CN110068644A - 高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，包括：采用甲醇溶解奥氮平配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成内标物工作液；将0‑5μL多个浓度的标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至100μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入内标物工作液，离心，取上清液，进行LC‑MS/MS定量分析，绘制标准曲线；精密吸取100μL的待测血浆，加入内标物工作液，离心，取上清液，进行LC‑MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取奥氮平浓度。本发明具有样本前处理简单方便、分析时间短、所需样本体积少、灵敏度高、回收率高、基质效应小等特点。

Description

高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法

技术领域

本发明涉及检测药物浓度的方法。更具体地说，本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法。

背景技术

奥氮平(Olanzapine)是美国Eli Lilly制药公司于1996年开发上市的一种非典型性抗精神病药。化学名为为2-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-10H-噻吩并[2,3-b][1,5]苯二氮杂分子式为C17H20N4S，分子量为456.32。奥氮平是二代抗精神病药物，是一种作用于多种受体系统，例如5-HT受体及组胺受体。奥氮平主要经过肝脏细胞色素P450酶代谢(如CYP4501A2)和谷氨酸转移酶等。

对于小分子化合物的定量测定，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)已经成为主要的检测方法，广泛应用于临床前和临床生物样本定量测定。LC-MS/MS方法具有高效、快速、灵敏、普适等优势，成为目前抗精神类药物的主要分析手段。目前，文献已报道的LC-MS/MS法测定生物基质中奥氮平的浓度主要应用于治疗药物监测(TDM)领域，具有较宽的线性范围(如5-500nM、0.25-50ng/mL、1-300ng/mL)，而且不能满足临床试验对生物样本检测限、质量控制及样本处理效率的要求。另外，已公布的方法还存在诸如样本体积大(0.2-0.5mL/样本)、每个样本的分析时间长(6-11min)、定量下限较高(如1-5ng/mL)、样本前处理采用费时费力的液液萃取法和固相萃取法。尽管也有文献报道有些LC-MS/MS方法采用蛋白沉淀法，然而，这些蛋白沉淀的过程尚需要干燥、复溶等操作，显著降低了生物样本前处理的效率，对临床药代动力学/生物等效性研究中大量血浆/血清样本的高通量处理提出了挑战。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其具有样本前处理简单方便、分析时间短、所需样本体积少、灵敏度高、回收率高、基质效应小等特点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，包括：

采用甲醇溶解奥氮平配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至100μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入300-400μL内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，以血浆样品中奥氮平浓度为横坐标，以奥氮平峰面积与稳定同位素内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围为0.1-20ng/mL的标准曲线；

精密吸取100μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的奥氮平峰面积与内标物峰面积的比值对应的奥氮平浓度；

液相条件为：色谱柱为X Brige C18，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.5mL/min，进样体积5μL，柱温35℃，洗针方法为依次采用500-1000μL的体积分数为70％的异丙醇水溶液洗针、500-1000μL的体积分数为20％的甲醇水溶液洗针，流动相的有机相为甲醇，水相为含10mM甲酸铵和体积分数为0.005％的七氟丁酸的水溶液，梯度洗脱设置为0-30s、31-120s、121-180s、181-190s、191-300s有机相与水相的体积比分别为3:7、3:7、8:2、95:5、3:7；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，奥氮平的定性离子对为313.2→282.1、奥氮平的定量离子对为313.2→2561、内标的离子对为316.2→256.1，扫描时间为100ms，质谱的喷雾电压3400V；温度600℃；雾化气压力为55psi；辅助气为55psi；气帘气为25psi；EP电压为10eV；DP电压为35V；碰撞气压力为6psi。

优选的是，采用甲醇溶解奥氮平配制成浓度为2、4、10、20、40、100、200、400ng/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成浓度为1.0mg/mL的内标物工作液。

优选的是，精密吸取5μL标准曲线工作液，加入95μL空白血浆，加入400μL内标物工作液。

优选的是，稳定同位素内标物为氘代物。

优选的是，4℃下13000rpm离心10min。

优选的是，采用甲醇溶解奥氮平配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至100μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入400μL内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

优选的是，采用甲醇溶解奥氮平配制成浓度为5、80、320ng/mL的质控工作液。

优选的是，精密吸取5μL质控工作液，加入95μL空白血浆，加入400μL内标物工作液。

优选的是，有机相的制备具体为：将色谱纯甲醇，采用1L的容量瓶定容，采用0.22μm有机滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后，置于流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；水相的制备具体为：用量筒量取适量的纯水置于烧杯中，加入1M甲酸铵溶液10mL、七氟丁酸50μL，混匀后置于容量瓶中定容至1L，配制成含10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸的水相，经0.22μm水相水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

优选的是，洗针方法为：用量筒量取800mL纯水置于烧杯中，加入200mL色谱纯甲醇，配制成体积分数为20％的甲醇水溶液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；量取300mL纯水置于烧杯中，加入700mL色谱纯异丙醇，配制成体积分数为70％的异丙醇水溶液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；依次采用700μL的体积分数为70％的异丙醇水溶液洗针3次、700μL的体积分数为70％的甲醇水溶液洗针2次。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明方法在建立之初分别考察了不同的有机相流动相(甲醇、乙腈)对待测物色谱峰的洗脱能力，经过优化最终选择了甲醇作为最终流动相，因为其能够使色谱峰实现基线分离，干扰较小；制备水相时通过添加不同比例的溶液添加剂，最终选择了水相中加入10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸；为了降低方法中可能存在的残留，发明人通过不同比例的强有机溶剂，最终发现700μL的体积分数为70％的异丙醇水溶液洗针3次、700μL的体积分数为20％的甲醇水溶液洗针2次可完全消除残留效应；发明人通过比较了Waters公司不同规格的色谱柱，如Symetry和XBrige，不同粒径(3.5vs 5.5μm)，最终选择了Waters公司XBrigeC18(2.1mm×50mm，3.5μm)，能够实现峰型对称、保留时间适宜；本方法专属性好、灵敏度高、方法学验证指标符合指导原则的要求，并已成功应用于一项健康志愿者的生物等效性研究。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为奥氮平和内标的分子离子质谱图；

图2为特异性考察结果典型色谱图；

图3为标准曲线示意图；

图4为方法的临床应用示意图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

1溶液配制

用于配制溶液的体积和重量可以成比例调整，除特殊声明外所有的溶液均保存于室温条件下。

1.1流动相溶液的配制

有机相(A1)：实验中所用有机相为色谱纯甲醇，采用1L的容量瓶定容，采用0.22μm有机滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后，置于流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

水相(B1)：用量筒量取适量的纯水置于烧杯中，加入1M甲酸铵溶液10mL、七氟丁酸50μL，混匀后置于容量瓶中定容至1L，配制成含10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸的水相，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

弱洗溶液(WW)：用量筒量取800mL纯水置于烧杯中，加入200mL色谱纯甲醇，配制成甲醇-水(2:8，v/v)溶液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

强洗溶液(SW)：量取300mL纯水置于烧杯中，加入700mL色谱纯异丙醇，配制成异丙醇-水(7:3，v/v)洗针液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

流动相配制好后，应将批号记录在标签和流动相配制记录上。批号由8位配制当天日期、2位流动相管路编号和2位该流动相当日配制的批次组成。

1.2奥氮平储备液和工作液的配制

领用奥氮平和内标标准品，精密天平称量奥氮平标准品10.00mg以上，准确记录按照奥氮平纯度折算的标准品质量，采用甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中制成浓度为1.0mg/mL的奥氮平储备液，分装备用。

采用甲醇将两份不同的储备液稀释成浓度为1μg/mL的溶液，按照梯度稀释法配制成浓度为2、4、10、20、40、100、200、400ng/mL的标准曲线工作液，5、80、320ng/mL的质控工作液。内标采用甲醇稀释，吸取内标储备液配制成浓度为10.00ng/mL的工作液，冷冻保存。仪器及试剂耗材如表1-2所示。

表1仪器设备明细

表2试剂耗材

以肝素抗凝的空白人血浆来源于经过知情同意的健康志愿者，首都医科大学附属北京朝阳医院伦理批件编号为2016-药-43，使用前保存于-70℃冰箱中。所有空白血浆均具有详细来源。

1.3奥氮平标准曲线和质控血浆样品的配制及前处理

采用空白人血浆基质配制血浆样品。精密吸取5μL标准曲线和质控工作液，加入95μL空白血浆，涡旋30s后制成标准曲线和质控血浆样品。所有血浆样品完全混匀后加入400μL内标物工作液，4℃下13000rpm离心10min，取上清液进样，进行LC-MS/MS定量分析。奥氮平和内标的分子离子质谱图如图1所示。

2液相色谱串联质谱方法条件

液相色谱条件：采用Waters XBrige C18色谱柱(粒径为3.5μm，2.1×50mm)，流速为0.50mL/min，进样体积为5μL，柱温：35℃，检测时间为5min。洗针方法：700μL的70％异丙醇洗针3次、700μL的20％甲醇-80％水溶液洗针2次。流动相的有机相为甲醇(A)，水相为含10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸的水溶液(B)。奥氮平和内标的保留时间为1.97min。洗脱条件如表3所示。

表3梯度洗脱

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)的多反应监测(MRM)模式，正离子扫描模式，Q1和Q3均为高分辨模式。奥氮平和内标的母子离子分别为m/z 313.2→256.1(奥氮平定量离子)、313.2→282.1(奥氮平定性离子)、316.2→256.1(内标)，扫描时间为100ms。质谱的喷雾电压3400V；温度600℃；雾化气(GS1)压力为55psi；辅助气(GS2)为55psi；气帘气(CUR)为25psi；EP电压为10eV；DP电压为35V；碰撞气(CAD)压力为6psi。

3数据计算及分析批接受标准

分析物奥氮平和内标的峰面积是由LC-MS系统工作站Analyst软件1.6.3版自动积分，若自动积分未能合理反映待测物的峰面积需手动积分时应记录手动积分原因及接受标准。以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(y＝1/x²)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程，血浆样品带入标准曲线即可计算相应浓度。原始数据浓度结果保留小数点后3位数字。标准曲线如图3所示。

定量检测的一个分析批包括双空白样品(不含分析物和内标的基质样品)、一个空白或零值样品(含内标的基质样品)、至少6个浓度水平的校正标样、至少3个浓度水平的质控样品(低、中、高浓度，双重样品或至少是实验样品总数的5％，两者中取数目更多者)、待分析的实验样品。所有样品(校正标样、质控样品和实验样品)应按照他们将被分析的顺序，在同一样品批中处理和提取。一个分析批的样品在同一时间处理，即没有时间间隔，由同一分析者相继处理，使用相同的试剂，保持一致的条件。避免将分别进行预处理的几批样品合并为同一分析批，这个标准既针对整个分析批，也针对分析批中每一部分样品。标准曲线上的校正标样回算浓度一般应在标示值的±15％范围内，LLOQ应在±20％范围内。标准曲线包括不少于6个浓度的校正标样，至少75％的标样应符合这些标准。如果校正标样中有一个不符合标准，则应该拒绝该校正标样，重新计算不含该标样的标准曲线，并进行回归分析。如果拒绝的校正标样是LLOQ，则此分析批的LLOQ是标准曲线的下一个可接受的校正标样最低浓度。如果最高浓度的校正标样被拒绝，则该分析批的ULOQ是标准曲线的下一个可接受的较低浓度的校正标样。如此修改的校正范围必须覆盖所有的质控样品(低、中、高浓度)。质控样品的准确度应该在标示值的±15％范围内，至少2/3的质控样品应满足这个条件，并且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。在不满足这些标准的情况下，应该拒绝该分析批，相应的实验样品应重新提取和分析。

4生物样本前处理

采用方便快捷的蛋白沉淀法进行血浆样本前处理。标准曲线和质控血浆样本完全混匀后加入400μL内标物工作液，4℃下13000rpm离心10min，取上清液进样，进行LC-MS/MS定量分析。临床未知血浆样本的处理包括精密吸取100μL血浆，加入400μL内标物工作液，4℃下13000rpm离心10min，取上清液进样。

5方法学验证

按照2015年版中国药典四部通则9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行全部验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证内容包括特异性、精密度和准确度、标准曲线、稳定性、基质效应、回收率等。

6临床生物样本测定

入组6例健康男性志愿者，口服奥氮平口崩片(再普乐，参比制剂，R)及奥氮平口腔崩解片(受试制剂，T)，给药剂量为5mg。在空腹过夜至少10h之后，受试者于试验当天早晨空腹口服受试制剂或参比制剂，药物置于舌面，在口腔中完全崩解后吞咽，不饮水。每周期每例受试者采集17份血样，于给药前(5min以内)及给药后0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和144h于前臂静脉采血4mL，置肝素抗凝试管中，4℃离心(3000r/min)10min，移取上层血浆，于-60～-80上℃冰箱中冷冻保存至测定。

7实验结果

7.1特异性

本发明考察了6个不同来源空白人血浆，包括临床试验中餐后高脂血样本。制备成特异性样品进行分析。配制双空白样品(不含分析物和内标的处理过基质样品)、空白样品(含内标的处理后基质样品)、定量下限样品。特异性考察结果典型色谱图如图2。实验中LLOQ样品中奥氮平和内标的色谱峰信噪比为126.9和6373.3。双空白样本中未发现奥氮平及内标的色谱峰、在空白样本中仅出现内标的色谱峰、在定量下限样本中可见两者的色谱峰、临床未知血浆样本在保留时间位置可见奥氮平和内标的色谱峰，上述结果提示本发明方法特异性良好，除保留时间位置外无其他干扰色谱峰，方法的特异性良好。

7.2精密度和准确度

平行配制6个血浆定量下限、低浓度、中浓度、高浓度质控样品的批内和批间的精密度和准确度的结果(表4)表明，均符合生物样本定量检测的要求。

表4方法的精密度和准确度

7.3基质效应和提取回收率

本发明考察了6个不同来源的空白人血浆，制备低浓度、中浓度和高浓度样品，通过计算基质存在下的峰面积由空白基质提取后加分析物测得)，与基质不存在(以水代替血浆)下的峰面积(分析物的纯溶液)比值，计算分析物和内标的基质因子。并通过分析物和内标的基质因子的比值，计算经内标归一化的基质。低、中、高浓度质控样品中分析物和内标的基质因子和经内标归一化的基质因子的变异均低于15％，表明人血浆中奥氮平和内标化合物的测定不受生物基质的影响。分别考察了低、中、高3个浓度质控样品的提取回收率，每个浓度平行6个样品，结果表明在本方法的定量范围内奥氮平具有足够且相对均一的提取回收率。结果如表5所示。

表5基质效应和提取回收率

7.4稳定性

本发明中制备了低浓度和高浓度血浆质控样本，考察了奥氮平实验台放置24h的稳定性、反复冻融五次稳定性、制备后室温进样器放置31h稳定性、-80℃长期放置62天的稳定性等。结果表明(表6)，奥氮平在上述不同条件下均稳定，可以支持临床中可能发生的各种超出预期后样本的准确测定。本发明也考察了全血稳定性，采用空白人新鲜全血(008MXYA)配制低浓度和高浓度全血稳定性质控样本，静置或轻微颠倒使药物在全血各组分间平衡分布。A组每一浓度的全血样品平行6样本，待化合物分布平衡后立即离心获得血浆，并立即经前处理(WBS0h)。B组每浓度平行6样本全血质控样本，待化合物分布平衡后置于与临床采血后全血样品相同的处置条件下(室温)2h后离心获得血浆(WBS2h)。接受标准：如果B组测定均值在A组均值的85％-115％之内，且变异系数不超过15％，则此情况下的全血稳定性可以被接受。表5的结果显示奥氮平在全血中室温放置2h稳定。

表6稳定性

表7全血室温放置2h稳定性

*％变异系数需≤15.0％，**％差异性需85.0％-115％

8临床应用

本发明方法的灵敏度高，能够准确测量健康受试者口服奥氮平药物后144h的血浆药物浓度。6例受试者经过两周期的给药采血后，测定奥氮平药物浓度，绘制药物浓度-时间曲线。如下图4所示，本发明方法专属性强、灵敏度高、可靠性好，已成功应用于临床生物等效性研究的浓度测定。图4的结果表明，奥氮平受试制剂与参比制剂的平均药时曲线基本接近，本发明方法可应用于该项临床试验的生物等效性血浆样本浓度的准确测定。

实验中发明人尝试采用色谱纯有机相，如甲醇、乙腈作为方法中的流动相，结果表明当采用乙腈作为有机相进行梯度洗脱时，色谱峰的峰高和峰面积显著低于甲醇作为有机相时的结果，为了能够检测临床未知血浆样本中足够低浓度的样本、保证方法的灵敏度，本发明最终采用甲醇作为有机相。

众所周知，在流动相中加入一些添加剂可助力提高质谱的离子化强度、增强检测信号、改善色谱峰拖尾等，故实验中发明人在流动相的水相中尝试加入色谱纯的甲酸(添加比例为0.01％、0.02％、0.2％、0.5％)、色谱纯的甲酸铵(添加比例为2mM、5mM和10mM)、质谱用七氟丁酸(添加比例为0.002％、0.005％)，实验结果显示当加入10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸时色谱和质谱信号均能满足实验需要，色谱峰峰型对称。

本发明方法中采用的是在线固相萃取-液相色谱联用系统，流动相及溶液在该系统中需要经过多次循环，可能存在药物残留，尤其在高浓度样本分析结束后。因此，本发明采用洗脱能力更强的异丙醇作为洗针液，并配制了不同比例(如50％、70％、80％)的洗脱液，再辅以甲醇进行再次洗针，经过摸索优化最终确定了洗针次数和所用液体体积，能够完全克服可能存在的残留效应。

本发明中探索应用不同规格的色谱柱进行分离，首先采用Waters公司常规的Symetry色谱柱，粒径为5μm，继而采用XBrige规格的色谱柱，粒径为3.5μm进行比较，实验结果提示当采用相同的流动相时，奥氮平和内标在小粒径的色谱柱中分离效果更好，色谱峰基线分离，因此最终选择了粒径较小的XBrige规格的色谱柱。

本发明方法克服了以下几个技术难点：①精神类药物的血药浓度一般较低，对高效液相色谱串联质谱方法的灵敏度要求较高，本发明方法的定量下限为0.1ng/mL，能够检测到临床给药后144h的血药浓度，将助力临床医师对这类精神疾病患者合理用药、剂量调整。②本发明采用简单便捷、省时省力的蛋白沉淀法作为血浆样本前处理的方式，显著降低了临床未知样本定量测定的复杂性、可以实现高通量生物样本定量分析，同时也最大限度降低可能存在的系统误差。③本发明方法最终仅需0.1mL的血浆体积，显著少于文献报道的体积，可提高临床精神疾病患者的依从性，最大限度减少临床有创采血环节。④针对可能出现的残留效应，本发明通过不断探索优化最终采用异丙醇和甲醇作为洗针液，设置程序进行多次清洗，消除残留效应。

本发明所建立的灵敏度高、专属性强、快速简便的高效液相色谱串联质谱方法通过了方法学验证的各项指标要求，可准确定量复杂生物基质中奥氮平的浓度，检测用血浆体积少，利用临床高通量检测的推广、助于提高精神疾病患者的依从性。另外，本发明方法可为精神疾病的其他类药物提供方法参考。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，包括：

采用甲醇溶解奥氮平配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至100μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入300-400μL内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，以血浆样品中奥氮平浓度为横坐标，以奥氮平峰面积与稳定同位素内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围为0.1-20ng/mL的标准曲线；

精密吸取100μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的奥氮平峰面积与内标物峰面积的比值对应的奥氮平浓度；

液相条件为：色谱柱为X Brige C18，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.5mL/min，进样体积5μL，柱温35℃，洗针方法为依次采用500-1000μL的体积分数为70％的异丙醇水溶液洗针、500-1000μL的体积分数为20％的甲醇水溶液洗针，流动相的有机相为甲醇，水相为含10mM甲酸铵和体积分数为0.005％的七氟丁酸的水溶液，梯度洗脱设置为0-30s、31-120s、121-180s、181-190s、191-300s有机相与水相的体积比分别为3:7、3:7、8:2、95:5、3:7；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，奥氮平的定性离子对为313.2→282.1、奥氮平的定量离子对为313.2→2561、内标的离子对为316.2→256.1，扫描时间为100ms，质谱的喷雾电压3400V；温度600℃；雾化气压力为55psi；辅助气为55psi；气帘气为25psi；EP电压为10eV；DP电压为35V；碰撞气压力为6psi。

2.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解奥氮平配制成浓度为2、4、10、20、40、100、200、400ng/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成浓度为1.0mg/mL的内标物工作液。

3.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，精密吸取5μL标准曲线工作液，加入95μL空白血浆，加入400μL内标物工作液。

4.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，稳定同位素内标物为氘代物。

5.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，4℃下13000rpm离心10min。

6.如权利要求1-5任一项所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解奥氮平配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解稳定同位素内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至100μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入400μL内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行LC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

7.如权利要求6所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解奥氮平配制成浓度为5、80、320ng/mL的质控工作液。

8.如权利要求7所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，精密吸取5μL质控工作液，加入95μL空白血浆，加入400μL内标物工作液。

9.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，有机相的制备具体为：将色谱纯甲醇，采用1L的容量瓶定容，采用0.22μm有机滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后，置于流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；水相的制备具体为：用量筒量取适量的纯水置于烧杯中，加入1M甲酸铵溶液10mL、七氟丁酸50μL，混匀后置于容量瓶中定容至1L，配制成含10mM甲酸铵和0.005％七氟丁酸的水相，经0.22μm水相水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用。

10.如权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法，其特征在于，洗针方法为：用量筒量取800mL纯水置于烧杯中，加入200mL色谱纯甲醇，配制成体积分数为20％的甲醇水溶液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；量取300mL纯水置于烧杯中，加入700mL色谱纯异丙醇，配制成体积分数为70％的异丙醇水溶液，经0.22μm水滤膜经G6垂熔玻璃漏斗过滤后转移至流动相瓶中，超声脱气，张贴标签后备用；依次采用700μL的体积分数为70％的异丙醇水溶液洗针3次、700μL的体积分数为70％的甲醇水溶液洗针2次。