CN110609138A - 一种用于间接血凝（iha）法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法 - Google Patents
一种用于间接血凝（iha）法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备血吸虫特异抗原：步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原；步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原；步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；步骤4、过碘酸钠处理抗原；步骤5、将经过碘酸钠处理过的日本血吸虫可溶性成虫抗原、日本血吸虫可溶性尾蚴抗原和日本血吸虫可溶性虫卵抗原按体积比1:0.5:2比例混合，即为特异抗原；步骤二：特异抗原制备间接血凝试剂：本发明将粗制的日本血吸虫成虫、尾蚴及虫卵可溶性抗原，经过碘酸钠处理后进行配比混合，制备出诊断试剂，该试剂降低了与其他疾病的交叉反应，同时保持了原本的高敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及血吸虫抗体检测技术领域，具体为一种间接血凝试剂中，用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备的方法。
背景技术
血吸虫病是严重危害人群健康和阻碍经济社会发展的重大传染病，我国党和政府高度重视血吸虫病的防控工作，经过60多年的努力我国血吸虫病防控起得了举世瞩目的成就。然而，在控制和消除血吸虫病的进程中，我们还存在不少的技术壁垒和障碍。尤其是随着血吸虫病防控工作的深入，流行区血吸虫病感染率越来越低，感染度也越来越轻。在血吸虫病病原学诊断中，本来检出率不理想的孵化法、加藤法、沉淀镜检法等，在低度流行区已经越来越不适用，尤其在我国实施以传染源控制为主的综合性防控对策中，如何最大限度地发现传染源是我们防控工作的重中之重。
日本血吸虫病是由于日本血吸虫寄生于人和哺乳动物体内引起的一种人兽共患寄生虫病。人感染日本血吸虫病后，其血清中可产生相应的特异性血吸虫抗体，该抗体在感染血吸虫病后，可在体内显现，并存在较长时间，故可被检测，以此作为诊断依据。早期、正确的诊断是控制血吸虫病流行的重要环节。血清免疫学检查方法在我国控制和消除血吸虫病中发挥着重要的作用。在血吸虫病的免疫性诊断中，先后研制了一系列用抗原检测体内抗体、用抗体检测体内抗原、检测血吸虫特异性DNA等方法。但各类方法不是敏感性不高，就是特异性不强，或是稳定性上存在不足。到目前为止没有一种特异性强、敏感性高，能考核疗效的理想方法。我们研制的以血吸虫虫卵可溶性抗原为基础的混合性特异抗原，以此作为抗原制成血吸虫病间接血凝诊断试剂，克服了传统单一虫卵粗抗原成分复杂，交叉反应高的不足，也克服了重组抗原，特异性低的缺陷。目前间接血凝试验也是我国血吸虫病流行区广泛使用的主要诊断方法。我们研制的抗原是目前市场上特异性和敏感性最好的诊断抗原。我们研制生产的间接血凝(IHA)诊断试剂早在2010年就获得国家食品药品监督管理局注册批号(国食药监械(准)字2010第3400632号)，该产品自从2005年就一直被国家卫生部和卫生计生委制定为全国血吸虫病监测点使用试剂。安徽省、湖南省、云南省和浙江省已全省多年招标采购使用我们的生产的诊断试剂。我们的产品在全国同类诊断试剂的评比中，多次获得第一名的好成绩。为了保护该产品的知识产权，特申请发明专利保护。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备血吸虫特异抗原：
步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原；
步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原；
步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；
步骤4、将制备的日本血吸虫可溶性成虫抗原，加入10mmol/L过碘酸钠室温反应30min，再加入50mmol/L硼氢化钠室温30min终止反应；将处理后的日本血吸虫可溶性成虫抗原溶液置pH7.2PBS中透析并于4℃过夜，超滤浓缩后配制1mg/ml溶液；同法将日本血吸虫尾蚴和虫卵抗原，经过碘酸钠和硼氢化钠处理，经透析和超滤浓缩后制备成1mg/ml溶液；过碘酸钠氧化法可使糖分子的羟基变成醛基或酮基，使蛋白所携带的糖基分子被破坏；
步骤5、将经过碘酸钠处理过的日本血吸虫可溶性成虫抗原、日本血吸虫可溶性尾蚴抗原和日本血吸虫可溶性虫卵抗原按体积比1:0.5:2比例混合，即为特异抗原；
步骤二：特异抗原制备间接血凝试剂：
步骤1、醛化红细胞制备；
步骤2、鞣化红细胞制备；
步骤3、致敏红细胞悬液的制备；
步骤4、冻干致敏红细胞制备；
在致敏红细胞悬液中加入10％浓度的蔗糖和2％浓度的经56℃灭活30min后的兔血清；摇匀后分装于2mL的安瓿瓶内，每支含量0.5mL；将分装后的致敏红细胞放入冷冻干燥机内进行抽干，并用封口机进行封口，冻干致敏红细胞外观为褐色或淡红色疏松体。
所述步骤一中步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原方法为：取日本血吸虫成虫冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清，经滤纸过滤后再次4℃10000g离心30min离心，吸取上清即为日本血吸虫可溶性成虫抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
所述步骤一中步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原方法为：取日本血吸虫尾蚴冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性尾蚴抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
所述步骤一中步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原方法为：取日本血吸虫虫卵冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性虫卵抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
所述步骤二中步骤1、醛化红细胞制备方法为：取“O”型人红细胞，用生理盐水洗涤3次，移入刻度离心管，1 200g离心10min，记录压积红细胞体积，取压积红细胞，每1mL加pH7.2PBS 25mL混匀，再缓慢滴加2.5％戊二醛2mL，边滴边摇，滴至最后一滴，室温摇荡1h，用PBS洗涤3次，再用蒸馏水洗涤2次，最后用0.01％硫柳汞生理盐水配成10％醛化红细胞悬液，置2℃～8℃备用。
所述步骤二中步骤2、鞣化红细胞制备方法为：配制含0.01％鞣酸的生理盐水，再量取等量的0.1mol/L pH 7.2PBS与生理盐水混匀，取压积醛化红细胞倒入上述溶液中使成1％浓度，置37℃恒温水浴振荡器中振摇15min，用pH 7.2PBS洗涤3次；将洗涤后的红细胞倒入pH 6.4PBS溶液中使成1％浓度，充分混匀，即为鞣化红细胞。
所述步骤二中步骤3、致敏红细胞悬液的制备方法为：鞣化红细胞悬液中加入步骤一制备的特异抗原使成0.2％浓度，充分混匀，置37℃恒温水浴振荡器中振摇45min致敏，离心沉淀弃去上清液，以含1％经56℃灭活30min后的兔血清的pH 7.2PBS洗涤沉淀以去除未结合的特异抗原，配制含4％致敏红细胞悬液，充分混匀，再加入经56℃灭活30min后的兔血清5mL，离心弃去上清液，再以含1％正常兔血清的pH 7.2PBS配制4％浓度致敏红细胞悬液。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本发明将粗制的日本血吸虫成虫、尾蚴及虫卵可溶性抗原，经过碘酸钠处理后进行配比混合，制备出诊断试剂，该试剂降低了与其他疾病的交叉反应，同时保持了原本的高敏感性。与传统方法比较，具有敏感性高、特异性强，方法简便、快速，并具有疾病早期诊断的特点，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学筛查。
具体实施方式
为了使本发明的操作流程、技术方法、生产工艺、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实例，对本发明实例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实例仅仅是本发明一部分实例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备血吸虫特异抗原：
步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原；取日本血吸虫成虫冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清，经滤纸过滤后再次4℃10000g离心30min离心，吸取上清即为日本血吸虫可溶性成虫抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原；取日本血吸虫尾蚴冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性尾蚴抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；取日本血吸虫虫卵冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性虫卵抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
步骤4、将制备的日本血吸虫可溶性成虫抗原，加入10mmol/L过碘酸钠室温反应30min，再加入50mmol/L硼氢化钠室温30min终止反应；将处理后的日本血吸虫可溶性成虫抗原溶液置pH7.2PBS中透析并于4℃过夜，超滤浓缩后配制1mg/ml溶液；同法将日本血吸虫尾蚴抗原和虫卵抗原，经过碘酸钠和硼氢化钠处理，经透析和超滤浓缩后制备成1mg/ml溶液；过碘酸钠氧化法可使糖分子的羟基变成醛基或酮基，使蛋白所携带的糖基分子被破坏；
步骤5、将经过碘酸钠处理过的日本血吸虫可溶性成虫抗原、日本血吸虫可溶性尾蚴抗原和日本血吸虫可溶性虫卵抗原按体积比1:0.5:2比例混合，即为特异抗原；
步骤二：特异抗原制备间接血凝试剂：
步骤1、醛化红细胞制备；取“O”型人红细胞，用生理盐水洗涤3次，移入刻度离心管，1 200g离心10min，记录压积红细胞体积，取压积红细胞，每1mL加pH 7.2PBS 25mL混匀，再缓慢滴加2.5％戊二醛2mL，边滴边摇，滴至最后一滴，室温摇荡1h，用PBS洗涤3次，再用蒸馏水洗涤2次，最后用0.01％硫柳汞生理盐水配成10％醛化红细胞悬液，置2℃～8℃备用。
步骤2、鞣化红细胞制备；鞣化红细胞制备方法为：配制含0.01％鞣酸的生理盐水，再量取等量的0.1mol/L pH 7.2PBS与生理盐水混匀，取压积醛化红细胞倒入上述溶液中使成1％浓度，置37℃恒温水浴振荡器中振摇15min，用pH7.2PBS洗涤3次；将洗涤后的红细胞倒入pH 6.4PBS溶液中使成1％浓度，充分混匀，即为鞣化红细胞。
步骤3、致敏红细胞悬液的制备；致敏红细胞悬液的制备方法为：鞣化红细胞悬液中加入步骤一制备的特异抗原使成0.2％浓度，充分混匀，置37℃恒温水浴振荡器中振摇45min致敏，离心沉淀弃去上清液，以含1％经56℃灭活30min后的兔血清的pH 7.2PBS洗涤沉淀以去除未结合的特异抗原，配制含4％致敏红细胞悬液，充分混匀，再加入经56℃灭活30min后的兔血清5mL，离心弃去上清液，再以含1％正常兔血清的pH 7.2PBS配制4％浓度致敏红细胞悬液。
步骤4、冻干致敏红细胞制备；在致敏红细胞悬液中加入10％浓度的蔗糖和2％浓度的经56℃灭活30min后的兔血清；摇匀后分装于2mL的安瓿瓶内，每支含量0.5mL；将分装后的致敏红细胞放入冷冻干燥机内进行抽干，并用封口机进行封口，冻干致敏红细胞外观为褐色或淡红色疏松体。
早期诊断检测：
本发明特异抗原制备的间接血凝试剂(AWA-SCA-SEA)检测感染20d、30d、45d阳性兔血清30例、28例、35例，并同时使用常规制备的间接血凝试剂(SEA-C)做对比，结果感染血吸虫20d兔血清样本30份，阳性检出率分别为26和12，阳性率分别为86.7％和40.0％，经统计学分析，AWA-SCA-SEA早期敏感性高于SEA-C(χ2＝10.56，P<0.01)，感染30d兔血清样本28份，阳性检出例数分别为28和26，阳性率分别为100％和92.9％，经统计学分析，AWA-SCA-SEA与SEA-C阳性率差异无统计学意义(χ2＝0.5，P>0.05)，感染45d兔血清样本25份，两者全部检出。
敏感性检测：检测100份血吸虫病人血清，阳性率为98％。
特异性检测：检测50份正常人血清，假阳性率为0；检测27份肝吸虫病人血清，假阳性率为0；检测39份肺吸虫病人血清，假阳性率为7.7％；检测44份钩虫病人血清，假阳性率为0；检测51份姜片虫病人血清，假阳性率为0；检测52份乙肝病人血清，假阳性率为0。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：制备血吸虫特异抗原：
步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原；
步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原；
步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；
步骤4、将制备的日本血吸虫可溶性成虫抗原，加入10mmol/L过碘酸钠室温反应30min，再加入50mmol/L硼氢化钠室温30min终止反应；将处理后的日本血吸虫可溶性成虫抗原溶液置pH7.2 PBS中透析并于4℃过夜，超滤浓缩后配制1mg/ml溶液；同法将日本血吸虫尾蚴抗原和虫卵抗原，经过碘酸钠和硼氢化钠处理，经透析和超滤浓缩后制备成1mg/ml溶液；过碘酸钠氧化法可使糖分子的羟基变成醛基或酮基，使蛋白所携带的糖基分子被破坏；
步骤5、将经过碘酸钠处理过的日本血吸虫可溶性成虫抗原、日本血吸虫可溶性尾蚴抗原和日本血吸虫可溶性虫卵抗原按体积比1:0.5:2比例混合，即为特异抗原；
步骤二：特异抗原制备间接血凝试剂：
步骤1、醛化红细胞制备；
步骤2、鞣化红细胞制备；
步骤3、致敏红细胞悬液的制备；
步骤4、冻干致敏红细胞制备；
在致敏红细胞悬液中加入10％浓度的蔗糖和2％浓度的经56℃灭活30min后的兔血清；摇匀后分装于2mL的安瓿瓶内，每支含量0.5mL；将分装后的致敏红细胞放入冷冻干燥机内进行抽干，并用封口机进行封口，冻干致敏红细胞外观为褐色或淡红色疏松体。
2.根据权利要求1所述的一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，其特征在于：所述步骤一中步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原方法为：取日本血吸虫成虫冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清，经滤纸过滤后再次4℃10000g离心30min离心，吸取上清即为日本血吸虫可溶性成虫抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
3.根据权利要求1所述的一种用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备间接血凝试剂的方法，其特征在于：所述步骤一中步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原方法为：取日本血吸虫尾蚴冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性尾蚴抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
4.根据权利要求1所述的一种用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备间接血凝试剂的方法，其特征在于：所述步骤一中步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原方法为：取日本血吸虫虫卵冻干品，按1％浓度加入pH5.6的50mmol/L醋酸钠缓冲液，在-20℃和37℃之间反复冻融3次后，超声10min，置冰箱中冷藏放置过夜，于4℃10000g离心30min，吸取上清即为日本血吸虫可溶性虫卵抗原，蛋白测定后以醋酸钠缓冲液配制成1mg/ml终浓度备用。
5.根据权利要求1所述的一种用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备间接血凝试剂的方法，其特征在于：所述步骤二中步骤1、醛化红细胞制备方法为：取“O”型人红细胞，用生理盐水洗涤3次，移入刻度离心管，1 200g离心10min，记录压积红细胞体积，取压积红细胞，每1mL加pH 7.2PBS 25mL混匀，再缓慢滴加2.5％戊二醛2mL，边滴边摇，滴至最后一滴，室温摇荡1h，用PBS洗涤3次，再用蒸馏水洗涤2次，最后用0.01％硫柳汞生理盐水配成10％醛化红细胞悬液，置2℃～8℃备用。
6.根据权利要求1所述的一种用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备间接血凝试剂的方法，其特征在于：所述步骤二中步骤2、鞣化红细胞制备方法为：配制含0.01％鞣酸的生理盐水，再量取等量的0.1mol/L pH 7.2PBS与生理盐水混匀，取压积醛化红细胞倒入上述溶液中使成1％浓度，置37℃恒温水浴振荡器中振摇15min，用pH 7.2PBS洗涤3次；将洗涤后的红细胞倒入pH 6.4PBS溶液中使成1％浓度，充分混匀，即为鞣化红细胞。
7.根据权利要求1所述的一种用于日本血吸虫抗体检测的特异抗原制备间接血凝试剂的方法，其特征在于：所述步骤二中步骤3、致敏红细胞悬液的制备方法为：鞣化红细胞悬液中加入步骤一制备的特异抗原使成0.2％浓度，充分混匀，置37℃恒温水浴振荡器中振摇45min致敏，离心沉淀弃去上清液，以含1％经56℃灭活30min后的兔血清的pH 7.2PBS洗涤沉淀以去除未结合的特异抗原，配制含4％致敏红细胞悬液，充分混匀，再加入经56℃灭活30min后的兔血清5mL，离心弃去上清液，再以含1％正常兔血清的pH 7.2PBS配制4％浓度致敏红细胞悬液。
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