本发明使用的三种不同的均质方法均显示较低的离子抑制效应，包括手持均质仪(Scilogex)，Beadblaster均质仪 (Benchmark)，漩涡震荡均质。

本发明所述的DPX枪头式分散固相微萃取柱(DPX tips^TM)的采用的是阳离子交换萃取枪头，其填加20mg的磺酸基团填料(Sulfonic acid groups)，对碱性化合物有强吸附能力。

附图说明

图1为枪头式分散固相微萃取枪头(Dispersive pipette extraction,DPX tips)结构示意图；其中，A为松散树脂，B为分析物，C为分析物与游离树脂的混合，D为隔离物，E为分散剂，F为填料；

图2为10种β-受体激动剂类化合物结构；

图3为10种β-受体激动剂类药物的回收率和基质效应图；其中，A为回收率，B为基质效应；

图4为10种β-受体激动剂的色谱图(1ng/g)；其中1-Terbutaline,2-Cimaterol,3-Salbutamol,4-Cimbuterol,5-Ractopamine,6-Clenbuterol,7-Bromobuterol,8-Isoxsuprine, 9-Mabuterol,10-Mapenterol。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱快速检测瘦肉精含量的样品前处理方法，其包括下列步骤：

一、取待检测样品，加入水或缓冲液，漩涡振荡并于4℃孵育过夜；

二、均质后加入乙腈，漩涡振荡后进行离心，分层后收集上清液；将上清液蒸发干燥，溶解于水中获得预处理样品；

三、上述预处理样品通过固相微萃取柱进行萃取，依次用甲醇、水润洗；

四、通过吸打的过程将预处理样品上柱；

五、依次用水、体积百分含量为1～3％甲酸/水溶液及体积百分含量为100％甲醇洗涤微萃取柱；

六、用配制的质量体积百分含量为3～7％NH₄OH/甲醇溶液洗脱，获得样品洗脱液；

七、将样品洗脱液蒸发干燥，溶解于含体积百分含量为0.1～0.3％甲酸以及体积百分含量为3～7％甲醇的水溶液中，得到所需的待测样液；所述的固相微萃取柱为DPX-CX枪头分散式固相微萃取柱。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五依次用水、体积百分含量为2％甲酸/水溶液及体积百分含量为100％甲醇洗涤微萃取柱。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤六用配制的质量体积百分含量为5％NH₄OH/甲醇溶液洗脱，获得样品洗脱液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将样品洗脱液蒸发干燥，溶解于含体积百分含量为0.1％甲酸以及体积百分含量为5％甲醇的水溶液中，得到所需的待测样液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式的一种液-质联用快速检测瘦肉精含量的方法，其包括如下步骤：

一、按照所述前处理方法对所述动物源食品样品进行前处理，得到所需的待测样品；

二、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(或功能相似的质谱仪器)对动物源食品中含有的β-受体激动剂进行检测；

三、所述高效液相色谱的参考检测条件为：

a.色谱柱：安捷伦Poroshell EC-C18(3.0×50mm,2.7μm)(或类似色谱柱)；

b.流动相：A：0.1％甲酸/水，B：0.1％甲酸/乙腈，梯度洗脱参数见表1；

c.流速：0.5mL/min；

d.柱温：35℃；

e.进样量：20μL；

四、所述质谱条件为：

a.电喷射电压：4000V；

b.辅助气体压力：8psi；

c.鞘气压力：30psi；

d.喷雾器温度：300℃；

e.毛细管温度：300℃；

f.其它质谱参数见表2。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

盐酸莱克多巴胺(Ractopamine HCl)、盐酸异克舒令(Isoxsuprine HCl)、盐酸克伦特罗(Clenbuterol HCl)及西布特罗(Cimbuterol)均购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。特布他林(Terbutaline)购于Abcam(Cambridge,MA,USA)。西马特罗(Cimaterol)购于Cayman Chemical Company(Ann Arbor,MI,USA)。沙丁胺醇(Salbutamol)购于VWR(Atlanta,GA,USA)。马贲特罗(Mapenterol)和马布特罗(Mabuterol)及盐酸溴布特罗(Brombuterol HCl)购于TRC-Canada(Toronto,Ontario,Canada)。内标d9-克伦特罗 (d9-Clenbuterol)及d3-特布他林(d3-Terbutaline)购于CDN Isotopes(Pointe-Claire,Quebec, Canada)。DPX CX tips购于DPX Technologies,LLC(Columbia,SC,USA)。

实施例：猪肉中多种“瘦肉精”残留检测中的应用

1.样品的制备

(1)标准溶液的配制：

标准品：盐酸莱克多巴胺(Ractopamine HCl)、盐酸异克舒令(Isoxsuprine HCl)、盐酸克伦特罗(Clenbuterol HCl)、西布特罗(Cimbuterol)、特布他林(Terbutaline)、西马特罗(Cimaterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)、马贲特罗(Mapenterol)、马布特罗(Mabuterol)、盐酸溴布特罗(Brombuterol HCl)。

准确称取上述标准品，用甲醇溶解并定容，配制成1mg/mL的单标储存液。使用时用甲醇进行稀释。

(2)样品前处理：

称取250mg猪肉馅置于2mL离心管中，加入250μL去离子水、相应的β-受体激动剂和内标(特布他林-D3和克伦特罗-D9)。漩涡振荡并于4℃孵育过夜。用均质仪均质，加入750μL乙腈。漩涡振荡，于17000g离心10分钟。将上清液转移至干净的离心管中，蒸发干燥10分钟。加入750μL水，漩涡振荡使残渣充分溶解，备用。

(3)样品的纯化：

将溶解后的样品加入到微孔板里，通过DPX-CX枪头分散式固相微萃取柱及Hamilton

自动移液系统对样品进行萃取。将加有水、甲醇、2％甲酸水溶液、 5％NH₄OH甲醇溶液的微孔板及四块空板载入到Nimbus系统中。在Nimbus系统中，在空板中加入水、1％甲酸水溶液及甲醇。随后将系统安装上DPX枪头，并通过反复吸打甲醇两次使之平衡。随后依次反复吸打水两次、样品溶液四次、洗液两次。最后通过反复吸打三次5％NH₄OH甲醇溶液进行洗脱。全过程小于20分钟。该过程也可以用于手动移液器。将洗脱后的样品溶液进行蒸发干燥，重悬于100μL 0.1％甲酸5％甲醇水溶液中。

2.仪器方法

(1)仪器：

Thermo TSQ Vantage^TM三重四级杆质谱仪(Milwaukee,WI)，安捷伦1260高效液相色谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)。也可以使用相同公司或不同公司的同类产品。

(2)参考液相色谱条件：

a.色谱柱：安捷伦Poroshell EC-C₁₈(3.0×50mm,2.7μm)或类似色谱柱；

b.流动相：A：0.1％甲酸/水，B：0.1％甲酸/乙腈，梯度洗脱参数见表1；

c.流速：0.5mL/min；

d.柱温：35℃；

e.进样量：20μL；

(3)参考质谱条件：

a.电喷射电压：4000V；

b.辅助气体压力：8psi；

c.鞘气压力：30psi；

d.喷雾器温度：300℃；

e.毛细管温度：300℃；

f.其它质谱参数见表2。

g.液相色谱串联质谱图见图4。

表1梯度洗脱表

表2.10种β-受体激动剂质谱参数

Compound	m/z	Quantifier	Qualifier
				Terbutaline	226.0	152.0	169.9
Cimaterol	219.8	142.4	115.5
				Salbutamol	240.0	148.0	166.0
Cimbuterol	233.9	160.0	142.3
				Ractopamine	302.1	164.0	107.0
Clenbuterol	277.0	202.8	167.9
				Bromobuterol	367.1	292.5	213.7
Isoxsuprine	302.0	284.0	190.0
				Mabuterol	310.8	217.0	236.6
Mapenterol	324.6	236.5	216.4

3.方法验证：

(1)线性及灵敏度：

适量移取标准工作液，用空白猪肉基质配制成浓度为0.2-50ng/g的六个标准浓度，按照上述样品处理方法对标样进行净化处理，每点三个重复。校正模式为1/x加权最小二乘法，通过检测限与定量限计算灵敏度。Y轴截距标准偏差(s_y)及平均斜率(avg_m)由五次重复的标准曲线所得。

检测限(limit of detection,LOD)计算公式：LOD＝(3.3s_y)/avg_m

定量限(limit of quantitation,LOQ)计算公式：LOD＝(10s_y)/avg_m

结果表明，每种β-受体激动剂在0.2-50ng/g浓度范围呈线性关系，1/x加权线性回归良好，校正系数(R²)均大于0.99。LODs和LOQs分别在2.88ng/g和8.72ng/g以下(表 3)。

表3.10种β-受体激动剂类药物的检测限(LOD)、定量限(LOQ)及信噪比(S/N,0.2ng/g)

(2)准确度和精密度：

通过对加标试样的分析，验证分析方法的可靠性。取3份基质与实际试样相似的空白样品，分别加入标准溶液，其浓度分别为0.5ng/g、5ng/g、10ng/g。将制备好的加标试样按上述方法进行分析，每个浓度做三个重复，并重复三次实验。

准确度计算公式：(检测平均浓度–添加浓度)/添加浓度×100％。

批内精密度计算公式：单次实验单个浓度的标准偏差/单次实验的计算平均值×100％。

批间精密度计算公式：每个浓度所有重复实验的标准偏差/总计算平均值×100％。

萃取效率及基质效应：基质效应由萃取后添加法进行计算。将未经过萃取的β-激动剂溶液进行上样四次，重复两个样品(set 1)。空白猪肉添加适当浓度的待测物并进行萃取(重复三个样品)(set 2)。基质效应计算公式：((set 2平均面积/set 1平均面积)-set 1平均面积)×100％。负值表示离子抑制，正值表示离子增强。set 3为空白猪肉经过蛋白沉淀及离心后添加了待测物，但没有经过萃取。萃取效率计算公式为：set 3平均面积/set 2平均面积×100％。

结果表明，利用本实施例方法得到的结果比预期更好，其批内、批间精确度见表4。最大平均批内精密度为11.8％(5ng/mL异克舒令)，最大平均批间精密度为21.0％(0.5 ng/mL溴布特罗)。

表4.批内、批间精密度

Claims (6)

1.一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于，样品前处理包括以下步骤：

一、取待检测样品，加入水或缓冲液，漩涡振荡并于4℃孵育过夜；

二、均质后加入乙腈，漩涡振荡后进行离心，分层后收集上清液；将上清液蒸发干燥，溶解于水中获得预处理样品；

三、上述预处理样品通过固相微萃取柱进行萃取，先依次用甲醇、水润洗所述的固相微萃取柱；

四、将步骤三的预处理样品上柱；

五、依次用水、体积百分含量为1~3%甲酸/水溶液及体积百分含量为100%甲醇洗涤微萃取柱；

六、用配制的质量体积百分含量为3~7% NH₄OH/甲醇溶液洗脱，获得样品洗脱液；

七、将样品洗脱液蒸发干燥，溶解于含体积百分含量为0.1~0.3%甲酸以及体积百分含量为3~7%甲醇的水溶液中，得到所需的待测样液；所述的固相微萃取柱为DPX-CX枪头分散式固相微萃取柱；

液-质联用快速检测瘦肉精含量的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、采用上述样品前处理的方法获得待测样液，备用；

二、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测样液中含有的β-受体激动剂进行检测；

三、所述高效液相色谱的检测条件为：

a.色谱柱： C18柱；

b.流动相：A：0.1%甲酸/水，B：0.1%甲酸/乙腈；

c.流速：0.5 mL/min；

d.柱温：35℃；

e.进样量：20 µL；

所述的流动相洗脱方式为梯度洗脱：第0min，流动相： 96% A相+ 4% B相；第2min，流动相： 92% A相+ 8% B相；第6min，流动相： 60% A相+ 40% B相；第7.5min，流动相： 5% A相+95% B相；第8.5min，流动相： 96% A相+ 4% B相；

四、所述质谱条件为：

a.电喷射电压：4000V；

b.辅助气体压力：8 psi；

c.鞘气压力：30 psi；

d.喷雾器温度：300 ℃；

e.毛细管温度：300 ℃；所述的瘦肉精为盐酸莱克多巴胺、盐酸异克舒令、盐酸克伦特罗、西布特罗、特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、马贲特罗、马布特罗和盐酸溴布特罗。

2.根据权利要求1所述的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于步骤五依次用水、体积百分含量为2%甲酸/水溶液及体积百分含量为100%甲醇洗涤微萃取柱。

3.根据权利要求1所述的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于步骤六用配制的质量体积百分含量为5%NH₄OH/甲醇溶液洗脱，获得样品洗脱液。

4.根据权利要求1所述的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于步骤七将样品洗脱液蒸发干燥，溶解于含体积百分含量为0.1%甲酸以及体积百分含量为5%甲醇的水溶液中，得到所需的待测样液。

5.根据权利要求1所述的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于所述的C18柱为安捷伦的Poroshell EC- C18柱。

6.根据权利要求5所述的一种利用DPX枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析β-受体激动剂类瘦肉精含量的检测方法，其特征在于所述的安捷伦的Poroshell EC- C18柱的尺寸为3.0 × 50 mm, 2.7 µm。

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