CN105866303B - 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法 - Google Patents

一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105866303B
CN105866303B CN201610466429.9A CN201610466429A CN105866303B CN 105866303 B CN105866303 B CN 105866303B CN 201610466429 A CN201610466429 A CN 201610466429A CN 105866303 B CN105866303 B CN 105866303B
Authority
CN
China
Prior art keywords
neurotransmitter
liquid
derivative
detection method
acetonitrile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610466429.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105866303A (zh
Inventor
赵先恩
和永瑞
魏娜
王仁君
颜平
王玉花
郑龙芳
朱树芸
尤进茂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Zhurong Property Co Ltd
Original Assignee
Qufu Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qufu Normal University filed Critical Qufu Normal University
Priority to CN201610466429.9A priority Critical patent/CN105866303B/zh
Publication of CN105866303A publication Critical patent/CN105866303A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105866303B publication Critical patent/CN105866303B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法。该检测方法首次以4’‑碳酰氯‑罗丹明为衍生试剂，使用超声辅助‑原位衍生‑分散液液微萃取技术对氨基酸类和单胺类神经递质进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱进行定性定量检测。采用三种内标物（异丙肾上腺素，5‑羟吲哚‑2‑羧酸，正亮氨酸）用于三类化学结构的神经递质线性方程建立。通过内标法定量，准确测定神经递质的存在。本发明具有简单、快速、灵敏度高、选择性好，且回收率结果良好等优势，能快速、准确测定神经递质。

Description

一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法，尤其是涉及一种利用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂，超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱同时检测多种神经递质的分析方法。
背景技术
神经递质（neurotransmitter）在突触传递中是担当“信使”的特定化学物质。神经递质分子极性强、缺乏能够灵敏检测的化学结构，并且在脑微透析液中和尿液中的含量低、基质干扰严重。采用传统的紫外-可见光谱法、色谱法及质谱法检测的灵敏度都很低，难以准确定量。化学衍生手段是提高色谱-质谱检测灵敏度的一个很好的解决办法。衍生化技术能够有效的提高检测灵敏度，现有技术中，对于神经递质的检测分析多采用邻苯二甲醛（OPA）或者苯甲酰氯为衍生试剂，但邻苯二甲醛衍生物不稳定、重复性较差、衍生过程时间长等缺点，一定程度上限制了它的广泛使用；苯甲酰氯易水解，且对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激作用；且采用邻苯二甲醛（OPA）或者苯甲酰氯进行检测时，无法同时检测出氨基酸类和单胺类的神经递质，耗时长，步骤繁琐。因此，开发一种衍生反应条件温和、简单、高效、灵敏度高且能多成分同时检测的分析方法成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的反应时间长，灵敏度低，基质干扰严重，不能同时测定多种成分，污染严重等问题，本发明提供了一种基于原位衍生测定多种神经递质的分析方法，本发明利用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取的样品前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱分离检测系统，能够同时测定待测样品中多种氨基酸类和单胺类神经递质，大大提高了质谱检测灵敏度、选择性和准确度，且得到了良好回收率。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法，其特征在于：所述的神经递质与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生超声辅助-原位衍生反应，经超声辅助-分散液液微萃取富集纯化，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
上述检测方法具体包括以下步骤：
a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取：取20-50 µL神经递质标准品混合溶液或待测样品，30 µL内标物溶液、800-1500 µL pH 8.0-10.0的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，加入离心管中，注入80-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明分散剂溶液，混合均匀后放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，反应结束后高速离心，吸取下层有机相并用乙腈定容到200 µL，得氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液；
所述内标物溶液是由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成；
所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷，溴苯；
所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；
b. 将上述氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液经滤膜过滤后，利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
进一步的，步骤a中所述的萃取剂最优化的为溴苯；所述分散剂最优化的为乙腈。
进一步的，步骤a中所述的4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10-2 mol/L。
本发明所使用的衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922g 4’-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。
进一步的，所述步骤a中所述超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取为在温度20-50℃，超声频率为40 KHz条件下反应1 -5 min。
进一步的，所述神经递质包括氨基酸类神经递质和单胺类神经递质；所述氨基酸类神经递质包括谷氨酸，γ-氨基丁酸，门冬氨酸，色氨酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸；所述单胺类神经递质包括：左旋多巴，多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素，3-甲氧酪胺，去甲变肾上腺素，变肾上腺素，高原儿茶酸，3,4-二羟基扁桃酸，DL-3,4-二羟基苯基二醇，高香草酸，香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇，羟色胺酸，5-羟色胺，5-羟吲哚乙酸，犬尿素，3-羟基犬尿氨酸，3-羟基邻氨基苯甲酸，犬尿酸。
本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法。
上述的梯度洗脱法，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸；色谱分离梯度条件为0 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A+95%B，16 min时5%A+95%B或0 min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95%B；质谱的条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
本发明流动相中各分数均指体积分数。
本发明所述的神经递质标准品混合溶液为将神经递质标准品加入体积分数为50%的乙腈/水配制，得到浓度为5.0 × 10−5 mol L-1的神经递质标准品溶液。本发明所使用的三种内标物用于三类化学结构的神经递质的线性方程建立：异丙肾上腺素（IP），5-羟吲哚-2-羧酸（5-HICA），正亮氨酸（NIe）。
本发明首次使用4’-碳酰氯-罗丹明对多种神经递质分子的活性基团进行衍生化，建立的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术简单、快速、高效。由于4’-碳酰氯-罗丹明试剂结构中含有一个稳定的分子内永久正电荷，利用原位衍生联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，能够带来显著的质谱增敏检测效果。另外，本发明克服了常规方法的等问题，大大提高了质谱检测灵敏度、选择性和准确度，且得到了良好回收率结果。本发明对脑微透析液和尿液中的氨基酸类和单胺类神经递质的同时检测提供了一种高效、可靠的技术手段。本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确且高灵敏地同时检测氨基酸类和单胺类神经递质。
本发明中首次使用含有一个分子内永久正电荷的衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明来衍生神经递质。因此，神经递质通过衍生化反应得到的衍生物进行检测时，衍生产物母离子能够产生特异性的含有罗丹明结构的报告离子，带来显著的质谱增敏检测效果。通过内标法定量，带来了该检测方法良好的灵敏度、选择性和准确度，和良好的回收率结果；本发明通过将传统的、毒性的氯代萃取溶剂更换为溴代溶剂，解决了环境不友好的问题。氨基酸类和单胺类神经递质所含有的活性氨基或酚羟基，能够和衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明迅速反应。以高原儿茶酸（DOPAC）为例，4’-碳酰氯-罗丹明为衍生试剂的衍生化反应示意图如下所示：
本发明的优点及有益效果：
1. 本发明首次使用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生化试剂对神经递质进行原位衍生，衍生化反应条件温和、快速，衍生产物稳定，衍生化技术显著提高了分析物的色谱分离度和检测灵敏度。
2. 本发明所提供的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测手段，采用内标法定量，实现了多种神经递质的简单、快速、准确、高灵敏的同时测定且环境友好。
3. 本发明的检测分析方法成功应用于大鼠脑微透析液或尿液中多种神经递质的检测，方法适用性良好。
附图说明
图1为实施例1中针对帕金森病和阿尔茨海默症的神经递质标准品分析方法质谱检测分离图。
图2为实施例1中高原儿茶酸（DOPAC）衍生物质谱裂解机理示意图。
图3为实施例2中帕金森病大鼠脑微透析液中神经递质的质谱检测分离图。
图4为实施例4中针对抑郁症的神经递质标准品分析方法质谱检测分离图。
图5为实施例5中抑郁症大鼠脑微透析液中神经递质的质谱检测分离图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中衍生化萃取物经0.45 μm滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
本发明所使用的衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明合成方法如下：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明(2 mmol，合成方法参考申请人发表的论文Journal of Chromatography A,2016, 1437: 49–57.)，30.0 mL氯化亚砜加入100 mL单口烧瓶中，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体。用乙醚重结晶，得到0.42 g紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明，收率45.5％。
实施例1
针对帕金森病和阿尔茨海默症大鼠脑微透析液中神经递质标准品分析方法：
神经递质标准品（19种，购自Sigma试剂公司）用乙腈/水配制，得到浓度为5.0 ×10−5 mol L-1的神经递质标准品溶液。取50 µL神经递质标准品溶液置于1.5 mL的离心管中，向所述的标准品溶液中加入30 µL内标物溶液（内标物溶液由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成）、加入800 µL pH 9.5的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，随后立即加入80 µL溴苯和200 µL摩尔浓度为0.01 mol/L的4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀，将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min（25 °C，40 KHz）后取出，高速离心（10000 rpm, 2min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。衍生化产物溶液经滤膜过滤后取2 µL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析；
检测分析：流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸；色谱分离梯度条件为0 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A+95%B，16 min时5%A+95%B；质谱条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV；
图1为针对帕金森病和阿尔茨海默症的神经递质标准品分析方法质谱检测分离图，分析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，分析物多反应监测模式（MRM）下产生相同的主要子离子m/z 398.1和m/z 443.1，m/z 398.1用作定量子离子，m/z 443.1用作定性子离子。以高原儿茶酸 (DOPAC)衍生物为例，图2为高原儿茶酸 (DOPAC) 衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z为1018.49 能够产生两个特异性子离子m/z 398.1 和m/z 443.1。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压（V）和电离能（eV）以及分析方法的相关系数、检出限见表 1。
表1
实施例2
1. 大鼠分组、给药及脑微透析取样：
将16只体重为200~250 g的雄性SD 大鼠分为2组，第1组为对照组，第2组为模型组。帕金森模型造模过程及行为学评价与文献（Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2011, 98: 286-291）保持一致。上述模型组大鼠需要经历以下3个实验阶段：第1个阶段，为造模成功后且能自由活动的帕金森病模型大鼠，自由饮水、饮食，在清醒状态下自动收集脑微透析液，并采用上述分析方法测定其中神经递质的含量；第2阶段，对第1阶段的大鼠迅速灌胃给予黄芩素（280 mg·kg-1）进行治疗，并自动收集脑微透析液；待神经递质浓度恢复到接近第一阶段时，准备实施第3阶段的实验；第3阶段，上述大鼠给予传统西药美多巴（60 mg·kg-1）进行治疗，并自动收集脑微透析液；超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定脑微透析液中神经递质：
上述3个不同实验阶段的脑微透析液各取20 µL，分别加入30 µL内标物溶液（内标物溶液由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成），加入1000 µL pH为9的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，分别加入100 µL1-溴-3-甲基丁烷和200 µL摩尔浓度为1×10-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min（35°C，40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，经滤膜过滤，采用同实施例1相同的梯度洗脱及质谱条件进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。图3为帕金森病大鼠脑微透析液神经递质质谱检测分离图。
正常组和帕金森病模型组大鼠（含3个实验阶段）脑微透析液中神经递质含量（n=3) ，以及正常大鼠脑微透析样品测定回收率结果，如表2所示。
表2
与正常组比较，# 表示 P ＜ 0.05， ### 表示 P ＜ 0.01；与实验阶段1比较，*表示 P ＜ 0.05， *** 表示 P ＜ 0.01；
实施例3
1. 阿尔茨海默症模型大鼠及尿液取样：
8只体重为200~250 g的雄性SD 大鼠，需要经历以下2个实验阶段：第1个阶段为正常状态大鼠，自由饮水、饮食，收集其尿液，用于检测神经递质浓度；第2个实验阶段，阿尔茨海默症模型大鼠造模过程及行为学评价参照文献进行（Journal of Mass Spectrometry,2015, 50: 354-363），并与文献一致，表明造模成功。自由饮水、饮食，收集其尿液。
超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定脑微透析液中神经递质含量：
上述2个不同实验阶段的尿液各取50 µL，分别加入30 µL内标物溶液（内标物溶液由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成），加入1500 µL pH 8的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，分别加入200 µL溴代环己烷和300 µL摩尔浓度为1×10-2 mol/L4’-碳酰氯-罗丹明乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，5 min（10 °C，40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。经滤膜过滤，采用同实施例1相同的梯度洗脱及质谱条件进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。
正常组和阿尔茨海默症模型组大鼠尿液中神经递质含量（n=3) ，以及正常大鼠尿液样品测定回收率结果，如表3所示。
表3
与正常组比较，* 表示 P ＜ 0.05，*** 表示 P ＜ 0.01
实施例4
针对抑郁症大鼠脑微透析液的神经递质标准品分析方法：
神经递质标准品（18种，购自Sigma试剂公司）用乙腈/水配制得到浓度为5.0 ×10−5 mol L-1的神经递质标准品溶液，取50 µL置于1.5 mL的离心管中，加入30 µL内标物溶液（内标物溶液由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成），加入800 µL pH 9.5的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，随后立即加入80 µL1-溴代辛烷和200 µL摩尔浓度为1×10-2 mol/L4’-碳酰氯-罗丹明丙酮溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1min（25 °C，40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。衍生化产物溶液经有机滤膜过滤后取2 µL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。
检测分析：流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸；色谱分离梯度条件为：0 min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95%B；质谱的条件同实施例1，图4为针对抑郁症大鼠脑微透析液神经递质标准品分析方法质谱检测分离图，分析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，分析物多反应监测模式（MRM）下产生相同的主要子离子m/z 398.1和m/z 443.1，m/z 398.1用作定量子离子，m/z 443.1用作定性子离子。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压（V）和电离能（eV）以及分析方法的相关系数、检出限和回收率见表4。
表4
实施例5
1. 大鼠分组、给药及脑微透析取样：
将16只体重为200~250 g的雄性SD 大鼠分为2组，第1组为正常对照组，第2组为抑郁症模型组，抑郁症模型大鼠造模参照文献（Analytical Chemistry, 2012, 84: 10044−10051）进行，造模成功，与文献结果一致。抑郁症模型组大鼠需要经历以下3个实验阶段：第1个实验阶段为抑郁症模型大鼠造模成功后，自由饮水、饮食，自动收集脑微透析液；第2个实验阶段，对第1个实验阶段的大鼠灌胃给予和厚朴酚（40.0mg·kg-1），自动收集脑微透析液，待和厚朴酚药效消失，该组大鼠进入第3个实验阶段；第3个实验阶段，对第2个实验阶段的大鼠灌胃给予传统西药“氟西汀”（10.0mg·kg-1），自动收集脑微透析液。
超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定脑微透析液中神经递质：
上述3个不同实验阶段的脑微透析液各取20 µL，加入含内标物，加入800 µL pH9.5的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，加入80 µL萃取剂和200 µL分散剂（含衍生试剂）的混合溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min（25 °C，40 KHz）后取出。高速离心（10000 rpm, 2 min），有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200µL。衍生化产物溶液经滤膜过滤，进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析：流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸；色谱分离梯度条件为：0min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12min时5%A+95%B；质谱的条件同实施例1。
实施例5中，正常组和抑郁症模型组大鼠（含3个实验阶段）脑微透析液神经递质含量（n=3) 如表5所示。
表5
与正常组比较，* 表示 P ＜ 0.05， *** 表示 P ＜ 0.01；与实验阶段1比较，#表示 P ＜ 0.05， ### 表示 P ＜ 0.01；
对比例1
该对比例过程与实施例1相同，不同在于衍生化反应过程中：衍生化过程采用邻苯二甲醛（OPA）为衍生试剂。
对比例2
该对比例过程与实施例1相同，不同在于衍生化反应过程中：衍生化过程采用苯甲酰氯为衍生试剂。
对比例3
该对比例过程与实施例1相同，不同在于未经衍生化反应，采用高效液相色谱-电化学直接检测法。
下表6为实施例1同对比例1、2和3的实验结果对比。
表6
由表6可知，本发明利用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术，具有快速、简单、灵敏等优点。本发明分析方法检出限比对比例低5-100倍左右，具有较高的灵敏度。本发明使用溴苯为萃取剂，代替了传统的氯代试剂，降低了实验过程中所使用的试剂的毒性，更符合绿色化学的精神。
本发明分析方法中神经递质的线性范围2.60×10-3-20.80 nM，检出限分布于7.42×10-4-0.48 nM之间，定量限分布于2.60×10-3-1.67 nM之间。表1-5结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于检测大鼠脑微透析液和尿液中相关神经递质的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法，其特征在于：所述的神经递质与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生超声辅助-原位衍生反应，经超声辅助-分散液液微萃取富集纯化，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测；
具体包括以下步骤：
a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取：取20-50 µL神经递质标准品混合溶液或待测样品，30 µL内标物溶液、800-1500 µL pH 8.0-10.0的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，加入离心管中，注入80-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明分散剂溶液，混合均匀后放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，反应结束后高速离心，吸取下层有机相并用乙腈定容到200 µL，得氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液；
所述内标物溶液是由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 µL浓度为1×10-5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成；
所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷或溴苯；
所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；
b. 将上述氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液经滤膜过滤后，利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测；
所述4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明加入30mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中所述的萃取剂为溴苯；所述分散剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中所述的4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10-2 mol/L。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤a中所述超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取为在温度20-50℃，超声频率为40 KHz条件下反应1 -5 min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述神经递质包括氨基酸类神经递质和单胺类神经递质；所述氨基酸类神经递质包括谷氨酸，γ-氨基丁酸，门冬氨酸，色氨酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸；所述单胺类神经递质包括：左旋多巴，多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素，3-甲氧酪胺，去甲变肾上腺素，变肾上腺素，高原儿茶酸，3,4-二羟基扁桃酸，DL-3,4-二羟基苯基二醇，高香草酸，香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇，羟色胺酸，5-羟色胺，5-羟吲哚乙酸，犬尿素，3-羟基犬尿氨酸，3-羟基邻氨基苯甲酸，犬尿酸。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2µL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的梯度洗脱法，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸；色谱分离梯度条件为0 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A+95%B，16 min时5%A+95%B或0 min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95%B。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行检测时质谱的条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
CN201610466429.9A 2016-06-24 2016-06-24 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法 Active CN105866303B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610466429.9A CN105866303B (zh) 2016-06-24 2016-06-24 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610466429.9A CN105866303B (zh) 2016-06-24 2016-06-24 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105866303A CN105866303A (zh) 2016-08-17
CN105866303B true CN105866303B (zh) 2018-05-25

Family

ID=56655502

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610466429.9A Active CN105866303B (zh) 2016-06-24 2016-06-24 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105866303B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106248838B (zh) * 2016-10-25 2018-09-11 杭州佰辰医学检验所有限公司 高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法
CN106645516B (zh) * 2016-12-29 2019-06-07 香港科技大学 毛发中神经递质的检测方法
CN107449841B (zh) * 2017-07-20 2020-07-17 上海药明康德新药开发有限公司 一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法
CN107966520A (zh) * 2017-11-07 2018-04-27 广东中科康仪生物技术有限公司 用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法
CN109142594A (zh) * 2018-08-14 2019-01-04 美康生物科技股份有限公司 用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒
CN108802250B (zh) * 2018-08-28 2020-09-25 上海中医药大学 超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法
CN111044642A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 贵州医科大学 一种同时测定五种神经递质含量的方法
KR102340107B1 (ko) * 2020-06-04 2021-12-17 한국과학기술연구원 유도체화를 이용한 신경전달물질 및 그의 대사체의 동시분석법
CN112630311B (zh) * 2020-07-09 2023-07-18 深圳云合医药科技合伙企业(有限合伙) 用于检测情感障碍的代谢标记物和试剂盒及使用方法
CN114621182B (zh) * 2020-12-10 2023-10-03 中国科学院深圳先进技术研究院 一种衍生化试剂及其合成方法以及基于maldi-ms原位分析单胺类神经递质的方法
CN115184525A (zh) * 2022-09-13 2022-10-14 裕菁科技(上海)有限公司 同一样品中性质相差很大的化合物的同时检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1151934A (ja) * 1997-07-31 1999-02-26 Kagakuhin Kensa Kyokai 生体成分の分析方法、及び生体成分分析装置
CN1210262A (zh) * 1998-09-18 1999-03-10 中国科学院生态环境研究中心 胺羟酰氯色谱衍生试剂及其制备工艺
WO2008071937A1 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Glaxo Group Ltd. Novel fluorescent kinase ligands and assays employing the same
CN103884676A (zh) * 2014-02-27 2014-06-25 浙江大学 一种中药材多指标成分含量的快速测定方法
CN104678028A (zh) * 2015-02-12 2015-06-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 生物原胺类神经递质的前处理和检测方法、及检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1151934A (ja) * 1997-07-31 1999-02-26 Kagakuhin Kensa Kyokai 生体成分の分析方法、及び生体成分分析装置
CN1210262A (zh) * 1998-09-18 1999-03-10 中国科学院生态环境研究中心 胺羟酰氯色谱衍生试剂及其制备工艺
WO2008071937A1 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Glaxo Group Ltd. Novel fluorescent kinase ligands and assays employing the same
CN103884676A (zh) * 2014-02-27 2014-06-25 浙江大学 一种中药材多指标成分含量的快速测定方法
CN104678028A (zh) * 2015-02-12 2015-06-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 生物原胺类神经递质的前处理和检测方法、及检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xian-En Zhao等.Simultaneous determination of amino acid and monoamine neurotransmitters in PC12 cells and rats models of Parkinson’s disease using a sensitizing derivatization reagent by UHPLC–MS/MS.《Journal of Chromatography B》.2015,第995-996卷第15-23页. *
Yongrui He等.In situ derivatization-ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction for the determination of neurotransmitters in Parkinson’s rat brain microdialysates by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.《Journal of Chromatography A》.2016,第1458卷第2.1-2.4节、3.1-3.2节，以及图1. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105866303A (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105866303B (zh) 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法
CN105866316B (zh) 一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法
Jafari et al. Determination of veterinary drug residues in chicken meat using corona discharge ion mobility spectrometry
CN106018612B (zh) 一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法
Smyth et al. A critical evaluation of high performance liquid chromatography‐electrospray ionisation‐mass spectrometry and capillary electrophoresis‐electrospray‐mass spectrometry for the detection and determination of small molecules of significance in clinical and forensic science
CN105067697B (zh) 一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法
CN106596796B (zh) 基于液液微萃取的gc-ms测卷烟烟气中芳香胺的方法
CN105044249B (zh) 水产品中28种多氯联苯快速检测前处理试剂盒及其应用
CN105758957A (zh) 蔬菜中8种喹诺酮类药物残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法及其应用
CN103389349B (zh) 水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法
CN107748212B (zh) 一种羊奶及其制品中检测药物的方法
Norouzi et al. Determination of morphine and oxymorphone in exhaled breath condensate samples: application of microwave enhanced three–component deep eutectic solvent-based air–assisted liquid–liquid microextraction and derivatization prior to gas chromatography–mass spectrometry
CN109738565A (zh) 一种测定保健食品中非法添加化合物的方法
Wei et al. Rapid and sensitive determination of multiple endocrine‐disrupting chemicals by ultrasound‐assisted in situ derivatization dispersive liquid–liquid microextraction coupled with ultra‐high‐performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry
CN105092753A (zh) 组合型胺类代谢标志物的应用及试剂盒与检测方法
CN107228914A (zh) 一种合相色谱‑串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法
CN103308641A (zh) 烟草及烟草制品中三种酰胺类除草剂的高效液相色谱-串联质谱测定方法
Zhang et al. Effects of the ambient fine particulate matter (PM2. 5) exposure on urinary metabolic profiles in rats using UPLC-Q-TOF-MS
Wang et al. Zeolite-loaded poly (dimethylsiloxane) hybrid films for highly efficient thin-film microextraction of organic volatiles in water
Murtada et al. LC-MS determination of catecholamines and related metabolites in red deer urine and hair extracted using magnetic multi-walled carbon nanotube poly (styrene-co-divinylbenzene) composite
Jain et al. Simple determination of dichlorvos in cases of fatal intoxication by gas Chromatography-Mass spectrometry
CN109459506A (zh) 一种用于茶叶中多氯联苯检测的快速样品前处理方法
CN103278586B (zh) 乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法
CN109001311A (zh) 一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法
Yang et al. Analysis of methylene blue and its metabolites in blood by capillary electrophoresis/electrospray ionization mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A detection method based on in situ derivatization for the determination of multiple neurotransmitters

Effective date of registration: 20211209

Granted publication date: 20180525

Pledgee: Zou Cheng Branch of industrial and Commercial Bank of China Ltd.

Pledgor: Zoucheng Xinqi Property Management Co.,Ltd.

Registration number: Y2021980014651

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211213

Address after: 273500 No. 517, Chenggong Road, Zoucheng City, Jining City, Shandong Province

Patentee after: Zoucheng Xinqi Property Management Co.,Ltd.

Address before: 273165 Jingxuan West Road, Qufu City, Jining, Shandong Province, No. 57

Patentee before: QUFU NORMAL University

TR01 Transfer of patent right
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 273500 No. 517, Chenggong Road, Zoucheng City, Jining City, Shandong Province

Patentee after: Shandong Zhurong Property Co., Ltd.

Address before: 273500 No. 517, Chenggong Road, Zoucheng City, Jining City, Shandong Province

Patentee before: Zoucheng Xinqi Property Management Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder