CN113311094A

CN113311094A - 一种液相色谱串联质谱法同时检测保健食品中雄激素化合物的方法

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Publication number: CN113311094A
Application number: CN202110744002.1A
Authority: CN
Inventors: 刘猛; 李秀萍; 李晓娜; 宿艳; 万慧慧
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113311094B

Abstract

本发明公开了一种液相色谱串联质谱法测定保健食品中雄激素化合物的方法，属于保健食品安全检测技术领域。包括以下步骤(1)超声提取；(2)涡旋离心萃取；(3)液相色谱‑串联质谱检测。本发明以乙腈为提取溶剂，涡旋，离心萃取，将保健食品中的雄激素化合物富集到有机相溶液中，之后上清液经氮吹浓缩后用乙腈复溶，利用液相色谱‑串联质谱多反应监测模式检测，内标法定量。该方法操作简便，灵敏度高，能同时检测保健食品中10种雄激素化合物。

Description

一种液相色谱串联质谱法同时检测保健食品中雄激素化合物的方法

技术领域

本发明属于保健食品质量安全检测技术领域，涉及一种液相色谱串联质谱法同时检测保健食品中雄激素化合物的方法。

背景技术

雄激素化合物(雄激素)为十九碳类固醇激素，主要产生于雄性动物睾丸中或少许分泌于雄性动物的肾上腺皮质上。在哺乳动物中，雄激素主要作用于雄性器官，以维持性功能和促进动物生长发育、维持性功能和第二性征，具有一定的蛋白质同化作用。雄激素受脑垂体和下丘脑调节，二者相互联系、相互制约，共同调节并控制动物生殖活动。除此之外，雄激素还能够明显地加速全身各种蛋白质的合成，能使肌肉发达，增加体重；同时减少氨基酸分解，使尿素生成减少减轻氮质血症。雄激素在动物界中广泛分布，激素以睾酮、雄烯二酮等为主要代表，此外还有部分人工合成的酯化、甲氧基化或氟取代的衍生物较为常见。

保健食品，是指具有特定保健功能或能补充维生素、矿物质的食品，适宜于特定人群食用，不以治疗疾病为目的，不对人体产生任何急性、亚急性或慢性危害。不法商贩为了达到其宣称的保健功效，在保健食品中非法添加化学药物，不可避免地会危害人体健康。近年来出现了许多增强体力、改善生长发育类的保健食品，除了添加以西地那非为代表的磷酸二酯酶5抑制剂以外，添加雄性激素类药物的情况也时有发生。

雄激素及同化激素类药物可促进机体内脂肪的堆积，导致机体内脂肪重新分布、血脂升高，造成向心性肥胖，严重者可以诱发心血管疾病；摄入的食品中含雄激素及同化激素残留，长期以往可产生负反馈作用等，造成机体的正常生理水平失衡而呈现不良后果，严重者可发生心率衰竭等病症：除此之外，该类激素过多可造成内分泌系统相关肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷、生育缺陷及不孕不育等，给人体健康及人类繁衍带来不良影响。

保健食品基质相对复杂，且雄激素残留量极低，因此对雄激素残留的检测方法、灵敏度等均有较高要求。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明提供了一种快速、简便、灵敏度高的保健食品中雄激素化合物的测定方法，以实现保健食品中雄激素的同时定性及定量检测。

为实现以上目的，技术方案如下：

一种液相色谱串联质谱法同时检测保健食品中雄激素化合物的方法，包括以下步骤：

(1)提取：向待测样品中加入同位素内标混合溶液和乙腈后，超声提取。

(2)涡旋离心萃取：样品液涡旋混合后离心，取上层乙腈溶液，加热氮吹浓缩至一定体积，加乙腈定容。

(3)液相色谱串联质谱检测：定容后的溶液经0.22μm有机滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测，绘制标准工作曲线，内标法定量，根据峰面积计算雄激素的浓度。

进一步地，雄激素化合物碳原子数为19个的类固醇激素。

进一步地，所述雄激素化合物为1,4-雄烯二酮、17α-群勃龙、群勃龙、雄烯二酮、诺龙、勃地酮、17α-勃地酮、睾酮、甲睾酮和司坦唑醇。

进一步地，步骤(1)包括：

口服液：量取待测口服液于离心管中，加入1μg/mL的同位素内标混合溶液50μL，加乙腈9mL，超声混合10-15min；

片剂、胶囊：称取试样于离心管中，加入1μg/mL的同位素内标混合溶液50μL，加乙腈10mL，超声混合10-15min。

进一步地，步骤(1)所述同位素内标混合溶液为含有相同体积比的睾丸酮-D3和康力龙-D3混合液，加甲醇-水混合溶液定容，其中，甲醇与水体积比为1：1。

进一步地，步骤(2)中，步骤(2)所述涡旋离心萃取的过程为：涡旋振荡10-15min，在4℃-10℃下8000-10000r/min离心10-15min，取上层乙腈溶液于另一个试管中，在25℃-40℃水浴中氮吹后用乙腈定容至1mL。

进一步地，步骤(2)中，所述氮吹至一定体积为1mL。

进一步地，步骤(3)中，

色谱条件为：采用X Bridge C₁₈柱(150mm×2.1mm，5μm)分离，流动相：A相0.1％甲酸乙腈；B相：0.1％甲酸水；柱温25℃，进样体积10μL，流速0.2mL/min；梯度洗脱：0～15min，90％B～0％B；15min～20min，0％B；20min～21min，0％B～90％B；21min～31min，90％B。

质谱条件为：ESI⁺电离模式；检测方式：多反应监测(MRM)；鞘气：40Unit；辅助气：10Unit；蒸发器温度：250℃；毛细管温度：350℃；电喷雾电压：2500V。

本发明的有益效果在于：

(1)采用乙腈超声提取，操作简单，耗时短，检测效果好，并能够有效降低基质对液相色谱串联质谱测定过程的干扰。

(2)采用液相色谱串联质谱法进行多反应监测，具有较高的准确度和灵敏度。

(3)本发明操作简单，准确灵敏，能同时定性和定量分析保健食品中10种雄激素化合物。

附图说明

图1为10种雄激素的MRM色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1一种液相色谱串联质谱法同时检测保健食品中雄激素化合物的方法

1.仪器、材料及溶液配制

1.1仪器与材料

液相色谱-串联质谱仪(TSQ Quantum Ultra，美国赛默飞公司)；雄激素化合物标准物质(100μg/mL，1mL，河南省万佳标准物质中心)；雄激素化合物对应系列同位素内标物质(100μg/mL，1mL，河南省万佳标准物质中心)。

本发明所使用的甲醇、乙腈、乙酸铵为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2标准溶液配制

雄激素混合标准溶液配制：将500μg/L的雄激素混合标准溶液用甲醇-水确认及其比例溶液稀释，配成浓度依次为1μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L的混合系列标准工作溶液，于-18℃环境下避光保存。

同位素内标混合溶液配制：将100μg/mL的同位素内标混合标准溶液用甲醇-水溶液稀释，配制成1μg/mL的内标混合溶液，于-18℃环境下避光保存。

含有同位素内标的雄激素混合系列标准溶液配制：吸取雄激素标准物质及同位素内标混合溶液，用甲醇-水溶液稀释配成雄激素浓度分别为1μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，以及同位素内标浓度为50μg/L的混合系列标准溶液，于-18℃环境下避光保存。

2.仪器条件

2.1色谱条件

色谱柱：X Bridge C₁₈柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相：A相0.1％甲酸乙腈；B相：0.1％甲酸水；柱温25℃，进样体积10μL，流速0.2ml/min；梯度洗脱：0～15min，90％B～0％B；15min～20min，0％B；20min～21min，0％B～90％B；21min～31min，90％B。

2.2质谱条件

采用ESI⁺电离模式；检测方式：多反应监测(MRM)；鞘气：40Unit；辅助气：10Unit；蒸发器温度：250℃；毛细管温度：350℃；电喷雾电压：2500V。MRM监测模式下10种雄激素的液相色谱-串联质谱参数如表1。

表1目标化合物的多反应监测质谱参数

^*定量离子

3.实验方法

以空白保健食品试样进行加标回收和精密度实验，以不同浓度的雄激素混合标准溶液作为回收率指示物，添加水平分别为1μg/L、5μg/L和20μg/L，对应同位素内标浓度均为50μg/L，每个添加浓度准备6个平行样，同位素内标与雄激素混合标准溶液均在样品前处理前加入。实验过程如下：

口服液：量取1mL待测口服液于50mL聚丙烯离心管中，加入500μg/L的雄激素标准混合液40μl，加入1μg/mL的同位素内标混合溶液50μl，加乙腈9mL，超声混合10min。片剂、胶囊：称取1.0g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入500μg/L的雄激素标准混合液40μl，加入1μg/mL的同位素内标混合溶液50μl，加乙腈10mL，超声混合10min。

涡旋10min，之后在8000r/min离心10min。取上层乙腈溶液于另一个试管中，在40℃水浴中氮气吹至微湿，加乙腈至1mL定容。

定容后的溶液吸入1mL注射器，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以保留时间和特征离子对定性，内标法定量，根据峰面积计算雄激素的浓度。

4.结果分析

4.1分析方法线性范围及检出限

将上述10种雄激素标准混合物溶液的质量浓度设置为1～500μg/L，采用内标法，以待测物的质量浓度作为横坐标，以待测物定量离子峰面积与内标物峰面积之比作为纵坐标，绘制标准曲线；此外，利用上述方法在提取后的空白保健食品样品中加入10种雄激素的混合标准溶液及同位素内标混合溶液，进行仪器检测，以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。10种雄激素的线性方程、相关系数如表2所示。口服液中本方法1,4-雄烯二酮、睾酮、司坦唑醇3种雄激素化合物检出限为0.001μg/L，定量限为0.005μg/L；雄烯二酮、诺龙、17α-勃地酮3种雄激素化合物检出限为0.005μg/L，定量限为0.01μg/L；17α-群勃龙、群勃龙、勃地酮、甲睾酮4种雄激素化合物检出限为0.01μg/L，定量限为0.05μg/L。片剂及胶囊中本方法10种雄激素化合物检出限均为0.001μg/L，定量限为0.005μg/L。

表2线性方程及相关系数

目标物	线性方程	相关系数(R<sup>2</sup>)
			1,4-雄烯二酮	Y＝-0.210019+0.0878853*X	0.9997
17α-群勃龙	Y＝-0.0350763+0.0200481*X	0.9996
			群勃龙	Y＝0.01847+0.0201561*X	0.9999
雄烯二酮	Y＝-0.0919469+0.022192*X	0.9997
			诺龙	Y＝-0.0511643+0.0133737*X	0.9994
勃地酮	Y＝0.00162883+0.0680046*X	0.9999
			17α-勃地酮	Y＝-0.180928+0.0546369*X	0.9995
睾酮	Y＝-0.0107894+0.0239142*X	0.9999
			甲睾酮	Y＝-0.0527558+0.0213866*X	0.9996
司坦唑醇	Y＝-0.0531726+0.0170172*X	0.9996

4.2方法回收率和精密度结果

以空白保健食品为样品基质，分别在1μg/L、5μg/L和20μg/L含量水平上添加雄激素的混合标准溶液，按上述方法测定并计算回收率，每个添加水平测定6个平行样品，利用上述实验方法进行回收率实验。结果如表3-表5，显示在空白保健食品样品中雄激素的回收率在81.3％～119.6％之间，相对标准偏差(RSD)小于20％。以上实验结果表明本检测方法的回收率高，结果可靠，适用于保健食品中10种雄激素的同时检测。

表3口服液类保健食品中雄激素化合物的添加回收率和精密度(n＝6)

表4片剂类保健食品中雄激素化合物的添加回收率和精密度(n＝6)

表5胶囊类保健食品中雄激素化合物的添加回收率和精密度(n＝6)