CN110672755B - 一种基于lc-mc/ms同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学分析检测领域，具体涉及一种基于LC‑MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法；本发明所述的方法包括对样品进行预处理的步骤，所述预处理包括：(1)提取：向样品中加入内标混合溶液后加入提取溶剂，所述的样品与内标混合溶液的固液比为5～15g/mL，所述的样品与提取溶剂的固液比为1：3～5g/mL；所述内标混合溶液包含40～200μg/kg的肾上腺素‑d₃、20～200μg/kg的4‑羟基‑3‑甲氧基扁桃酸‑d₃、80～200μg/kg的3,4‑二羟基扁桃酸‑d₃，所述提取溶剂为乙腈和水的混合液；(2)净化：采用PRiME HLB固相萃取柱。本发明所述的方法能够有效降低基质效应，同时定性和定量检测肾上腺素及其代谢产物；该方法操作简单、灵敏度高、定性能力强、定量准确，在食品安全检测领域具有良好的应用前景。

Description

一种基于LC-MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法

技术领域

本发明涉及化学分析检测领域，具体涉及一种基于LC-MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法。

背景技术

盐酸肾上腺素作为兽用处方药主要用于动物心脏骤停的急救，缓解严重过敏性疾患的症状，与局部麻醉药配伍以延长局部麻醉持续时间等，是一种重要的兽用处方类药物，同时也是一种内源性α和β受体激动剂。由于肾上腺素口服吸收率低，临床上一般采用皮下注射的方式给药，3～5min显效，作用可维持1h。注射给药后，其会迅速被血液和组织中的儿茶酚-O-甲基转移酶和单胺氧化酶代谢失活，转化成代谢物3,4-二羟基扁桃酸、甲氧基肾上腺素和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸，最后经尿液排出体外。因此在对实际样品进行检测中除了原药肾上腺素外，还需关注3,4-二羟基扁桃酸和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸等代谢产物。

中国专利文献CN109828071A公开了一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，包括以下步骤：(1)目标物经水溶液提取后，通过大粒径硅藻土柱可实现水的快速吸附，乙腈作为洗脱液逐级渗入，替换掉水溶液的同时，完成了9种常见注水类药物及代谢物的同步净化、浓缩过程；(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；(3)经Hypersile Gold C18色谱柱，乙腈-水为流动相梯度洗脱，通过采集目标物的高准确度质量数并自动触发二级，从而实现9种目标物的快速筛查；(4)通过基质标准曲线计算待测物浓度。然而由于动物源性食品的基质条件复杂，加之肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的极性大、分子量小，在分析中易导致严重的基质效应，进而造成绝对回收率低；再加之该方法采用外标法定量，使用高分辨质谱进行分析，因此采用上述方法测得的定量结果存在一定误差，尤其是处于定量限附近样品的定量结果偏差会较大；另外该方法仅限于猪肉样品的检测，适用范围小。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于LC-MC/MS(超高效液相色谱串联质谱法)同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法，所述的方法特异性强、灵敏度高、操作简便，可实现对肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸同时定性及定量的检测，在动物源性样品检测中体现出明显的优势。

具体而言，本发明所述的方法包括对样品进行预处理的步骤，所述预处理包括：

(1)提取：向样品中加入内标混合溶液后加入提取溶剂，所述的样品与内标混合溶液的固液比为5～15g/mL，所述的样品与提取溶剂的固液比为1：3～5g/mL；所述内标混合溶液包含40～200μg/kg的肾上腺素-d₃、20～200μg/kg的4-羟基-3-甲氧基扁桃酸-d₃、80～200μg/kg的3,4-二羟基扁桃酸-d₃，所述提取溶剂为乙腈和水的混合液；

(2)净化：采用PRiME HLB固相萃取柱。

作为优选，所述提取溶剂为乙腈-水(80+20，0.2％甲酸)。

作为优选，所述固相萃取柱的柱容量为500mg/6mL。

本发明发现，肾上腺素及其代谢产物由于本身的极性大、分子质量小，所以在质谱检测中易被基质影响，同时肾上腺素在正检测模式下响应高，其两个代谢产物4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸在负模式下相应高，给精准的同时检测肾上腺素及其代谢产物带来了挑战；而本发明经过大量尝试发现，对待测样品进行上述预处理后，再进行高效液相色谱/串联质谱法测定，可以消除基质效应的影响，实现同时准确测定肾上腺素及其代谢产物。

本发明所述的肾上腺素及其代谢产物包括肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸。

本发明所述的肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸的相应内标物的分子结构如下；

通过本发明所述的方法可以同时定性及定量测定肾上腺素及其代谢产物。

为了进一步提升检测的准确性和灵敏性，本发明对高效液相色谱/串联质谱法的条件及其他步骤进行了优化，得到如下优选方案(将各优选方案组合可得本发明较佳实施方式)：

作为优选，高效液相色谱条件：采用SB-Aq色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为0.01％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计：

在第0～2min，所述流动相A的体积由2％递增为20％，所述流动相B的体积由98％递减为80％；

在第2～3min，所述流动相A的体积由20％递增为80％，所述流动相B的体积由80％递减为20％；

在第3～4min，所述流动相A的体积为80％，所述流动相B为20％；

在第4～4.1min，所述流动相A的体积由80％递减为2％，所述流动相B由20％递增为98％；

在第4.1～6min，所述流动相A的体积为2％，所述流动相B为98％。

作为优选，所述流动相的流速为0.3～0.5mL/min。

作为优选，所述色谱柱的柱温为28～32℃。

作为优选，质谱条件：正离子扫描/负离子扫描；采集方式：MRM采集方式；电离电压：4.5kV/-4.5kV；脱溶剂温度：550℃/550.0℃。

作为优选，所述的提取还包括超声或振荡的步骤；所述超声进行18～22min，所述振荡进行8～12min。

作为优选，当所述样品为固体时，在所述超声或振荡后，还包括离心的步骤；所述离心在12000r/min下进行8～12min。

作为优选，所述净化具体为：将经过提取的样品直接通过PRiME HLB固相萃取柱后，用氮气吹干，再用0.01％甲酸水溶液复溶；经0.22μm滤膜过滤后，待测定。

作为优选，本发明所述的方法还包括建立标准曲线的步骤：分别以所述的肾上腺素及其代谢产物的浓度为横坐标，以其相应内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，分别得肾上腺素及其代谢产物的回归方程。

作为优选，本发明所述的方法还包括定量分析的步骤：分别将所述的肾上腺素及其代谢产物与其相应的峰面积比值代入肾上腺素及其代谢产物的回归方程，即得肾上腺素及其代谢产物的相应浓度。

作为本发明的优选实施方式，本发明所述的方法包括如下步骤：

(1)提取：向样品中加入内标混合溶液后加入提取溶剂，所述的样品与内标混合溶液的固液比为5～15g/mL，所述的样品与提取溶剂的固液比为1：3～5g/mL；所述内标混合溶液包含40～200μg/kg的肾上腺素-d₃、20～200μg/kg的4-羟基-3-甲氧基扁桃酸-d₃、80～200μg/kg的3,4-二羟基扁桃酸-d₃，所述提取溶剂为乙腈和水的混合液；

(2)净化：将经过提取的样品直接通过PRiME HLB固相萃取柱后，用氮气吹干，再用0.01％甲酸水溶液复溶；

(3)建立标准曲线；

(4)高效液相色谱/串联质谱测定，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：采用SB-Aq色谱柱，规格为3.0×100mm，1.8μm；

流动相A为0.01％甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

柱温：28～32℃；

进样室温度：3～5℃；

流速：0.3～0.5mL/min；

进样体积：1.5～2.5μL；

采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计：

在第0～2min，所述流动相A的体积由2％递增为20％，所述流动相B的体积由98％递减为80％；

在第2～3min，所述流动相A的体积由20％递增为80％，所述流动相B的体积由80％递减为20％；

在第3～4min，所述流动相A的体积为80％，所述流动相B为20％；

在第4～4.1min，所述流动相A的体积由80％递减为2％，所述流动相B由20％递增为98％；

在第4.1～6min，所述流动相A的体积为2％，所述流动相B为98％；

质谱条件：正离子扫描/负离子扫描；采集方式：MRM采集方式；电离电压：4.5kV/-4.5kV；脱溶剂温度：550℃/550.0℃；

(5)利用标准曲线进行定量分析。

作为优选，所述的样品为动物源性样品；优选为畜肉、禽肉、内脏、牛奶中的一种或几种。

本发明的有益效果：

本发明所述的方法能够有效降低基质效应，同时定性和定量检测肾上腺素及其代谢产物；同时本方法且操作简单、灵敏度高、定性能力强、定量准确，在食品安全检测和兴奋剂检测等领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1是肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸及其相应内标物的MRM色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中所涉及的仪器与试剂如下：水：一级水，乙腈(CH₃CN)：色谱纯，甲酸(HCOOH)：色谱纯，浓盐酸(HCl)：分析纯，提取溶剂：乙腈-水(80+20，0.2％甲酸)；

0.01％甲酸水溶液：量取甲酸0.10mL于1000mL容量瓶中，用水定容，用0.22μm滤膜过滤后备用；

0.1mol/L盐酸溶液：准确量取8.5mL浓盐酸，用水定容至1L；

液相色谱-质谱联用仪；

高速冷冻离心机；

超声波清洗仪；

氮吹仪。

实施例1

本实施例提供一种基于LC-MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法，具体如下：

(1)提取：称取2.5g样品于50mL离心管中，加入0.25mL 1μg/mL的内标混合溶液(包含40～200μg/kg的肾上腺素-d3、20～200μg/kg的4-羟基-3-甲氧基扁桃酸-d3、80～200μg/kg的3,4-二羟基扁桃酸-d3)，然后加入10mL提取溶剂，用涡旋混合器涡旋1min后，将盛有样品的离心管置于超声波清洗仪中超声提取20min或置于涡旋振荡器中振荡提取10min，提取结束后将离心管置于高速冷冻离心机中离心10min(12000r/min)，离心结束后将上清液取出并置于干净容器中；

(2)净化：取3mL上清液直接通过PRiME HLB固相萃取柱于干净的玻璃试管中，然后从中取出2mL于另外一支干净的玻璃试管，氮气快速吹干，用1.0mL 0.01％甲酸水溶液复溶，用0.22μm针式滤器过滤后供高效液相色谱/串联质谱测定。

(3)建立标准曲线：分别准确称取肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸标准品及相应的内标物质适量，置于容量瓶中，用乙腈-水(80+20，0.2％甲酸)混合溶剂溶解，制成标准储备液备用；分别以肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的浓度为横坐标，以肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸与内标的峰面积比为纵坐标，用最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方法即为标准曲线；回归方程及相关系数见表1。

表1肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的保留时间、线性方程及相关系数

(4)高效液相色谱/串联质谱测定，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：采用SB-Aq色谱柱，规格为3.0×100mm，1.8μm；

流动相A为0.01％甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

柱温：30℃；

进样室温度：3～5℃；

流速：0.3mL/min；

进样体积：2μL；

采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计：

在第0～2min，所述流动相A的体积由2％递增为20％，所述流动相B的体积由98％递减为80％；

在第2～3min，所述流动相A的体积由20％递增为80％，所述流动相B的体积由80％递减为20％；

在第3～4min，所述流动相A的体积为80％，所述流动相B为20％；

在第4～4.1min，所述流动相A的体积由80％递减为2％，所述流动相B由20％递增为98％；

在第4.1～6min，所述流动相A的体积为2％，所述流动相B为98％；

质谱条件：正离子扫描/负离子扫描；采集方式：MRM采集方式；电离电压：4.5kV/-4.5kV；脱溶剂温度：550℃/550.0℃；定性离子对、定量离子和碰撞能量见表2。

表2待测物质的定性离子、定量离子和碰撞能量

注：*为定量离子；

(5)定量分析：分别将所述的肾上腺素及其代谢产物与其相应的峰面积比值代入肾上腺素及其代谢产物的回归方程，即得肾上腺素及其代谢产物的相应浓度。

本发明方法的实验验证过程及结果见实验例1；所述肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸及其相应内标物的MRM色谱图见图1。

实验例1实施例1精密度及回收率实验

本实验例利用实施例1的方法分别测定猪肉、猪肝、牛奶、鸡肉中的肾上腺素及其代谢产物；具体如下：

(1)利用实施例1的方法检测猪肉中的肾上腺素及其代谢产物；将每个猪肉样品按照加标浓度(低、中、高三个加标浓度)分别制备6个平行样品，以标准曲线计算质控加标样品的浓度，求得方法的回收率精密度(RSD)，结果见表3；

(2)利用实施例1的方法检测猪肝中的肾上腺素及其代谢产物；将每个猪肝样品按照加标浓度(低、中、高三个加标浓度)分别制备6个平行样品，以标准曲线计算质控加标样品的浓度，求得方法的回收率精密度(RSD)，结果见表4；

(3)利用实施例1的方法检测牛奶中的肾上腺素及其代谢产物；将每个牛奶样品按照加标浓度(低、中、高三个加标浓度)分别制备6个平行样品，以标准曲线计算质控加标样品的浓度，求得方法的回收率精密度(RSD)；其中，对牛奶样品进行提取时不包括离心的步骤；结果见表5；

(4)利用实施例1的方法检测鸡肉中的肾上腺素及其代谢产物；将每个鸡肉样品按照加标浓度(低、中、高三个加标浓度)分别制备6个平行样品，以标准曲线计算质控加标样品的浓度，求得方法的回收率精密度(RSD)；结果见表6；

表3：不同猪肉样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结果

表4不同猪肝样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结果

表5不同牛奶样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结

表6不同鸡肉样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结果

对比例1

本对比例提供一种同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法，具体如下：

(1)提取：称取5g样品于50mL离心管中，加入10mL提取溶剂(将草酸溶于水配制成浓度为8.6g/L的草酸溶液，用氨水调pH至4.0)，振荡、超声各4min，4000r/min下离心4min；

(2)净化：取10mL上清液上填充量为1000mg的硅藻土柱后平衡5min，然取10mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2-3次，收集洗脱液并加入0.5mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20mL；取出10mL，氮吹后用纯水定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，供高分辨质谱测定；

(3)建立标准曲线

(4)测定条件：

色谱柱：Hypersile Gold C18；

流动相A为0.1％甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

柱温：40℃；

流速：0.3mL/min；

进样体积：10μL；

采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计：

在第0～3min，所述流动相A的体积为95％，所述流动相B的体积为5％；

在第3～6min，所述流动相A的体积由95％递减为10％，所述流动相B的体积由5％递增为90％；

在第6～8min，所述流动相A的体积为10％，所述流动相B为90％；

在第8～8.1min，所述流动相A的体积由10％递增为95％，所述流动相B由90％递减为5％；

在第8.1～10min，所述流动相A的体积为95％，所述流动相B为5％；

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-500，分辨率70000，自动增益控制目标值5×105；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸采用负离子模式2700V，其余成分则采用正离子模式3800V，离子传输管温度为300℃，鞘气压35arb，辅助气压10arb，气化室温度350℃；二级采用自动触发模式，分辨率35000，自动增益控制目标值2×105，碰撞能量范围25％～40％，保留时间采集范围：根据色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0min。

(4)浓度计算方法：

样品中肾上腺素及其代谢产物的含量根据如下计算公式得到：X＝2*C*V/m；

式中，X-试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C-试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V-定容体积，单位为mL；

m-试样体积或质量，单位为g。

实验例2对比例1的精密度及回收率实验

本实验例利用对比例1的方法测定猪肉中的肾上腺素及其代谢产物；将每个猪肉样品按照加标浓度(低、中、高三个加标浓度)分别制备6个平行样品，以标准曲线计算质控加标样品的浓度，求得方法的回收率精密度(RSD)，结果见表7；

表7不同猪肉样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结果

实验结果与分析

实施例1与对比例1的方法测定猪肉中的肾上腺素及其代谢产物的对比如表8；

表8不同猪肉样品加标浓度下，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸的回收率和精密度试验结果对比

由表8可知，实施例1在各加标水平下三种物质的回收率均明显高于对比例1，且实施例1检测结果的精密度也高于对比例1。可见，本发明所述的方法能够更加精准的定量及定性测定动物源性食品中肾上腺素及其代谢产物(3,4-二羟基扁桃酸和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸)，况且本发明所述的方法基于LC-MS/MS即可快速完成检测，为食品安全检测和兴奋剂检测提供了有效地分析方法。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种基于LC-MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取：向样品中加入内标混合溶液后加入提取溶剂，所述的样品与内标混合溶液的固液比为5~15 g/mL，所述的样品与提取溶剂的固液比为1：3~5 g/mL；所述内标混合溶液包含40~200 μg/kg的肾上腺素-d₃、20~200 μg/kg的4-羟基-3-甲氧基扁桃酸-d₃、80~200 μg/kg的3,4-二羟基扁桃酸-d₃，所述提取溶剂为乙腈和水的混合液；

（2）净化：将经过提取的样品直接通过PRiME HLB固相萃取柱后，用氮气吹干，再用0.01%甲酸水溶液复溶；

（3）建立标准曲线；

（4）高效液相色谱/串联质谱测定，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：采用SB-Aq色谱柱，规格为3.0×100 mm，1.8 μm；

流动相A为0.01%甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

柱温：28~32℃；

进样室温度：3~5℃；

流速：0.3~0.5 mL/min；

进样体积：1.5~2.5 μL；

采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100%计：

在第0~2min，所述流动相A的体积由2%递增为20%，所述流动相B的体积由98%递减为80%；

在第2~3min，所述流动相A的体积由20%递增为80%，所述流动相B的体积由80%递减为20%；

在第3~4min，所述流动相A的体积为80%，所述流动相B为20%；

在第4~4.1min，所述流动相A的体积由80%递减为2%，所述流动相B由20%递增为98%；

在第4.1~6min，所述流动相A的体积为2%，所述流动相B为98%；

质谱条件：正离子扫描/负离子扫描；采集方式：MRM采集方式；电离电压：4.5 kV/-4.5kV；脱溶剂温度：550℃/550.0℃；

（5）利用标准曲线进行定量分析；

其中，所述的样品为畜肉、禽肉、内脏、牛奶中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取还包括超声或振荡的步骤；所述超声进行18~22 min，所述振荡进行8~12 min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述样品为固体时，在所述超声或振荡后，还包括离心的步骤；所述离心在12000 r/min下进行8~12 min。

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