CN109709241A - 含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，属于中药制剂检测技术领域。所述测定方法包括：(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。本发明采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液作为含酚酸类化合物的中药注射液的稀释剂制备液相色谱分析的供试品溶液，解决了因酚酸类化合物对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰而无法准确测定的问题。

Description

含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法

技术领域

本发明涉及中药制剂检测技术领域，具体涉及一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法。

背景技术

中药注射剂作为中华民族传统文化的代表，在人类健康史上发挥着不可替代的作用。中药注射液系指饮片经提取、纯化后制成的供注入人体内的无菌液体制剂，包括溶液型或乳状液型或混悬型等注射液，但随着应用的增多，有关临床不良反应的报道相继增加，尤其是严重的不良反应如过敏性休克、心血管系统不良反应、呼吸系统损伤等。

有学者认为中药注射液中蛋白质或多肽高分子物质的存在极有可能是引起不良反应的因素之一，在药剂提取过程中存在部分高分子物质，如蛋白质、多肽等，此类物质一旦引入中药注射剂成品，将引起中药注射剂的一系列不良反应或不良事件。因此，亟需建立中药注射剂中高分子量物质的检测方法，用于其高分子量物质的控制。

现有的中药注射剂的高分子量物质的检测方法基本上是采用葡聚糖凝胶色谱柱HPLC法分析，采用已知分子量的标准物质定位，判断高分子是否存在或者用于标定分子量的分布区间。目前研究者常通过高效液相体分子排阻色谱法直接分析样品(中医药学报，2013，41，31–32；中国药学杂志，2014，49，64–67；中国药业，2014，23，51–52)或采用超滤的方法将样品富集后进行分析(中国药品标准，2012，13，1；药物分析杂志，2016，36，1451–1455)。

据文献报道，中药注射剂中含有的酚酸类化合物能够通过疏水作用和氢键等相互作用与蛋白质或多肽结合(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2017，134，100–107；Plos One，2015，10，e0128919)。而上述常见的测定高分子量物质的方法中溶剂均为水，无法消除酚酸类化合物与蛋白质或多肽的相互作用，进而影响蛋白质或多肽等高分子量物质在凝胶柱中的保留时间和紫外响应，使得无法准确测定。

因此，为了消除样品中酚酸类化合物对蛋白质或多肽等高分子量物质测定的影响，必须研究建立消除酚酸类化合物干扰的特异样品预处理方法，以保证有效、准确地测定含酚酸类成分的中药注射剂中高分子量物质，对含酚酸类成分的中药注射剂中蛋白质或多肽类高分子量物质的监测，保障用药安全，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效消除样品中的酚酸类化合物对蛋白质或多肽等高分子量物质检测结果影响的供试品制备方法，提高含酚酸类成分的中药注射液中蛋白质或多肽等高分子量物质检测准确度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，包括以下步骤：

(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；

(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，如供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收峰，则判定待测中药注射液中含有多肽或蛋白类高分子量物质，或者按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。

本发明研究表明，在制备供试品溶液时，采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或乙腈水溶液作为稀释剂，能有效消除酚酸类物质对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰，保证样品中高分子量物质测定的准确性，为中药注射液的安全性提供有效的评估数据。

临床上使用的含酚酸类成分的中药注射液有丹红注射液、刺五加注射液、丹参注射液等。

作为优选，步骤(1)中，采用截留分子量为3000Da的超滤离心管进行超滤浓缩，离心力为1000-4000g。

本发明将待测中药注射液经超滤浓缩5-10倍，有助于提高检测灵敏度。具体地，取5～20.0mL待测中药注射液超滤离心至0.2～0.5mL，再利用稀释剂定容至2mL。更为优选，离心力采用2800g。

超滤浓缩后，采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或乙腈水溶液吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0ml量瓶中，制成供试品溶液。研究表明，供试品溶液中三氟乙酸终浓度为0.13％-0.15％，甲醇终浓度为45％-55％或乙腈终浓度为17％-20％时，能够有效消除酚酸类物质对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰。

作为优选，步骤(1)中，所述的含三氟乙酸的甲醇水溶液中三氟乙酸体积百分比为0.15％-0.25％、甲醇的体积百分比为55％-60％；所述的含三氟乙酸的乙腈水溶液中三氟乙酸的体积百分比为0.05％-0.25％、乙腈的体积百分比为15％-20％。

作为优选，浓缩液与含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液按照体积比1:6-8进行混合。

供试品溶液在液相色谱分析之前，经8000-15000rpm离心5-15分钟，取上清液进行分析。

步骤(2)中，采用TSK gel G2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)进行液相色谱分析。该类凝胶柱主要用于分析多肽或蛋白质，对色谱条件进行优化得出适合本发明制备的供试品溶液分析方法。

作为优选，色谱条件为：0.05％三氟乙酸乙腈与0.05％三氟乙酸溶液以体积比30:70混合的混合液为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL。

作为优选，步骤(2)中，所述的标准蛋白分子量物质为分子量为13700Da的核糖核酸酶A、分子量为5808Da的人胰岛素、分子量为3108Da的胸腺肽α1和分子量为1638Da的生长抑素。

可采用上述标准蛋白分子量物质的混合物作为对照，具体地，分别取核糖核酸酶A(分子量13700)、人胰岛素(分子量5808)、胸腺肽α1(分子量3108)和生长抑素(分子量1638)对照品各1支，加10％乙腈水溶液(含0.05％三氟乙酸)溶解并稀释制成每1ml中各含1mg的储备液。分别精密量取各分子量对照储备液适量，加含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容制成混合分子量对照溶液。

以混合分子量对照品各峰的保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标，进行线性回归，供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收的判定为待测中药注射液中有多肽或蛋白类高分子质量物质。按面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比或分子量分布。具体地，将比人胰岛素色谱峰先出峰的色谱峰视为高分子物质。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液作为含酚酸类化合物的中药注射液的稀释剂制备液相色谱分析的供试品溶液，能够解决因酚酸类化合物对多肽或蛋白质类高分子量物质的干扰导致的高分子量物质液相色谱保留时间发生变化而无法准确判断是否含有高分子量物质的问题。

(2)本发明通过优化制样条件和色谱条件，显著提高了高分子量物质检测的准确性，可应用于生物医药领域注射剂的研发、生产工艺科学性与合理性的评价。

附图说明

图1为丹红供试品溶液中甲醇终浓度对高分子量物质人胰岛素(A)和核糖核酸酶A(B)测定回收率的影响。

图2为丹红供试品溶液中三氟乙酸终浓度对高分子量物质测定回收率的影响。

图3为样品采用超滤管富集后洗涤次数优化。

图4为刺五加供试品溶液中乙腈终浓度对高分子量物质测定回收率的影响。

图5为刺五加供试品溶液中三氟乙酸终浓度对高分子量物质测定回收率的影响。

图6为供试品溶液制备溶剂对血塞通注射液中高分子量物质测定的影响。

图7为供试品溶液制备溶剂(甲醇-三氟乙酸体系)对舒血宁注射液中高分子量物质测定的影响。

图8为供试品溶液制备溶剂(乙腈-三氟乙酸体系)对舒血宁注射液中高分子量物质测定的影响。

图9为供试品溶液制备溶剂(甲醇-三氟乙酸体系)对丹红注射液中高分子量物质测定的影响。

图10为供试品溶液制备溶剂(乙腈-三氟乙酸体系)对丹红注射液中高分子量物质测定的影响。

图11为供试品溶液制备溶剂(甲醇-三氟乙酸体系)对刺五加注射液中高分子量物质测定的影响。

图12为供试品溶液制备溶剂(乙腈-三氟乙酸体系)对刺五加注射液中高分子量物质测定的影响。

图13为供试品溶液制备溶剂对丹参注射液中高分子量物质测定的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1

丹红注射液预处理方法的优化，确定了供试品溶液中甲醇浓度和三氟乙酸浓度

(1)供试品溶液中甲醇浓度优化

丹红注射液是由丹参、红花两味药材经提取、浓缩、醇沉、水沉等工艺精制而成的中药注射液。主要化学成分有丹参酚酸类及黄酮类。

一般在中药注射液研究中将分子量高于5000的化合物称为高分子量物质，因此首先选择分子量为5808的人胰岛素作为对照品进行甲醇浓度优化。

在丹红注射液中加入适量人胰岛素对照品储备液混匀，再加不同量0.05％三氟乙酸甲醇和0.05％三氟乙酸水溶液，分别制成甲醇终浓度为30％、35％、40％、45％、50％和55％的供试品溶液，10000rpm离心10分钟，取上清液，精密吸取40μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgelG2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05％三氟乙酸乙腈-0.05％三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，以人胰岛素对照品溶液为参照，计算回收率，结果见图1A。

由图1A可知，随着供试品中甲醇含量的升高，人胰岛素回收率升高，表明甲醇含量升高有利于消除酚酸类物质与人胰岛素的结合，使丹红样品液中人胰岛素在色谱柱中保留时间与人胰岛素对照品溶液相同，当甲醇终浓度大于45％时，人胰岛素回收率较好。

进一步将核糖核酸酶A作为对照品进行甲醇含量的二次优化。在丹红注射液中加入适量分子量为13700的核糖核酸酶A对照品储备液混匀，再加不同量的0.05％三氟乙酸甲醇和0.05％三氟乙酸水溶液，分别制成甲醇终浓度为50％、55％、60％和70％的供试品溶液，10000rpm离心10分钟，取上清液，精密吸取100μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgelG2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05﹪三氟乙酸乙腈-0.05﹪三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，以核糖核酸酶A对照品溶液为参照，计算回收率，结果见图1B。

由图1B可知，随着供试品中甲醇浓度的升高，核糖核酸酶A回收率先升后降，以55～60％甲醇浓度为佳。考虑到超滤管对甲醇最大耐受浓度为60％，初步选择55％的甲醇终浓度体系进行三氟乙酸浓度优化。

(2)供试品溶液中三氟乙酸含量优化

在丹红注射液中加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A对照品储备液混匀，再分别加一定量的含0.05％、0.10％、0.15％、0.20％和0.25％三氟乙酸甲醇和0.05％、0.10％、0.15％、0.20％和0.25％三氟乙酸水溶液，使体系中甲醇终浓度为55％，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各100μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgel G2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05﹪三氟乙酸乙腈-0.05﹪三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，以核糖核酸酶A对照品溶液为参照，计算回收率。

结果显示，随着体系中三氟乙酸百分含量增加，人胰岛素回收率变化不大。而核糖核酸酶A回收率随三氟乙酸浓度增加而增大，结果见图2。当溶剂中三氟乙酸含量≥0.15％(供试品溶液中三氟乙酸含量≥0.11％)时，核糖核酸酶A回收率较好。

(3)供试品溶液富集方式选择

由于一般中药注射液中高分子量物质含量较低，如不经过浓缩处理，较难检测得到，参照文献报道[中国药品标准，2012,13,1；药物分析杂志，2016,36，1451–1455]拟采用超滤浓缩的方法富集注射剂中的高分子量物质。本研究选择截留分子量为3000Da的超滤离心管对样品中的高分子量物质进行富集。

分别精密量取10.0mL丹红注射液分次加于超滤管中，加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A，2800g离心至体积为0.5mL，分别用55％甲醇水溶液(含0.20％三氟乙酸)3.5mL洗涤1、2、3和4次，最后离心浓缩至0.25mL后，用55％甲醇(含0.20％三氟乙酸)水溶液吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液。

精密吸取供试品溶液100μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。洗涤次数对样品中人胰岛素和核糖核酸酶A的色谱峰峰面积影响不大，而样品中低分子化合物的量随着洗涤次数增加而减少。考虑到洗涤会大大延长样品处理时间，且样品中低分子化合物存在并不影响高分子量物质的测定，故选择富集后不洗涤方式制样。

由于供试品溶液中甲醇和三氟乙酸终浓度会影响人胰岛素和核糖核酸酶A回收率，前期优化结果显示在固定甲醇终浓度为55％，三氟乙酸终浓度≥0.11％时，人胰岛素和核糖核酸酶A回收率均较好。

固定三氟乙酸终浓度为0.15％，进一步考察甲醇浓度对回收率的影响。在丹红注射液中加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A对照品储备液混匀，固定溶剂中三氟乙酸浓度为0.20％(供试品中三氟乙酸终浓度为0.15﹪)，调整甲醇终浓度为45％、55％，结果人胰岛素和核糖核酸酶A回收率与甲醇终浓度为55％的溶液无明显差异。表明供试品溶液中三氟乙酸终浓度为0.15％，甲醇终浓度为45～55％时，人胰岛素和核糖核酸酶A回收率均较好。

将样品富集终体积固定为0.25mL，进一步优化转移和稀释富集液的溶剂中甲醇浓度。固定溶剂中三氟乙酸浓度为0.17％(供试品溶液中三氟乙酸终浓度为0.15％)，调整溶剂中甲醇浓度为55％、63％(供试品溶液中甲醇终浓度分别为48％、55％)，结果人胰岛素和核糖核酸酶A回收率无明显差异，考虑超滤管材质对甲醇浓度的耐受性(最大耐受甲醇浓度为60％)，最终选择55％甲醇水溶液(含0.17％三氟乙酸)作为转移和稀释富集液的溶剂。

综上所述，最终的制样方式为：将丹红注射液10.0mL分次加入超滤管中，2800g离心浓缩至0.25mL后，用55％甲醇水溶液(含0.17％三氟乙酸)吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

实施例2

刺五加注射液中高分子量物质测定制样方式的优化，确定了稀释剂中乙腈浓度和三氟乙酸的浓度。

刺五加注射液有平补肝肾，益精壮骨等功效，含有木脂素类、酚酸类、糖类成分。由于一般中药注射液中高分子量物质含量较低，如不经过浓缩处理，较难检测得到，故选择截留分子量为3000Da的超滤离心管对样品中的高分子量物质进行富集。此外，由于刺五加注射液中存在的酚酸类物质会与多肽或蛋白类高分子量物质相互作用从而影响高分子量物质的测定，为了消除影响，以加样回收率为指标，优化了供试品溶液稀释用溶剂。

(1)稀释剂中乙腈浓度优化

精密量取10.0mL刺五加注射液分次加于超滤管中，加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A，2800g离心至0.25mL，分别用10％、15％和20％的乙腈水溶液(均含有0.05﹪三氟乙酸)吹打内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各100μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgel G2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05﹪三氟乙酸乙腈-0.05﹪三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，以对照品溶液为参照，计算回收率，结果见图4。

由图4可知，当稀释剂中乙腈含量低于15％时，无法检测到人胰岛素的色谱峰，随着稀释剂中乙腈含量的升高，核糖核酸酶A和人胰岛素回收率均显著升高。当乙腈浓度达到20％时，人胰岛素回收率可达到98％，而核糖核酸酶A回收率为88％。考虑到超滤管对乙腈最大耐受浓度为20％，因此选择20％乙腈体系，进一步优化三氟乙酸浓度。

(2)稀释剂中三氟乙酸浓度优化

精密量取10.0mL刺五加注射液分次加于超滤管中，加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A，2800g离心至0.25mL，分别用含有0.05％、0.10％、0.15％和0.20％三氟乙酸的20％乙腈水溶液吹打内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各100μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgel G2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05﹪三氟乙酸乙腈-0.05﹪三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，以对照品溶液为参照，计算回收率，结果见图5。

结果显示，随着稀释剂中三氟乙酸浓度增加，核糖核酸酶A和人胰岛素回收率先增加后基本不变，当三氟乙酸浓度等于或高于0.10％时，核糖核酸酶A和人胰岛素均能获得较好的回收率。最终选择含0.15％三氟乙酸的20％乙腈水溶作为转移和稀释富集液的溶剂。

综上所述，最终的制样方式为：将刺五加注射液10.0mL分次加入超滤管中，2800g离心浓缩至0.25mL后，用20％乙腈水溶液(含0.15％三氟乙酸)吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

实施例3

血塞通注射液、舒血宁注射液、刺五加注射液、丹红注射液、丹参注射液中高分子量物质测定制样方法比较。

五种注射液中刺五加注射液、丹红注射液和丹参注射液均含有酚酸类成分，舒血宁注射液主要成分为黄酮但含有极少量酚酸类成分，而血塞通注射液主要成分为皂苷不含酚酸类成分。

分别将血塞通注射液、舒血宁注射液、刺五加注射液、丹红注射液、丹参注射液各10.0mL分次加入超滤管中并加入适量人胰岛素和核糖核酸酶A，平行制备三份，2800g离心浓缩至0.25mL后，分别用水、55％甲醇水溶液(含0.17％三氟乙酸)、20％乙腈水溶液(含0.15％三氟乙酸)吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0mL量瓶中，稀释并定容，10000rpm离心10分钟，取上清液，即可。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各100μL，注入液相色谱仪(色谱条件：TSKgel G2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)，以0.05﹪三氟乙酸乙腈-0.05﹪三氟乙酸溶液(30:70)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL)，记录色谱图，结果见图6-13。

结果显示，当以水为稀释剂时，含有酚酸类成分的刺五加注射液、丹红注射液、丹参注射液供试品的色谱图中不能检测到人胰岛素和核糖核酸酶A色谱峰，表明刺五加注射液、丹红注射液、丹参注射液中存在的酚酸类物质与人胰岛素和核糖核酸酶A相互作用，影响了人胰岛素和核糖核酸酶A的保留时间，同理也会影响样品中多肽或蛋白类高分子量物质的保留时间，使得样品中多肽或蛋白类高分子量物质测定不准确；而当以55％甲醇水溶液(含0.17％三氟乙酸)和20％乙腈水溶液(含0.15％三氟乙酸)为稀释剂时，刺五加注射液、丹红注射液和丹参注射液供试品的色谱图中均能检测到人胰岛素和核糖核酸酶A的色谱峰且与单一人胰岛素和核糖核酸酶A标准品溶液保留时间一致，且色谱响应相当，表明55％甲醇水溶液(含0.17％三氟乙酸)和20％乙腈水溶液(含0.15％三氟乙酸)溶剂能有效消除酚酸类物质对高分子量物质检测的干扰。

不含酚酸类成分的血塞通注射液能检测到人胰岛素和核糖核酸酶A的色谱峰且与单一人胰岛素和核糖核酸酶A标准品溶液保留时间一致，色谱响应相当，表明不含酚酸类成分的中药注射剂可以采用文献方法，以水为稀释剂进行制样。

舒血宁注射液主要成分为黄酮但含有极少量酚酸类成分，用水为稀释剂能检测到人胰岛素和核糖核酸酶A的色谱峰且与单一人胰岛素和核糖核酸酶A标准品溶液保留时间一致，但色谱响应较等浓度的单一标准品溶液低，表明极少量酚酸类成分仍然会干扰样品中多肽或蛋白类高分子量物质的测定。

Claims (7)

1.一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；

(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，如供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收峰，则判定待测中药注射液中含有多肽或蛋白类高分子量物质，或者按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。

2.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，采用截留分子量为3000Da的超滤离心管进行超滤浓缩，离心力为1000-4000g。

3.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含三氟乙酸的甲醇水溶液中三氟乙酸体积百分比为0.15％-0.25％、甲醇的体积百分比为55％-60％；所述的含三氟乙酸的乙腈水溶液中三氟乙酸的体积百分比为0.05％-0.25％、乙腈的体积百分比为15％-20％。

4.如权利要求3所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，浓缩液与含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液按照体积比1:6-8进行混合。

5.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质量的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，采用TSKgel G2000SWXL凝胶柱进行液相色谱分析。

6.如权利要求5所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，色谱条件为：0.05％三氟乙酸乙腈与0.05％三氟乙酸溶液以体积比30:70混合的混合液为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL。

7.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的标准蛋白分子量物质为分子量为13700Da的核糖核酸酶A、分子量为5808Da的人胰岛素、分子量为3108Da的胸腺肽α1和分子量为1638Da的生长抑素。