CN112285243B - 一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方法及其应用 - Google Patents

一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方法及其应用，处理方法包括将动物组织样品与EDTA缓冲溶液进行混合，得到混合溶液；将提取溶剂和盐析试剂加入混合溶液中进行混合，得到提取物上清液；将提取物上清液、净化剂加入净化管中进行混合、离心，得到净化的提取物上清液；去除提取物净化上清液中的杂质，得到待测样品。通过上述方法有效的去除了样品中的金属离子、脂质等大分子和单糖等极性小分子的基质干扰，大大提高了检测的灵敏度。同时，本申请还提供了一种动物组织中药物残留的确证检测方法，实现了多类别药物的同时测定，能在短时间内快速准确的完成多种药物的定性、定量分析，满足实际检测的时效性要求。

Description

一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方 法及其应用
技术领域
本申请涉及食品安全检测领域，具体而言，涉及一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方法及其应用。
背景技术
随着畜牧养殖业进一步向集约化和规模化发展，养殖动物的规模和密度不断增加，动物疫病的发病率也呈现升高趋势。在动物疫病防控过程中，兽药对于降低发病率和死亡率，提高饲料利用率，提高动物生长性能，改善畜禽产品品质方面发挥十分重要的作用，已成为畜牧养殖生产中不可缺少的农业投入品。但是，在实际生产中存在兽药使用不严格执行休养期、多种药物混合使用和超剂量使用以及非兽药误用和滥用的现象，导致动物组织中药物残留超标，产生食品安全隐患，进而威胁消费者健康。因此，制定动物组织中药物残留检测方法标准对于保障食品安全具有重要现实意义。
根据目前发展水平及各类药物性质，针对动物组织中药物残留检测的现有分析技术主要是高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳法(CE)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等，这些检测方法因自身存在的一些局限性，适用的药物测定范围有限。此外，由于不同种类间药物的化学性质差别较大，采用以上检测技术也很难实现多类别药物的同时测定，并且测定过程繁杂，耗费时间较长，不利于复杂样本的大规模筛查。
现有的动物组织中药物残留检测方法前处理步骤繁琐，消耗时间长，实验耗材昂贵，在影响了检测工作效率同时消耗了大量时间和经济成本。同时，由于现有方法无法有效降低基质效应的影响，导致检测结果准确性不高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种动物组织样品的处理方法，以改善采用现有的前处理方法处理样品存在的检测结果准确性不高的问题。
本申请的另一个目的在于提供一种动物组织中药物残留的确证检测方法，从而实现多类别药物的同时测定，能在短时间内快速准确地完成多种药物的定性定量分析，满足实际检测的时效性要求。
本申请的另一个目的在于提供一种上述动物组织中药物残留的确证检测方法在检测甾体激素类药物、抗组胺类药物、解热镇痛类药物和抗菌抗虫类药物中的应用。
本申请是采用以下技术方案实现的：
在第一方面，本申请提供了一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法，包括：
S1将动物组织样品与EDTA缓冲溶液进行混合，得到混合溶液；
S2将提取溶剂和盐析试剂加入到混合溶液中进行混合，得到提取物上清液；
S3将提取物上清液、净化剂加入到净化管中进行混合、离心，得到净化的提取物上清液；
S4去除提取物净化上清液中的杂质，得到待测样品；
其中，盐析试剂为Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，净化管为活化的Bond Elut EMR-Lipids净化管，净化剂为石墨化碳黑。
进一步地，在本申请较佳实施例中，动物组织包括肌肉和内脏。
进一步地，在本申请较佳实施例中，畜、禽、水产动物组织。
进一步地，在本申请较佳实施例中，动物组织为动物组织经过匀浆处理后的均匀样品。
进一步地，在本申请较佳实施例中，EDTA缓冲溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠-EDTA二钠缓冲溶液，优选EDTA缓冲溶液中包括：8.4重量份柠檬酸、7.1重量份磷酸氢二钠、19.5重量份乙二胺四乙酸二钠和650重量份水。
进一步地，在本申请较佳实施例中，步骤S2包括：
S21将混合溶液与提取溶剂混合后，加入盐析试剂混合，静置，得到混合提取溶液；
S22将混合提取溶液离心处理，得到提取物上清液；
其中，离心处理的离心温度为0-8℃，优选为4-6℃，离心速度为7000-10000r/min，优选为8000-9000r/min，离心时间为5-15min，优选为8-10min；和/或，提取溶剂为乙腈、酸化乙腈中的一种。
进一步地，在本申请较佳实施例中，步骤S3包括：
S31将超纯水加入净化管中进行活化处理，得到活化的净化管；
S32将提取物上清液加入活化的净化管与净化剂混合，得到净化混合溶液；
S33将净化混合溶液进行离心处理，得到净化的提取物上清液；
其中，离心处理的离心温度为0-8℃，优选为4-6℃，离心速度为7000-10000r/min，优选为8000-9000r/min，离心时间为5-15min，优选为8-10min。
在第二方面，本申请提供了一种动物组织中药物残留的确证检测方法，包括：采用液相色谱-质谱联用法对动物组织样品进行检测；
其中，按照上述动物组织样品的处理方法处理动物组织样品；液相色谱-质谱联用法采用多反应监测MRM模式对目标化合物的碎片离子进行监测，以化合物保留时间、两对母离子/子离子特征对目标药物的碎片离子进行定性或定量分析。
进一步地，在本申请较佳实施例中，检测时的液相色谱条件为：色谱柱：ZORBAXEclipse Plus C18(3.0×150mm，1.8μm)；流动相A为含0.2％甲酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.2％甲酸甲醇溶液；流速：0.5ml/min；柱温：40℃±5℃；进样量：5μl-20μl，优选为10μl。
进一步地，在本申请较佳实施例中，检测时的四级杆串联质谱条件为：离子源：ESI+；扫描方式：MRM；干燥器流速：7L/min；鞘气温度：325℃；鞘气流速：11L/min；雾化气压力：35psi；毛细管电压：3500V(+)；喷嘴电压：300(+)。
在第三方面，一种上述动物组织中药物残留的确证检测方法在检测甾体激素类药物、抗组胺类药物、解热镇痛类药物和抗菌抗虫类药物中至少一种的应用。
进一步地，在本申请较佳实施例中，甾体激素类药物包括阿氯米松双丙酸酯、安西奈德、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松双丙酸酯、布地奈德、醋酸氯地孕酮中的一种或多种；和/或，抗组胺类药物包括阿司咪唑、溴苯那敏、西替利嗪、氯苯那敏、氯丙嗪、赛庚啶中的一种或多种；和/或，解热镇痛类药物包括氨基比林、萘普生、对乙酰氨基酚、非那西汀中的一种或多种；和/或，抗菌抗虫类药物包括甲苯噻嗪、甲硫氧嘧啶、青霉素G、青霉素V、阿洛西林、喹乙醇、常山酮、氯羟吡啶中的一种或多种。
与现有技术相比，本申请的较佳实施例提供的一种动物组织样品的处理方法、检测方法及其应用的有益效果包括：
本申请提供一种动物组织样品的处理方法，在处理过程中加入EDTA缓冲溶液，将Bond Elut EMR-Lipids和石墨化碳黑结合使用，有效地去除了样品中的金属离子、脂质等大分子和单糖等极性小分子的基质干扰，大大提高了检测的灵敏度。同时，本申请还提供了一种动物组织中药物残留的确证检测方法，实现了多类别药物的同时测定，能在短时间内快速准确的完成多种药物的定性定量分析，满足实际检测的时效性要求。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图也属于本申请的保护范围。
图1为本申请的动物组织样品的处理方法流程图；
图2为本申请的对比例1的两种不同提取液提取效果对比图；
图3为本申请的对比例2的有无石墨化碳黑净化效果对比图；
图4为实施例1处理的肌肉中检出对乙酰氨基酚时的提取离子色谱图和总离子流图；
图5为实施例2处理的肝脏中检出对甲苯噻嗪的提取离子色谱图和总离子流图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行描述。
兽药残留是指畜禽动物用药后，蓄积或储存在其机体细胞、组织或器官以及其产品中的原型药物、代谢产物或与兽药相关的杂质残留。食品中残留的兽药经过食物链传递到人体内并在其中不断富集，从而引发人体慢性中毒。因此，有必要针对动物组织中兽药残留进行检测。
目前，针对物组织中兽药残留的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳法(CE)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等，这些检测方法因自身存在的一些局限性，适用的药物测定范围有限。此外，由于不同种类间药物的化学性质差别较大，采用以上检测技术也很难实现多类别药物的同时测定，并且测定过程繁杂，耗费时间较长，不利于复杂样本的大规模筛查。同时，现有的动物组织中药物残留检测方法前处理方法步骤繁琐，消耗时间长，同时，由于无法有效降低基质效应的影响，导致检测结果准确性不高。
针对上述问题，请参阅图1，本申请提供了一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法，包括：
S1将动物组织样品与EDTA缓冲溶液进行混合，得到混合溶液；
S2将提取溶剂和盐析试剂加入到混合溶液中进行混合、离心，得到提取物上清液；
S3将提取物上清液、净化剂加入到净化管中进行混合、离心，得到净化的提取物上清液；
S4去除提取物净化上清液中的杂质，得到待测样品；
其中，盐析试剂为Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，净化管为活化的Bond Elut EMR-Lipids净化管，净化剂为石墨化碳黑。
QuEChERS作为一种新型样品前处理方法，因具有快速(quick)、简单(easy)、廉价(cheap)、高效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)等特点而被广泛应用于食品中药物多残留分析。QuEChERS前处理主要分为两个步骤：酸化乙腈的液液萃取过程和基质分散固相萃取(MSPE)净化过程。具体的，首先，选用一定酸度的乙腈或其他有机溶剂作为提取剂，同时加入适量盐析剂、除水剂以促使有机相与水相的分离，振荡、离心后获得萃取液；其次，将其转移至装有合适分散剂(PSA、C18、GCB等)的离心管中萃取净化，获得净化液；最后经HPLC-MS或其它检测器分析测定。
在本申请中，使用Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，可以起到缓冲溶液作用，促使待测物从水相向有机相转移从而提高提取效率。
使用传统的QuEChERS处理后的样品，在兽药残留分析过程中，大多数目标化合物的回收率可以保持在50.2％-96.5％之间，然而，有少数的药物回收率较低，影响了检测结果的准确性。经发明人在研究中发现，这类药物易于动物组织样品中的金属离子螯合，形成难溶的盐沉淀或悬浮在样品中，无法被提取溶剂提取，导致在后续检测过程中不易被检测。发明人发现，在加入提取剂前，将动物组织样品与EDTA缓冲溶液进行混合，此时，EDTA作为金属螯合剂可以与样品基质中的金属阳离子进行螯合，从而抑制药物与金属离子之间的螯合作用，从而改善了这类药物的回收率。同时，加入EDTA缓冲溶液对样品进行预处理，也不会影响其他目标物回收率，从而提高了检测结果的准确性。
作为一个示例，本申请的EDTA缓冲溶液可以选择使用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、PBS-EDTA缓冲溶液、Tris-EDTA缓冲溶液。可选的，在本申请实施例中，EDTA缓冲溶液通过以下方法制得：将8.4重量份柠檬酸、7.1重量份磷酸氢二钠和19.5重量份乙二胺四乙酸二钠溶于650重量份水中，超声溶解。
为了除去干扰物，减小基质效应影响，通常采取一定的净化手段。经典QuEChERS方法中常用的净化剂有C18、PSA(N-丙基乙二胺)、-NH2吸附剂。使用传统的QuEChERS处理后的样品，样品基质中存在大量的磷脂和脂肪类化合物，这些强保留化合物很容易在色谱柱中积累，使色谱柱的柱压不断升高，色谱柱过滤效率严重下降，并且，他们不容易被冲洗出来，从而导致色谱柱使用寿命的大大缩短。同时，这些磷脂和脂肪类化合物还会干扰检测结果，降低了检测的灵敏度。
针对上述问题，本申请使用EMR-Lipids净化管对提取液进行净化，可以有效的去除磷脂和脂肪类化合物，避免磷脂和脂肪类化合物的干扰。同时，石墨化碳黑因对平面型分子具有较强的亲和力，可以吸附色素和一些甾醇类物质。在本申请中，将Bond Elut EMR-Lipids和石墨化碳黑结合使用进行净化处理，可以有效的去除了磷脂和脂肪类化合物和单糖等极性小分子的基质干扰，大大提高了检测的灵敏度。
可选的，本申请实施例中，在步骤S4中，可以使用过滤的方式去除提取物净化上清液中的杂质。作为一个示例，可以选择使用0.2μm Captiva RC过滤膜过滤上清液以达到除去杂质的目的。
在本申请中，动物组织样品是指全部可食用的肌肉以及内脏，包括畜、禽及水生动物组织样品等。可选的，本申请实施例中，动物组织包括肌肉及内脏，作为一个示例，肌肉可以是畜、禽、水产动物肌肉样品等，内脏可以是动物肝脏、心脏、肺等。
作为一个示例，本申请的动物组织样品优选为肌肉或内脏，其中，肌肉或内脏是经过匀浆处理后的均匀、细腻的样品。
可选的，本申请实施例中，步骤S2包括：
S21将混合溶液与提取溶剂混合后，再加入盐析试剂混合，水平静置，得到混合提取溶液；
S22将混合提取溶液离心处理，得到提取物上清液。
可选的，本申请实施例中，步骤S3包括：
S31将超纯水加入净化管中进行活化处理，得到活化的净化管；
S32将提取物上清液加入活化的净化管与净化剂混合，得到净化混合溶液；
S33将净化混合溶液进行离心处理，得到净化的提取物上清液。
发明人研究发现，在离心过程中，如果离心温度过高，样品中的蛋白质、脂肪等杂质不能完全溶出，分离效果不好；如果离心温度过低，离心管会因为冷冻出现爆裂现象。作为一个示例，在本申请中，离心处理的离心温度为0-8℃，优选为4-6℃，在这个温度条件下离心，样液和杂质均能很好的分离，得到的样品净化效果好。同时，离心速率和离心时间对于提取效率没有明显的影响，因此，仅需要满足离心后的溶液液相分层明显即可。作为一个示例，本申请的离心速度为7000-10000r/min，优选为8000-9000r/min，离心时间为5-15min，优选为8-10min。
对于提取溶剂的选择，QuEChERS方法中，乙腈作为其经典的提取溶剂，不仅可以减小基质中其它干扰物的共萃取，从而减小基质效应，而且能够溶解并提取较宽极性范围的农药或兽药，此外，相比于丙酮、乙酸乙酯等其它有机溶剂，盐包的加入也更易使得乙腈相与水相分层，从而提高目标化合物的回收率。作为一个示例，可以选择使用乙腈或酸化乙腈中的一种作为萃取溶剂，至于二者具体的选择是根据具体目标化合物的性质决定的。
液相色谱-质谱联用技术是集液相色谱的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息等定性能力于一体的一项综合性现代分离技术，具有分析范围广、重复性好、灵敏度高、分析时间快的特点。但是，目前的液相色谱-质谱联用技术无法实现多类别药物的同时测定，并且测定过程繁杂，耗费时间较长，不利于复杂样本的大规模筛查。
针对上述问题，本申请提供了一种动物组织中药物残留的确证检测方法，包括：
采用液相色谱-质谱联用法对动物组织样品进行检测；
其中，按照上述动物组织样品的处理方法处理动物组织样品；液相色谱-质谱联用法采用多反应监测MRM模式对目标化合物的碎片离子进行监测，以化合物保留时间、两对母离子/子离子特征对目标药物的碎片离子进行定性或定量分析。
在本申请中，使用QuEChERS结合液相色谱/质谱法，采用多反应监测MRM模式对目标化合物的碎片离子进行监测，以化合物保留时间、两对母离子/子离子特征实现对目标药物的碎片离子进行定性或定量分析，从而实现多类别药物的同时测定，能在短时间内快速准确的完成多种药物的定性定量分析，满足实际检测的时效性要求。
其中，定性分析的主要方法为：运用液相色谱-质谱法对经过样品前处理的待检测动物组织样品进行筛查，采用液相色谱-串联四极杆质谱仪的离子扫描功能，建立MRM筛查方法，获得待检测动物组织样品中各目标药物母离子的MS2谱图；用已知数据库中各药物的标准MS2谱图与获得待检测动物组织样品中各目标药物母离子的MS2谱图分别进行对比，获得相似度值，并匹配两者的特征碎片离子，进而判断待检测动物组织样品中是否含有目标药物。
定量分析的主要方法为：分别称取各药物标准品，依据相似相溶原理选择溶剂分别配制1mg/mL的标准储备液，备用；按照上述样品处理方法对空白样品进行处理后，用空白样品基质溶液稀释标准储备液，制成混合标准储备溶液；将混合标准储备溶液定容后，得到空白样品基质溶液，配制浓度为0.5ng/mL～100ng/mL的系列匹配标准工作溶液；运用液相色谱-质谱法，采用液相色谱-串联四极杆质谱仪对系列匹配标准工作溶液和经过样品前处理的待检测动物组织样品分别进行测定，获得以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标的绘制标准曲线，以此标准曲线来计算待检测动物组织样品中目标药物的残留量。
作为一个示例，在本申请检测时的液相色谱条件为：色谱柱：ZORBAX EclipsePlus C18(3.0×150mm，1.8μm)；流动相A为含0.2％甲酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.2％甲酸甲醇溶液；流速：0.5ml/min；柱温：40℃±5℃；进样量：10μl；在本申请检测时的四级杆串联质谱条件为：离子源：ESI+；扫描方式：MRM；干燥器流速：7L/min；鞘气温度：325℃；鞘气流速：11L/min；雾化气压力：35psi；毛细管电压：3500V(+)；喷嘴电压：300(+)。
作为一个示例，在本申请实施例中液相色谱梯度洗脱条件为：
0-0.5min时，流动相A保持为95％，流动相B保持为5％。
0.5-3.0min时，流动相A由95％减小至85％，流动相B由5％增加至15％。
3.0-10.0min时，流动相A由85％减小至60％，流动相B由15％增加至40％。
10.0-18.0min时，流动相A由60％减小至0，流动相B由40％增加至100％。
18.0-22.0min时，流动相A保持为0，流动相B保持为100％。
23.0-25.0min时，流动相A保持为95％，流动相B保持为5％。
进一步地，本申请实施例还提供一种上述动物组织中药物残留的确证检测方法在检测甾体激素类药物、抗组胺类药物、解热镇痛类药物和抗菌抗虫类药物中至少一种的应用。
作为一个示例，在本申请中，甾体激素类药物包括但不限于，阿氯米松双丙酸酯、安西奈德、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松双丙酸酯、布地奈德、醋酸氯地孕酮中的一种或多种。
作为一个示例，在本申请中，抗组胺类药物包括但不限于，阿司咪唑、溴苯那敏、西替利嗪、氯苯那敏、氯丙嗪、赛庚啶中的一种或多种。
作为一个示例，在本申请中，解热镇痛类药物包括但不限于，氨基比林、萘普生、对乙酰氨基酚、非那西汀中的一种或多种。
作为一个示例，在本申请中，抗菌抗虫类药物包括但不限于，甲苯噻嗪、甲硫氧嘧啶、青霉素G、青霉素V、阿洛西林、喹乙醇、常山酮、氯羟吡啶中的一种或多种。
具体的，上述26种药物名称、色谱保留时间以及质谱定性定量离子信息如表1所示。
表1
Figure BDA0002746597410000111
Figure BDA0002746597410000121
可选的，作为一个示例，在检测时，可以针对上述一种药物进行跟踪性地检测，当出现目标药物时，立即停止检测。或者，作为一个示例，也可以针对上述药物进行全时段的跟踪检测，当出现目标药物时，继续进行下一个药物的检测，这样，可以实现全时段的多种药物的同时测定，满足实际检测的时效性要求。
综上所述，本申请实施例中提供的一种动物组织样品的处理方法，在处理过程中加入EDTA缓冲溶液，将Bond Elut EMR-Lipids和石墨化碳黑结合使用，有效的去除了样品中的金属离子、脂质等大分子和单糖等极性小分子的基质干扰，大大提高了检测的灵敏度，延长了液相色谱柱的使用寿命。同时，本申请还提供了一种动物组织中药物残留的确证检测方法，实现了多类别药物的同时测定，能在短时间内快速准确的完成多种药物的定性、定量分析，满足实际检测的时效性要求。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
如无特殊说明，本申请中所涉及的操作和处理方法属于本领域常规方法。
如无特殊说明，本申请中所采用的仪器为本领域常规仪器。
本申请具体实施方式中涉及的检测方法如下：
基质效应的评价
1)峰面积比值法，计算方法见公式2.1：
Figure BDA0002746597410000131
式中：Am—分析物在基质中响应信号的峰面积；
As—分析物在纯溶剂中响应信号的峰面积。
若ME>100％，为基质增强效应，反之，ME<100％，为基质减弱效应，ME＝100％，则不存在基质干扰现象。
2)标准曲线斜率比较法，计算方法见公式2.2：
Figure BDA0002746597410000132
其中，Sm是根据空白基质匹配溶液所绘制的工作曲线的斜率；
Ss是根据纯溶剂所配制的混合标准液制得的工作曲线的斜率。
若ME>0，表现为基质增强效应，若ME<0，表现为基质抑制效应。当0≤ME≤20％时，说明基质对信号干扰较低，可忽略不计；当20％<ME<50％时，表现为中等强度的基质干扰，而当ME≥50％，则为强烈的基质干扰，此时须采取措施来补偿基质影响。
实施例1
肌肉样品的处理过程如下：
S1称取5g经过匀浆处理的后猪肉样品，转移至一次性塑料离心管中，加入3mLEDTA缓冲溶液和陶瓷均质子，涡旋混合1min，形成混合溶液；
S2向上述混合溶液加入10ml乙腈，涡旋混合1min，然后加入Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，再次涡旋混合1min，水平静置10min，得到混合提取溶液，将上述混合提取溶液在4℃、9000r/min条件下离心10min，离心管上部得到乙腈上清液(即提取物上清液)；
S3向Bond Elut EMR-Lipids净化管中加入5mL超纯水，涡旋3s，弃去水，使用洁净的一次性吸管吸取5ml乙腈上清液至Bond Elut EMR-Lipids净化管中，加入150mg石墨化碳黑，涡旋1min，得到净化混合溶液，将净化混合溶液在4℃、9000r/min条件下离心10min，得到净化地提取物上清液；
S4移取该净化地提取物上清液1ml，通过0.2μm Captiva RC过滤膜，得到待测样品溶液；
其中，EDTA缓冲溶液的配置方法为分别称取8.4g柠檬酸、7.1g磷酸氢二钠和19.5gNa2EDTA，溶解于650mL水中，超声至完全溶解，该缓冲溶液的pH值约为4.0。
实施例2
检测肝脏样品的处理过程如下：
S1将5g匀浆处理后的鸡肝样品转移至一次性塑料离心管中，加入3mL EDTA缓冲溶液和陶瓷均质子，涡旋混合1min，形成混合溶液；
S2向上述混合溶液加入10ml乙腈，涡旋混合1min，然后加入Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，再次涡旋混合1min，水平静置10min，得到混合提取溶液，将上述混合提取溶液在4℃、9000r/min条件下离心10min，离心管上部得到乙腈上清液(即提取物上清液)；
S3向Bond Elut EMR-Lipids净化管中加入5mL超纯水，涡旋3s，弃去水，使用洁净的一次性吸管吸取5ml乙腈上清液至Bond Elut EMR-Lipids净化管中，加入150mg石墨化碳黑，涡旋1min，得到净化地提取物上清液，将净化混合溶液在4℃、9000r/min条件下离心10min，得到净化上清溶液；
S4移取该净化上清溶液1ml，通过0.2μm Captiva RC过滤膜，得到待测样品溶液；
其中，EDTA缓冲溶液的配置方法为分别称取8.4g柠檬酸、7.1g磷酸氢二钠和19.5gNa2EDTA，溶解于650mL水中，超声至完全溶解，该缓冲溶液的pH值约为4.0。
对比例1
组织中样品的处理步骤同实施例1，区别在于，不执行步骤S1，直接将乙腈加入样品中进行处理，提取液颜色较深，浑浊度相对较高。使用EDTA溶液和乙腈的混合溶液提取时，提取液颜色相对较浅，澄清度较高。两种不同提取液提取效果对比结果如图2所示，A为使用EDTA溶液和乙腈混合溶液提取效果，B为乙腈直接提取。
对比例2
组织中样品的处理步骤同实施例1，区别在于，在步骤S3中，仅采用Bond ElutEMR-Lipids净化管对乙腈上清液进行净化，后续不添加石墨化碳黑，处理后的提取溶液呈淡红色，为红细胞中的色素，加入石墨化炭黑净化后红色消失，表明红细胞中色素被有效清除。结果如图3所示，A为使用石墨化碳黑净化效果，B为未石墨化碳黑净化效果。
测试例1
测试采用型号为安捷伦6470LC-QQQ的液相色谱-串联四极杆质谱仪对实施例1得到的样品进行测试。
设置液相色谱条件，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×150mm，1.8μm)；流动相A为含0.2％甲酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.2％甲酸甲醇溶液；流速：0.5ml/min；柱温：40℃±5℃；进样量：10μl。
液相色谱梯度洗脱条件为：
0-0.5min时，流动相A保持为95％，流动相B保持为5％。
0.5-3.0min时，流动相A由95％减小至85％，流动相B由5％增加至15％。
3.0-10.0min时，流动相A由85％减小至60％，流动相B由15％增加至40％。
10.0-18.0min时，流动相A由60％减小至0，流动相B由40％增加至100％。
18.0-22.0min时，流动相A保持为0，流动相B保持为100％。
23.0-25.0min时，流动相A保持为95％，流动相B保持为5％。
四级杆串联质谱条件为：离子源：ESI+；扫描方式：MRM；干燥器流速：7L/min；鞘气温度：325℃；鞘气流速：11L/min；雾化气压力：35psi；毛细管电压：3500V(+)；喷嘴电压：300v(+)。
结果判定：通过液相色谱-串联质谱检测，利用MRM检测模式对26种目标化合物的离子对进行监测，在6.0min处监测到对乙酰氨基酚的定性和定量碎片离子，结果如图4所示，结果表明，组织中检出对乙酰氨基酚。
测试例2
测试采用型号为安捷伦6470LC-QQQ的液相色谱-串联四极杆质谱仪对实施例2得到的样品进行测试，测试条件如测试例1。
结果判定：通过液相色谱-串联质谱检测，利用MRM检测模式对26种目标化合物的离子对进行监测，在10.3min处监测到对甲苯噻嗪的定性和定量碎片离子，结果如图5所示，结果表明，组织中检出甲苯噻嗪。
以上所述仅为本申请的一部分实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，其包括：
S1 将动物组织样品与EDTA缓冲溶液进行混合，得到混合溶液；
S2 将提取溶剂和盐析试剂加入到所述混合溶液中进行混合，得到提取物上清液；
S3 将所述提取物上清液、净化剂加入到净化管中进行混合、离心，得到净化的提取物上清液；
S4 去除所述净化的提取物上清液中的杂质，得到待测样品；
其中，所述盐析试剂为Bond ElutQuEChERS兽药残留分析萃取盐包，所述净化管为活化的Bond Elut EMR-Lipids 净化管，所述净化剂为石墨化碳黑；
所述药物为甾体激素类药物、抗组胺类药物、解热镇痛类药物和抗菌抗虫类药物；
所述甾体激素类药物包括阿氯米松双丙酸酯、安西奈德、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松双丙酸酯、布地奈德、醋酸氯地孕酮中的一种或多种，所述抗组胺类药物包括阿司咪唑、溴苯那敏、西替利嗪、氯苯那敏、氯丙嗪、赛庚啶中的一种或多种，所述解热镇痛类药物包括氨基比林、萘普生、对乙酰氨基酚、非那西汀中的一种或多种，所述抗菌抗虫类药物包括甲苯噻嗪、甲硫氧嘧啶、青霉素G、青霉素V、阿洛西林、喹乙醇、常山酮、氯羟吡啶中的一种或多种；
所述提取溶剂为乙腈、酸化乙腈中的一种。
2.根据权利要求1所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，所述动物组织为畜、禽、水产动物组织。
3.根据权利要求2所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，所述动物组织为经过匀浆处理后的均匀样品。
4.根据权利要求1所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，所述EDTA缓冲溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠-乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，所述EDTA缓冲溶液中包括：8.4重量份柠檬酸、7.1重量份磷酸氢二钠、19.5重量份乙二胺四乙酸二钠和650重量份水。
6.根据权利要求1所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21 将所述混合溶液与所述提取溶剂混合后，加入所述盐析试剂混合，水平静置，得到混合提取溶液；
S22 将所述混合提取溶液离心处理，得到所述提取物上清液；
其中，所述离心处理的离心温度为0-8℃，离心速度为7000-10000r/min，离心时间为5-15min。
7.根据权利要求6所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，离心速度为8000-9000 r/min，离心时间为8-10min，离心温度为4-6℃。
8.根据权利要求1所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，步骤S3包括：
S31 将超纯水加入所述净化管中进行活化处理，得到活化的净化管；
S32 将所述提取物上清液加入所述活化的净化管与净化剂混合，得到净化混合溶液；
S33 将所述净化混合溶液进行离心处理，得到所述净化的提取物上清液；
其中，所述离心处理的离心温度为0-8℃，离心速度为7000-10000r/min，离心时间为5-15min。
9.根据权利要求8所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法，其特征在于，所述离心温度为4-6℃，所述离心速度为8000-9000 r/min，所述离心时间为8-10min。
10.一种动物组织中药物残留的确证检测方法，其特征在于，其包括：
采用液相色谱-质谱联用法对动物组织样品进行检测；
其中，按照权利要求1-9中任一项所述的动物组织样品中药物残留检测的处理方法处理所述动物组织样品，所述液相色谱-质谱联用法采用多反应监测MRM模式对目标化合物的碎片离子进行监测，以化合物保留时间、两对母离子/子离子特征对目标药物的碎片离子进行定性或定量分析。
11.根据权利要求10所述的动物组织中药物残留的确证检测方法，其特征在于，液相色谱条件为：
色谱柱：3.0×150mm，1.8µm，ZORBAX Eclipse Plus C18；
流动相A为含0.2%甲酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.2%甲酸甲醇溶液；
流速：0.5ml/min；
柱温：40℃±5℃；
进样量：5μl-20μl。
12.根据权利要求11所述的动物组织中药物残留的确证检测方法，其特征在于，所述进样量为10μl。
13.根据权利要求10或11所述的动物组织中药物残留的确证检测方法，其特征在于，四级杆串联质谱条件为：
离子源：ESI+；
扫描方式：MRM；
干燥器流速：7L/min；
鞘气温度：325℃；
鞘气流速：11 L/min；
雾化气压力：35psi；
毛细管电压：+3500V；
喷嘴电压：+300。
14.一种如权利要求10~13任一项所述的动物组织中药物残留的确证检测方法在检测甾体激素类药物、抗组胺类药物、解热镇痛类药物和抗菌抗虫类药物中的应用。
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