CN105866316B

CN105866316B - 一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法

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Publication number: CN105866316B
Application number: CN201610466430.1A
Authority: CN
Inventors: 赵先恩; 和永瑞; 王仁君; 颜平; 王玉花; 魏娜; 雷翠华; 朱树芸; 尤进茂
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Institute of food, drug and environmental control (Shandong) Group Co.,Ltd.
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: CN105866316A

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法。该方法首次以4’‑碳酰氯‑罗丹明为衍生试剂，使用超声辅助‑原位衍生‑分散液液微萃取技术对食品中的氨基酸和生物胺进行同时衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱进行定性定量检测分析。本发明的方法可用于同时分析检测8种氨基酸和9种生物胺，以1,7‑二氨基庚烷为内标物，通过内标法定量，准确得到不同食品中氨基酸和生物胺的含量。该方法具有简单、快速、灵敏度高、选择性好等优势，且得到良好的回收率结果。对于食品质量的评价和监督提供了准确、可靠的技术手段。

Description

一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法，尤其是涉及一种利用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂，超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。

背景技术

氨基酸和生物胺是一类具有生物活性的低分子质量含氮有机化合物，广泛存在于各类食品中，例如：红酒，白酒，啤酒，肉制品，奶酪，水产品等。近年来的研究表明，生物胺的产生主要来源于微生物体内游离氨基酸的脱羧作用，摄入适量的氨基酸和生物胺对于维持人体正常的生理活动是必需的。如果食品中生物胺含量超标，会严重影响食品风味甚至改变其成分，而且对人体产生严重的毒害作用，造成人体神经系统和心血管系统损伤，因此，食品中氨基酸和生物胺的含量检测与监督引起了广泛关注。

但氨基酸和生物胺分子往往缺乏光谱、色谱或质谱灵敏检测的化学结构，并且在食品中的含量低、基质干扰严重，因此采用传统的紫外-可见光谱法、色谱法及质谱法检测的灵敏度都很低，难以准确定量。使用化学衍生手段，提高色谱-质谱检测灵敏度是一个很好的解决办法。中国专利（CN103837635A）公开了一种利用商品化丹磺酰氯作为衍生试剂，通过超高效液相色谱法对鱼露样品中的生物胺进行测定的分析方法，显著提高了生物胺的灵敏度。丹磺酰氯是测定生物胺中应用较多的衍生试剂，但是该衍生试剂存在衍生反应时间长，试剂本身及衍生产物易分解，生成干扰副产物等缺点；文献《RP-HPLC 柱后衍生法检测干酪中6 种生物胺》（中国食品学报，2015, 15(5): 213-218）使用邻苯二甲醛为衍生试剂，对干酪中的生物胺进行了定量检测，但邻苯二甲醛的衍生物不稳定需尽快检测，重复性差、衍生时间长等，且仅与初级胺反应，一定程度上限制了它的广泛使用。因此，开发一种衍生化反应条件温和、简单、快速、高灵敏且能同时测定食品中多种氨基酸和生物胺的分析方法，对于食品质量的监督和评价具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确且高灵敏的同时检测食品中多种氨基酸和生物胺。本发明的目的是提供一种原位衍生技术，对氨基酸和生物胺同时衍生标记及检测分析方法。首次使用了4’-碳酰氯-罗丹明对氨基酸和生物胺的活性基团进行衍生化，同时利用溴苯替代了传统的、毒性的氯代溶剂作为萃取剂，解决了环境不友好的问题。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法，所述的氨基酸和生物胺在温和条件下与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生原位衍生反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

上述分析方法具体包括以下步骤：

a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取：取10-100 µL标准品混合溶液或预处理的待测样品，10-30 µL内标物溶液、500-800 µL pH 8.0-10.0的 NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲溶液，加入离心管中，注入60-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液，摇匀后密封，在温度10-60 ºC水浴中超声波振荡反应1-5分钟；离心分离，所得沉积相取出后用乙腈定容到200 µL，得氨基酸和生物胺衍生物萃取物溶液；

b. 将氨基酸和生物胺衍生物萃取物溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

进一步的，所述待测样品为液体时采用的预处理方法为：将液体样品直接超声3min后即可；所述待测样品为固体时采用的预处理方法为：将固体样品粉碎或匀浆后，每2 g固体样品中加入20 mL浓度为0.1 mol/L的盐酸，超声3 min后离心，取上清液即可。

进一步的，所述内标物溶液为1×10^-5mol/L 的1,7-二氨基庚烷的乙腈溶液；所述萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷或溴苯；所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇。

进一步的，所述萃取剂最优化的为溴苯；所述分散剂最优化的为乙腈。

进一步的，所述4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10^-2mol/L。

本发明所使用的衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g4’-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。

进一步的，所述氨基酸为酪氨酸(Tyr)，组氨酸(His)，2-苯乙氨酸(Phe)，色氨酸(Try)，赖氨酸(Lys)，鸟氨酸(Orn)，精氨酸(Arg)，瓜氨酸(Cit)；所述生物胺为酪胺(TYM)，组胺(HIM)，2-苯乙胺(PEA)，色胺(TRM)，尸胺(CAD)，腐胺(PUT)，胍基丁胺(AGM)，亚精胺(SPD)，精胺(SPM)。

本发明所使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 ℃，采用梯度洗脱法。

进一步的，所述梯度洗脱法，时间为10 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，6 min时35%A+65%B，8.5 min时5%A+95%B，10 min时5%A+95%B；所述质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。

本发明流动相中各分数均指体积分数。

所述的氨基酸和生物胺样品溶液为可能含有氨基酸和生物胺的红酒，白酒，啤酒，奶酪，香肠，鱼肉等的实际样品。

本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统由安捷伦1290系列超高效液相色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。

所述的氨基酸和生物胺及它们之间的生物合成与代谢关系如下：

本发明利用原位衍生技术联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，对氨基酸和生物胺的检测能够带来显著的质谱增敏效果。首次使用含有一个分子内永久正电荷的衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明来衍生氨基酸和生物胺。因此，对氨基酸和生物胺通过衍生化反应得到的衍生物进行检测时，衍生产物母离子能够产生特异性的含有罗丹明结构的报告离子，带来显著的质谱增敏检测效果。通过内标法定量，该分析方法具有良好的灵敏度、选择性和准确度，并且得到良好的回收率结果。8种氨基酸和9种生物胺所含有的活性氨基或酚羟基，能够和衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明的碳酰氯活性反应基团迅速反应。本发明克服了常规方法的反应时间长，灵敏度低，基质干扰严重等问题，大大提高了质谱检测灵敏度、选择性和准确度，并且得到良好的回收率结果。本发明为食品中氨基酸和生物胺的同时检测提供了一种高效、可靠的技术手段。以2-苯乙胺为例，4’-碳酰氯-罗丹明为衍生试剂的衍生化反应过程如下所示：

本发明中采用原位衍生技术衍生、富集、净化红酒、白酒、啤酒、奶酪、香肠、鱼肉等实际样品中的氨基酸和生物胺，该技术具有简单、快速、高效、绿色等优点。

本发明的优点及有益效果：

1. 本发明首次使用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生化试剂对食品中的多种氨基酸和生物胺进行原位衍生，衍生化反应条件温和、快速，衍生产物稳定，衍生化技术显著提高了分析物的色谱分离度和检测灵敏度。

2. 本发明所提供的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法，具有简单、快速、准确、高灵敏、环境友好的优点。

3. 本发明的分析方法针对可能含有氨基酸和生物胺的酒类饮品、肉制品、奶酪、水产品等实际样品，分析方法适用性良好。

附图说明

图1为实施例1中8种氨基酸9种生物胺及内标物的衍生物质谱检测分离图。

图2为实施例1红酒中氨基酸和生物胺的质谱检测分离图。

图3为实施例2中2-苯乙胺衍生物质谱裂解机理示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明所使用的1-溴-3-甲基丁烷，丙酮等化学试剂为分析纯，乙腈为色谱纯。

本发明中衍生化萃取物经滤膜（0.45 μm）过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

本发明所使用衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明合成方法如下：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明(2 mmol，合成方法参考申请人发表的论文Journal of Chromatography A, 2016,1437: 49–57.)，30.0 mL氯化亚砜加入100 mL单口烧瓶中，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体。用乙醚重结晶，得到0.42 g紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明，收率45.5％。

实施例1

氨基酸和生物胺的色谱分离和质谱定性定量分析方法：

氨基酸和生物胺标准品（购自Sigma试剂公司）用50%乙腈/水溶液配制得到浓度为1×10^-5mol/L的氨基酸和生物胺混合标准品溶液。取10 µL氨基酸和生物胺混合标准品溶液，置于1.5 mL的离心管中，加入10 µL 1×10^-5mol/L 1,7-二氨基庚烷-乙腈溶液，加入800 µL pH 9.2碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，随后立即加入200 µL 1×10^-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明乙腈溶液和90 µL溴苯，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min（25 ℃，超声频率40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。

流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，按照上述部分的梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图1为8种氨基酸和9种生物胺及内标物的衍生物质谱检测分离图，18种分析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，各种分析物的衍生物在多反应监测模式（MRM）下产生相同的主要子离子m/z 398.1和m/z 441.2，将m/z 398.1用作定量子离子，m/z 441.2用作定性子离子。以2-苯乙胺衍生物为例，图2为2-苯乙胺衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]⁺ m/z 546.3，在MRM检测时产生两个特异性子离子m/z 398.1 和 m/z 441.2。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压（V）和电离能（eV）以及线性方程的相关系数、检出限和回收率见表1。

表1

实施例2

红酒/白酒/啤酒中氨基酸和生物胺的提取包括以下操作步骤：

取以上三种酒各100 µL到3个离心管中，超声3 min随后用有机滤膜过滤。以备原位衍生；取90 µL分别置于1.5 mL的离心管中，加入10 µL 1×10^-5mol/L 1,7-二氨基庚烷乙腈溶液，加入500 µL pH 10的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，随后立即加入200 µL 1×10^-2mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液（红酒分散剂为甲醇，白酒为丙酮，啤酒为乙腈）和120 µL萃取剂（红酒萃取剂为溴代环己烷，白酒为1-溴代辛烷，啤酒为溴苯），漩涡混匀震荡5 s，将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，5 min（10℃，40 KHz）后取出；高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后进样2 µL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。

实施例3

奶酪中氨基酸和生物胺的提取包括以下操作步骤：

准确称取2.0 g奶酪，匀浆后转移到50 mL的离心管中，快速注入20 mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，进行提取，在室温下对其进行超声处理3 min，随后离心5 min，转速10000 r/min, 使氨基酸和生物胺溶出更彻底，减少前处理中氨基酸和生物胺损失。随后，合并上清液；取100 µL分别置于1.5 mL的离心管中，加入30 µL 1×10^-5mol/L 1,7-二氨基庚烷乙腈溶液，加入800 µL pH 8的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，随后立即加入300 µL 1×10^-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液和200 µL1-溴-3-甲基丁烷，漩涡混匀震荡5 s，将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，3 min（50 ℃，40KHz）后取出；高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后进样2µL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。

实施例4

香肠中氨基酸和生物胺的提取包括以下操作步骤：

准确称取2.0 g香肠，匀浆后转移到50 mL的离心管中，快速注入20 mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，进行提取，在室温下对其进行超声处理3 min，随后离心5 min，转速10000 r/min。随后，合并上清液；取10 µL上清液置于1.5 mL的离心管中，加入10 µL 1×10^-5mol/L 1,7-二氨基庚烷乙腈溶液，加入800 µL pH为9的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，随后立即加入200 µL 1×10^-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液和60 µL溴苯，漩涡混匀震荡5 s，将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，3 min（60 ℃，40 KHz）后取出；高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后进样2 µL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。

实施例5

鱼肉中氨基酸和生物胺的提取包括以下操作步骤：

准确称取2.0 g鱼，匀浆后转移到50 mL的离心管中，快速注入20 mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，进行提取，在室温下对其进行超声处理3 min，随后离心5 min，转速10000 r/min。随后，合并上清液；取100 µL上清液，置于1.5 mL的离心管中，加入20 µL 1×10^-5mol/L 1,7-二氨基庚烷-乙腈溶液，加入800 µL pH 9.2碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，随后立即加入250 µL 1×10^-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明乙腈溶液和150 µL溴苯，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min（25 ℃，超声频率40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。

将实施例2-5进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析，使用安捷伦SBC18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 ℃，采用梯度洗脱法；梯度洗脱法，时间为10 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，6 min时35%A+65%B，8.5 min时5%A+95%B，10 min时5%A+95%B；质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。以实际样品红酒为例，质谱检测分离图见图3。检测到各种食品中氨基酸和生物胺的含量（n=3) 如表2所示。

表2

对比例1

该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，采用商品化丹磺酰氯作为衍生试剂进行对比。

对比例2

该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，采用商品化邻苯二甲醛作为衍生试剂。

下表3为实施例2同对比例1和2的实验结果对比。

表3

表3结果表明，本发明利用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术，具有快速、简单、灵敏、绿色等优点。本发明的检出限比对比例低20-600倍左右。本发明使用溴苯为萃取剂，代替了传统的氯代溶剂，更符合绿色化学精神。

本分析方法中氨基酸和生物胺的线性范围4.50-2.25×10⁴ng/L，检出限分布于0.90 -80 ng/L之间，定量限分布于4.50-475 ng/L之间。表1-2结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于不同食品中的氨基酸和生物胺的含量测定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法，其特征在于：所述的氨基酸和生物胺在温和条件下与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生原位衍生反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测；

具体包括以下步骤：

b. 将氨基酸和生物胺衍生物萃取物溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测；

所述4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明加入30mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明;

所述内标物溶液为1×10^-5mol/L 的1,7-二氨基庚烷的乙腈溶液；所述萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷或溴苯；所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；

所述氨基酸为酪氨酸(Tyr)，组氨酸，2-苯乙氨酸，色氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，瓜氨酸；所述生物胺为酪胺，组胺，2-苯乙胺，色胺，尸胺，腐胺，胍基丁胺，亚精胺，精胺；

所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 ℃，采用梯度洗脱法；

所述梯度洗脱法，时间为10 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，6 min时35%A+65%B，8.5 min时5%A+95%B，10 min时5%A+95%B；所述质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述待测样品为液体时采用的预处理方法为：将液体样品直接超声3 min后即可；所述待测样品为固体时采用的预处理方法为：将固体样品粉碎或匀浆后，每2 g固体样品中加入20 mL浓度为0.1 mol/L的盐酸，超声3min后离心，取上清液即可。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述萃取剂为溴苯；所述分散剂为乙腈。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10^-2mol/L。