CN115015422A - 一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种酱油中的3‑氯‑1，2‑丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法。本发明通过将酱油中的3‑MCPD用氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类或磺酰胺苯酚类物质衍生后进行测定：首先，采用自制活性炭萃取小柱吸附3‑MCPD，再用甲醇‑水洗脱液洗脱3‑MCPD，洗脱液过滤膜后直接进行衍生反应。采用同位素内标法进行定量，该方法绿色环保，避免了昂贵的衍生成本及检测成本，且操作简单。

Description

一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测 方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
1978年
Figure BDA0003679460830000011
等人首次在酸性水解植物蛋白(HVP)的氧化过程中发现了3-氯-1，2-丙二醇。酱油作为我国传统的调味料，其生产工艺随着人们需求量的增加而发生了很大变化，为了提高产量和降低成本，酸水解植物蛋白被广泛应用于酱油工业，但也引入了氯丙醇类污染物。其中3-氯-1，2-丙二醇在酱油中的含量最高。
3-氯-1，2-丙二醇又称氯甘油，是氯丙醇类物质的一种，简写为3-MCPD，其化学结构式为CH2OH-CHOH-CH2Cl。3-MCPD作为一种食品加工污染物因其能诱发肿瘤和肾脏病变等毒理学特性而被重视。植物油的精炼过程、酱油的生产过程和各种肉类的木材熏制等过程中均会形成3-MCPD。目前，已在各种精炼油、酱油和烟熏肉类中检测到游离3-MCPD。动物研究表明3-MCPD的存在会引起β-氯乳酸及其相关代谢物对糖酵解的抑制，从而对肝脏、肾脏和睾丸等器官产生不利影响。高剂量时，3-MCPD存在致突变性和致癌风险。由于其存在致癌风险而被国际癌症研究机构(IARC)归类为2B组。
虽然3-MCPD具有相对简单的化学结构，但其某些特性使其难以灵敏分析。这是由于缺乏合适的发色团、高沸点和低分子量。缺乏合适的发色团影响其检测，并使紫外线或荧光与高效液相色谱联用的方法(HPLC)应用受到限制。高沸点和低分子量使其不能被气相色谱-质谱联用(GC-MS)或液相色谱-质谱联用(LC-MS)直接定量。3-MCPD的低挥发性和高极性意味着它需要衍生化。因此，分析3-MCPD需要调整基质样品制备和化合物衍生。
在ISO、AOCS、AOAC和JOCS发布的官方检测方法中，游离的3-MCPD通常与苯硼酸(PBA)衍生，再通过GC-MS定量。然而，许多研究人员报道，当PBA用作衍生试剂时，GC-MS系统容易受到污染，灵敏度会迅速降低。因此，为了避免污染，有必要配备程序升温汽化(PTV)入口或反冲电动压力控制器(EPC)。然而，配备PTV或反冲EPC费用昂贵，大大增加了实验成本与实行难度。在GB/T 5009.191-2016法中改用七氟丁酰基咪唑(HFBI)衍生并通过GC-MS定量。虽然用HFBI衍生无需使用PTV入口或反冲EPC，可以提高分析物的灵敏度，确保色谱柱有足够的使用寿命。但是，HFBI试剂昂贵且极易潮解，不仅经济成本高且对衍生剂的保存要求高。而且，样品前处理过程中不可避免的会引入水分子，而3-MCPD与HFBI的衍生效果会受到水的影响，水分多的话衍生实验会失败，这就要求有更高的前处理条件。随着分子印迹材料以及纳米复合材料的发展，目前也有许多直接或间接法通过分子印迹或纳米材料来快速检测3-MCPD，但是这些方法都不如GC-MS或LC-MS得到的数据准确。因此，突破传统的GC-MS检测，探索一种低成本、反应条件温和的衍生剂并建立一个快速、准确、简便方法测定酱油中3-MCPD的含量十分必要。
发明内容
基于上述内容，本发明提供一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法。
本发明的技术方案之一，一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，以氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类或磺酰胺苯酚类物质中的一种为衍生剂赋予3-MCPD质谱响应活性，对酱油中的3-氯-1，2-丙二醇进行衍生，使用液相色谱串联质谱仪进行检测。
3-MCPD是小分子物质，且其沸点高挥发性低等特点使其不能直接被LC-MS检测，所以要通过衍生反应赋予3-MCPD质谱响应活性。在本发明中氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类和磺酰胺苯酚类物质均可作为3-氯-1，2-丙二醇的衍生剂，氨基、磺酸基、磺酰胺基分别在苯酚基团的邻位、间位或对位进行一元取代，形成一元取代物。衍生方案如下：
Figure BDA0003679460830000021
其中R1为邻位取代基团，选自氢原子、氨基基团、磺酸基基团、磺酰基基团中的任意一组；
R2为对位基团，选自氢原子或氨基基团、磺酸基基团、磺酰基基团中的任意一组；
R3为间位取代基团，选自氢原子或氨基基团、磺酸基基团、磺酰基基团中的任意一组。
3-氯-1，2-丙二醇在碱性条件下环化生成环氧丙醇(GC)，NaOH与氨基苯酚类、磺酸基苯酚类和磺酰胺苯酚类反应生成苯酚盐，而GC通过升温开环与各种苯酚钠盐反应生成相应的衍生物。本反应进行的关键步骤是3-氯-1，2-丙二醇在碱性条件下环化生成环氧丙醇，并升温与活性苯酚类物质反应。氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类物质和磺酰胺基苯酚类物质均具有高反应活性酚羟基基团，可作为3-氯-1，2-丙二醇的衍生剂。
进一步地，所述酱油为液态酱油。
进一步地，包括以下步骤：
步骤1：采用活性炭萃取柱吸附3-氯-1，2-丙二醇，然后用甲醇-水洗脱液进行洗脱后过滤得到洗脱液；
步骤2：向洗脱液中依次加入衍生剂溶液、氢氧化钠溶液，进行衍生反应得到衍生液；
步骤3：使用液相色谱串联质谱仪对衍生液进行定量检测。
进一步地，所述步骤1中：甲醇-水洗脱液具体为甲醇体积分数为10-70％的甲醇水溶液，过滤具体为过0.22μm滤膜。
进一步地，所述步骤2中：衍生剂溶液的浓度为7～700mg/mL，氢氧化钠溶液的浓度为0.4～6.4mol/L；所述洗脱液、衍生剂溶液、氢氧化钠溶液的体积比为1mL：100μL：100μL；所述衍生反应温度为4～80℃，衍生反应时间为30min～16h。
进一步地，所述步骤3中液相色谱串联质谱仪检测条件：
色谱分析条件：
EclipsePlusC18 RRSD色谱柱规格3.0×150mm，1.8um；
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
进样量：4μL；
流动相A：含0.2％(质量分数)甲酸和5mM乙酸铵的水；
流动相B：含0.2％(质量分数)甲酸的甲醇；
洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B；
质谱分析条件：
HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)，2800V(-)；
鞘气：50arb；
辅气：15arb；
吹扫气：1arb；
毛细管温度：350℃；
辅助气体加热温度：400℃；
质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。
进一步地，步骤3选用稳定同位素内标法进行定量检测。
进一步地，所述方法的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明结合3-MCPD的结构特点，分别使用氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类和磺酰胺苯酚类物质开发了新的衍生方法。该衍生方法需要的实验条件温和且具有优异的稳定性。在分析仪器方面运用液相色谱串联质谱对3-MCPD定量分析。突破了只能用传统的GC-MS分析衍生物的技术局限。而且高分辨质谱的高灵敏度降低了定量分析时对分离度的要求，消除复杂基体中其他物质带来的干扰，使定性、定量结果更为准确。在前处理方法上也进行一定程度的创新，通过简单的两步过柱实验就能完成酱油样品的前处理，避免了复杂前处理引入更多的基质干扰，影响结果的准确性。采用同位素内标法进行定量，该方法绿色环保，避免了昂贵的衍生成本及检测成本，且操作简单。
本发明基于新型衍生试剂、液相色谱-质谱选择正离子Full MS及PRM扫描模式建立酱油中3-氯-1，2-丙二醇的检测方法，有益效果在于：
(1)采用自制活性炭吸附柱开发酱油中3-MCPD残留检测的前处理方法，该方法具备快速、简单、便宜、有效、安全的特点。
(2)用氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类和磺酰胺苯酚类物质作为新型衍生剂，运用温和的实验条件在水相体系中直接对酱油中的3-MCPD衍生，不使用GC-MS仪器检测，不需要去除样品水分，简化了前处理方法，降低了仪器维护成本；低成本且在水环境中稳定的衍生试剂比HFBI更具优势。
(3)突破3-MCPD衍生后只能用GC-MS检测的常规检测手段，运用液相色谱串联质谱对3-MCPD定量分析。该仪器方法可以提高分析物的选择性、灵敏度和回收率。
因此，该方法具有前处理简单、有机溶剂用量少、绿色环保、衍生条件温和、准确度高、检测成本低、易于推广等特点，能够满足日常检测工作的需要并且灵敏度更高。
附图说明
图1为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生反应产物(待检测物)的核磁氢谱图。
图2为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生反应产物(待检测物)的核磁碳谱图。
图3为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生产物的质谱图(定性和定量离子选择图)。
图4为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇-D5衍生产物的质谱图(定性和定量离子选择图)。
图5为本发明实施例2中混合标准工作溶液的总离子流图(TIC)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以下实施例采用液相色谱串联质谱检测酱油中的3-氯-1，2-丙二醇，所述酱油为液态酱油，将酱油中的3-MCPD用对二甲氨基苯酚盐酸盐衍生后进行测定：首先，采用自制活性炭萃取小柱吸附3-MCPD，再用70％甲醇-水洗脱液洗脱3-MCPD，洗脱液过0.22um滤膜后直接进行衍生反应。采用同位素内标法进行定量，该方法绿色环保，避免了昂贵的衍生成本及检测成本，且操作简单。具体步骤如下：
(1)活性炭小柱制作：
称取0.6g活性炭(精确至0.1g)，加入带有下筛板小柱中并用聚四氟乙烯小棒压实，取下筛板放入压实的活性炭小柱上，小柱即制作完成。
(2)配制反应溶液：
a、准确称取0.7g(精确至0.01g)对二甲氨基苯酚盐酸盐作为衍生剂加入10mL去离子水。得到70mg/mL的衍生剂溶液，避光于-4℃保存；
b、准确称取1.6g(精确至0.01g)NaOH加入10mL去离子水。得到4mol/L的NaOH溶液，于-4℃保存。
(3)配制标准溶液
①配制标准储备溶液：
a、称取3-氯-1，2-丙二醇标准物质10mg(精确至0.01mg)，用乙腈溶解，转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。得到1mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。
b、称取内标物3-氯-1，2-丙二醇-D510 mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到2mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。
②配制标准工作溶液：
a、移取10uL 1mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到1mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。
b、移取10μL 2mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到2mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。
(4)配制洗脱溶液
70％甲醇-水溶液：准确量取70mL甲醇，再准确量取30mL去离子水加入，充分振荡，使其混合均匀。
(5)配制系列标准工作液：
准确移取3-MCPD标准工作液(1mg/L)适量，用加入适量内标的水溶液稀释，标准工作液(1mg/L)配制成102.4ng/mL浓度，并用含适量内标的水溶液分别稀释为51.2ng/mL、25.6ng/mL、12.8ng/mL、6.4ng/mL、3.2ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL的系列标准工作液，其中3-氯-1，2-丙二醇-D5的浓度均为10ng/mL。
(6)制备样品溶液：
取5mL酱油样品加入25μL 2mg/L的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准工作溶液，过自制活性炭小柱，再用2mL 70％甲醇-水溶液洗脱3-氯-1，2-丙二醇，收集洗脱液并过0.22μm滤膜。取1mL滤液加入70mg/mL的衍生剂溶液100μL，室温放置30min后加入4mol/L的NaOH溶液100μL，然后放60℃烘箱衍生8h。同时做3-氯-1，2-丙二醇系列标准工作液的衍生反应。
(7)液相色谱-质谱仪器条件
①色谱分析条件：EclipsePlusC18 RRSD色谱柱(3.0×150mm，1.8μm)；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：4μL；流动相A为水(含0.2％甲酸和5mM乙酸铵)，流动相B为甲醇(含0.2％甲酸)洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B。
②质谱分析条件：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)，2800V(-)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。
③监测离子(m/z)：定量离子、定性离子、驻留时间等见表1。
表1 3-氯-1，2-丙二醇和3-氯-1，2-丙二醇-D5的母离子、子离子
Figure BDA0003679460830000081
a表明该离子用于分析物的定量；
(8)样品测定
对样品进行定性分析时：将样品溶液按照和标准工作液相同的仪器条件进行测定；若试样中检测出的色谱峰的保留时间与3-氯-1，2-丙二醇色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于0.05min；扣除本底后试样中定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围内，可判定样品中存在对应的3-氯-1，2-丙二醇。
表2定性分析时相对离子丰度的最大允许偏差
Figure BDA0003679460830000082
对样品进行定量分析时，记录样品溶液和标准工作液中目标化合物和内标物质的定量离子的峰面积，采用内标法进行定量；或使用仪器工作站软件进行定量分析。
(9)结果计算：计算公式为：
Figure BDA0003679460830000083
其中：
X—样品中3-MCPD的含量，单位为毫克每千克(mg/Kg)；
C—样品测试溶液中3-MCPD的含量，单位为微克(μg)。
实施例1实验方法的优化
①提取材料的选择
从酱油中提取3-MCPD的固相萃取填料应能满足对3-MCPD有较好的选择过滤性或吸附性，这样才能尽可能的提高回收率，使检测结果更加准确。因此，本申请申请人尝试了在加标酱油液中直接加入质量比为5：2的Pestcarb碳粉和ODS C18粉末的混合物质，经2500rpm离心10min，离心两次，取上层清液过0.22μm滤膜并衍生。但是该提取方法即使通过离心也不能得到澄清的上清液且衍生效果不佳；随后，用Carb-GCB(石墨化炭黑)SPE固相萃取柱对加标酱油进行前处理，发现Carb-GCB柱能过滤掉酱油中近90％的色素及固形物，其对3-MCPD的柱效达到70％。故GCB固相萃取小柱能达到很好的对3-MCPD选择过滤并去除杂质的效果。但是，GCB固相萃取小柱成本较高，不符合我们低成本的预期。最后，我们用活性炭粉制成活性炭小柱，利用活性炭对3-MCPD的吸附性对加标酱油液作前处理，发现活性炭对3-MCPD的吸附效率达到99％。因此，本申请最终选择用活性炭作为提取3-MCPD的理想材料，其便宜、快捷和优异的保留效果完全符合实验预期。
②不同浓度甲醇-水洗脱溶液的优化
由于活性炭材料对3-MCPD具有优异的吸附性，故需要选择一种合适的洗脱液把吸附在活性炭上的3-MCPD洗脱下来，而甲醇-水溶液可以作为理想的洗脱剂。为此，需要对甲醇-水的洗脱浓度进行优化。配制浓度为10％、25％、40％、55％、70％、85％、100％的甲醇-水溶液。配制适量加3-MCPD外标为100ng/mL的酱油液。取5mL加标酱油过活性碳柱，收集过柱液，弃去。再用2mL不同浓度的甲醇-水洗脱3-MCPD，收集洗脱液，过0.22μm滤膜。取500μL洗脱液，加入25uL 2μg/mL的3-MCPD-D5，加入50uL 100mg/mL的DMAphenol衍生剂，常温反应30min后，加入50μL 2.5M NaOH，60℃加热4h。由实验得，3-MCPD-D5与3-MCPD的峰面积比在70％甲醇-水洗脱响应达到最大值故选70％甲醇-水洗脱。
③测定方法的优化
选用稳定同位素内标法，在过柱前加入3-MCPD-D5内标物，伴随分析全过程，能更好的校正整个分析过程的偏差情况，所以采用同位素内标法作为定量方法。对3-MCPD及3-MCPD-D5的衍生产物进行全扫描，选择丰度较高且质荷比较大的特征离子作为定量、定性离子，采用灵敏度高的PRM平行反应模式监测。
实施例2本发明的方法验证实验
(1)分别制备含3-MCPD-D5浓度为10ng/mL和3-MCPD浓度分别为102.4ng/mL、51.2ng/mL、25.6ng/mL、12.8ng/mL、6.4ng/mL、3.2ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL的系列标准工作液，将系列标准工作液进行衍生化反应并按确定的分析条件进行检测，得到3-MCPD在0.8～102.4ng/mL的含量范围内的线性方程为y＝0.131132+0.143513X，判定系数R2＝0.9967。
(2)回收率与精密度见表3；
表3
Figure BDA0003679460830000101
(3)定量限和检出限
检测限和定量限分别根据峰高约在基线噪音高的3倍和10倍即S/N＝3和S/N＝10时确定。该检测方法能达到的检测限为0.0005mg/kg，定量限为0.001mg/kg。
(4)通过CFAPA能力测试进行验证
①实验过程：购买一份CFAPA的酱油质控样品，质控样品的3-氯-1，2-丙二醇指定值为3.821mg/Kg，标准差σ为0.421mg/Kg。由于酱油质控液中3-氯-1，2-丙二醇的浓度太高导致检测结果不在线性范围内且偏差很大。故先将酱油质控液稀释40倍再检测。具体过程如下：取0.5mL的酱油质控液加入19.5mL的去离子水得到稀释40倍的酱油质控液，再取100μL 2mg/L的3-氯-1，2-丙二醇-D5内标溶液加入到19.9mL的稀释40倍酱油质控液中得到含内标10ng/mL的酱油质控液。取5mL含10ng/mL3-氯-1，2-丙二醇-D5的酱油质控液，过自制活性炭小柱，用2mL 70％的甲醇-水洗脱液洗脱，收取洗脱液过0.22um滤膜。取1mL滤液置于进样小瓶并加入70mg/mL的对二甲氨基苯酚盐酸盐溶液100μL，室温放置30min后加入4mol/L的NaOH溶液100μL，然后放60℃烘箱衍生8h。衍生完成后用相同条件的液相色谱-质谱检测。重复测定3次结果为2.8790mg/Kg，最终结果用Z-比分数评价。Z-比分数计算式如下：
Figure BDA0003679460830000102
式中：
x表示测试结果；
X表示指定值，即3.821mg/Kg；
σ表示标准差，即0.421mg/Kg。
当|Z|≤2，测试结果可行；
当2＜|Z|＜3，测试结果可疑；
当|Z|≥3，测试结果离群。
该检测方法的Z-比分数计算为：
Figure BDA0003679460830000111
图1为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生反应产物(待检测物)的核磁氢谱图。图2为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生反应产物(待检测物)的核磁碳谱图。图3为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇衍生产物的质谱图(定性和定量离子选择图)。图4为本发明实施例2中3-氯-1，2-丙二醇-D5衍生产物的质谱图(定性和定量离子选择图)。图5为本发明实施例2中混合标准工作溶液的提取离子色谱图(EIC)。
实施例3酱油实际样品检测
(1)活性炭小柱制作：
称取0.6g活性炭(精确至0.1g)，加入带有下筛板小柱中并用聚四氟乙烯小棒压实，取下筛板放入压实的活性炭小柱上，小柱即制作完成。
(2)配制反应溶液：
a、准确称取0.7g(精确至0.01g)对二甲氨基苯酚盐酸盐加入10mL去离子水。得到70mg/mL的衍生剂溶液，避光于-4℃保存。
b、准确称取1.6g(精确至0.01g)NaOH加入10mL去离子水。得到4mol/L的NaOH溶液，于-4℃保存。
(3)配制标准溶液：
①配制标准储备溶液：
a、称取3-氯-1，2-丙二醇标准物质10mg(精确至0.01mg)，用乙腈溶解，转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。得到1mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。
b、称取内标物3-氯-1，2-丙二醇-D510 mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到2mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。
②配制标准工作溶液：
a、移取10uL 1mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到1mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。
b、移取10uL 2mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到2mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存
(4)配制洗脱溶液：
①70％甲醇-水溶液：准确量取70mL甲醇，再准确量取30mL去离子水加入，充分振荡，使其混合均匀。
(5)配制系列标准工作液：
准确移取3-MCPD标准工作液(1mg/L)适量，用加入适量内标的水溶液稀释，标准工作液(1mg/L)配制成102.4ng/mL浓度，并用含适量内标的水溶液分别稀释为51.2ng/mL、25.6ng/mL、12.8ng/mL、6.4ng/mL、3.2ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL的系列标准工作液，其中3-氯-1，2-丙二醇-D5的浓度均为10ng/mL。
(6)制备酱油样品：
从超市购买11份酱油真实样品，分别取5mL酱油样品加入25μL 2mg/L的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准工作溶液，过自制活性炭小柱，再用2mL 70％甲醇-水溶液洗脱3-氯-1，2-丙二醇，收集洗脱液并过0.22μm滤膜。取1mL滤液置于进样小瓶并加入70mg/mL的衍生剂溶液100μL，室温放置30min后加入4mol/L的NaOH溶液100μL，然后放60℃烘箱衍生8h。同时做3-氯-1，2-丙二醇系列标准工作液的衍生反应。衍生完成后用液相色谱-质谱检测。
(7)液相色谱-质谱仪器条件：①色谱分析条件：EclipsePlusC18 RRSD色谱柱(3.0x150mm，1.8um)；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：4μL；流动相A为水(含0.2％甲酸和5mM乙酸铵)，流动相B为甲醇(含0.2％甲酸)洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B。
②质谱分析条件：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)，2800V(-)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。
③监测离子(m/z)：定量离子、定性离子、驻留时间等见表1：
(8)样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作液相同的仪器条件进行测定；若试样中检测出的色谱峰的保留时间于3-氯-1，2-丙二醇色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中定性离子的相对丰度于浓度接近的混合标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围内，可判定样品中存在对应的3-氯-1，2-丙二醇。
②定量分析：记录样品溶液和标准工作液中目标化合物和内标物质的定量离子的峰面积，采用内标法进行定量；或使用仪器工作站软件进行定量分析。
(9)结果计算：
使用工作站软件，计算公式为：
Figure BDA0003679460830000131
式中：
X—样品中3-MCPD的含量，单位为毫克每千克(mg/Kg)；
C—样品测试溶液中3-MCPD的含量，单位为微克(μg)。
(10)检测结果：该检测方法用内标法定量，每份样品均重复测定3次，得到酱油样品中3-MCPD的含量如表4所示。
表4酱油实际样品检测结果
Figure BDA0003679460830000132
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，以氨基苯酚类物质、磺酸基苯酚类或磺酰胺苯酚类物质为衍生剂，对酱油中的3-氯-1，2-丙二醇进行衍生后，使用液相色谱串联质谱仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用活性炭萃取柱吸附3-氯-1，2-丙二醇，然后用甲醇-水洗脱液进行洗脱后过滤得到洗脱液；
步骤2：向洗脱液中依次加入衍生剂溶液、氢氧化钠溶液，进行衍生反应得到衍生液；
步骤3：使用液相色谱串联质谱仪对衍生液进行定量检测。
3.根据权利要求2所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1中：甲醇-水洗脱液具体为甲醇体积分数为10-70％的甲醇水溶液，过滤具体为过0.22μm滤膜。
4.根据权利要求2所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤2中：衍生剂溶液的浓度为7～700mg/mL，氢氧化钠溶液的浓度为0.4～6.4mol/L；所述洗脱液、衍生剂溶液、氢氧化钠溶液的体积比为1mL：100μL：100μL；所述衍生反应温度为4～80℃，衍生反应时间为30min～16h。
5.根据权利要求2所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤3中液相色谱串联质谱仪检测条件：
色谱分析条件：
EclipsePlusC18 RRSD色谱柱规格3.0×150mm，1.8um；
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
进样量：4μL；
流动相A：含0.2wt％甲酸和5mM乙酸铵的水；
流动相B：含0.2wt％甲酸的甲醇；
洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B；
质谱分析条件：
HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)，2800V(-)；
鞘气：50arb；
辅气：15arb；
吹扫气：1arb；
毛细管温度：350℃；
辅助气体加热温度：400℃；
质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。
6.根据权利要求2所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤3选用稳定同位素内标法进行定量检测。
7.根据权利要求1所述的酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述方法的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
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