CN106198788A

CN106198788A - 一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的hplc检测方法

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Publication number: CN106198788A
Application number: CN201610503587.7A
Authority: CN
Inventors: 李国梁; 吴頔; 吴永宁; 邱楠楠; 尤进茂; 赵梅
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: CN106198788B

Abstract

本发明公开了一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法该方法，采用高效液相色谱荧光检测法进行检测，所用的待测样品溶液的制备包括以下步骤：将饲料或肉类食品用乙腈和水的混合溶液超声萃取，得初步样品溶液；用荧光试剂2‑(11H‑苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯对初步样品溶液进行荧光标记；荧光标记的初步样品溶液进行超声辅助分散液液微萃取，得待测样品溶液。本发明能够在较短时间内完成沙丁胺醇的检测，样品使用量少、有机溶剂用量也较少，检测效率高，成本低，沙丁胺醇的检出限在1 ng mL^‑1以下，灵敏度大大提升，为沙丁胺醇的检测提供了新的思路。

Description

一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及一种沙丁胺醇的检测方法，具体涉及一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法。

背景技术

沙丁胺醇是一种β受体激动剂，可以作为药物用于临床医学中呼吸道疾病的治疗，也作为瘦肉精用于改变动物体内的肥瘦肉比例以提高饲料转化率。在家畜的体内，沙丁胺醇可以很大程度上使肥肉转化为瘦肉，从而使家畜得到更大的经济利益。沙丁胺醇亦可用作运动员提高身体兴奋度的兴奋剂。在大多数国家和地区(例如中国和印度)，由于沙丁胺醇对于人体的危害巨大，沙丁胺醇的使用是明令禁止的，但在很多地方，由于使用沙丁胺醇造成的食物中毒事件仍在发生。因此，一种简单的、低成本的、快速的、灵敏度高的、特异性强的食品中沙丁胺醇的检测方法是具有重要意义的。

当前，用于沙丁胺醇的检测方法有ELISA法、毛细管电泳法、高效液相色谱(HPLC)法、液相-质谱联用(LC-MS)法、气相-质谱联用(GC-MS)法等。这些方法在沙丁胺醇的检测中有各自的特点，在实际应用中也有各自的不足。例如：在过去兴起沿用至今的免疫分析法和酶联免疫吸附法由于无法克服抗体的交叉反应性，已经证实是不适合沙丁胺醇的检测的。又如，近几年，气相色谱质谱联用法广泛的用于沙丁胺醇的鉴定和检测，但是由于沙丁胺醇的强极性和低挥发性，使得沙丁胺醇的检测耗时多，操作过程繁琐，成本高。再如，比起气相色谱质谱联用法更有效率的是液相色谱质谱联用技术，但由于需要同位素内标，使得液相色谱质谱联用法非常昂贵，在大多数实验室不能得到普及，近年来被广泛地应用于微量目标化合物的测定。由于沙丁胺醇不具有荧光基团，一般采用HPLC-DAD进行检测，但检测灵敏度低且易受内源物质的干扰。因此，为了更灵敏检测沙丁胺醇，一般需要用荧光试剂对其进行衍生化处理，使沙丁胺醇具有荧光基团，从而能顺利的利用荧光检测方法进行选择性检测。目前，常用试剂有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)，4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)，1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)等，这些试剂均存在诸多不足，如6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)已成为了一种广泛使用的柱前荧光衍生试剂，但是其衍生物在水溶液中的荧光强度仅是纯乙腈中的10％，造成早洗脱的氨基酸衍生物通常比晚洗脱的氨基酸衍生物检测限高1～2数量级。4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)试剂在水溶液中的稳定性较差,见光容易分解,1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)不仅稳定性差，其衍生物还伴有荧光猝灭现象，造成检测灵敏度下降。

此外，对肉类等食品进行沙丁胺醇检测时，需要对样品进行提取，以便后续的检测。目前，常用于沙丁胺醇的样品前处理方法有固相萃取(SPE)。SPE萃取的方式是利用固体吸附剂吸附目标物，与样品基体及干扰物分离，再经洗脱而实现待测物的分离和富集，萃取方式提取时间长、提取率低、样本量大，有机溶剂消耗量也较大，检测耗时多，使应用受限。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法，该方法操作简便、省时、省力，检测灵敏度高，为沙丁胺醇的检测提供了新的思路。

近几年，超声辅助分散液液微萃取(UA-DLLME)作为一个新兴的前处理方法由于拥有操作简单、快速、省时显著、节约化学试剂、良好的恢复和高富集系数、低功耗等优点被广泛的应用。本发明中，我们首次使用BCEC-Cl作为荧光标记试剂，结合超声辅助分散液液微萃取(UA-DLLME)技术对饲料和肉类食品中的沙丁胺醇进行检测，先对样品进行荧光标记(也称为荧光衍生化处理)，再使用UA-DLLME技术进行萃取，并且经过研究得到了合适的荧光标记条件和萃取条件，使沙丁胺醇的高效液相色谱荧光检测法的检测灵敏度大大提升。

本发明具体技术方案如下：

一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法，该方法采用高效液相色谱荧光检测法进行检测，所用的待测样品溶液的制备包括以下步骤：

(1)沙丁胺醇的初步提取：将饲料或肉类食品用乙腈和水的混合溶液超声萃取，离心所得萃取上清液在气体保护下干燥，然后用水溶解、过膜除杂，得初步样品溶液；

(2)用荧光试剂2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯对初步样品溶液进行荧光标记；

(3)荧光标记的初步样品溶液的超声辅助分散液液微萃取：将氯化钠溶液和荧光标记初步样品溶液混合，然后与分散剂与萃取剂的混合液混合，所得混合液在超声萃取后离心分离，取底层液体，用保护性气体吹干，然后用甲醇复溶，过膜除杂，得待测样品溶液。

本发明荧光标记的步骤发生在初步样品进行超声辅助分散液液微萃取前，即先用荧光试剂对初步样品溶液中的沙丁胺醇进行荧光标记，再进行超声辅助分散液液微萃取。荧光标记和超声辅助分散液液微萃取彼此协同，提高了萃取率，通过荧光标记既有利于样品中沙丁胺醇的充分提取又提高了检测的准确性和灵敏度。如果先进行超声辅助分散液液微萃取再进行荧光标记，样品中沙丁胺醇的萃取率将大大降低，降低了后续的检测效果。

所用荧光试剂也可以称之为衍生化试剂。本发明通过实验，选择2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯，简称BCEC-Cl作为荧光试剂。与其他荧光试剂相比，本发明所用的BCEC-Cl稳定性好、检测灵敏度更高。该BCEC-Cl可以按照现有技术公开的方法制备，例如文献：WuH,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents of six steroidal and phenolicendocrine disrupting chemicals in chicken,fish and aquaculture pond watersamples using pre-column derivatization and dispersive liquid–liquidmicroextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Foodchemistry,2016,192:98-106.

进一步的，饲料或肉类食品烘干后再进行提取。

进一步的，荧光标记包括以下步骤：取4ml pH 7-10的缓冲溶液，加入40μL初步样品溶液，然后加入荧光试剂乙腈溶液，震荡后密封，在20-60℃反应10-30min，即得荧光标记的初步样品溶液。

上述荧光标记步骤中，荧光试剂的用量远大于其理论需求量。

上述荧光标记步骤中，pH优选为8.5-9.0。反应温度为优选为40-50℃，反应时间优选为10-15min。

上述方法中，采用超声辅助分散液液微萃取对待检样品进行提取，操作简单、快速、省时，降低了有机溶剂的使用量，大大提高了检测效率。本发明方法可以用于饲料或肉类食品中沙丁胺醇的检测，所述的肉类食品包括鸡肉、猪肉、鱼肉等生肉或熟肉，还包括以这些肉类为原料进行加工得到的半成品或成品。

上述步骤(1)中，乙腈和水的混合溶液中，乙腈的体积含量优选为80％。

上述步骤(1)中，饲料或肉类食品用乙腈和水的混合溶液进行超声萃取，混合溶液的量可以自行调整，超声的时间一般为5min，快速、省时。

上述步骤(1)中，每1g饲料或肉类食品经超声萃取、干燥所得的提取物用1ml水溶解。用水溶解后的液体最好用0.22μm的膜过滤除杂。

上述步骤(3)中，所述分散剂为乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，优选为丙酮。

上述步骤(3)中，所述萃取剂为二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，优选为二氯甲烷。

上述步骤(3)中，分散剂、萃取剂和待测样品溶液的体积比为500-1500μL：50-150μL：1.5-5.5ml，优选为1400μL：145μL：4ml。

上述步骤(3)中，氯化钠在混合液中的重量体积分数为0-5％，不包括0％，优选为1％。

上述步骤(3)中，超声萃取时间为2-6min，优选为2.5min。该萃取时间短、效率高，省时省力。

步骤(3)中，每4ml初步样品溶液经超声辅助分散液液微萃取、保护性气体吹干所得的产物用0.5ml甲醇复溶。

进一步的，本发明检测方法采用外标法检测饲料或肉类食品中的沙丁胺醇。同样的，外标法所用的沙丁胺醇标准品在进入高效液相色谱仪前采用与初步样品溶液同样的荧光标记方法进行荧光标记。步骤包括：取沙丁胺醇标准品溶液，调整pH，然后加入荧光试剂乙腈溶液，震荡后密封反应，即得荧光标记的沙丁胺醇标准品溶液。

进一步的，本发明高效液相色谱条件如下：色谱柱为Hypersil C18，流动相A：体积分数30％的甲醇水溶液；B:体积分数70％的甲醇水溶液，梯度洗脱条件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速为1.0mLmin^-1，柱温＝30℃；荧光检测时，λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

本发明有益效果为：本发明提供了一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的检测方法，该方法采用荧光衍生试剂BCEC-Cl作为荧光标记试剂，通过衍生化反应对沙丁胺醇进行荧光标记，结合超声辅助分散液液微萃取技术对待检样品进行处理，系统的优化了荧光标记和萃取条件，使萃取效率高、用时短、操作简便、检测准确度高。本发明能够在较短时间内完成沙丁胺醇的检测，并且样品使用量少、有机溶剂用量也较少，检测效率高，成本低，沙丁胺醇的检出限在1ng mL^-1以下，灵敏度大大提升，本发明方法能够成功的应用到饲料和猪肉、鸡肉、鱼肉等实际样品的测定中，为沙丁胺醇的检测提供了新的思路。

附图说明

图1萃取剂的种类、分散剂的种类、pH值、盐含量和样品溶液的体积与峰面积的关系曲线。

图2时间和萃取剂对响应值的影响的响应面图。

图3时间和分散剂对响应值的影响的响应面图。

图4萃取剂和分散剂对响应值的影响的响应面图。

图5沙丁胺醇的标准品色谱图(A)和市购猪肉样品(B)所得的HPLC色谱图。

图6市购鸡肉样品(C)和鱼肉样品(D)所得的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。

实施例1超声辅助分散液液微萃取条件的筛选与优化

1、仪器与试剂

Agilent 1100HPLC–FLD(美国，Agilent公司)配四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器；半制备高效液相色谱(Waters600E，美国，Waters公司)，Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)色谱柱(Agilent公司)。

衍生试剂(即荧光试剂)2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl，自制).

沙丁胺醇(美国sigma公司)，乙腈(光谱纯，德国，Merck公司)，二氯甲烷(CH₂Cl₂,分析纯，中国禹王试剂公司)，氯仿(CHCl₃,分析纯，中国禹王试剂公司)，四氯化碳(CCl₄,分析纯，中国禹王试剂公司)，丙酮(分析纯，中国禹王试剂公司)，甲醇(光谱纯，德国，Merck公司)，乙醇(光谱纯，德国，Merck公司)，水由Milli-Q超纯水系统制备。

2、色谱条件

高效液相色谱条件：色谱柱为Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流动相A：体积分数30％甲醇水溶液；流动相B:体积分数70％甲醇水溶液。梯度洗脱条件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速为1.0mLmin^-1,进样量＝10μL；柱温＝30℃；荧光检测的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

3、标准溶液配制

(1)沙丁胺醇标准品储备液：准确取一定量沙丁胺醇标准品，用甲醇配成1.0×10^- ³mol L^-1的溶液。

(2)衍生试剂溶液：用10mL乙腈溶解准确称取16.15mg的BCEC-Cl，其浓度为5.0×10^-3mol L^-1。

4、外标标准品和实际样品处理

4.1因实际样品中一般不含沙丁胺醇，所以采用在样品中加入沙丁胺醇的方式模拟含有沙丁胺醇的样品。取从当地超市(山东曲阜，中国)购买的猪肉、鸡肉或鱼肉，烘干后粉碎。精确称取1g猪肉、鸡肉或鱼肉粉，按照5μg/kg的量加入沙丁胺醇标准品，搅拌混匀，作为待检样品，将待检样品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

4.2衍生化

向10mL离心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸钠缓冲盐，40μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于40-50℃反应10-15min，取出冷却后备用。衍生反应方程式如下：

4.3超声辅助分散液液微萃取

将分散剂与萃取剂混合均匀后，用注射器打入到盛NaCl溶液和衍生化的初步样品溶液的离心管中，超声萃取，然后离心，取底层小液滴用氮气吹干，用甲醇复溶，过0.22μm膜，得待测样品溶液。

5、实验方法及结果

5.1将衍生化(即荧光标记)的沙丁胺醇标准品储备液用甲醇稀释至不同浓度，然后按照上述色谱条件进行高相液相色谱检测，绘制峰面积对沙丁胺醇浓度的标准曲线。

5.2为了获得更高的萃取效率，对影响超声辅助分散液液微萃取的六个重要的参数(萃取剂的种类和分散剂的种类，pH值，盐效应和样品溶液的体积)进行了单因素优化，各参数与峰面积的关系曲线见图1。

5.2.1萃取剂的种类的影响

萃取剂可以显著影响液液微萃取的提取效率。本发明选择氯化溶剂(例如二氯甲烷，氯仿和四氯化碳)作为萃取剂，该类萃取剂具有水溶解度低，密度大于水，能溶解分析物等特点。结果表明，二氯甲烷，氯仿和四氯化碳都可以取得一定的提取效果，但二氯甲烷比其他的提取效果要好，更适合拥有羟基和叔胺官能团的沙丁胺醇的萃取。因此，二氯甲烷为优选的萃取剂。

5.2.2分散剂的种类的影响

分散剂的作用是使各成分充分混溶，本发明选取乙腈，丙酮，甲醇和乙醇作为分散剂。结果表明，丙酮比其他溶剂更适合作为沙丁胺醇的提取剂。因此，丙酮为优选的分散剂。

5.2.3pH值的影响

待检样品溶液的pH可以显著影响提取效率，尤其是当目标为碱性或酸性化合物时。本次对溶液的pH值(由4至10)进行了的研究。结果表明，不同的pH值对提取结果无明显影响，这主要是因为在超声辅助分散液液微萃取之前，沙丁胺醇的酚羟基和胺基已经被衍生试剂的基团取代，因此，选择中性的pH。

5.2.4盐效应的影响

离子强度的增加会导致分析物在样品溶液中的溶解度下降，从而可以提高提取效率。为调查离子强度对超声辅助分散液液微萃取的提取效率的影响，本发明研究了在其他实验条件保持恒定的情况下，控制样品溶液中NaCl的浓度(0～5％，重量/体积)对萃取效率的影响。结果表明，过多的增加离子强度不会显著提高萃取效率；与此相反，在较高的离子强度不益于沙丁胺醇的衍生产物的超声辅助分散液液微萃取。因此，氯化钠浓度选择(1％，重量/体积)。

5.2.5样品溶液的体积的影响

超声辅助分散液液微萃取的提取效率可以通过增加样品的体积得以提高，因为增加的样本体积可为目标化合物从水相转移到萃取剂的有机相提供一个正向的效应。本发明考察了样品体积从1.5mL到5.5mL对超声辅助分散液液微萃取的影响。结果表明，样品体积由1.5mL增加至4mL,峰面积的波动较小；由4.5mL增加至5.5mL，峰面积反而有所降低。所以，优选4mL为样品体积。

5.3对提取时间(T)，萃取剂的体积(EV)和分散剂的体积(DV)采用响应面法进行优化。

根据BBD设计，优化包括17组实验(见下表1)。基于实验数据，获得了可以预测的最佳点的回归方程。预测的二阶多项式模型如下：

Y＝12.60–0.40X₁+2.40X₂+2.80X₃–2.40X₁X₂+2.81X₁X₃–0.89X₂X₃–3.68X₁ ²–2.05X₂ ²–4.08X₃ ²

式中，Y是预测的平均峰面积；X₁，X₂和X₃分别为超声时间(T)，萃取剂的体积(EV)和分散剂的体积(DV)。

表1响应面实验设计

响应面曲线可以反映出各变量之间的相互作用关系(见图2-4)。图2展示了在分散剂的体积固定时，超声时间和萃取剂体积之间的相互作用关系，当超声时间由2min增加到6min时，峰面积先迅速增加，达到一个最大值，然后略有下降；萃取剂体积从50μL增加到150μL时，峰面积一直增加。图3展现了当萃取剂体积一定时超声时间和分散剂的体积之间的相互作用关系，分散剂的体积由500μL增加到1500μL时，峰面积首先表现是增加的趋势，在1300μL附近达到最高值，然后有少许下降；超声时间的趋势是与图2基本一致。图4描述的是萃取剂的体积和分散剂的体积之间的相互作用关系，峰面积随着分散剂的体积的增加表现为显著增加，达到峰值后有所下降；峰面积随着萃取剂体积的增加而增加。

上述结果表明,该模型显著(p<0.05)，且实验值与模型预测值之间有高度的相关性(R²＝0.9125)。通过分析实验结果，软件评估出的最佳超声辅助分散液液微萃取条件分别为萃取剂体积为145μL，分散剂体积为1400μL和超声时间为2.5min。在最佳的条件下，峰面积预测值为9.85，实际的测量值为9.98，两者非常接近。预测值和测量值之间的良好的相关性验证了该响应模型是适当的，足以体现预期的优化。

实施例2

根据实施例1的优化，得到了本发明优选的检测方法，其具体如下：

1、色谱条件

高效液相色谱条件：色谱柱为Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流动相A：体积分数30％甲醇水溶液；流动相B:体积分数70％甲醇水溶液。梯度洗脱条件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速为1.0mL min^-1,进样量＝10μL；柱温＝30℃；荧光检测的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

2、标准溶液配制

(1)沙丁胺醇标准品储备液：准确取一定量沙丁胺醇标准品，用甲醇配成1.0×10^- ³mol L^-1的溶液，备用。

3、外标标准品和实际样品处理

3.1精确称取1g待饲料或测肉类食品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

3.2衍生化

向10mL离心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸钠缓冲盐，40μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于40-50℃反应10-15min，得衍生化标准品储备液或初步样品溶液，取出冷却后备用。

3.3超声辅助分散液液微萃取

取4ml衍生化初步样品溶液，加入氯化钠溶液至氯化钠浓度为1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取剂)和1400μL丙酮(分散剂)的混合溶液，超声2.5min，离心分5min(5000rmin^-1)，两相分离，取底层小液滴用氮气吹干，用0.5mL甲醇复溶，过0.22μm膜，得待测样品溶液。

4、检测方法

采用外标法，将衍生化的储备液用甲醇稀释，得到一系列不同浓度的衍生化沙丁胺醇标准溶液，采用上述色谱条件对不同浓度的标准溶液进行高相液相色谱-荧光检测，绘制浓度对峰面积的标准曲线。

取衍生化的待测样品溶液，按照相同的色谱条件进行高相液相色谱-荧光检测，得到峰面积，根据峰面积计算沙丁胺醇的含量。

5、为了检测该方法的可行性，根据USP指导对该方法进行验证。方法验证具体如下：

5.1标准曲线线性范围和检出限、定量限

步骤：用沙丁胺醇标准品储备液制成0-1000ngmL^-1的一系列标准溶液，绘制沙丁胺醇浓度对峰面积的标准曲线。以3倍基线噪声所对应的沙丁胺醇的浓度为其检测限，以10倍基线噪声所对应的沙丁胺醇的浓度为其定量限。

结果：本方法在0-1000ng mL^-1浓度范围内呈线性关系，所得线性回归方程见表2，其相关性系数为0.9998。经验证，其LOD(S/N＝3：1)和LOQ(S/N＝10：1)分别为0.2ng mL^-1和1.1ng mL^-1，这表明，该方法具有良好的灵敏度。

表2线性回归方程，R，检出限，定量限，重现性和精度

将本发明方法和现有技术中报道的其他样品处理方法和分析方法所得的沙丁胺醇的检测限和定量限进行比较，结果如下表3所示。从表中可以看出，在样品处理方面，相比SPE，本发明UA-DLLME可以克服SPE操作繁琐的缺点，展现出包括操作简单，省时显著，节约化学试剂和具有良好的高富集系数低等优势。在灵敏度方面，本发明所建立的方法具有其他方法更低LOD和LOQ。MS虽然能提供较低的检测极限，但其需要同位素内标，设备是昂贵的，且并没有达到普及的水平，而与MS相比，本发明具有高效率和灵敏度的HPLC-FLD方法能被广泛地应用于常见的实验室中。此外，本发明荧光标记和随后的UA-DLLME的超声时间分别为10min和2.5min，时间短，省时高效。

表3方法比较

文献1：Tyagi A,Sharma N,Mittal K,et al.HPTLC-Densitometric and RP-HPLCMethod Development and Validation for Determination ofSalbutamol Sulphate,Bromhexine Hydrochloride and Etofylline in Tablet Dosage Forms[J].PharmaceuticaAnalyticaActa,2015:1-5

文献2：Rosales‐Conrado N,Dell'Aica M,León‐González M E,etal.Determination of salbutamol by direct chiral reversed‐phase HPLC usingteicoplanin as stationary phase and its application to natural water analysis[J].Biomedical Chromatography,2013,27(11):1413-1422.

文献3：Zhang D,Teng Y,Chen K,et al.Determination of salbutamol inhuman plasma and urine using liquid chromatography coupled to tandem massspectrometry and its pharmacokinetic study[J].Biomedical Chromatography,2012,26(10):1176-1182.

文献4：Wu Y Y,Shi W X,Chen S Q.Determination of beta-estradiol,bisphenol A,diethylstilbestrol and salbutamol in human urine by GC/MS[J].Medical sciences,2009,38(3):235-241.

5.2重复性和精确度

在相同的最佳色谱条件下平行检测6次，得到的保留时间和峰面积的RSD分别为0.03％和0.51％,重复性良好。连续3天内对沙丁胺醇的衍生物平行分析6次，测得的日内平均和日间平均的精密度分别为0.4％和1.2％，见表2。

5.3准确度

按照表4的数据向实际样品中添加已知的三个不同浓度的标准品(1μg/kg，5μg/kg和10μg/kg)并测其回收率，测得的回收率结果见表4。由表4可知，回收率在95.0-101.4％的范围内，且RSD小于3.1％。

表4实际样品的回收率(n＝6)

5.4鲁棒性

鲁棒性是考察对分离的色谱条件进行较小的改变对分离结果的影响。对流速和柱温分别进行1±0.2mg·mLmin^-1和30±1℃的改变，得到了观察微不足道的变化，表明鲁棒性良好。

综上所述，该方法具有良好的线性，满意的重复性，可接受的鲁棒性，良好的精密度和准确度，具有可应用性。

实施例3

以猪肉为样品，对衍生化条件进行筛选和优化，方法如下：

1、色谱条件

同实施例2。

2、标准溶液配制

同实施例2。

3、外标标准品和实际样品处理

3.1取从当地超市购买的猪肉，烘干后粉碎。精确称取1g猪肉粉，按照2μg/kg的量加入沙丁胺醇标准品，搅拌混匀，作为待检样品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

3.2衍生化

按照下述四种方法进行衍生化处理：

方法一：向10mL离心管中加入4mLpH＝8.5-9.0的硼酸钠缓冲盐，40μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于40-50℃反应10-15min，取出冷却后备用。

方法二：向10mL离心管中加入4mLpH＝7-8的硼酸钠缓冲盐，60μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，90μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于20-25℃反应30min，取出冷却后备用。

方法三：向10mL离心管中加入4mLpH＝9.5-10的硼砂氢氧化钠缓冲液，40μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于55-60℃反应10min，取出冷却后备用。

方法四：向10mL离心管中加入4mLpH＝5-6的磷酸盐缓冲液，60μL沙丁胺醇标准品储备液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于80℃反应10min，取出冷却后备用。

3.3超声辅助分散液液微萃取

将上述四种方法得到的衍生化初步样品溶液分别按照实施例23.3的超声辅助分散液液微萃取方法进行萃取，得到待测样品溶液1、2、3、4。

4、检测方法

采用外标法，对衍生化的待测样品溶液进行检测，各样品中沙丁胺醇的峰面积和含量如下表5所示。

表5

从以上结果可以看出，衍生化时pH、反应温度和反应时间对检测结果均有影响，衍生化条件为：pH8.5-9.0，反应温度40-50℃、反应时间10-15min时效果最佳。

实施例4

采用本发明方法对本地猪肉、鸡肉和鱼肉中沙丁胺醇的含量进行检测，方法如下：

1、色谱条件

同实施例2。

2、标准溶液配制

同实施例2。

3、外标标准品和实际样品处理

3.1取从当地超市购买猪肉、鸡肉和鱼肉，烘干后粉碎。分别精确称取1g猪肉、鸡肉和鱼肉粉，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

3.2衍生化

同实施例2。

3.3超声辅助分散液液微萃取

同实施例2。

4、检测方法

采用外标法，对衍生化的待测样品溶液进行检测，各样品所得的色谱图如图5和6所示。从图中可以看出，猪肉、鱼肉和鸡肉中均未检测到沙丁胺醇，由此可知，该地区对沙丁胺醇的控制还是十分有效的。

对比例1

以猪肉和鱼肉作为待检样品，按照实施例2的方法制备待测样品溶液和对待测样品溶液进行检测，不同的是：初步样品溶液先进行分散液液微萃取，再进行荧光标记，步骤如下：

取从当地超市(山东曲阜，中国)购买的猪肉或鱼肉，烘干后粉碎。精确称取1g猪肉或鱼肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇标准品，搅拌混匀，作为待检样品，将待检样品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

取4ml初步样品溶液，加入氯化钠溶液至氯化钠浓度为1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取剂)和1400μL丙酮(分散剂)的混合溶液，超声2.5min，离心分5min(5000r min^-1)，两相分离，取底层小液滴用氮气吹干，用0.5mL甲醇复溶，过0.22μm膜，备用。

向10mL离心管中加入4mLpH＝9的硼酸钠缓冲盐，40μL沙丁胺醇标准品储备液或液液微萃取后的初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于50℃反应10min，取出冷却，得待测样品溶液。

采用外标法，待测样品溶液进行检测，结果如下表6所示。

表6

对比例2

1、色谱条件

同实施例2。

2、标准溶液配制

同实施例2。

3、外标标准品和实际样品处理

3.1取从当地超市购买猪肉和鱼肉，烘干后粉碎。精确称取1g猪肉和鱼肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇标准品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

3.2衍生化

同实施例2。

3.3超声辅助分散液液微萃取

取4ml初步样品溶液，加入氯化钠溶液至氯化钠浓度为6％，然后加入36μL二氯甲烷(萃取剂)和1645μL丙酮(分散剂)的混合溶液，超声2.5min，离心分5min(5000r min^-1)，两相分离，取底层小液滴用氮气吹干，用0.5mL甲醇复溶，过0.22μm膜，备用。

4、检测方法

采用外标法，对衍生化的待测样品溶液进行检测，结果见下表7。

表7

对比例3

采用实施例2的方法检测食品中莱克多巴胺的含量，步骤如下：

1、标准溶液配制

(1)莱克多巴胺标准品溶液：准确取一定量莱克多巴胺标准品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液。

2、样品溶液配制

因实际样品中一般不含莱克多巴胺，所以采用在样品中加入莱克多巴胺的方式模拟含有莱克多巴胺的样品。精确称取1g猪肉，干燥后粉碎，按照10μg/kg的量加入莱克多巴胺标准品，搅拌混匀，作为待检样品，将待检样品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得初步样品溶液。

3、衍生化处理

3.1、向10mL离心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸钠缓冲盐，40μL莱克多巴胺标准品溶液或初步样品溶液，60μL衍生试剂溶液，将离心管震荡10s后，密封，于40-50℃反应10-15min，取出冷却后备用。

3.2、取4ml衍生化初步样品溶液，加入氯化钠溶液至氯化钠浓度为1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取剂)和1400μL丙酮(分散剂)的混合溶液，超声2.5min，离心分5min(5000r min^-1)，两相分离，取底层小液滴用氮气吹干，用0.5mL甲醇复溶，过0.22μm膜，得待测样品溶液。

4、HPLC-FLD检测

4.1采用外标法，将衍生化的储备液用甲醇稀释，得到一系列不同浓度的衍生化莱克多巴胺标准溶液，采用下述色谱条件对不同浓度的标准溶液进行高相液相色谱-荧光检测，绘制浓度对峰面积的标准曲线。色谱条件：色谱柱为Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流动相A：体积分数30％甲醇水溶液；流动相B:体积分数70％甲醇水溶液。梯度洗脱条件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速为1.0mL min^-1,进样量＝10μL；柱温＝30℃；荧光检测的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

4.2取衍生化的待测样品溶液，按照相同的色谱条件进行高相液相色谱-荧光检测，结果如表8所示。

表8

Claims

1.一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的HPLC检测方法，其特征是：采用高效液相色谱荧光检测法进行检测，所用的待测样品溶液的制备包括以下步骤：

（1）沙丁胺醇的初步提取：将饲料或肉类食品用乙腈和水的混合溶液超声萃取，离心所得萃取上清液在气体保护下干燥，然后用水溶解、过膜除杂，得初步样品溶液；

（2）用荧光试剂2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯对初步样品溶液进行荧光标记；

（3）荧光标记的初步样品溶液的超声辅助分散液液微萃取：向荧光标记初步样品溶液中加入氯化钠，混合均匀后加入分散剂与萃取剂的混合液，所得混合物在超声下萃取，萃取后离心分离，取底层液体，用保护性气体吹干，然后用甲醇复溶，过膜除杂，得待测样品溶液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：荧光标记包括以下步骤：取4ml pH 7-10的缓冲溶液，加入40μL初步样品溶液，然后加入荧光试剂乙腈溶液，震荡后密封，在20-60℃反应10-30min，即得荧光标记的初步样品溶液。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征是：荧光标记时，荧光试剂的用量大于理论需求量；pH为8.5-9.0；反应温度为40-50℃，反应时间为10-15min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤（3）中，所述分散剂为乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，优选为丙酮；所述萃取剂为二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，优选为二氯甲烷。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤（1）中，每1g饲料或肉类食品所得的提取物用1ml水溶解；步骤（3）中，每4ml初步样品溶液所得的吹干的底层液体用0.5ml甲醇复溶。

6.根据权利要求1、4或5所述的检测方法，其特征是：步骤（3）中，分散剂、萃取剂和加入氯化钠的荧光标记初步样品溶液的体积比为500-1500μL：50-150μL：1.5-5.5ml，优选为1400 μL：145μL：4ml；氯化钠在混合液中的重量体积分数为0-5%，不包括0%，优选为1%。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤（3）中，超声萃取时间为2-6min，优选为2.5min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：采用外标法检测饲料或肉类食品中的沙丁胺醇，外标法所用的沙丁胺醇标准品采用与初步样品溶液同样的荧光标记方法进行荧光标记。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：高效液相色谱条件如下：色谱柱为Hypersil C18，流动相A：体积分数30 % 的甲醇水溶液； B:体积分数70 %的甲醇水溶液，梯度洗脱条件：0~5 min (30-90 %B), 5~7 min (90-100 % B),8~10 min (100-100 %B)；流速为1.0 mL min^-1，柱温为30 ℃；荧光检测时，λ_ex=279 nm，λ_em=380 nm。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述肉类食品包括鸡肉、猪肉、鱼肉等生肉或熟肉，还包括以这些肉类为原料进行加工得到的半成品或成品。