CN110618221B - 一种水产品中脱氢胆酸的检测方法 - Google Patents

一种水产品中脱氢胆酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水产品中添加剂的检测方法，具体是涉及一种水产品中脱氢胆酸的检测方法，配制标准溶液，乙酸铵缓冲盐溶液浸泡水产品样品，加入β‑葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解过夜，乙酸乙酯提取目标物，氮吹浓缩至干后甲醇定容，以液相色谱‑三重四极杆质谱联用仪检测，采用外标法定量，所得标准曲线的相关系数R2＞0.999，脱氢胆酸在1、2、5、10和50ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系，对脱氢胆酸的仪器检测限为0.117μg/kg，本方法具有快速简便，灵敏准确，环保廉价的特点，对水产品中脱氢胆酸残留检测具有实际应用、指导意义，回收率、重复性、灵敏度和检测限均满足水产品出口韩国的检测限要求。

Description

一种水产品中脱氢胆酸的检测方法
技术领域
本发明涉及一种水产品中添加剂的检测方法，具体是涉及一种水产品中脱氢胆酸的检测方法。
背景技术
脱氢胆酸是一种胆汁酸，胆汁酸是动物体内胆固醇代谢过程中所产生的一系列固醇类物质，因为主要经由胆囊和胆汁一起排汇到肠道中，并具有酸性，因此统称为胆汁酸。不同动物的胆汁酸种类和数量都不相同。胆汁酸具有表面活性作用，因为它的分子结构有两性，一端为烷基，具有亲酯性，可以和油脂类结合，另一端为羟基和羧基，具有亲水性。因此，在动物体内胆汁酸最重要的功能是消化食物中的脂肪和脂溶性物质(脂溶性维生素和胆固醇等)。其次，胆汁酸具有提高动物免疫力，减少动物体内细菌内毒素吸收量的功能。胆汁酸还是一种有效的杀菌剂，通过抑制大肠杆菌，能够预防气胀与腹肿胀等疾病。脱氢胆酸还可促进肝细胞分泌大量稀薄的胆汁，增加胆汁容量，使胆道畅通，消除胆汁淤滞，起到利胆作用。对脂肪的消化和吸收也有一定的促进作用。综上所述，饲料中添加胆汁酸可以促进水产品健康养殖，提高经济效益，但同时，过量的胆汁酸会在水产品体内蓄积、残留，而人类食用含有胆汁酸，如脱氢胆酸的水产品，可有嗳气、打嗝、腹泻、恶心、肌痉挛、直肠区周围皮肤刺激等不良反应，如果是长期食用或一时摄入量过多，可导致电解质失衡，甚至可出现呼吸困难、心跳骤停、心律紊乱、肌痉挛、极度疲乏无力等严重反应。
韩国食药监局对水产品中的脱氢胆酸制定了残留限量标准，规定水产品中的脱氢胆酸不得超过0.01mg/kg；并对来自中国的水产品进行了脱氢胆酸残留的检测，其中2018年1月起到2019年8月，中国共有2个批次的水产品被检出脱氢胆酸残留不合格，且均是在2019年7月、8月连续发现，造成了较大的经济损失。相反，我国在水产品中脱氢胆酸的检测尚无标准方法，国内外的检测方法也基本没有，因此急需建立一套灵敏、准确、快速的水产品中脱氢胆酸残留检测方法，为出口韩国水产品的脱氢胆酸残留检测提供技术手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种水产品中脱氢胆酸的检测方法，回收率、重复性、灵敏度和检测限均满足水产品出口韩国的检测限要求。
本发明的技术方案如下：
一种水产品中脱氢胆酸的检测方法，包括以下步骤，
S1、配制标准品：将脱氢胆酸标准品用甲醇溶解配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，将所述标准储备溶液用甲醇稀释成浓度为100ng/mL标准工作溶液；
S2、标准溶液配制：分别吸取步骤S1所述的标准工作溶液10、20、50、100、500μL于2mL离心管中，甲醇定容到1.0mL，过滤，得到系列标准溶液；
S3、样品前处理：水产品样品取可食部分搅碎后，加入乙酸铵缓冲溶液和β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混匀，酶解；酶解后放置至室温，加入乙酸乙酯，涡旋提取，离心，移取上层有机相，再在下层水相中加入乙酸乙酯，涡旋提取，离心，合并有机相，氮吹浓缩至干，加入甲醇定容，过滤，得到滤液；
S4、检测：将步骤S2的系列标准溶液和步骤S3的滤液分别注入液相色谱-三重四极杆质谱联用仪中进行定量和/或定性分析测试。
优选的，步骤S2中所述过滤为采用平均孔径0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤。
优选的，步骤S3中所述样品前处理的具体步骤为，水产品取可食部分搅碎后，准确称取2g于50mL离心管，加入8mL乙酸铵缓冲溶液，再加入100μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于恒温振荡器37℃下水浴振荡16h酶解；酶解后放置至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，移取上层有机相，再在下层水相中加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，合并有机相，氮吹浓缩至干，加入1.0mL甲醇定容，一次性注射器吸取过滤，获得滤液。
更优选的，所述乙酸铵缓冲溶液中乙酸铵的浓度为15.4g/L，乙酸铵缓冲溶液的pH为5.2。
更优选的，所述过滤为采用平均孔径0.22μm的PTFE滤膜过滤。
优选的，步骤S4中所述液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的测试条件为：
1)液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18柱(2.1mm×100mm，2.6μm)；柱温：35℃；流速：0.25mL/min；进样量：5μL；
流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相A和流动相B按体积比40:60进行等度洗脱，时间为7分钟；
2)质谱条件
离子源：电喷雾电离源；离子源温度：325℃；毛细管电压：4000V；鞘气温度：350℃；
质谱扫描信息为：定量离子对为401.1/330.9，碰撞能30V，源内碎裂电压140V；定性离子对为401.1/249.0，碰撞能35V，源内碎裂电压140V。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供一种水产品中脱氢胆酸的检测方法，对脱氢胆酸的仪器检测限为0.117μg/kg，在2倍浓缩条件下的脱氢胆酸方法检测限为0.059μg/kg；对照品的曲线方程相关系数R2＞0.999，脱氢胆酸在1、2、5、10、50ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系。本发明灵敏度高、准确性好。
(2)在脱氢胆酸的提取溶剂的选择中经过大量的测试，发现使用乙酸乙酯具有较好的提取效果，目标物峰形好，回收率高。
说明书附图
图1为本发明采用外标法定量，所得标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围。
图2为脱氢胆酸浓度为1ng/mL下的信噪比。
图3为脱氢胆酸的质谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
如无特别指明，以下实施方案中的份数都为重量份数。
实施方式
一、仪器、试剂和材料
脱氢胆酸标准品(纯度99.04％，Stanford Analytical Chemicals Inc.)；
β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(上海安谱实验科技有限公司)；
乙酸铵(≥98.0％，西陇科学股份有限公司)；
乙酸(≥99.8％，国药集团化学试剂有限公司)；
乙酸铵缓冲溶液(称取15.4g乙酸铵，用超纯水定容至1L，用适量乙酸调节pH至5.2)；
乙酸乙酯、甲醇、乙腈(色谱纯，德国Sigma公司)；
IKA MS3Digital旋涡混匀器数显型、恒温振荡器(常州国华电器有限公司)；
氮吹仪(上海安谱实验科技有限公司)；
锐思捷Unique+UV实验室多功能纯水-超纯水系统(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；
安捷伦6460液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Agilent公司)。
0.22μm PTFE针头式过滤器(天津津腾)。
二、测试过程
(1)配制标准品：将脱氢胆酸标准品用甲醇溶解配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，将所述标准储备溶液用甲醇稀释成浓度为100ng/mL标准工作溶液；
(2)标准溶液配制：分别吸取(1)中所述的标准工作溶液10、20、50、100、500μL于2mL离心管中，甲醇定容到1.0mL，采用平均孔径0.22μm PTFE针头式过滤器过滤，得到系列标准溶液；
(3)样品前处理：水产品取可食部分搅碎后，准确称取2g于50mL离心管，加入8mL乙酸铵缓冲溶液，再加入100μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于恒温振荡器37℃下水浴振荡16h酶解；酶解后放置至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，移取上层有机相，再在下层水相中加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，合并有机相，氮吹浓缩至干，加入1.0mL甲醇定容，一次性注射器吸取，采用平均孔径0.22μm PTFE针头式过滤器过滤，获得滤液；
(4)检测：将(2)中的系列标准溶液和(3)中的滤液分别注入液相色谱-三重四极杆质谱联用仪中进行定量和/或定性分析测试。
液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的测试条件为：
1)液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18柱(2.1mm×100mm，2.6μm)；柱温：35℃；流速：0.25mL/min；进样量：5μL；
流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相A和流动相B按体积比40:60进行等度洗脱，时间为7分钟；
2)质谱条件
离子源：电喷雾电离源；离子源温度：325℃；毛细管电压：4000V；鞘气温度：350℃；
质谱扫描信息为：定量离子对为401.1/330.9，碰撞能30V，源内碎裂电压140V；定性离子对为401.1/249.0，碰撞能35V，源内碎裂电压140V。
图1为本发明采用外标法定量，所得标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围。
图2为脱氢胆酸浓度为1ng/mL下的信噪比。
以10倍信噪比时相应浓度确定检测低限，见表1；本发明方法对脱氢胆酸的仪器检测限为0.117μg/kg；在2倍浓缩条件下的脱氢胆酸方法检测限为0.059μg/kg，说明该方法灵敏度高，能够满足水产品中脱氢胆酸残留的检测需求。
表1检测低限与定量限
Figure BDA0002255651350000051
实施例
以市售的三种水产品黄鱼鱼肉、对虾虾肉和牡蛎肉作为测试对象，分别加标2μg/kg和10μg/kg，同时做平行试验(n＝6)，测定回收率及RSD见表2。结果显示，在两个加标浓度条件下脱氢胆酸的回收率在80.15％～103.33％，相对标准偏差RSD(n＝6)在2.93％～5.42％。测定结果满足出口韩国水产品的要求。
表2加标回收率
Figure BDA0002255651350000052
应用本检测方法，国内2个批次的水产品被韩国检出脱氢胆酸残留不合格的样品，脱氢胆酸的检测含量在0.001～0.004mg/kg，结果如表3所示。
表3 2个批次水产品的检测结果
Figure BDA0002255651350000053
以上所述，显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例仅为本发明的较佳实施例而已，不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一种水产品中脱氢胆酸的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，S1、配制标准品：将脱氢胆酸标准品用甲醇溶解配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，将所述标准储备溶液用甲醇稀释成浓度为100ng/mL标准工作溶液；
S2、标准溶液配制：分别吸取步骤S1所述的标准工作溶液10、20、50、100、500μL于2mL离心管中，甲醇定容到1.0mL，过滤，得到系列标准溶液；
S3、样品前处理：水产品样品取可食部分搅碎后，加入乙酸铵缓冲溶液和β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混匀，酶解；酶解后放置至室温，加入乙酸乙酯，涡旋提取，离心，移取上层有机相，再在下层水相中加入乙酸乙酯，涡旋提取，离心，合并有机相，氮吹浓缩至干，加入甲醇定容，过滤，得到滤液；
S4、检测：将步骤S2的系列标准溶液和步骤S3的滤液分别注入液相色谱-三重四极杆质谱联用仪中进行定量和定性分析测试；
所述液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的测试条件为：
1)液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18柱；柱温：35℃；流速：0.25mL/min；进样量：5μL；
流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相A和流动相B按体积比40:60进行等度洗脱，时间为7分钟；
2)质谱条件
离子源：电喷雾电离源；离子源温度：325℃；毛细管电压：4000V；鞘气温度：350℃；
质谱扫描信息为：定量离子对为401.1/330.9，碰撞能30V，源内碎裂电压140V；定性离子对为401.1/249.0，碰撞能35V，源内碎裂电压140V。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤S2中所述过滤为采用平均孔径0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤S3中所述样品前处理的具体步骤为，水产品取可食部分搅碎后，准确称取2g于50mL离心管，加入8mL乙酸铵缓冲溶液，再加入100μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于恒温振荡器37℃下水浴振荡16h酶解；酶解后放置至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，移取上层有机相，再在下层水相中加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取，4500r/min离心5min，合并有机相，氮吹浓缩至干，加入1.0mL甲醇定容，一次性注射器吸取过滤，获得滤液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述乙酸铵缓冲溶液中乙酸铵的浓度为15.4g/L，乙酸铵缓冲溶液的pH为5.2。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述过滤为采用平均孔径0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤。
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