CN103901123A - 一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药品检测领域，公开了一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法。本发明采用分子排阻色谱法，并结合热毒宁注射液生产工艺的特点，建立了以胸腺肽α1为对照的热毒宁注射液高分子物质检测方法。被测样品中组分将按照分子量由大到小的顺序被洗脱下来，将先于对照品出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。通过重复性、分离度、检出限、精密度、分子量对数-保留时间曲线、溶液稳定性考察，证明本发明建立的热毒宁注射液高分子物质检测方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可作为热毒宁注射液质量内控方法，对中药注射剂质量控制具有指导意义。

Description

一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法

技术领域

本发明屈于药品检测领域，涉及一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法。

背景技术

中药注射剂是我国中医药创新的重要成果，其生物利用度高、作用迅速，在治疗急重症方面具有优势，广泛应用于临床。随着我国药品不良反应监测工作的发展，中药注射剂的安全性问题也逐渐显现。引起不良反应的因素很多，有学者认为大分子物质的存在亦是其因素之一。热毒宁注射液(国药准字Z20050217，江苏康缘药业股份有限公司生产)处方由栀子、金银花、青蒿三味药材组成，具有清热、疏风、解毒等功效，其除有效成分外，也可能含有导致不良反应的大分子物质，如蛋白质、聚合物等。为保证临床用药的安全，更好地控制药品质量，增加中药注射剂高分子物质检测十分必要。

王一博等人《HPSEC法检测中药注射液中的高分子量物质》建立高效分子排阻色谱法(HPSEC)检测中药注射液中的高分子量物质，该文献方法的流速偏低，致使保留时间过长，且易造成峰形展宽等现象；赖宇红等人《注射用丹参分子排阻色谱及指纹图谱差减分析》分别应用凝胶分子排阻色谱、碳十八反相液相色谱进行指纹图谱分析，通过综合差减分析揭示非小分子酚酸类成分信息。该文献采用的流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)，实验结果表明采用此种流动相测定，高分子物质的色谱行为为非理想排阻行为。王新彤《清开灵注射液中大分子蛋白的检测研究》公开了尺寸排阻色谱法可用于清开灵注射剂中大分子蛋白分析，该文献的线性关系考察只采用了3个对照品进行考察，数据可靠性偏低。

CN102411033A中公开了一种检测中药注射液中高分子物质的方法，以胸腺肽α和人生长激素释放抑制因子为对照品，采用TSK G2000SWXL型凝胶柱对中药注射液中的高分子物质进行检测，结果在进样体积20μl，检出限为0.08μg下未能检出大分子物质。但是该方法的流动相为乙腈-0.83％三氟乙酸溶液(40∶60)，根据《中国药典2010年版二部》分子排阻色谱法的要求：流动相中有机相比例不应超过30％，且溶液的pH值不宜超出色谱柱的耐受力，该方法有机相比例超出30％，且酸度过高，超出色谱柱的耐受范围，不符合《中国药典》的技术要求，其检测结果的可信度不高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，包含如下步骤：

(1)对照溶液的制备：配制胸腺肽α1标准品溶液；

(2)供试品溶液的制备：用流动相稀释热毒宁注射液，配制成供试品溶液；

(3)检测：分别吸取供试品溶液和对照溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定各溶液的色谱将先于胸腺肽α1出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。

步骤(1)所述的配制胸腺肽α1标准品溶液优选取胸腺肽α1标准品，用水溶解并稀释制成胸腺肽α1浓度为25-50μg/ml的溶液，摇匀，即得。

步骤(2)所述的供试品溶液的制备优选：精密量取热毒宁注射液适量，加流动相稀释5-10倍，摇匀，即得供试品溶液。

所述的步骤(3)中，高效液相色谱条件优选为：色谱柱：凝胶色谱柱；以乙腈-0.1％三氟乙酸体积比为30∶70为流动相；流速为每分钟0.5-0.7ml；柱温25-30℃；检测器：VWD检测器，检测波长为214±1nm；理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

所述的步骤(3)中，高效液相色谱条件进一步优选为：色谱柱：凝胶色谱柱；以乙腈-0.1％三氟乙酸体积比为30∶70为流动相；流速为每分钟0.7ml；柱温30℃；检测器：VWD检测器，检测波长为214nm；理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

步骤(3)中高效液相色谱检测的进样量优选10μl。

所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，优选包含如下步骤：

(1)对照溶液的制备：

取胸腺肽α1标准品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成胸腺肽α1浓度为25μg/ml的溶液，摇匀，即得，所述的胸腺肽α1标准品分子量为3108；

(2)供试品溶液的制备：

精密量取热毒宁注射液1ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，即得；

(3)检测：

分别吸取供试品溶液和对照溶液各10μl注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，各溶液的色谱图中将先于胸腺肽α1出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。

有益效果：

本发明采用分子排阻色谱法，并结合热毒宁注射液生产工艺的特点，通过对色谱条件的优化，建立了热毒宁注射液高分子物质检测方法。根据分子排阻色谱理论，溶质分子的保留是由于小分子化合物进入填满溶剂的填料孔，而较大的分子根据它们体积的大小而被排阻，大分子优先于小分子被洗脱出来。被测样品中组分将按照分子量由大到小的顺序被洗脱下来，将先于对照品出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。通过重复性、分离度、检出限、精密度、分子量对数-保留时间曲线、溶液稳定性考察，证明本发明建立的热毒宁注射液高分子物质检测方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可作为热毒宁注射液质量内控方法，对中药注射剂的质量控制具有指导意义。

本发明较之CN102411033A中公开的一种检测中药注射液中高分子物质的方法存在以下优点：

1、首次应用在热毒宁注射液产品上。

2、符合2010年版《中国药典》的技术要求，可信度高。

3、准确度，精密度，稳定性均较好。

附图说明

图1五种蛋白质对照品色谱图，A到E图分别对应牛血清白蛋白、胰蛋白酶、核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺肽α1色谱图。

图2蛋白分子量对数-保留时间曲线。

图311批热毒宁注射液高分子物质测定色谱图-以胸腺肽α1为对照。

具体实施方式

以下实施例中所涉及的样品来源如下：

1、热毒宁注射液：江苏康缘药业股份有限公司生产，规格：10ml/支

批号：100919、100906、101011、110702、110703、110704、110705、110708、110710、110711、110712、110714。

2、胸腺肽α1：分子量3108Amresco99.10％；批号：110321050-201106。

3、人胰岛素：分子量5800Amresco27.5u/mg；批号：11070738-201106。

4、牛血清白蛋白：分子量66446，中国计量科学研究院；批号BSA081110。

5、胰蛋白酶：分子量23463，Sigma；批号1997B017。

6、核糖核酸酶A：分子量13700，中国食品药品检定研究院；批号140635-200802。

实施例1以蛋白质为对照品HPLC方法的建立

1.1色谱条件优选

1.1.1检测波长的确定

因蛋白质在低波长处有较好吸收，故选择214nm作为检测波长。

1.1.2流动相优选

仪器：Agilent1100(VWD)；

凝胶柱：TSK G2000SWxl，300mm×7.8mm，5μm；

柱温：30℃；

检测波长：214nm；

流动相一：以0.1mol/L硫酸钠为流动相，流速为0.5ml/min；

流动相二：以乙腈-0.05％三氟乙酸(乙腈与0.05％三氟乙酸体积比为30∶70)为流动相，流速为0.7ml/min；

流动相三：以乙腈-0.08％三氟乙酸(乙腈与0.08％三氟乙酸体积比为30∶70)为流动相，流速为0.7ml/min；

流动相四：以乙腈-0.1％三氟乙酸(乙腈与0.1％三氟乙酸体积比为30∶70)为流动相，流速为0.7ml/min；

流动相五：以乙腈-0.83％三氟乙酸(乙腈与0.83％三氟乙酸体积比为40∶60)为流动相(CN102411033A中流动相)，流速为0.7ml/min。

结果表明：在流动相一条件下，牛血清白蛋白、核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺肽α1四种蛋白呈现非理想排阻行为；在流动相二至流动相五条件下，随着三氟乙酸浓度的增大，牛血清白蛋白、核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺肽α1四种蛋白的色谱行为由非理想排阻行为逐渐呈现理想的排阻行为，流动相三至流动相五条件下四种蛋白的分子量对数-保留时间曲线相关系数大小顺序为：流动相五＞流动相四＞流动相三，流动相四虽然线性关系不如流动相五，但根据《中国药典2010年版二部》分子排阻色谱法的要求，流动相四有机相的比例及pH均符合其要求，而流动相五有机相比例超过30％且酸度过高，超出色谱柱的耐受范围，综合考虑故以乙腈-0.1％三氟乙酸(30∶70)为流动相。结果见表1。

表1五种流动相下对照品溶液的保留时间考察

1.2线性关系考察

精密称取胸腺肽α1、核糖核酸酶A、胰蛋白酶、牛血清白蛋白标准品适量，分别加水溶解并制成一定浓度的标准品溶液，另称取人胰岛素标准品适量，加0.025％三氟乙酸溶解并制成一定浓度的标准品溶液，即分别配制成胸腺肽α1为0.0285mg/ml、核糖核酸酶A为0.0565mg/ml、胰蛋白酶为0.0354mg/ml、牛血清白蛋白为0.845mg/ml、人胰岛素为0.0322mg/ml的溶液，精密量取各对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，色谱条件为1.1中优化的色谱条件，记录色谱图。试验数据见表2及图2。

表2蛋白分子量对数-保留时间曲线数据

以保留时间X(min)为横坐标，分子量对数Y为纵坐标，绘制分子量对数-保留时间曲线，如图2所示，得回归方程：Y＝-0.2735X+7.1977，相关系数R²＝0.9841。

结果表明：在此色谱条件下，分子量在3108～66446范围内的物质呈现良好的线性关系。1.3进样精密度试验

取线性关系考察中胸腺肽α1标准品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，色谱条件为1.1中优化的色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，考察胸腺肽α1保留时间，结果见表3。

表3胸腺肽α1进样精密度考察结果

结果表明：连续进样6次，RSD小于2.0％，表明在此条件下进样精密度良好。

1.4溶液稳定性试验

1.4.1胸腺肽α1标准品溶液稳定性试验

分别于0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h，精密量取线性关系考察中胸腺肽α1标准品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，色谱条件为1.1中优化的色谱条件，记录色谱图，考察溶液的稳定性，结果见表4。

表4胸腺肽α1标准品溶液稳定性结果

结果表明：胸腺肽α1标准品溶液保留时间的RSD小于2％，故在3小时内溶液稳定性良好。

1.4.2供试品溶液稳定性试验

精密量取热毒宁注射液(批号100919)1ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，作为供试品溶液。分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h，精密量取供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察溶液的稳定性，结果见表5。

表5供试品溶液稳定性结果

结果表明：供试品溶液保留时间的RSD小于2％，故在12小时内溶液稳定性良好。

1.5重复性考察

精密量取热毒宁注射液(批号100919)1ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，作为供试品溶液，平行制备供试品6份。精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，色谱条件为1.1中优化的色谱条件，记录色谱图，计算高分子物质含量，考察保留时间，结果见表6。

表6重复性考察结果

结果表明：本品平行测定6份，均未检出高分子物质，供试品溶液的保留时间的RSD小于2％，本测定方法重复性较好。

1.6分离度考察

精密量取胸腺肽α1标准品贮备液50μl和热毒宁注射液100μl于1ml量瓶内，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行制备供试品6份。精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，色谱条件为1.1中优化的色谱条件，记录色谱图，考察胸腺肽α1与邻近峰的分离度。结果见表7。

表7分离度考察结果

结果表明：本品平行测定6份，胸腺肽α1与邻近峰的分离度均不低于2.0，故该色谱条件可以满足测定要求。

1.7检出限考察

精密量取0.570mg/ml胸腺肽α1标准品溶液加水稀释成0.057mg/ml、0.00570mg/ml、0.00228mg/ml的样品溶液，各精密量取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表8。

表8检出限考察结果

结果表明：当进样量为0.0114μg时，信噪比约为3，故检测限为0.0114μg。

实施例2高分子物质测定

2.1测定方法热毒宁注射液中高分子物质测定方法--以胸腺肽α1为对照品

精密量取热毒宁注射液1ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，作为供试品溶液；取胸腺肽α1标准品适量，称定，用水溶解并稀释制成每1ml中含0.025mg的溶液作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于胸腺肽α1(分子量3108)出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量，高分子物质不得过0.05％。

色谱条件与系统适应性试验色谱柱：TSK G2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；以乙腈-0.1％三氟乙酸(30∶70)为流动相；流速为每分钟0.7ml；柱温30℃；检测波长为214nm。理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

2.2热毒宁注射液中高分子物质测定

按上述高分子物质测定方法对批号为110708、110712、110714、100906、101011、110702、110703、110704、110705、110710、110711十一批热毒宁注射液进行高分子物质进行测定，结果：以胸腺肽α1为对照品测定，十一批热毒宁注射液均未检出分子量大于3108的高分子物质，见图3。

实施例3高分子物质测定

3.1测定方法热毒宁注射液中高分子物质测定方法--以胸腺肽α1为对照品

精密量取热毒宁注射液1ml，加流动相稀释至5ml，摇匀，作为供试品溶液；取胸腺肽α1标准品适量，称定，用水溶解并稀释制成每1ml中含0.05mg的溶液作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于胸腺肽α1(分子量3108)出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量，高分子物质不得过0.05％。

色谱条件与系统适应性试验色谱柱：TSK G2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；以乙腈-0.1％三氟乙酸(30∶70)为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温25℃；检测波长为214nm。理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

3.2热毒宁注射液中高分子物质测定

按上述高分子物质测定方法对批号为110708的热毒宁注射液进行高分子物质进行测定，结果：以胸腺肽α1为对照品测定，热毒宁注射液未检出分子量大于3108的高分子物质。

Claims (7)

1.一种检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)对照溶液的制备：配制胸腺肽α1标准品溶液；

(2)供试品溶液的制备：用流动相稀释热毒宁注射液，配制成供试品溶液；

(3)检测：分别吸取供试品溶液和对照溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定各溶液的色谱将先于胸腺肽α1出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。

2.根据权利要求1所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于步骤(1)所述的配制胸腺肽α1标准品溶液是取胸腺肽α1标准品，用水溶解并稀释制成胸腺肽α1浓度为25-50μg/ml的溶液，摇匀，即得。

3.根据权利要求1所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于步骤(2)所述的供试品溶液的制备：精密量取热毒宁注射液适量，加流动相稀释5-10倍，摇匀，即得供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于所述的步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：凝胶色谱柱；以乙腈-0.1％三氟乙酸体积比为30∶70为流动相；流速为每分钟0.5-0.7ml；柱温25-30℃；检测器：VWD检测器，检测波长为214±1nm；理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

5.根据权利要求4所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于所述的步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：凝胶色谱柱；以乙腈-0.1％三氟乙酸体积比为30∶70为流动相；流速为每分钟0.7ml；柱温30℃；检测器：VWD检测器，检测波长为214nm；理论板数按胸腺肽α1计算应不低于10000。

6.根据权利要求1所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于步骤(3)中高效液相色谱检测的进样量为10μl。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测热毒宁注射液中高分子物质的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)对照溶液的制备：

取胸腺肽α1标准品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成胸腺肽α1浓度为25μg/ml的溶液，摇匀，即得，所述的胸腺肽α1标准品分子量为3108；

(2)供试品溶液的制备：

精密量取热毒宁注射液1ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，即得；

(3)检测：分别吸取供试品溶液和对照溶液各10μl注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定各溶液的色谱将先于胸腺肽α1出峰时间的峰视为高分子物质，按面积归一化法计算其含量。

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