CN108802250B - 超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法 - Google Patents
超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体涉及超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，步骤包括：脑微透析液用乙腈‑水溶液或乙腈‑甲酸水溶液稀释配制的脑微透析样本液，用超高效液相色谱‑质谱/质谱进行定性和/或定量检测。该方法只需对脑微透析液进行简单稀释，即可通过超高效液相色谱‑质谱/质谱系统一次实现11种神经递质实时的定性和定量检测，检测结果可控、准确、稳定，方法使用性良好，且分析时间短。克服因神经递质种类多、神经递质含量低、基质效应大等导致的检测方法处理繁琐、耗时长、准确性低、数据单一等缺陷，具有可预期的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法。
背景技术
神经递质是指由突触前神经元合成并在末梢处释放，能特异性作用于突触后神经元或效应器细胞上的受体，并能起到信息传递作用的一类化学物质。神经递质主要包括γ-氨基丁酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸类，多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等单胺类，乙酰胆碱、胆碱等胆碱类及肽类等。
大脑中枢系统内存在大量的神经递质，其含量变化对生物体的行为有着重要影响，并与多种疾病密切相关，包括抑郁症、阿尔茨海默症、癫痫、帕金森在内的多种疾病，对人的心理及生理健康造成了严重危害。有研究表明，帕金森病是由于黑质纹状体通路中多巴胺递质显著减少所致；单胺假说认为单胺类神经递质浓度水平或功能降低是抑郁症的生物学基础；脑缺血状态下的神经细胞和胶质细胞摄取EAAs功能下降或受损，使细胞外EAAs含量增高，进而导致神经元死亡，引发神经毒性。因此，对脑透析液、组织匀浆液等生物样本进行神经递质含量测定，并监测脑内神经递质含量的变化，对神经学研究及相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义，对于揭示神经中枢中化学过程与认知、行为及情绪状态等之间的关系有着重要作用。由于大部分神经递质在生物样本中含量低、基质复杂、内源性成分干扰大，因而其含量的测定对于样本的前处理、仪器的灵敏度等均有着较高的要求。
目前，生物样本中神经递质的检测方法已经有了很多报道。单胺类神经递质较为常用的有电化学、荧光法、毛细管电泳法和液质联用法(LC-MS/MS)；氨基酸类神经递质多采用柱前衍生化后的荧光法检测；胆碱类主要采用电化学检测。不同类型神经递质的检测大都采用高效液相系统进行分离，在前处理方法和检测系统(检测器)的选择上有差异，不能实现同时检测。生物样本中神经递质的检测所面临的问题，主要包括以下几个方面：1、神经递质的含量很低，且属于内源性物质，其他物质对其干扰较大；2、单胺类成分的化学性质不稳定，在光照和碱性条件下易发生氧化分解；3、氨基酸类递质采用HPLC-荧光法需要对检测样本进行衍生化以使其产生荧光，加大了分析检测及方法学建立上的难度。
在神经递质研究的样本采集、前处理方法上，目前国内外采集的生物样本主要来源于脑组织、血液、尿液及脑脊液等。前处理方法主要有固相萃取法、有机溶剂沉淀法、固相微萃取法及微透析法。其中，微透析技术是一种能够应用于清醒或麻醉动物体内，对内源性生物分子与药物成分浓度进行同时连续监测的采样技术，具有活体、微创、实时、动态等特点。
目前用于神经递质检测的微透析技术所用探针膜长一般在3～4mm，通常用于大鼠脑内较大核团中单一种类的神经递质检测，于临床或实验监测的实时、快速、准确、数据多样化等要求仍有一定差距。因一些较小核团不适宜采用3～4mm膜长的探针进行采样，为保证脑内核团定位的准确性有必要采用膜长较小的探针进行微透析采样。而探针回收率与膜长密切相关，探针膜长越小，回收率越低，在透析液中神经递质含量较低的情况下，如何实现对多种类神经递质的同时检测仍是需要解决的问题。
电化学法和荧光法很难一次定量检测生物透析液中多种神经递质，UPLC-MS/MS结合了超高液相色谱和质谱，操作简单、灵敏度高、分析时间短、选择性高，是分析复杂生物样品中痕量成分的有力工具。UPLC-MS/MS进行神经递质定性和定量检测的生物样本均来自组织匀浆液，检出的神经递质种类和个数也有限，为了准确定量，氨基酸类和单胺类神经递质仍需衍生化，且只能进行单一种类神经递质检测。
以透析液作为生物样本，进行神经递质定性和定量检测的方法也有报道，但均只能用于单一种类神经递质检测。使用UPLC-MS/MS检测系统时，需透析套管在高流速下采集麻醉状态下的透析液作为生物样本，无法反映正常生理状态下的真实水平；当降低探针膜长和流速、在清醒状态下收集微透析液作为生物样本用于神经递质定性和定量检测时，因微透析液中神经递质含量低，所使用检测系统为专属于单一种类神经递质的UPLC-ECD、UPLC-荧光法或化学发光法等方法；且探针膜长越短，微透析液中神经递质含量越低，越不利于检测。
如何将微透析技术(尤其是活体微透析技术)与UPLC-MS/MS结合，一次实现脑内多种类多成分神经递质的实时、快速、准确、稳定的定性和定量监测，以便于神经学研究及相关疾病诊断和治疗，仍是需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，该方法可一次性完成脑透析液中3类11种神经递质实时的定性和定量测定，分析时间短，结果准确、可靠，临床应用前景广阔。
本发明的技术方案为，超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，步骤包括：脑微透析液用乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液稀释配制的脑微透析样本液，用超效高液相色谱-质谱/质谱进行定性和/或定量检测。
超高效液相色谱-质谱/质谱对脑微透析样本液进行定量检测时，采用标准曲线法，用溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液绘制各神经递质标准品的标准曲线，得到用于定量计算的各神经递质标准品的回归方程；
所述溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液以人工脑脊液和乙腈-水溶液或人工脑脊液和乙腈-甲酸水溶液为主要溶剂配制而成，且混合标准样本液中，人工脑脊液的体积比例恒定，具体地，人工脑脊液与混合标准样本液中其余溶液的体积比为1：1.5～4，优选为1：3。优选地，以人工脑脊液和乙腈-水溶液为主要溶剂，配制溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液，可改善峰形，减少基质效应。作为优选方案，混合标准样本液中人工脑脊液的体积比例与脑微透析样本液中脑微透析液的体积比例相同。
所述乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液中，乙腈与水或者甲酸水的体积比为1～6：1，优选为4：1；甲酸水中甲酸的体积分数为0.1％～1％，优选为0.2％。
所述溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液的制备方法包括：取11种神经递质标准品的各自溶解的单个标准溶液，或溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液，加入人工脑脊液和乙腈-水溶液或人工脑脊液和乙腈-甲酸水溶液，优选加入人工脑脊液和乙腈-水溶液，配制成溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液；且混合标准样本液中，人工脑脊液的体积比例恒定，人工脑脊液与混合标准样本液中其余溶液的体积比为1：1.5～4，优选为1：3。
溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液的制备方法包括：取11种神经递质标准品的各自溶解的单个标准溶液，加入乙腈-水溶液或者乙腈-甲酸水溶液，配制成溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液；所述乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液中，乙腈与水的体积比为1～6：1，优选为4：1；甲酸水中甲酸的体积分数为0.1％～1％，优选为0.2％；
或者，取11种神经递质标准品，用对11种神经递质均可溶的溶剂溶解，配制溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液。优选水作溶剂。
11种神经递质标准品的各自溶解的单个标准溶液的制备方法包括：取11种神经递质标准品，分别用各自对应的可溶性溶剂制备各自溶解的单个标准溶液。谷氨酸和天冬氨酸的可溶性溶剂为水，乙酰胆碱、甘氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、组胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸和多巴胺的可溶性溶剂为水、甲醇和乙腈中任意一种或组合。
11种神经递质包括胆碱类神经递质、氨基酸类神经递质和单胺类神经递质；胆碱类神经递质包括乙酰胆碱(Ach)；氨基酸类神经递质包括甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)、天冬氨酸(Asp)和组胺(Hist)；单胺类神经递质包括去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)和多巴胺(DA)。
脑微透析液与乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液的体积比为1：1.5～4，优选为1：3；乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液中，乙腈与水或甲酸水的体积比为1～6：1，优选为4：1；甲酸水中甲酸的体积分数为0.1％～1％，优选为0.2％；作为优选方案，脑微透析液加入乙腈-水溶液稀释，乙腈-水溶液中，乙腈与水的体积比为4：1，可改善峰形，减少基质效应。
脑微透析液为活体脑透析液，尤其指清醒状态下的活体脑透析液。脑微透析液指在1mm膜长、1～3μL/min流速下收集的脑微透析液，优选在1mm膜长、1～2μL/min流速下收集的脑微透析液，更优选在1mm膜长、1μL/min流速下收集的脑微透析液。
人工脑脊液为包含氯化钙、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钾和氯化钠的pH＝7.3～7.4水溶液，氯化钙、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钾和氯化钠的摩尔比为1：1.6：0.8：2.25：121，氯化钙的摩尔浓度为1.2mmol·L-1；
或者为包含氯化钙、氯化钾、氯化钠的水溶液，其pH＝7.3～7.4，氯化钙、氯化钾、氯化钠的摩尔比为1：1.3：49，氯化钙的摩尔浓度为2.97mmol·L-1；
或者为包含氯化钙、氯化镁、氯化钾、氯化钠的水溶液，其pH＝7.3～7.4，氯化钙、氯化镁、氯化钾、氯化钠的摩尔比为1：0.71：2.25：122，氯化钙的摩尔浓度为1.2mmol·L-1。
还包括脑微透析样本液和溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液分别离心取上清液，用于超高效液相色谱-质谱/质谱的定性和/或定量检测。
离心条件为：于6000～20000r/min转速下离心3～15min，转速优选为10000r/min，离心时间优选为10min。
采用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行定性和/或定量检测。超高效液相色谱检测条件为：UPLC亲水作用(HILIC)色谱柱，优选为UPLC BEH amide色谱柱，色谱柱参数为：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温30℃～40℃，优选为35℃；以乙腈-0.2％甲酸水为流动相的梯度洗脱程序为：
(1)体积比例为75％～80％的乙腈等度洗脱1～1.5min；
(2)乙腈体积比例从75％～80％匀速降至35％～40％梯度洗脱1.8～2.2min；
(3)体积比例为35％～40％的乙腈等度洗脱0.8～1min；
(4)乙腈体积比例从35％～40％瞬时切换至75％～80％后等度洗脱0.9～1.2min。
优选地，以乙腈-0.2％甲酸水为流动相的梯度洗脱程序为：0-1.2min：78％乙腈；1.2-3.2min：78％乙腈→40％乙腈；3.2-4.0min：40％乙腈；4.0-5.0min：78％乙腈。
质谱检测条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正离子模式；离子源喷雾电压：5.5kV；离子源气帘气：206.8～275.8kPa，优选241.3kPa；碰撞气：41.4～55.1kPa，优选48.3kPa；离子源温度：500℃～600℃，优选500℃；雾化气：379.2～448.2kPa，优选413.7kPa；辅助气：379.2～448.2kPa，优选413.7kPa；多反应监测模式(MRM)；
在优选超高效液相色谱和质谱检测条件下，在3.5min的分析时间(duration)内即可完成11种神经递质的定性和定量检测。
11种神经递质的质谱监测离子对为：谷氨酸的监测离子对：148.1/84.1，天冬氨酸的监测离子对：134.1/74.0，5-羟色胺的监测离子对：177.2/160.3，多巴胺的监测离子对：154.2/137.3，组胺的监测离子对：112.0/95.1，乙酰胆碱的监测离子对：146.3/87.0，甘氨酸的监测离子对：76.2/30.0，5-羟吲哚乙酸的监测离子对：192.1/146.1，谷氨酰胺的监测离子对：147.1/130.1，γ-氨基丁酸的监测离子对：104.1/87.2，去甲肾上腺素的监测离子对：170.3/152.2。
作为优选方案，超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，步骤包括：采用标准曲线法，将脑微透析样本液和溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液分别离心所得上清液，进行超高效液相色谱-质谱/质谱的定性和/或定量检测；
脑微透析样本液的制备方法包括：脑微透析液加入乙腈-水溶液稀释，脑微透析液与乙腈-水溶液的体积比为1：3，乙腈-水溶液中，乙腈与水的体积比为4：1，配制脑微透析样本液；
溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液的制备方法包括：取11种神经递质标准品的各自溶解的单个标准溶液，加入乙腈-水溶液，配制溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液；再取溶有11种神经递质标准品的混合标准溶液，加入人工脑脊液和乙腈-水溶液稀释，配制溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液；混合标准样本液中，人工脑脊液与其余溶液的体积比为1：3；乙腈-水溶液中，乙腈与水的体积比为4：1；
超高效液相色谱检测条件为：UPLC BEH amide色谱柱，色谱柱参数为：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温30℃～40℃；以乙腈-0.2％甲酸水为流动相梯度的梯度洗脱程序为：0-1.2min：78％乙腈；1.2-3.2min：78％乙腈→40％乙腈；3.2-4.0min：40％乙腈；4.0-5.0min：78％乙腈；
质谱检测条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正离子模式；离子源喷雾电压：5.5kV；离子源气帘气：241.3kPa；碰撞气：48.3kPa；离子源温度：500℃；雾化气：413.7kPa；辅助气：413.7kPa；多反应监测模式(MRM)。
本发明的有益效果为：
(1)本发明采用UPLC-MS/MS实现脑微透析液中3类11种神经递质的实时、快速、准确、可靠的定性和定量检测，还克服活体脑微透析液(尤其是清醒状态下的活体脑微透析液)因神经递质含量低、内源性成分干扰大等阻碍而无法准确、可靠的进行定性和定量检测的问题，准确反应各神经递质的真实生理水平；适于活体(尤其是清醒状态下)脑组织各类核团神经递质的定性和定量监测，满足临床或实验监测的实时、快速、准确、数据多样化等要求。
(2)本发明方法无需对脑微透析液进行复杂的衍生化前处理，只需进行简单的稀释前处理，即可减少基质效应，并保持良好峰形，提高检测的灵敏度、准确度和稳定性。
(3)本发明方法首次使用膜长1mm探针采集脑透析液，并可一次实现脑微透析液中3类11种神经递质的定性和定量检测，克服因探针膜长越小，透析液神经递质含量越低，回收率越低，越不利于后续定性和定量检测的技术问题。
(4)本发明采用乙腈-水或乙腈-甲酸水(4:1，v/v)作为稀释溶液，对生物样本进行稀释，起改善峰形、减少基质效应的作用。
(5)本发明方法通过一次操作即可实现脑微透析液中3类11种神经递质的定性和定量检测，分析时间短，定性和定量检测结果准确、可靠，且定性和定量检测方法适用性良好，具有可预期的临床应用前景。
(6)本发明方法在探针膜长1mm、1μL/min流速下测得各神经递质的回收率为5.2％～16.2％，相对于现有技术，回收率有所改善，保证检测结果的准确、可靠和稳定性。
附图说明
图1为实施例1中9个神经递质标准品(谷氨酸Glu、5-羟色胺5-HT、多巴胺DA、组胺Hist、乙酰胆碱Ach、5-羟吲哚乙酸5-HIAA、谷氨酰胺Gln、γ-氨基丁酸γ-GABA、去甲肾上腺素NE)的多反应离子监测色谱图。
图2为实施例1中2个神经递质标准品(甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp)的多反应离子监测色谱图。
图3为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Gly(甘氨酸)的多反应离子监测色谱图。
图4为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中γ-GABA(γ-氨基丁酸)的多反应离子监测色谱图。
图5为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Hist(组胺)的多反应离子监测色谱图。
图6为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Asp(天冬氨酸)的多反应离子监测色谱图。
图7为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Ach(乙酰胆碱)的多反应离子监测色谱图。
图8为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Gln(谷氨酰胺)的多反应离子监测色谱图。
图9为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中Glu(谷氨酸)的多反应离子监测色谱图。
图10为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中DA(多巴胺)的多反应离子监测色谱图。
图11为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中NE(去甲肾上腺素)的多反应离子监测色谱图。
图12为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中5-HT(5-羟色胺)的多反应离子监测色谱图。
图13为实施例4中大鼠给予葛根素后的脑透析液中5-HIAA(5-羟吲哚乙酸)的多反应离子监测色谱图。
图14为实施例4中不同组别大鼠脑透析液中神经递质Glu、Asp、Gly、5-HIAA、Gln、γ-GABA和NE的浓度水平比较图。
图15为实施例4中不同组别大鼠脑透析液中神经递质5-HT、DA、Hist和Ach的浓度水平比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步描述。以下实例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，并不对其内容进行限定。
实施例1
本实施例目的是建立一种基于液质联用法测定脑透析液中3类11种神经递质的检测方法。3类11种神经递质包括：胆碱类神经递质包括乙酰胆碱(Ach)；氨基酸类神经递质包括甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)、天冬氨酸(Asp)和组胺(Hist)；单胺类神经递质包括去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)和多巴胺(DA)。
标准品溶液配制：精密称取11种神经递质对照品，谷氨酸和天冬氨酸以超纯水溶解，其余神经递质对照品以甲醇溶解，分别配制成10mM的单标储备液，存于－20℃。采用乙腈-水(4:1，V/V)配制总混合标准溶液(Glu、NE、DA、5-HT、Ach的摩尔浓度分别对应为：20μM、50μM、1μM、0.5μM、0.5μM，Asp、Hist、Gly、5-HIAA、Gln和γ-GABA的摩尔浓度均为10μM)。临用前用乙腈-水(4:1，V/V)稀释总混合标准溶液，配制混合标准溶液中各神经递质呈不同浓度分布的一系列混合标准溶液。
人工脑脊液配制(aCSF)：氯化钙(CaCl2)66.6mg、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)358.15mg、六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)101.65mg、氯化钾(KCl)100.65mg，氯化钠(NaCl)4236.9mg，加超纯水配制成500mL(pH＝7.4)。
其中，人工脑脊液也可用包含氯化钙、氯化钾和氯化钠的水溶液(pH＝7.3～7.4)，氯化钙、氯化钾和氯化钠的摩尔比为1：1.3：49，氯化钙的摩尔浓度为2.97mM·L-1；还可用包含氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠的水溶液(pH＝7.3～7.4)，氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠的摩尔比为1：0.71：2.25：122，氯化钙的摩尔浓度为1.2mM·L-1。
样本前处理：(1)取1mm膜长探针收集的清醒大鼠的脑透析液20μL，加入乙腈-水(4:1，V/V)60μL稀释，离心10min(转速为10000r/min)，取5μL进样。(2)标准工作液制备：取“标准品溶液配制”项下制备的一系列混合标准溶液各20μL，分别加入人工脑脊液20μL，再加入乙腈-水(4:1，V/V)40μL，制得相应的一系列标准工作液作为混合标准样本液，取5μL进样。采用乙腈-水(4:1，V/V)作为稀释溶剂，对样品进行稀释，起到改善峰形、减少基质效应的作用。
液相色谱条件：Waters Acuity超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，ACQUITYUPLC BEH amide色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：乙腈(B)-0.2％甲酸水溶液(A)；梯度洗脱(0→1.2min：22％A；1.2→3.2min：22％A→60％A；3.2→4.0min：60％A；4.0→5.0min：22％A)；柱温为35℃，流速为0.35mL/min，进样量为5μL。
质谱条件：API5500三重四极杆串联质谱仪(美国AB Sciex公司)，电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；离子源喷雾电压：5.5kV；离子源气帘气：241.3kPa；碰撞气：48.3kPa；离子源温度：500℃；雾化气：413.7kPa；辅助气：413.7kPa；分析时间(duration)：3.5min；多反应监测模式(MRM)，仪器参数及监测离子对见表1。所得神经递质标准品的多反应离子监测色谱图，见附图1。
表1
(1)绘制标准曲线：取“标准工作液制备”项下的一系列标准工作液，采用外标法定量，以待测物的离子峰面积为纵坐标，以待测物浓度为横坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归计算，得到相应的回归方程，S/N≥3确定检出限，S/N≥10确定定量限，见表2。
表2
由表2可知，各神经递质的标准曲线在相应的线性范围内，待测物峰面积与待测物浓度线性关系良好。
(2)精密度与准确度：取“标准工作液制备”项下各神经递质浓度呈低、中、高分布的一系列标准工作液，每个浓度平行制备5份，进样分析；连续测定3天，代入当日的标准曲线方程，计算得到批间、批内精密度及准确度，结果见表3。
表3
由表3可知，生物样品中各神经递质的低、中、高浓度的批内及批间的精密度和准确度良好，均满足生物分析方法的要求。
(3)基质效应：取1mm膜长探针收集的清醒空白大鼠的脑透析液20μL，加入适量浓度的“标准品溶液配制”项下制备的一系列混合标准溶液20μL，再加入乙腈-水(4:1，V/V)溶液40μL，配制各神经递质呈低、中、高三个浓度水平的基质标样，进样分析，记录峰面积A。
取适量浓度的“标准品溶液配制”项下制备的一系列混合标准溶液20μL，加入流动相60μL混匀，配制各神经递质呈低、中、高三个浓度水平的溶剂标样，溶剂标样中各神经递质的低、中、高三个浓度与基质标样相同，进样分析，记录峰面积B。
取1mm膜长探针收集的清醒空白大鼠脑透析液20μL，加入乙腈-水(4:1，V/V)60μL稀释，进样分析，记录峰面积C。
以上3种制备方法，每个浓度平行5份，计算11种神经递质的基质效应，见表4。基质效应(ME)的计算公式如下：
表4
由表4可知，11种神经递质的ME范围为：70.33％～107.7％之间，RSD范围均小于15％，表明透析液对待测物没有明显干扰。
(4)稳定性：取“标准工作液制备”项下各神经递质浓度呈低、中、高分布的一系列标准工作液，每个浓度平行制备5份，分别于室温放置4h，进样分析，结果显示，室温放置4h后RSD的范围为0.58％～14.48％；反复冻融3次后RSD范围为1.8％～14.09％。稳定性试验结果表明各神经递质在上述条件下稳定性良好。
实施例2
本实施例目的是利用建立的检测方法研究11种神经递质的体外探针回收率与灌流速度之间的关系。
混合标准品溶液配制：取实施例1“标准品溶液配制”项下各神经递质的单标储备液，用乙腈-水(4:1，V/V)配制各神经递质浓度均为1.0μM的混合标准溶液。
采用实施例1配制的人工脑脊液作为灌流液，考察各神经递质浓度均为1.0μM的混合标准溶液分别在灌流速度为3.0μL/min、2.0μL/min、1.0μL/min时的体外探针(探针膜长1mm)回收率(n＝3)。根据公式R＝Cs/Cm*100计算探针回收率，结果如表5所示，Cm代表已知浓度的混合标准溶液，Cs代表经微透析后的溶液检测浓度。由表5可知，各神经递质的探针体外回收率随着流速的增加而逐渐降低。当灌流速度为1.0μL/min时，各神经递质的探针体外回收率范围在5.2％～16.2％。
表5
实施例3
本实施例目的是利用建立的检测方法研究11种神经递质的体外探针回收率与神经递质浓度水平之间的关系。
混合标准品溶液配制：取实施例1“标准品溶液配制”项下各神经递质的单标储备液，用乙腈-水(4:1，V/V)配制各神经递质浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.0μM的混合标准溶液。
采用实施例1制备的人工脑脊液作为灌流液，考察各神经递质浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.0μM的混合标准溶液在1.0μL/min灌流速度下的体外探针(探针膜长1mm)回收率(n＝3)，每30min收集一份样品。根据公式R＝Cs/Cm*100计算探针回收率，结果如表6所示，Cm代表已知浓度的混合标准溶液，Cs代表经微透析后的溶液检测浓度，由表6可知，低、中、高三个浓度水平的体外探针回收率基本一致，各神经递质的探针回收率与样品浓度没有明显相关性。
表6
实施例4
本实施例目的是利用建立的检测方法研究葛根素单用及合用冰片后对大鼠纹状体中11种神经递质含量的影响。
大鼠分组、给药及脑透析取样：健康雄性大鼠随机分为3组(n＝5)，其中空白对照组(control group)：灌胃给予生理盐水，每次1mL；葛根素组(puerarin group)：给予葛根素水溶液；联合给药组(combination group)：给予葛根素水溶液及冰片混悬液。其中，葛根素给药量为100mg·kg-1·d-1，冰片给药量为100mg·kg-1·d-1，均灌胃给药，每日一次，连续饲喂7d。灌胃给药的第7天将微透析探针的植入，定位大鼠纹状体，次日拔出导管帽，插入已经活化好的膜长1mm的探针，开启微透析灌流系统，以1.0μL/min的流速灌流人工脑脊液，灌流平衡90min后，连续采集3h，收集得到的脑微透析液。
脑透析液中11种神经递质多反应离子监测色谱图如图3至图13所示。大鼠纹状体透析液中11种神经递质的含量结果见表7，不同组别的透析液中11种神经递质浓度水平比较如图14和图15所示。
表7
与对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；
由表7、图14和图15可知，与空白对照组相比，葛根素组中Glu、Gly、5-HIAA、γ-GABA、Ach的含量升高，Asp、Gln、5-HT、Hist、NE、DA的含量降低，结果具有统计学意义(P＜0.05)；与空白组相比，冰片及葛根素合用组中Glu、γ-GABA、Asp、Gly、Ach的含量升高，NE、DA、5-HT、Hist、5-HIAA、Gln的含量降低，结果具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明，葛根素、葛根素与冰片合用对大鼠纹状体内神经递质的作用存在差异，给予葛根素之后大鼠脑纹状体内的大部分神经递质水平发生了明显的改变；而给予冰片及葛根素之后，除DA、NE外，其余各神经递质的变化程度较单用葛根素的变化程度小。
以上所述实施例仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、改进、替换等，均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，其特征在于，步骤包括：脑微透析液用乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液稀释配制的脑微透析样本液，用超高效液相色谱-质谱/质谱进行定性和/或定量检测；
超效高液相色谱-质谱/质谱对脑微透析样本液进行定量检测时，采用标准曲线法，用溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液绘制各神经递质标准品的标准曲线，得到用于定量计算的各神经递质标准品的回归方程；
所述溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液以人工脑脊液和乙腈-水溶液或人工脑脊液和乙腈-甲酸水溶液为主要溶剂配制而成，且混合标准样本液中，人工脑脊液的体积比例恒定；
所述的11种神经递质包括胆碱类神经递质、氨基酸类神经递质和单胺类神经递质，胆碱类神经递质包括乙酰胆碱；氨基酸类神经递质包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、天冬氨酸和组胺；单胺类神经递质包括去甲肾上腺素、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸和多巴胺；
超高效液相色谱检测条件为：UPLC亲水作用色谱柱，柱温30℃～40℃，以乙腈-0.2％甲酸水为流动相的梯度洗脱程序为：
(1)体积比例为75％～80％的乙腈等度洗脱1～1.5min；
(2)乙腈体积比例从75％～80％匀速降至35％～40％梯度洗脱1.8～2.2min；
(3)体积比例为35％～40％的乙腈等度洗脱0.8～1min；
(4)乙腈体积比例从35％～40％瞬时切换至75％～80％后等度洗脱0.9～1.2min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脑微透析样本液中，脑微透析液与乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液的体积比为1：1.5～4；乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液中，乙腈与水或者甲酸水的体积比为1～6：1，甲酸水中甲酸的体积分数为0.1％～1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，人工脑脊液为包含氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、六水合氯化镁、氯化钾和氯化钠的pH＝7.3～7.4水溶液，氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、六水合氯化镁、氯化钾和氯化钠的摩尔比为1：1.6：0.8：2.25：121，氯化钙的摩尔浓度为1.2mmol·L-1；
或者包含氯化钙、氯化钾、氯化钠的水溶液，氯化钙、氯化钾、氯化钠的摩尔比为1：1.3：49，氯化钙的摩尔浓度为2.97mmol·L-1；
或者包含氯化钙、氯化镁、氯化钾、氯化钠的水溶液，氯化钙、氯化镁、氯化钾、氯化钠的摩尔比为1：0.71：2.25：122，氯化钙的摩尔浓度为1.2mmol·L-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶有11种神经递质标准品的混合标准样本液中，人工脑脊液与混合标准样本液中其余溶液的体积比为1：1.5～4；乙腈-水溶液或乙腈-甲酸水溶液中，乙腈与水或者甲酸水的体积比为1～6：1，甲酸水中甲酸的体积分数为0.1％～1％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括脑微透析样本液离心所取上清液，用于超高效液相色谱-质谱/质谱的定性和/或定量检测。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以乙腈-0.2％甲酸水为流动相的梯度洗脱程序为：0-1.2min：78％乙腈；1.2-3.2min：78％乙腈→40％乙腈；3.2-4.0min：40％乙腈；4.0-5.0min：78％乙腈。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱检测条件为，离子源为电喷雾离子源，扫描模式为正离子模式；离子源喷雾电压：5.5kV；离子源气帘气：206.8～275.8kPa；碰撞气：41.4～55.1kPa；离子源温度：500℃～600℃；雾化气：379.2～448.2kPa；辅助气：379.2～448.2kPa；多反应监测模式。
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