CN115808477A - 一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3‑氯‑1,2‑丙二醇和缩水甘油的方法，属于食品检测及分析化学技术领域。本发明通过以氨基苯酚类物质作为衍生剂，并利用LC‑MS/MS对鱼油虾油膳食补充剂中的3‑氯‑1,2‑丙二醇(3‑MCPD)和缩水甘油(GC)进行定量分析。本发明提供的检测方法衍生条件温和、环保，检测手段新颖且对于膳食补充剂中3‑氯‑1,2‑丙二醇(3‑MCPD)和缩水甘油(GC)的检测具有重要的指导意义。

Description

一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和 缩水甘油的方法

技术领域

本发明涉及食品检测及分析化学技术领域，特别涉及一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法。

背景技术

研究表明，经常食用多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，有助于大幅降低心血管疾病的风险(Lunn和Theobald，2006年)。此外，多不饱和脂肪酸已被证明能改善炎症性疾病，如哮喘、湿疹、银屑病和克罗恩病(Lunn和Theobald，2006；Ashley等人，2013)。不饱和脂肪酸主要来自鱼、虾，除了直接食用外，基于鱼油、虾油的膳食补充剂是目前人类饮食中多不饱和脂肪酸的主要来源。在过去二十年中，这些产品的受欢迎程度大大提高，使其成为市场上最受欢迎的膳食补充剂之一。

鱼油虾油补充剂的生产是一个复杂的过程，未经纯化的粗油含色素、矿物质和有毒物质。所以为了提高鱼油虾油的质量和安全性，需要对鱼油虾油进行精炼、漂白和除臭。然而，已经观察到，在除臭过程中，会形成一些其他污染物，如3-氯-1,2-丙二醇及其脂肪酸和缩水甘油及其脂肪酸。国际癌症研究机构(IARC)把3-氯-1,2-丙二醇列为2B组(possiblycarcinogenic to humans)致癌物，同时把缩水甘油列为2A组(probably carcinogenic tohumans)致癌物”。而目前在油脂类食品加工过程中通常关注的为3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯的存在，而研究以这些污染物的酯类物质会在体内完全水解为游离态导致致癌毒性和基因毒性的发生为前提对3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯的检测方法进行大量的探索开发。因此，一种稳定检测游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法对于3-氯-1,2-丙二醇酯和缩水甘油酯及其水解游离态是很必要的。这些污染物在鱼油虾油膳食补充剂中的间接检测与研究尚处于空白阶段，从发表的文献来看有以下几篇文献报道过相关的检测手段及检测数据。

Kuhlmann(2011)基于弱碱性酯交换反应释放游离态污染物并与苯硼酸(PBA)衍生通过GC-MS/MS测定了鲑鱼油膳食补充剂中的2-/3-氯丙醇酯和缩水甘油酯。(KUHLMANNJ.Determination of bound 2,3-epoxy-1-propanol(glycidol)and boundmonochloropropanediol(MCPD)in refined oils[J].Eur J Lipid Sci Technol,2011,113(3):335-44.)R.Jedrkiewicz等人(2016)也基于弱碱性酯交换反应在5个鱼油膳食补充剂样品中均检测出2-/3-氯丙醇酯和缩水甘油酯。(

R,

A,GROMADZKA J,et al.Determination of3-MCPD and 2-MCPD esters in edible oils,fish oils and lipid fractions ofmargarines available on Polish market[J].FoodControl,2016,59(487-92.)。

Sadowska-Rociek等人(2020)结合AOCS Cd 29a-13的官方检测方法通过GC-MS对不同鱼种鱼油的膳食补充剂进行了3-氯-1,2-丙二醇酯和缩水甘油酯的定量分析。(SADOWSKA-ROCIEK A.Monochloropropanediol esters and glycidyl esters indietary supplements based on fish oils[J].Food Addit Contam Part B:Surveill,2020,13(4):305-12.)。

K.Beekmann等人(2022)在AOCS Cd29a-13官方检测方法上进行一定修改并通过三重四极杆GC-MS/MS系统对鱼类、藻类和磷虾的海洋油膳食补充剂样品中的2-/3-氯丙醇酯和缩水甘油酯进行检测及定量分析。(BEEKMANN K,SLOOT SJ,OEY SB,et al.MCPD estersand glycidyl esters in food supplements offish oils,algae oils,and krill oils[J].Food Control,2022,136)。

除了这些研究外，几乎没有关于含有鱼油膳食补充剂中这些污染物的信息、关于虾油膳食补充剂的检测更是少之又少。综合以上研究的特点，不难发现，目前的研究方法所用衍生剂均为PBA，所用检测手段均为GC-MS/MS。然而，许多研究人员报道，当PBA用作衍生试剂时，GC-MS系统容易受到污染，灵敏度会迅速降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法。通过以氨基苯酚类物质作为衍生剂，并利用LC-MS/MS对鱼油虾油膳食补充剂中的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油进行定量分析。该方法衍生条件温和、环保，检测手段新颖且对于膳食补充剂中3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的检测具有重要的指导意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，包括A和B两部分，A部分测定缩水甘油的量，B部分测定3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的总量，通过差减法得到3-氯-1，2-丙二醇的量，具体步骤如下：

缩水甘油测定：以NaCl溶液为提取液提取待测样品中的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，提取后除杂，先加入PBS缓冲溶液，然后加入氨基苯酚类物质进行衍生反应，最后利用液相色谱串联质谱检测衍生后反应液中缩水甘油的含量，计算出待测样品中缩水甘油的含量；

3-氯-1,2-丙二醇的测定：以NaCl溶液为提取液提取待测样品中的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，提取后除杂，先加入氨基苯酚类物质，然后加入NaOH溶液进行衍生反应，最后利用液相色谱串联质谱检测衍生后反应液中3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，结合B部分缩水甘油的含量测定计算出待测样品中3-氯-1,2-丙二醇的含量；

3-氯-1，2-丙二醇的含量：B部分的测量值减去A部分的测量值。

优选地，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，NaCl溶液的质量分数为10％，NaCl溶液与待测样品的体积比为3:1。

优选地，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，除杂为利用C18固相萃取柱去除NaCl提取液中的杂质。

本发明采用一定浓度的NaCl溶液和C18固相萃取小柱对鱼油虾油进行前处理，该方法能萃取出完全澄清的待衍生溶液，且能保证加标样品的回收率在90％～117％的范围内，该前处理方法具备快速、简单、便宜、有效、安全的特点。C18固相萃取小柱对鱼油虾油中脂肪酸的完美过滤效果也可为研究3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯提供非常大的前处理参考价值。

优选地，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，氨基苯酚类物质为二甲氨基苯酚盐酸盐。

优选地，所述3-氯-1,2-丙二醇的测定步骤中，NaOH溶液的浓度为1mol/L。

优选地，所述缩水甘油的测定步骤中，PBS缓冲溶液的pH值为6.5。

3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油均是伴随着鱼油虾油的除臭过程产生。在除臭过程中缩水甘油作为氯丙醇的前体物质导致两者的出现密不可分。本发明探究了一种有效区分3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，该方法通过使用弱酸性的PBS缓冲液将缩水甘油维持在一个稳定的pH范围内而阻止3-氯-1，2-丙二醇向其转化，以此严格区分3-氯-1，2-丙二醇和缩水甘油，实现3-氯-1，2-丙二醇和缩水甘油能分开定量的目的。由于3-氯-1，2-丙二醇向缩水甘油的转化受pH环境的影响较大，故该方法优化了弱酸性PBS缓冲液的pH值，找到一个最佳的pH环境抑制3-MCPD的转化。

具体的优化方法为：配制不同pH的PBS缓冲溶液，pH值分别为：5.8、6.0、6.5、7、7.5。取加标鱼油虾油的过柱清液分别用不同pH的缓冲溶液1∶1稀释后取适量稀释液衍生。由不同pH环境下稀释液加标衍生的实验结果可得，当pH＝6.5时既能保证缩水甘油的衍生效率又能抑制3-氯-1，2-丙二醇向缩水甘油转化。

优选地，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，液相色谱串联质谱的检测条件如下：

液相色谱：

色谱柱：EclipsePlusC18 RRSD色谱柱；

流速：0.5mL/min；

进样量：4μL；

以含0.2wt.％甲酸和5mM乙酸铵的水溶液为流动相A，以含0.2wt.％甲酸的水溶液为流动相B，洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B；

质谱：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。

本发明的有益技术效果如下：

本发明选用鱼油虾油膳食补充剂作为检测基质，对鱼油虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的检测提供方便、快捷的前处理方式和高效、准确的检测手段。首次实现国内外关于鱼油虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的检测，在人口老龄化不断增加，保健品市场不断壮大的情况下以期为该领域的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油检测提供参考。

由于3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯在各类加工产品中比3-氯-1，2-丙二醇和缩水甘油的量大得多，所以，目前国内外关于该领域的检测研究80％以上均是检测各类加工产品中的3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯。但是，这些方法一般都是以酯结合态完全水解为游离态为前提，把酯结合态经过水解得到游离态物质并衍生，衍生物通过GC-MS/MS定量。这些方法有一些弊端：首先，3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯的酯类物质繁多，现有方法通过先提取出待测物中以酯类物质存在的3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯，以每一种酯类均以酯水解为100％含量的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油进行假定，而待测物本身又存在游离态的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，现有的测定方式仅测得结合态的3-氯-1，2-丙二醇酯和缩水甘油酯，造成3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油含量的低估。其次，目前对于游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油准确定量检测的文献报道太少，导致大多数的方法甚至包括一些官方检测方法在检测3-氯-1,2-丙二醇酯和缩水甘油酯的时候并不区分出游离态物质，且均以气相色谱串联质谱法进行测定。然而，忽视及不区分游离态实际上是不合理的，通过准确的检测手段来把游离态和结合态完全区分开，分别准确定量是必要的。本发明提供的测定方法则是对于游离态物质的准确定量测定方法，也为之后的结合态的准确定量提供科学有效的方法依据。

附图说明

图1为本发明实施例1的实验操作流程图。

图2为实施例1标准工作溶液中浓度为128ng/mL GC衍生产物的二级质谱图。

图3为实施例1标准工作溶液中浓度为10ng/mL GC-D5衍生产物的二级质谱图。

图4为实施例1中GC和GC-D5标准工作溶液的提取离子流图(GC：XIC：137.08354,136.07581；GC-D5 XIC：137.08354,136.07581)。

图5为实施例1标准工作溶液中浓度为128ng/mL 3-MCPD衍生产物的二级质谱图。

图6为实施例1标准工作溶液中浓度为20ng/mL 3-MCPD-D5衍生产物的二级质谱图。

图7为实施例1中3-MCPD和3-MCPD-D5标准工作液的提取离子流图(3-MCPD m/z:137.08354,136.07581；3-MCPD-D5 m/z：137.08354,136.07581)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

反应溶液的配制：

a、准确称取1.0g(精确至0.01g)对二甲氨基苯酚盐酸盐加入10mL去离子水。得到100mg/mL的对二甲氨基苯酚盐酸盐溶液，避光于-4℃保存。

b、准确称取0.4g(精确至0.01g)NaOH加入10mL去离子水。得到1mol/L的NaOH溶液，于-4℃保存。

pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：

a、准确称取3.58g(精确至0.001g)磷酸氢二钠加入50mL去离子水得到0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液用于配制PBS缓冲液，于-4℃保存；

b、准确称取2.49g(精确至0.001g)磷酸二氢钠加入80mL去离子水得到0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液用于配制PBS缓冲液，于-4℃保存；

c、准确称移取31.5mL 0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液加入68.5mL0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混合摇匀。得到pH＝6.5的PBS缓冲溶液，于-4℃保存。

3-氯-1，2-丙二醇标准储备溶液的配制：

a、称取3-氯-1，2-丙二醇标准物质10mg(精确至0.01mg)，用乙腈溶解，转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。得到1mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。

b、称取内标物3-氯-1，2-丙二醇-D510 mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到2mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。

3-氯-1，2-丙二醇标准工作溶液的配制：

a、移取10μL 1mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到1mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。

b、移取10μL 2mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准储备液，用水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到2mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。

3-氯-1，2-丙二醇标准工作液的配制：

a、3-氯-1，2-丙二醇-D5溶液：准确移取3-氯-1，2-丙二醇-D5标准工作液(2mg/L)适量，加入80mL质量分数为10％的NaCl溶液与20mL纯甲醇的混合溶液作为溶剂溶解3-氯-1，2-丙二醇-D5，得到3-氯-1，2-丙二醇-D5溶液。

b、准确移取3-氯-1，2-丙二醇标准工作溶液(1mg/L)适量，用适量3-氯-1，2-丙二醇-D5内标溶液稀释，标准工作溶液(1mg/L)配制成256ng/mL浓度，并用适量3-氯-1，2-丙二醇-D5内标溶液分别稀释为128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL的系列标准工作液，其中3-氯-1，2-丙二醇-D5的浓度均为20ng/mL。

缩水甘油标准储备溶液的配制：

a、称取缩水甘油标准物质20mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到2mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。

b、取500μL 2mg/mL的缩水甘油转移至10mL容量瓶中，加入9.5mL甲醇混匀，避光于-4℃保存。

c、称取内标缩水甘油-D510 mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到2mg/mL的标准储备溶液，避光于-4℃保存。

缩水甘油标准工作溶液的配制：

a、移取100μL 100μg/mL的缩水甘油标准储备液，用去离子水稀释，转移至10mL容量瓶中并用去离子水定容。得到1mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。

b、移取10μL 2mg/mL的缩水甘油-D5标准储备液，用去离子水稀释，转移至10mL容量瓶中并用水定容。得到2mg/L的标准工作溶液，避光于-4℃保存。

缩水甘油标准工作液的配制：

a、缩水甘油-D5溶液：准确移取缩水甘油-D5标准工作溶液(2mg/L)适量，取80mL质量分数为10％的NaCl溶液和20mL纯甲醇的混合溶液与pH＝6.5的PBS缓冲液按一定比例混合后作为溶剂溶解缩水甘油-D5，得到缩水甘油-D5溶液。

b、准确移取缩水甘油标准工作溶液(1mg/L)适量，用适量缩水甘油-D5溶液稀释，标准工作溶液(1mg/L)配制成256ng/mL浓度，并用适量缩水甘油-D5溶液分别稀释为128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL的系列标准工作液，其中缩水甘油-D5的浓度均为10ng/mL。

实施例1

(1)缩水甘油的测定：

样品中缩水甘油的提取及其衍生物溶液制备：

取1mL虾油(或鱼油)样品，加入40μL 2mg/L的缩水甘油-D5标准工作溶液，继续加入3mL10％的NaCl，摇匀后涡旋混合8min，取2mL下层相加入0.5mL甲醇混合均匀后过C18柱，收集过柱液。取适量过柱液用pH＝6.5的PBS缓冲液1：1稀释，取0.5mL稀释液加入100mg/mL的对二甲氨基苯酚盐酸盐溶液50μL，室温放置30min后，放入60℃烘箱衍生4h。同时做缩水甘油系列标准工作液的衍生反应。

含缩水甘油-D5浓度为10ng/mL和缩水甘油浓度分别为256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL的系列标准工作液得到的标准曲线为y＝0.0415775+0.118085x，判定系数R²＝0.9999。

液相色谱-质谱仪器条件：

a、色谱分析条件：EclipsePlusC18 RRSD色谱柱(3.0x150 mm，1.8μm)；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：4μL；流动相A为水(含0.2wt.％甲酸和5mM乙酸铵)，流动相B为甲醇(含0.2wt.％甲酸)洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B。

b、质谱分析条件：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子FullMS及PRM扫描。

c、监测离子(m/z)：定量离子、定性离子、保留时间和丰度比见表1。

表1 GC和GC-D5的母离子、子离子信息

^a表明该离子用于分析物的定量

定性分析：将样品溶液按照和标准工作液相同的仪器条件进行测定；若试样中检测出的色谱峰的保留时间与缩水甘油色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中定性离子的相对丰度于浓度接近的混合标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围内，可判定样品中存在对应的缩水甘油。

表2定性分析时相对离子丰度的最大允许偏差

定量分析：记录样品溶液和标准工作液中目标化合物和内标物质的定量离子的峰面积，采用内标法进行定量；或使用仪器工作站软件进行定量分析，每份样品均重复测定3次。根据定量分析结果，计算虾油(或鱼油)样品中缩水甘油的含量，检测结果表明，在已检测的样本中，鱼油样品中未检出缩水甘油。虾油真实样中游离缩水甘油的计算结果见表3。

表3虾油真实样中游离缩水甘油(GC)检测情况

(2)3-氯-1,2-丙二醇+缩水甘油的测定：

样品中3-氯-1,2-丙二醇+缩水甘油的提取及其衍生物溶液制备：

取1mL虾油(或鱼油)样品，加入40μL2mg/L的3-氯-1，2-丙二醇-D5标准工作溶液，继续加入3mL10％的NaCl，摇匀后涡旋8min，取2mL下层相加入0.5mL甲醇混合均匀后过C18柱，收集过柱液。取0.5mL过柱液加入100mg/mL的对二甲氨基苯酚盐酸盐溶液50μL，室温放置30min后加入1mol/L的NaOH溶液50μL，然后放60℃烘箱衍生4h。同时做3-氯-1，2-丙二醇系列标准工作液的衍生反应。

含3-氯-1，2-丙二醇-D5浓度为20ng/mL和3-氯-1，2-丙二醇浓度分别为256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL的系列标准工作液得到的标准曲线为y＝0.0567353+0.0571678x，判定系数R₂＝0.9995。

液相色谱-质谱仪器条件：

a、色谱分析条件：EclipsePlusC18RRSD色谱柱(3.0x150mm，1.8μm)；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：4μL；流动相A为水(含0.2wt.％甲酸和5mM乙酸铵)，流动相B为甲醇(含0.2wt.％甲酸)洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B。

b、质谱分析条件：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子FullMS及PRM扫描。

c、监测离子(m/z)：定量离子、定性离子、保留时间和丰度比见表4。

表4 3-MCPD和3-MCPD-D5的母离子、子离子信息

^a表明该离子用于分析物的定量

定性分析：将样品溶液按照和标准工作液相同的仪器条件进行测定；若试样中检测出的色谱峰的保留时间与3-氯-1，2-丙二醇色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中定性离子的相对丰度于浓度接近的混合标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围内，可判定样品中存在对应的3-氯-1，2-丙二醇。

定量分析：记录样品溶液和标准工作液中目标化合物和内标物质的定量离子的峰面积，采用内标法进行定量；或使用仪器工作站软件进行定量分析，每份样品均重复测定3次。根据定量分析结果，计算虾油(鱼油)样品中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的总量，再通过差减法结合表3中各样品中游离缩水甘油的含量，计算出虾油(鱼油)样品中游离3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)的含量，计算结果见表5和表6。

表5鱼油真实样中游离3-氯-1,2-丙二醇检测情况

表6虾油真实样中游离3-氯-1,2-丙二醇检测情况

实施例1的实验操作流程图见图1。

实施例1标准工作溶液中浓度为128ng/mL GC衍生产物的二级质谱图见图2。

实施例1标准工作溶液中浓度为10ng/mL GC-D5衍生产物的二级质谱图见图3。

实施例1中GC和GC-D5标准工作溶液的提取离子流图见图4(GC：XIC：137.08354,136.07581；GC-D5 XIC：137.08354,136.07581)。

实施例1标准工作溶液中浓度为128ng/mL 3-MCPD衍生产物的二级质谱图见图5。

实施例1标准工作溶液中浓度为20ng/mL 3-MCPD-D5衍生产物的二级质谱图见图6。

实施例1中3-MCPD和3-MCPD-D5标准工作溶液的提取离子流图见图7(3-MCPD：XIC：137.08354,136.07581；3-MCPD-D5 XIC：137.08354,136.07581)。

实施例2

回收率与精密度的测定：

方法与实施例1相同，测定结果见表7～表10。

表73-氯-1，2-丙二醇在虾油中的回收率与精密度

表8 3-氯-1，2-丙二醇在鱼油中的回收率与精密度

表9缩水甘油在虾油中的回收率与精密度

表10缩水甘油在鱼油中的回收率与精密度

定量限和检出限：检测限和定量限分别根据峰高约在基线噪音高的3倍和10倍即S/N＝3和S/N＝10时确定。该检测方法在鱼油和虾油3-氯-1，2-丙二醇和缩水甘油检测中均分别能达到检测限为0.0005mg/kg，定量限为0.001mg/kg。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，包括以下步骤：

缩水甘油的测定：以NaCl溶液为提取液提取待测样品中的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，提取后除杂，先加入PBS缓冲溶液，然后加入氨基苯酚类物质进行衍生反应，最后利用液相色谱串联质谱检测衍生后反应液中缩水甘油的含量，计算出待测样品中缩水甘油的含量；

3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定：以NaCl溶液为提取液提取待测样品中的3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油，提取后除杂，先加入氨基苯酚类物质，然后加入NaOH溶液进行衍生反应，最后利用液相色谱串联质谱检测衍生后反应液中3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的总含量，再通过总含量与缩水甘油含量进行差减法计算出待测样品中3-氯-1,2-丙二醇的含量。

2.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，NaCl溶液的质量分数为0～25％，NaCl溶液与待测样品的体积比为3:1。

3.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，除杂为利用C18固相萃取柱去除NaCl提取液中的杂质。

4.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，氨基苯酚类物质为二甲氨基苯酚盐酸盐。

5.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇的测定步骤中，NaOH溶液的浓度为0.4～6.4mol/L。

6.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述缩水甘油的测定步骤中，PBS缓冲溶液的pH值为5～8。

7.根据权利要求1所述的测定鱼油和虾油膳食补充剂中游离3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇和缩水甘油的测定步骤中，液相色谱串联质谱的检测条件如下：

液相色谱：

色谱柱：EclipsePlusC18 RRSD色谱柱；

流速：0.5mL/min；

进样量：4μL；

以含0.2wt.％甲酸和5mM乙酸铵的水溶液为流动相A，以含0.2wt.％甲酸的水溶液为流动相B，洗脱梯度：0-1.5min，1％B；1.5-6min，1％-20％B；6-8.5min，20％-100％B；8.5-10min，100％-1％B；

质谱：HESI离子源，喷雾电压：3200V(+)；鞘气：50arb；辅气：15arb；吹扫气：1arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热温度：400℃；质谱数据获取模式：正离子Full MS及PRM扫描。

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