CN102680642B - 一种检测参芪扶正注射液中大分子物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测参芪扶正注射液大分子物质的方法。该方法包括如下步骤：(1)采用超滤离心法对参芪扶正注射液超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；(2)采用BCA法和Molish法检测步骤(1)获得的上层截留液，以确定所述参芪扶正注射液否存在大分子物质。此法所采用的仪器材料及试验方法都简单常见，成本低廉，可以方便的运用于生产实际中，为产家生产过程中的质量控制提供参考，进一步保证参芪扶正注射液的安全性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测参芪扶正注射液中大分子物质的方法。
背景技术
参芪扶正注射液作为一种中药注射液，主要由党参、黄芪制备而成，参芪扶正注射液的原料的提取过程中会产生大量的如蛋白质、多糖、多肽、鞣质等大分子杂质，而大分子杂质是产生过敏性反应等不良反应的主要原因，其中，大分子多糖一般为蛋白多糖，该糖蛋白的抗原性高于原有的蛋白质，同时单纯的多糖也能够作为免疫佐剂来增强过敏反应。因此在注射液生产过程中这些大分子如果不能去除干净，有可能引起患者过敏、红肿等不良反应。
广东省不良反应检测中心开展了对参芪扶正注射液上市后安全性再评价研究，其不良反应累积发生率为0.2％，属“偶见”，主要表现为皮疹、刺激痛、过敏等。这些不良反应主要是因为注射液中存在的大分子物质引起的。因此，建立对有害大分子物质的检查及限量监控方法对于保证参芪扶正注射液的安全性是非常重要的。
目前学术界对于产生不良反应的大分子物质的分子量没有形成统一的界限，认为中药注射液的疗效来自所含的小分子物质，与分子量大于3000的物质无关，然而许多中药中分子量大于3000的多糖和蛋白的大分子物质仍具有很强的药物活性，若将此类中药注射液中分子量大于3000的物质除去，该注射液的安全性会增加，但是药效则会大大降低。目前未有文献公开参芪注射液中易发生副反应的大分子物质的具体分子量界限，而常规多糖和蛋白质检测方法无法对不同分子量的大分子物质分别进行检测，对于参芪扶正注射液而言，既能保证其安全性，又能保证其有效性的检测方法未见相关文献报道。
参芪扶正注射液不同于普通注射液之处在于，由于中药提取过程中不可避免地产生的色素残留，若直接使用如Folin-酚试剂法、Bradford法等显色反应检测蛋白质和多糖会导致检测结果产生严重误差，因此使用显色法进行检测前，需要除去注射液中的色素，诸如中国专利申请201010504574.4公开了中药注射液中的微量蛋白质检测方法，而在中药注射液本身具有色素的情况下(如参芪扶正注射液为黄色液体)，则需要增加脱色步骤才不会影响最终结果，而使用蛋白特异性吸附膜脱色时，浸泡时间至少需要15小时，由此可见，该方法操作时间过长，步骤繁琐。
参芪扶正注射液作为一种中药注射液，注射液中的蛋白质、多糖大分子成分不能使用常规检测方法检测，因为使用常规方法进行检测时，其他成分可能会对检测结果产生较大的影响。为了消除其他成分的影响，中药注射液中大分子物质的检测方法通常比较复杂。中国专利ZL200610001838.8公开了一种测定注射液高分子物质含量的方法，该方法采用高效液相色谱法，虽然测定结果的灵敏度高，但是需要使用参照物，操作步骤较为繁杂。
中国专利申请201110002873.2采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生脉注射液中微量蛋白，该方法操作步骤较多，成本较高。
现行药典(2010版)制定了中药注射液中的蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐的物质检测标准，但没有特别制定大分子物质蛋白质、多肽、多糖的质量控制标准。而且药典中控制中药注射液蛋白的磺基水杨酸比浊法灵敏度低，且易受到注射液本身颜色的干扰影响判断。
发明内容
鉴于现有的蛋白质和多糖的质量控制标准，已经远远落后于中药注射液的质量控制需要，为了提高对中药注射液的有效成分的质控水平，本发明以参芪扶正注射液为研究实例，建立了一种简便有效的检测方法，可用于检测注射液中大分子物质蛋白质、多糖的存在情况。该方法对于大分子物质多糖、蛋白质类检测灵敏度均可达微克级，远低于引起过敏反应的量，可应用在注射液成品及生产、贮存过程中的大分子物质的监控及检测，以防止在临床使用中产生过敏反应。
本发明实验证明，参芪扶正注射液分子量大于3.8KD的大分子多糖和蛋白容易导致不良反应的发生。因此，本发明采用超滤离心的方法分离分子量大于3.8KD的大分子物质，再用常规的BCA法和Molish法检测分离出来的大分子蛋白和多糖，即可消除注射液中的其他成分对实验结果的影响。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种检验参芪扶正注射液中大分子物质的方法，该方法包括如下步骤：
(1)采用超滤离心法对参芪扶正注射液进行超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；
(2)采用BCA法和Molish法检测步骤(1)获得的上层截留液，以确定所述参芪扶正注射液中是否存在大分子物质。
上述检测方法中，步骤(1)中，使用的超滤离心管优选为Millipore Ultra-153.0kD-3.8kD。
上述检测方法中，步骤(1)中，每次超滤离心后的上层截留液体积为150μl-250μl。
上述检测方法中，步骤(1)中，加入超纯水的次数优选为8-10次，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性。
上述检测方法中，所述参芪扶正注射液大分子物质是指大分子蛋白和多糖。
根据本发明的一个具体实施方案，所述检测方法包括如下步骤：
(1)精密吸取参芪扶正注射液10ml置于Millipore Ultra-153.0kD-3.8kD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余体积为150μl-250μl，往上层截留液加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余体积为150μl-250μl，重复加水8～10次，每次2ml，每次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml。
(2)采用BCA法检测注射液中是否含有大分子的蛋白质，具体方法为：使用BCA蛋白试剂盒，于96孔板中加入20μl样品液及200μlBCA工作液，37℃放置30min，观察是否有紫色络合物出现。采用Molish法检测注射液中是否含有大分子的多糖物质，具体方法为：小试管中加入1ml样品液和两三滴Molish试液，摇匀，沿管壁慢慢加入1ml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现.
采用BCA法检测是否含有大分子蛋白质类物质，如反应为阳性，则表示含有大分子蛋白质，反之则不含该类物质；采用Molish法检测是否含有大分子糖类物质，若反应阳性则含有大分子多糖，反之则不含该类物质。
经过试验，此法对于大分子糖类及蛋白质类检测灵敏度均可达微克级，远低于引起过敏反应的量。由于超滤离心仅保留了注射液中的大分子物质，克服了由于其他非大分子物质对检测结果所带来的影响，同时在超滤离心的过程中不断用超纯水洗涤，也消除了参芪扶正注射液本身的色素对后续显色反应结果所产生的影响，无需单独除色即可进行后续显色反应。因此只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。
本发明建立了一种对参芪扶正注射液能存在的大分子物质(蛋白质类及多糖类)的经济实用的限量检查方法，该方法检测灵敏度高，操作简单，成本低廉，同时克服了非大分子物质对检测结果的影响，可以无需单独脱色即可方便有效的检测出注射液中相应大分子物质的存在情况，所用仪器材料均较常见，可以方便的运用于生产实际中，对于生产过程中的产品质量控制具有较强的现实意义。该方法对参芪扶正注射液品质量控制提供参考，进一步保证参芪扶正注射液的安全性。
具体实施方式
下面结合具体实施例子对本方法做进一步说明。
实施例1：注射液样品大分子物质的检测
精密吸取各批参芪扶正注射液、丹参注射液、参附注射液样品和各参芪扶正注射液中间体样品各10ml置于Millipore Ultra-153.0kD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余150μl，往上层截留液中加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余150μl，重复加水(8～10次，每次2ml)，每次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml，采用BCA法和Molish法分别检测是否含有大分子的蛋白质类和糖类物质。从而判断这些样品中大分子物质的存在情况。
Molish反应步骤：小试管中加入1ml样品液和两三滴Molish试液，摇匀。把试管倾斜，沿管壁慢慢加入1ml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现；
BCA反应步骤：使用BCA蛋白试剂盒(碧云天P0010BCA蛋白浓度测定试剂盒)，于96孔板中加入20μl样品液及200μlBCA工作液，37℃放置30min，观察是否有紫色络合物出现。
另外，将已知大分子蛋白质及多糖的含量超滤浓缩液样品的上层截留液部分，按照一定梯度加入到参芪扶正注射液样品中稀释，使其中大分子物质含量是原来超滤浓缩液样品的1/10，1/50，1/100，1/200，1/500，1/1000。按照上述的分离检测方法进行检测。经过检测，其中大分子物质含量在原来超滤浓缩液样品1/500时，即多糖1.08μg/ml，蛋白质0.92μg/ml，糖类和蛋白质类检出均已相当弱，这已经达到检测下限，大分子物质为原超滤浓缩液样品1/1000时，已经完全检测不出。可以认为对于糖类和蛋白质类检测限度均在1μg/ml级，远低于引起过敏反应的量(mg级)。故只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。检测结果如表1所示。
表1各批注射液样品大分子物质检测结果
实施例2：注射液样品大分子物质的检测
精密吸取各批参芪扶正注射液和参芪扶正注射液中间体样品各10ml置于MilliporeUltra-153.8kD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余250μl，往上层截留液中加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余250μl，重复加水(8～10次，每次2ml)，每次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml，采用BCA法和Molish法分别检测是否含有大分子的蛋白质类和糖类物质。
Molish反应步骤：小试管中加入1ml样品液和两三滴Molish试液，摇匀。把试管倾斜，沿管壁慢慢加入1ml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现；
BCA反应步骤：使用BCA蛋白试剂盒(碧云天P0010BCA蛋白浓度测定试剂盒)，于96孔板中加入20μl样品液及200μlBCA工作液，37℃放置30min，观察是否有紫色络合物出现。
另外，将已知大分子蛋白质及多糖的含量超滤浓缩液样品的上层截留液部分，按照一定梯度加入到参芪扶正注射液样品中稀释，使其中大分子物质含量是原来超滤浓缩液样品的1/10，1/50，1/100，1/200，1/500，1/1000。按照上述的分离检测方法进行检测。经过检测，其中大分子物质含量在原来超滤浓缩液样品1/500时，即多糖1.18μg/ml，蛋白质1.02μg/ml，糖类和蛋白质类检出均已相当弱，这已经达到检测下限，大分子物质为原超滤浓缩液样品1/1000时，已经完全检测不出。可以认为对于糖类和蛋白质类检测限度均在1μg/ml级，远低于引起过敏反应的量(mg级)。故只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。检测结果如表2所示。
表2各批注射液样品大分子物质检测结果
通过以上方法检测结果显示，参芪扶正注射液中间体样品中，存在一些大分子物质，其成分为糖类及蛋白质类，在生产工艺过程中，这些物质被逐步除去，尤其是超滤步骤的除杂效果尤为显著。经过生产工艺的除杂，在成品中，大分子物质已经完全得以去除，成品已不含分子量在3800Da以上的大分子物质。在实验中，对产家提供的不同贮藏期参芪扶正注射液样品进行了检测，结果证明在保质期内，产品质量稳定可靠，没有大分子物质的出现。同样的，本发明公开的方法也可应用于丹参注射液、参附注射液等同类中药注射液产品的质量控制当中。
通过这种方法，可以比较方便有效的检验出注射液中的大分子物质存在情况，从而为厂家的生产过程质量控制提供参考，保证产品的安全性。
实施例3：豚鼠的过敏试验。
采用建立豚鼠全身主动过敏试验动物模型的方法，对样品进行检测，并与所建立的方法进行比较。按照药典附录XI K及《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则》的方法进行试验。取体重250g至350g的健康豚鼠，分为阴性对照组，阳性对照组，以及各批中间体样品(参芪提取物样品、参芪提取物超滤前样品、参芪提取物超滤浓缩液样品)试验组，参芪扶正注射液组，丹参注射液组，参附注射液组，每组6只动物。各批参芪注射液中间体样品组分别经过等效剂量换算后，注射相当于生药量260mg/ml的参芪注射液中间体样品，其中所含的大分子糖类及蛋白质类的含量已经测得；参芪扶正注射液组、丹参注射液组，参附注射液组分别给与相应的注射液样品；阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射2mg/ml卵蛋白溶液。
每鼠隔日分4次腹腔注射相应药液0.5mL进行致敏，末次致敏后第13天，每组豚鼠由静脉注射相应药液1.0mL，观察静脉注射后30min内受试豚鼠有无过敏反应发生，如有竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐、休克、死亡现象之一者，判为过敏反应阳性。通过豚鼠的过敏试验，确定大分子物质存在情况与引起过敏反应之间的关系。
表2大分子物质存在情况与过敏反应关系
引起豚鼠的过敏反应的各批注射液中间体样品，经过MALDI-TOF质谱检测，这些样品均含有分子量在3800Da-4500Da左右的大分子物质。而不含分子量在3800Da以上的大分子物质的各注射液样品没有引起过敏反应，说明分子量在3800Da以上的大分子物质的存在是引起豚鼠过敏反应的原因。注射的中间体样品大分子糖类和蛋白质类含量均在0.5mg/ml左右，会引起豚鼠的过敏反应，但是过敏反应级数较弱，主要是竖毛、发抖、骚鼻、喷嚏、呼吸急促等反应，并在20min左右恢复正常，均为过敏反应弱阳性或阳性，与2mg/ml卵蛋白组引起的很快死亡的极强阳性反应相比有比较明显差距。
由此可以看出，引起豚鼠发生过敏反应的大分子糖类及蛋白质总量约在1mg/ml，是毫克级。而本发明建立的检测方法，灵敏度可达微克级，灵敏度远远高于引起动物过敏反应的量，故可以认为经过这种检测方法检测合格的产品，不含大分子物质，产品质量合格。而且比起其他灵敏度较高的方法，如MALDI-TOF质谱检测、ELISA法等，本发明的方法成本低，经济有效，故可以方便有效的检验出注射液样品中的大分子物质存在情况，从而为厂家的生产过程质量控制提供参考，保证产品的安全性。
Claims (3)
1.一种检验参芪扶正注射液大分子物质的方法，该方法包括如下步骤：
(1)采用超滤离心法分离分子量大于3.8KD的大分子物质：对中药注射注射液使用超滤离心管Millipore Ultra-153.0KD-3.8KD进行超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，加入超纯水的次数为8-10次，每次超滤离心后的上层截留液体积为150μl-250μl，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；
(2)采用BCA法和Molish法检测步骤(1)获得的上层截留液，以确定所述中药注射注射液是否存在大分子物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大分子物质是指参芪扶正注射液中的大分子蛋白和大分子多糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)精密吸取参芪扶正注射液10ml置于MilliporeUltra-153.0KD-3.8KD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余体积为150μl-250μl，往上层截留液加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余体积为150μl-250μl，重复加水8～10次，每次2m1，每次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，收集上层截留液，定容至10m1；
(2)采用BCA法检测注射注射液是否含有大分子的蛋白质，具体方法为：使用BCA蛋白试剂盒，于96孔板中加入20μl样品液及200μl BCA工作液，37℃放置30min，观察是否有紫色络合物出现；采用Molish法检测注射注射液是否含有大分子的多糖物质，具体方法为：小试管中加入1ml样品液和两三滴Molish试液，摇匀，沿管壁慢慢加入1ml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现。
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