CN101570573A - 一种诊断日本血吸虫病的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血吸虫SjP7蛋白及其用途，所述的SjP7蛋白具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，其可用于制备检测血吸虫病的试剂或试剂盒。本发明还公开了一种检测血吸虫病的试剂盒以及诊断血吸虫病的方法。

Description

一种诊断日本血吸虫病的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种诊断日本血吸虫病的方法及试剂盒。

背景技术

血吸虫亦称裂体吸虫或住血吸虫，隶属于吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属。寄生人体的血吸虫主要有6种，即曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)，日本血吸虫(S.japonicum)，埃及血吸虫(S.haematobium)，间插血吸虫(S.intercalatum)，湄公血吸虫(S.mekongi)和马来血吸虫(S.malayensis)，其中以曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫所引起的血吸虫病流行范围最广，危害最大。血吸虫病(Schistosomiasis)主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲，而在我国流行的是日本血吸虫病，并且由日本血吸虫感染所引起的病情也是最严重，防治难度最大的，这主要是由于日本血吸虫动物宿主多；成虫寿命长；感染后的伴随免疫和治愈后的免疫力差；中间宿主钉螺不易控制等特点。

日本血吸虫成虫为雌雄异体。雄虫乳白色，体长12-20mm，体表光滑，前端有发达的口吸盘和腹吸盘。自腹盘以下，虫体向两侧延展，并略向腹面卷曲，形成抱雌沟(gynecophoral canal)，雌虫停留其中，与雄虫呈合抱状态。雌虫体长20-25mm，暗黑色，前端细小，后端粗圆。

随着全国性血吸虫病防治工作的展开，感染度降低，患者的虫卵负荷减少，由此导致其病原学检查(粪便检查)的敏感度已不符合当前需要，粪样的采集也日趋困难，免疫学检测方法日益成为血吸虫病的主要诊断手段，而其中的早期免疫诊断更具有重要的意义。目前，用于血吸虫病免疫诊断最常用的抗原是虫卵抗原、尾蚴抗原和成虫抗原。但这些虫源性抗原成分极其复杂；针对这种抗原的血清抗体在宿主体内长期存在，不能区分现症感染和既往感染；这些虫源性抗原不易大量获得，且其生产的质量监控等问题的存在制约了其在血吸虫病诊断中的应用。随着分子生物学及免疫学的迅速发展与应用，血吸虫病的诊断抗原由最初的粗抗原和各虫期抗原正在发展为由基因工程方法生产的重组抗原。近年来研究比较深入的几种免疫诊断方法主要如下：间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFAT)、胶体染料试纸条法(DDIA)。

目前血吸虫病诊断的抗原主要为天然的虫源性抗原。由于虫源性抗原的制备步骤烦琐，产量低且不易质控，难以适应大规模现场普查的需求。而依靠基因工程技术生产的重组抗原分子可为现场推广应用提供大量的抗原材料，但目前尚无应用于诊断的重组抗原，也无早期诊断的试剂和方法，因此，须继续寻找高敏感性和特异性的诊断抗原，以及早期诊断抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于诊断血吸虫病的抗原。

本发明的另一目的在于提供一种诊断血吸虫病的方法。

本发明的另一目的在于提供一种诊断血吸虫病的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种分离的血吸虫SjP7蛋白，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的血吸虫SjP7蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。

另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有前述的载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

另一方面，提供一种抗体，所述的抗体特异性结合所述的蛋白。

在本发明的第三方面，提供所述的蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的用途，用于制备检测血吸虫病的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的血吸虫为日本血吸虫(Schistosoma japonicum)或曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。

在本发明的第四方面，提供一种检测血吸虫病的试剂盒，所述的试剂盒中含有：

SjP7蛋白；或

特异性结合SjP7蛋白的抗体；或

特异性扩增SjP7基因的引物；或

特异性识别SjP7基因的探针。

在另一优选例中，所述的试剂盒中含有：

固相载体，以及包被于固相载体上的SjP7蛋白；或者

固相载体，以及包被于固相载体上的特异性结合SjP7蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：用于检测抗原-抗体反应的试剂(如酶联免疫试剂)，或用于基因扩增的试剂(如PCR试剂)。

在本发明的第五方面，提供一种制备检测血吸虫病的试剂盒的方法，所述方法包括：

(1)将所述的SjP7蛋白以0.5-2.0μg/ml的浓度包被固相载体(如酶标板)，去除未发生包被的溶液，获得包被了SjP7蛋白的固相载体；

(2)将(1)的包被了SjP7蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测血吸虫病的试剂盒。

在另一优选例中，步骤(1)还包括：用血清白蛋白(优选牛血清白蛋白)封闭所述包被了SjP7蛋白的固相载体。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的SjP7蛋白以0.8-1.2μg/ml(优选的约1.0μg/ml)的浓度包被固相载体。

附图说明

图1A.阳性克隆的初步免疫筛选；图1B.阳性克隆的第二次免疫筛选；图1C.阳性克隆的第三次免疫筛选。

图2.日本血吸虫cDNA文库阳性克隆的PCR扩增鉴定。其中，M：DNA标志物；1：阴性对照；2-8：7个阳性克隆的PCR产物。

图3.PCR扩增SjP7基因的目的片段。其中，M：DNA分子量标准，1：SjP7，2：SjP7阴性对照。

图4.SjP7重组质粒PCR鉴定。其中，M：DNA分子量标准，1：SjP7，2：SjP7阴性对照。

图5.SjP7表达产物的SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标准；1，3，5：1号，2号，3号重组克隆未诱导表达的产物；2，4，6：1号，2号，3号重组克隆诱导表达4h(1mM/L IPTG)的产物。

图6.SjP7重组蛋白可溶性鉴定的结果。其中，M：蛋白质标志物，1：重组克隆诱导前，2：重组克隆诱导4h(1mM/L IPTG)，3：菌体裂解后上清，4：菌体裂解后沉淀。

图7.SjP7可溶重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析。其中，M：蛋白分子量标准，1-8：洗脱收集液，M：蛋白标记，1-8：洗脱缓冲液。

图8.SjP7不可溶重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析。其中，M：蛋白分子量标准，1-8：洗脱收集液。

图9.三个虫期RT-PCR电泳结果。其中，M：DNA标志物，1：对照(未加模板)，2：尾蚴，3：童虫，4：成虫。

图10.三个虫期的蛋白免疫印迹分析。其中，M：预染蛋白质标志物；1，2：尾蚴蛋白；3，4：童虫蛋白；5，6：成虫蛋白；一抗：1、3、5：正常兔血清；2、4、6：重组蛋白免疫的多抗兔血清。

图11.光镜下的14日龄肝期童虫(20×)。

图12.14日龄肝期童虫阴性对照(20×)中，SjP7蛋白在体内的定位。

图13.A和B为SjP7蛋白在14日龄肝期童虫体内的定位(20×)。

图14.rSjP7的免疫印迹分析。其中，M：预染蛋白质标志物，1：一抗为正常兔血清，2：一抗为重组SjP7蛋白免疫多抗兔血清，3：一抗为正常鼠血清，4：一抗为日本血吸虫感染14d鼠血清，5：一抗为日本血吸虫感染42d鼠血清。

图15.rSjP7包被浓度的确定。其中，◆感染鼠血清；■正常鼠血清。

图16.日本血吸虫病人治疗前后血清中的特异性抗体的检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次从日本血吸虫中分离获得一条特别适合于作为血吸虫病检测标志物的蛋白，其位于日本血吸虫的表膜上。本发明人将之命名为“SjP7蛋白”，以该蛋白作为检测抗原来检测待测样本中是否含有抗SjP7蛋白的抗体，可以在血吸虫感染早期检测出样本中血吸虫童虫或成虫诱导的特异性抗体，从而实现血吸虫病的早期诊断早期治疗。

血吸虫SjP7蛋白及其编码基因

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的SjP7蛋白”是指SjP7蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化SjP7蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括血吸虫SjP7蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然血吸虫SjP7蛋白相同的生物学功能、抗原性(或免疫原性)的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“血吸虫SjP7蛋白”指具有SEQ ID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与血吸虫SjP7蛋白相同功能的、具有相同抗原性的、SEQ IDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括血吸虫SjP7蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO：2所示序列的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码SjP7蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的血吸虫SjP7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或SjP7蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的SjP7蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码血吸虫SjP7蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，血吸虫SjP7多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含血吸虫SjP7编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗体

另一方面，本发明还包括对血吸虫SjP7 DNA或是其片段编码的蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于血吸虫SjP7基因产物或片段。较佳地，指那些能与血吸虫SjP7基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制血吸虫SjP7蛋白的分子，也包括那些并不影响血吸虫SjP7蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的血吸虫SjP7基因产物结合的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的血吸虫SjP7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达血吸虫SjP7蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体还可以利用血吸虫SjP7基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。

多克隆抗体的生产可用血吸虫SjP7蛋白或蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

一种检测待测样品中是否存在SjP7蛋白的方法是利用SjP7蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SjP7蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SjP7蛋白。

如本文所用，“待测样本(样品)”包括但不限于：血液、血清、粪便或组织。对于血吸虫感染的检测，通常的“待测样本”是血液或血清。

SjP7蛋白用途

基于本发明人的新发现，所述的血吸虫SjP7蛋白或其编码基因有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：

(1)用于作为检测早期血吸虫感染的标志物，从而实现早期诊断早期治疗；

(2)用于制备抗SjP7蛋白的抗体，所述的抗体可用于检测样品中是否存在血吸虫循环抗原。

作为一种良好的检测标志物，所述的SjP7蛋白，抗SjP7蛋白的抗体，特异性扩增SjP7基因或转录本的引物，或特异性识别SjP7基因或转录本的探针均可被用于制备检测血吸虫(特别是日本血吸虫)病的试剂或试剂盒。

所述的特异性扩增SjP7基因或转录本的引物的设计可根据本领域人员已知的技术进行。可根据其基因序列设计不同种引物，通过PCR试验确定最合适的引物。所述的特异性识别SjP7基因或转录本的探针的设计也可根据本领域人员已知的技术进行。

在感染了血吸虫后，宿主体内会产生相应的防御性抗体。因此，在得知了SjP7蛋白作为血吸虫检测标志物的用途后，可采用本领域人员已知的方法来检测待测样品中是否含有抗SjP7蛋白的抗体。一种优选的方法是采用酶联免疫检测法(ELISA)，较佳的为间接ELISA法。更具体地，采用间接ELISA检测的方法如下：将SjP7蛋白包被在固相载体上，然后在包被了SjP7蛋白的固相载体上加样待测样品，之后再加样酶标的第二抗体(抗抗体)，从而通过加入酶底物并显色，得知待测样品中是否存在抗SjP7蛋白的抗体，进一步得知血吸虫的感染情况。该种方法是特别优选的。另一种优选的方法是滤纸条法或渗滤法，即固相戴体为纤维膜，并用金标记的第二抗体进行检测。

可选择的，在得知了SjP7蛋白作为血吸虫检测标志物的用途后，可采用特异性抗SjP7蛋白的抗体，来检测待测样品中是否含有SjP7蛋白抗原。一种优选的方法是采用酶联免疫检测法(ELISA)，较佳的为双抗夹心ELISA法。更具体地，采用双抗夹心ELISA检测的方法如下：将特异性抗SjP7蛋白的抗体包被在固相载体上，然后在包被了特异性抗SjP7蛋白的抗体的固相载体上加样待测样品，之后再加样酶标抗体，从而通过加入酶底物并显色，得知待测样品中是否存在SjP7蛋白，进一步得知血吸虫的感染情况。

检测试剂盒

基于本发明人的新发现，还提供了一种检测血吸虫病的试剂盒，所述的试剂盒中含有：SjP7蛋白；或特异性结合SjP7蛋白的抗体；或特异性扩增SjP7基因的引物；或特异性识别SjP7基因的探针。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中含有：

固相载体，以及包被于固相载体上的SjP7蛋白；或者

固相载体，以及包被于固相载体上的特异性结合SjP7蛋白的抗体。

此外，所述试剂盒中还可包括装在适当容器中的、用于检测抗原-抗体反应的试剂(如酶联免疫试剂)，或用于基因扩增的试剂(如PCR试剂)，和/或还包括使用说明(书)。

一种利用本发明的SjP7蛋白的制备检测血吸虫病的试剂盒方法包括：(1)将所述的SjP7蛋白以0.5-2.0μg/ml的浓度包被固相载体(如酶标板)，去除未发生包被的溶液，获得包被了SjP7蛋白的固相载体；(2)将(1)的包被了SjP7蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测血吸虫病的试剂盒。

较佳的，步骤(1)还包括：用血清白蛋白(优选牛血清白蛋白)封闭所述包被了SjP7蛋白的固相载体。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1从日本血吸虫童虫cDNA文库筛选得到P7蛋白基因

本实施例中，利用日本血吸虫感染14天的小鼠血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库，对得到的阳性克隆进行序列分析，并通过生物信息学软件对其编码蛋白的结构和功能进行预测分析，以期获得具有早期诊断价值的抗原基因。

1.材料

(1)cDNA文库：日本血吸虫童虫λZAP II cDNA文库，利用stratagene公司的ZAP-cDNA Synthesis Kit建库试剂盒构建，构建方法如下：1、采用TRIzol^TM试剂(Invitrogen)从日本血吸虫童虫新鲜组织中提取总RNA；2、采用OligotexmRNA Spin-column Protocol(QIAGEN)从总RNA中分离纯化出mRNA；3、采用ZAP-cDNA Synthesis Kit(stratagene)构建文库(以Oligo-dT(带有Xho I位点)作引物，用StrataScript反转录酶合成cDNA第一链，合成的同时掺入甲基化CTP，使cDNA甲基化；RNaseH和DNA聚合酶1处理，合成cDNA第二链；用T4DNA连接酶在cDNA两端加上EcoR I粘性接头；Xho I消化去除5′端的EcoR I接头，暴露出Xho I粘性接头，从而将外源片段定向插入到克隆载体中，构建成功)，滴度为3×105pfu/ml。

(2)菌株：XL1-blue MRF′菌株(Stratagene)、SOLR菌株(Stratagene)和EXAssist辅助噬菌体(Stratagene)。

(3)实验试剂与仪器

四环素(Tetracycline)、卡那霉素(Kanamycin Sulfate)和氨苄青霉素(Ampicillin Na)：购自华美生物工程公司。

羊抗鼠辣根过氧化物酶结合物(HRP-GAM)：购自Sigma。

Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep试剂盒：购自V-gene。

超滤装置：购自Ultrafree-15(MILLIPORE)。

(4)部分实验试剂的配方

NZY Agar：NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，酵母提取物5g，NZ Amine 10g，琼脂15g，去离子水1000ml，高压蒸汽灭菌。

NZY Top Agar：NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，酵母提取物0.5g，NZ amine1g，Agar 0.7g，去离子水100ml，高压蒸汽灭菌。

SM缓冲液：NaCl 0.58g，1M Tris·HCl(pH 7.5)5.0ml，MgSO4·7H2O 0.2g，2％明胶0.5ml，用去离子水定容至100ml。

LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1000ml，高压蒸汽灭菌。

LB固体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂20g，去离子水1000ml，高压蒸汽灭菌。

TBS：1M Tris·HCl(pH 7.5)20ml，NaCl 8.77g，去离子水定容至1000ml。

TBST：1M Tris·HCl(pH 7.5)20ml，NaCl 8.77g，Tween-200.5ml，用去离子水定容至1000ml。

抗体稀释液：1g BSA，用TBS定容至100ml。

封闭液：1g BSA，用TBS定容至100ml。

0.2％(w/v)麦芽糖：麦芽糖0.2g，用去离子水定容至100ml，用0.2μm的滤膜抽滤除菌，保存于4℃。

DAB显色液：DAB 2mg，PBS 3ml，3％H₂O₂ 9μl。

2.方法

(1)筛库血清的制备

a.制备E.coli XL1-blue MRF′的裂解液

挑取E.coli XL1-blue MRF′菌株的单克隆接种于100ml LB(含15μg/mlTet)培养基中，37℃，200rpm，培养3-4h。将培养液于4℃，5000g离心10min，除尽培养基。重悬菌体于3ml的Tris·HCl(50mM，pH 8.0)和EDTA(10mM，pH 8.0)，反复冻融3次，再超声处理10-20min(至菌液变清亮)。4℃，5000g离心15min，收获上清即为E.coli细菌裂解液。

b.筛库血清的来源

日本血吸虫尾蚴感染20只昆明株小鼠(每只老鼠感染800头尾蚴)14天后眼眶取血，采用ELISA法挑选效价较高的小鼠血清作为筛库血清，备用。

c.筛库血清的预处理

取挑选好的血吸虫感染14天的小鼠血清混合后取出100μl，加入1ml的E.coli裂解液，于室温吸附过夜后，5000g离心10min，去除底部的细菌沉淀，将上清用抗体稀释液稀释，使血清终浓度为1∶200，加入0.02％的叠氮化钠，血清于4℃保存。

(2)日本血吸虫童虫λZAP II cDNA文库的免疫筛选

a.初筛

(i)细菌培养

用无菌接种环挑取E.coli XL1-blue MRF′划线接种于LB培养平板(含15μg/ml Tet)，37℃倒置培养过夜。挑取E.coli XL1-blue MRF′的单菌落于3mlLB培养基(含10mM MgSO4，0.2％(w/v)麦芽糖，15μg/ml Tet)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日，取培养的菌液100μl转接到新的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养约2h。

将培养液2000rpm，离心10min，弃上清液后，用10mM MgSO₄重悬沉淀，测定OD值，并稀释至OD600＝0.5。NZY平板用前于37℃培养箱内温育1小时，以去除平板表面的水滴。

(ii)噬菌体感染

溶解NZY top agar，55℃水浴温育。将上述菌液200μl和日本血吸虫童虫λZAP II cDNA文库(噬菌体)5μl(其滴度为3×105pfu/ml)混合(约3000pfu/90mm plate)于5ml的培养管，37℃温育15min。向上述混合物中加入3mlNZY top agar，颠倒混匀，立即铺在NZY培养基的平板上，室温下凝固10min。于42℃培养箱育板，直至观察到小的可见的噬菌斑出现(大约3.5h)。

(iii)融合蛋白的诱导表达

用灭菌的ddH₂O稀释IPTG至10mM，使用前30min将硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡入诱导剂IPTG中，浸透后取出用Whatman 3MM的滤纸吸干多余的溶液，避免噬菌斑间产生交叉。用铅笔分别标记NC膜和平板，将对应的NC膜覆盖到平板上(用镊子轻轻夹住NC膜从平板的一侧将膜轻轻放下，避免产生气泡，膜应完全覆盖到平板上)，37℃培育3.5h。

把平板转移到4℃冰箱，冷却20min，然后用针头在NC膜、平板上的不对称的三点做好标记后，用镊子将NC膜从平板一侧轻轻剥离，平板存放在4℃冰箱。NC膜放入TBST(10ml/membrane)中洗三次，每次至少15min，除去残留的NZY top agar。把NC膜浸在封闭液中，室温，轻微振荡，封闭过夜。

(iv)目的融合蛋白表达的噬菌斑检测

将NC膜从封闭液中取出，用TBST(10ml/膜)洗膜2次，每次5min。加入筛库血清(5ml/膜)室温下轻微振荡3h，将血清回收。再用TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗(5-6ml/膜)即羊抗鼠辣根过氧化物酶结合物(HRP-GAM，BIO-RAD，1∶3000稀释)室温下反应1h，用TBST洗膜3次，每次10min，用TBS洗膜3次，每次5min，洗去残留的Tween 20。

将NC膜从TBS中取出，用Whatman 3MM的滤纸吸干多余的溶液，然后放入显色液中，在暗处进行显色反应直到阳性斑点清晰可见(一般不超过30min)。将NC膜从显色液中取出，加入另一个盛有去离子水的较大容器中，终止显色反应。取出NC膜，室温下风干，避光保存。

(v)阳性克隆的定位

根据NC膜上阳性斑点在原始LB培养板上的相应位置，挑取阳性噬菌斑，尽量挑取单个噬菌斑置于200μl SM缓冲液(含1滴氯仿)中，室温下放置30min，使噬菌体颗粒扩散出琼脂块后，4℃保存。

b.复筛

将保存有阳性克隆的SM缓冲液稀释到一定的噬菌体滴度后，以每个平板200-300个噬菌斑的密度铺板，重复上述筛选步骤。注意要控制噬菌斑的数量，尽量在复筛时获得单一的阳性噬菌斑克隆。否则要进行第三次筛选。

c.三筛

重复复筛的步骤，直至平板上出现100％的阳性克隆。

(3)阳性噬菌体删除环化为pBluescript重组质粒。

按照Stratagene公司的ZAP-cDNA Synthesis Kit的操作说明进行。

a.辅助噬菌体的扩增和滴度测定

转接E.coli XL1-blue MRF′于LB培养基(含10mM MgSO₄，0.2％麦芽糖，15μg/ml Tet)中，37℃，200rpm振荡培养约2-3h。将培养液2000rpm，离心10min，弃上清液后，用10mM MgSO₄重悬沉淀。取200μl重悬的菌液加入1μl辅助噬菌体，混匀，37℃温育15min，加入预先溶解的3ml NZY top agar，充分混匀后铺在NZY平板(预先在37℃培养箱温育)上，凝固后，于37℃培养箱倒置培养过夜。次日，取出NZY平板，无菌条件下加入3ml SM缓冲液及1滴氯仿，室温下静置30min后，将液体转入Ep管中，10000rpm离心1min，取上清分装入新的Ep管中，-80℃保存。

用SM缓冲液稀释辅助噬菌体，取1μl加入到200μl E.coli XL1-blue MRF′重悬液中。37℃吸附15min后，再加入3ml NZY top agar混匀铺板，倒置培养过夜，次日做噬菌斑计数。辅助噬菌体滴度计算：(噬菌斑数量(pfu)×稀释倍数/铺板体积(μl))×1000μl/ml。

b.噬菌体删除环化为噬菌粒

接种E.coli XL1-blue MRF′于LB培养基(含有10mM MgSO₄，0.2％麦芽糖，15μg/ml Tet)中培养过夜。次日，取培养液100μl转接到新的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养约2h。培养液于2000g，离心10min沉淀细菌，用10mMMgSO₄重悬至OD₆₀₀＝1.0。在细菌培养管中加入200μl E.coli XL1-blue MRF′重悬液、50μl含有阳性噬菌体的SM缓冲液和1μl辅助噬菌体。将细菌培养管放置于37℃水浴中15min。然后加入3ml LB，37℃振荡培养5小时。取出细菌培养管，在65℃下20min，然后3000g离心15min，将上清转入一个新Ep管中，置于4℃保存。

接种SOLR菌于LB培养基(含有10mM MgSO₄，50μg/ml Kan)中振荡培养，然后2000g，离心10min，用10mM MgSO4重悬至OD₆₀₀＝1.0，在1.5ml Ep管中加入200μl SOLR和上述的上清保存液5μl，37℃温育15min，然后取出25μl均匀涂布于LB(含100μg/ml Amp)琼脂糖平板上，37℃倒置培养过夜。

(4)pBluescript重组质粒的提取、检测和分析

a.质粒的提取和PCR鉴定

用质粒提取试剂盒(Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit，V-gene)抽提环化后的质粒DNA。在LB-Amp平板上挑取SOLR单菌落于5ml LB培养基(含有10mM MgSO₄，100μg/ml Amp)中，37℃培养过夜。次日，取1ml培养液于1.5ml Ep管中，保存于4℃留作菌种。将剩余的培养液转移到1.5ml Ep管中，10000rpm，离心5min，弃去上清液。如此反复多次收集菌体，最后弃尽上清。用250μl已加入RNaseA1的缓冲液S1悬浮细菌沉淀。加入250μl缓冲液S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。加入400μl缓冲液S3，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将离心后的上清液加入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。以同样的方法重复结合一次。弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl缓冲液W1，5500rpm离心1min。弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml MicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的缓冲液W2，5500rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl缓冲液W2洗涤一次。将DNA-prep Tube置回到原2-mlMicrofuge Tube中，14000rpm离心1-2min。将DNA-prep Tube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜正中央加20μl Eluent缓冲液，室温静置1min。14000rpm离心1min洗脱DNA。将洗脱液重新加入silica膜正中央，室温静置1min。14000rpm离心1min再次洗脱DNA。洗脱液置于-20℃保存。

以抽提好的质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR引物为通用引物T 3和T7，反应条件为：95℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，共进行30个循环；72℃延伸10min。PCR体系如下：

PCR缓冲液(10×)                1.0μl

Mg²⁺                           0.5μl

dNTP                           0.5μl

Primer T3                      0.5μl

Primer T7                      0.5μl

Taq酶                          0.2μl

Plasmid DNA                    5μl

ddH₂O                          1.8μl

                                            

总体积                         10μl

依据1％琼脂糖凝胶电泳结果初步判断插入片段的大致分子量。

b.序列分析

将获得的阳性克隆进行序列测定。将测序结果通过NCBI上的Blast程序进行同源性比对分析，通过ORF Finder软件对基因编码的蛋白质进行阅读框分析，以确定正确的阅读框架。

对发现的新基因，主要通过下面多个生物信息学分析软件对其所编码蛋白的功能及其生化特性进行分析预测：利用丹麦科技大学生物序列分析中心的SignalP3.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测蛋白是否含有信号肽；采用SubLoc v1.0软件(http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)来对蛋白进行亚细胞定位的预测；采用Scanprosite软件(http://us.expasy.org/tools/scanprosite/)来分析蛋白的功能位点；在http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/index.html上进行蛋白质结构域的分析；蛋白的跨膜区分析是通过TMpred软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行的；通过SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)来分析预测目的蛋白的二级结构。

3.结果

(1)筛库血清的制备

筛库血清的制备是关系到cDNA文库筛选是否成功的关键性因素之一。血吸虫感染的小鼠血清中可能含有大肠杆菌抗体，为了消除或者尽量减少其可能造成的筛选结果假阳性问题，必须先去除其中的大肠杆菌抗体。本发明人采用大肠杆菌裂解液吸附法来对其进行处理，阳性抗血清经大肠杆菌裂解液处理后，除去了大部分的非特异性成分，增加筛选到阳性克隆的机率。

(2)日本血吸虫童虫λZAP II cDNA文库的免疫筛选

在cDNA表达文库的筛选中，当培养平板上的噬菌体发育成斑之后，每个噬菌斑中都含有大量的由噬菌体产生的融合蛋白质，然后将它们原位复印到硝酸纤维素滤膜上。通过特异的一抗和二抗对膜进行处理以及最后的显色后，阳性克隆在NC膜上相应的位置呈现出深色斑点，与周围背景有明显的区别。初筛时，由于是大量筛选，铺板密度比较大，相邻噬菌斑之间的共同周边上颜色强度减弱，导致无法分离出单一的阳性克隆(图1A)。复筛时，将保存有阳性克隆的SM缓冲液稀释，以控制平板上的噬菌斑数量，使阳性斑点与阴性斑点分离。复筛时由于阳性噬菌斑显色充分，表现为色度均一的圆形或环形斑点(图1B)。选取复筛平板中显色最好并与周围噬菌斑分离的一个阳性噬菌斑，保存于SM缓冲液中。同法再进行第三次筛选，最终在NC膜上可得到100％的阳性克隆，无阴性斑点(图1C)。

本发明人利用预吸附的感染小鼠血清对日本血吸虫童虫λZAP II cDNA文库进行三轮筛选后共获得7个阳性克隆，它们的一些序列信息以及生物信息学分析预测结果将在后续详细描述。

(3)重组pBluescript质粒的提取和检测分析

a.阳性噬菌体删除环化为pBluescript重组质粒

因辅助噬菌体含有琥珀型突变，非限制型的大肠杆菌菌株(如SOLR菌)可抑制辅助噬菌体基因组的复制。当阳性噬菌体与辅助噬菌体和SOLR菌共同作用时，可使pBluescript质粒从Uni-ZAP XP载体上有效地切除并且可防止辅助噬菌体的共染，而只有从载体上切除的质粒可以在宿主菌中得到复制。用辅助噬菌体和SOLR菌将阳性克隆的pBluescript噬菌粒从Uni-ZAP XR载体中有效的删除并环化，以备进一步的质粒提取和分析。

b.质粒的提取和PCR鉴定

对最终筛选得到的7个阳性克隆转化的宿主菌进行质粒的提取以及PCR方法鉴定，再用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果这7个阳性克隆的插入cDNA片段大小从0.5到3kb不等(图2)。

c.序列分析

(i)同源性分析

对上述筛选到的7个阳性克隆(编号分别为SjP1、SjP2、SjP4-3、SjP7、SjP11、SjP13和SjP16)的插入序列进行核酸序列测定。7个克隆的插入片段长度分别为1398bp、1295bp、666bp、547bp、2425bp、722bp和817bp，A+T含量分别为59.37％、68.80％、61.11％、67.28％、62.85％、64.13％和64.26％，符合血吸虫碱基组成A+T含量高的规律。将测序结果通过NCBI上的Blast进行同源性分析。结果显示，四个克隆所测序列与其他已知基因序列无显著同源性，为新基因(表1)。

(ii)SjP7的生物信息学分析

在上述新基因中，SjP7基因大小为547bp(SEQ ID NO：1)，含有一个423bp的开放阅读框架，编码一条140aa的蛋白(SEQ ID NO：2)，起始密码子位于第54位。

表1.7个阳性克隆的一些特征

表2.7个蛋白的一些性质

蛋白质功能位点：a：蛋白激酶C磷酸化位点；b：酪蛋白激酶II磷酸化位点；c：N-肉豆蔻酸化位点；d：N-糖基化位点；e：cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点；f：酪氨酸激酶磷酸化位点；g：酰胺化位点

蛋白质二级结构：1：α螺旋；2：无规卷曲；3：延伸链；4：β转角*：按照含量多少排序。

(iii)SjP7蛋白的结构与功能预测

SjP7基因编码140个氨基酸，其理论分子量为16kD，等电点为4.75。经SignalP软件预测SjP7基因的编码蛋白不含有信号肽，SubLoc v1.0软件预测其编码蛋白定位于细胞核内。TMpred软件分析其编码一非跨膜蛋白(Score＜500)。Scanprosite软件分析该蛋白富含3种类型多个特定功能位点。包括7个酪蛋白激酶II磷酸化位点(分别在第2、16、25、32、43、105、133位)、2个蛋白激酶C磷酸化位点(分别在第68、82位)和1个N-糖基化位点(第123-126位)。

SjP7蛋白的二级结构分析：

经SOPMA软件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)来进行二级结构的分析预测，该蛋白α螺旋(Alphahelix(Hh))占77.14％，无规卷曲(Random coil(Cc))占19.29％，延伸链(Extendedstrand(Ee))占2.14％，β转角Beta turn(Tt))占1.43％。

SjP7蛋白的结构域分析：

在http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/index.html预测SjP7基因编码蛋白含有PTHR13511 Domain，是一种未知蛋白的结构域。

实施例2.SjP7基因的克隆表达

根据SjP7的DNA序列，用PREMIER 5.0软件分别设计特异性引物，进行PCR扩增，引物由英骏生物技术有限公司合成。引物序列如下：

PF SjP7：5CGCGGATCCATGTCAATATCTGAGTCGTTTG 3(SEQ ID NO：3)；

PR SjP7：5CCGCTCGAGTTATTCAAGAGAGTCTTCAC 3(SEQ ID NO：4)。

以阳性克隆的pBluescript重组质粒为模板，进行PCR反应，反应体系如下：ddH2O 15.5μl；10×缓冲液2.5μl；Mg²⁺ 1.5μl；PF 1.5μl；PR 1.5μl；dNTPs1.0μl；模板1.0μl；Taq酶0.5μl；总体积25.0μl。

反应条件：95℃5min；(94℃1min，57℃1min进行34循环)；72℃1min；72℃10min；4℃保存。

PCR扩增SjP7基因的目的片段的结果见图3。

SjP7-pET28a重组表达载体的鉴定：SjP7重组质粒用PCR方法鉴定结果如图4所示。

SjP7基因的表达：SjP7的重组质粒分别转化Ecoli.BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导，并收集菌体进行SDS-PAGE分析。SjP7基因经IPTG诱导表达后，出现了分子量约为23kDa的条带，即为SjP7基因的表达产物，如图5所示。

SjP7重组蛋白可溶性鉴定：经过诱导表达条件(温度和诱导剂浓度)优化分析后，确定SjP7蛋白的最优表达条件是：摇菌温度为18℃和诱导剂IPTG终浓度为0.5mM。表达的重组蛋白SjP7(rSjP7)经BugBuster蛋白抽提剂(Novagen)裂解，离心后分离上清和沉淀，将沉淀用PBS重悬。分别取上清液和沉淀的悬浮液进行SDS-PAGE分析。电泳结果表明SjP7基因的表达产物主要位于沉淀中，上清中也存在一定的可溶蛋白，如图6所示。

SjP7重组蛋白的纯化：利用QIAGEN的6×His标记的蛋白纯化系统分别按照可溶性和不可溶性蛋白纯化方法对rSjP7的上清和沉淀进行纯化。SDS-PAGE检测结果表明，本实验获得了纯度较高的重组蛋白，结果如图7，8所示。本研究的后续实验中除了制备SjP7免疫多抗兔血清用的是不可溶性的rSjP7外，其余的实验中用到的rSjP7均是可溶性的。

实施例3日本血吸虫SjP7基因在各个虫期的转录和表达情况研究

本实施例中，为了研究日本血吸虫SjP7基因在尾蚴、童虫和成虫三个虫期中的转录与翻译情况，分别抽提了尾蚴、童虫和成虫三个虫期的总RNA和尾蚴、童虫和成虫的总蛋白，然后分别使用SjP7基因的特异性引物进行RT-PCR检测，利用rSjP7免疫的多抗兔血清进行Western blot检测，以研究该基因转录和表达的虫期特异性。

1.RT-PCR方法扩增SjP7基因

利用SjP7特异性引物，以各虫期cDNA为模板，进行PCR反应，扩增目的条带。反应体系如下：10×缓冲液2μl；Mg2+ 1μl；dNTPs 0.5μl；PF 0.5μl；PR 0.5μl；dNTPs 0.5μl；模板5μl；Taq酶0.5μl；ddH2O 10μl；总体积20μl。

反应条件：95℃5min；(94℃1min，57℃1min，72℃1min，进行34个循环)；72℃10min；4℃保存。

2.日本血吸虫三个虫期RT-PCR检测SjP7基因转录本的结果

为了研究SjP7基因在尾蚴、童虫和成虫三个虫期中的转录与翻译情况，分别使用SjP7基因的特异性引物进行了RT-PCR检测，结果在尾蚴、童虫和成虫这三个虫期中均扩增出特异性片段，大小与SjP7基因相符，如图9。

3.SjP7基因在尾蚴、童虫和成虫三个虫期中的表达情况

SjP7免疫多抗兔血清的制备方法：

第一次免疫：SjP7蛋白抗原加完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；

第二次免疫：隔四周后，抗原加不完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；

第三次免疫：隔二周后，抗原加不完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；

第四次免疫：隔二周后，抗原加不完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；7天后取血样检测效价；

第五次免疫：隔二周后，抗原加不完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；7天后取血样检测效价；

最后次免疫：隔二周后，抗原加不完全佐剂(按体积1∶1)乳化后免疫；免疫剂量200μg/只兔；10天后杀兔取血。

为了研究SjP7基因在尾蚴、童虫和成虫三个虫期中的转录与翻译情况，本发明人抽提了这三个虫期的总蛋白，然后使用rSjP7免疫的多抗兔血清进行Western blot检测。结果只在童虫期的总蛋白中检测到了大小约为21kDa的产物，与SjP7基因表达产物的理论分子量相符，如图10。

从Western blot的实验结果可以看出，SjP7基因的表达具有明显的虫期特异性。结合上述的RT-PCR实验结果，在尾蚴，童虫和成虫这三个虫期均检测到了SjP7基因转录本的存在，但是在利用重组蛋白质制备的多克隆抗血清进行Western blot的实验中，仅在童虫期总蛋白中检测到SjP7蛋白的存在，而尾蚴和成虫期均没有检测到，这提示该基因虽然在尾蚴、童虫和成虫阶段均存在转录本，但只在童虫阶段才表达以发挥作用。

实施例4SjP7蛋白在日本血吸虫童虫体内的免疫定位

本实施例中，将通过间接法免疫荧光定位技术观察日本血吸虫P7蛋白在童虫体内的组织分布情况。

1.冰冻切片的荧光免疫定位

本发明人利用间接免疫荧光的手段研究了SjP7蛋白在童虫组织的分布定位。用rSjP7免疫的多抗兔血清作为一抗，以FITC标记的羊抗兔IgG二抗进行的间接免疫荧光染色实验结果显示，天然的SjP7蛋白主要分布在日本血吸虫童虫表膜，而其阴性对照只有微弱的非特异性荧光反应，如图11，12，13所示。

实施例5日本血吸虫P7重组蛋白免疫诊断价值的评价

本实施例中，将纯化后的SjP7重组蛋白(rSjP7)，通过电转移印迹到NC膜上，分别与多抗兔血清和正常兔血清进行反应，初步鉴定表达蛋白的免疫反应性。同时通过间接法ELISA实验评价其免疫诊断价值。

1.材料

(1)实验用重组蛋白、感染动物血清及试验动物

重组蛋白：纯化的rSjP7；

感染动物血清：感染14天的小鼠血清(制备方法：将小鼠固定后用剃毛工具将其腹部鼠毛剃干净：用生理盐水致其腹部湿润；将沾有尾蚴的盖玻片覆盖于小鼠的腹部，每只小鼠感染大约800头尾蚴；15分钟后取下盖玻片，感染结束，将小鼠置于鼠笼进行饲养；14天后杀死小鼠取其血清)和感染21天的兔血清(制备方法类似感染小鼠)；

疫区血吸虫病人血清：安徽安庆疫区病原学确诊病人。

2.方法

(1)SjP7重组蛋白的Western blot鉴定

将纯化好的rSjP7按照前述的方法进行Western blot鉴定，一抗分别用rSjP7免疫兔血清，感染鼠血清以及正常鼠、兔血清。

(2)间接ELISA法检测感染血清中的抗体

1)将rSjP7以1.0μg/ml的浓度(rSjP7溶于PBS中)包被酶标板，4℃过夜。

2)用PBST洗板3次，每次3min；每孔加入100μl的1％BSA，于37℃封闭2h。

3)用PBST洗板3次，每次3min；以100μl/孔加入1∶100稀释的感染血清和正常血清，37℃下反应2h。

4)用PBST洗板3次，每次3min；以100μl/孔加入1∶2000稀释的HRP标记的二抗，37℃下反应1h。

5)用PBST洗板3次，每次3min；每孔加入100μl底物显色缓冲液，37℃下显色后加入50μl的H₂SO₄(2M)终止反应。

6)用酶标仪读取OD_490nm。

3.结果

(1)rSjP7的Western blot检测结果

通过Western blot实验发现，rSjP7能与感染14d的鼠血清及免疫兔血清反应，但与正常鼠、兔血清和感染42d的鼠血清则无反应，如图14所示。这提示该蛋白具有免疫原性，于血吸虫感染早期就引发了宿主的免疫反应，并且可能只在感染早期发挥作用，具有作为候选诊断抗原的潜力。

(2)ELISA实验结果

a.rSjP7 ELISA包被浓度的确定

以不同浓度rSjP7包被检测板，测定感染鼠血清和正常鼠血清中的抗rSjP7的抗体存在情况，方法同前。

表3 rSjP7的ELISA包被浓度的确定

rSjP7包被浓度的确定见图15和表3。根据上述试验结果，本发明人最终确定较为适宜的rSjP7的包被浓度为1μg/ml。

b.间接ELISA方法检测早期感染兔血清的敏感性

以纯化的rSjP7为包被抗原(1μg/ml)，检测感染早期的兔血清(18份)，检测结果如表4所示，阳性检出率为83.3％。

表4 rSjP7 ELISA方法检测感染兔血清抗体的敏感性

c.间接ELISA方法检测疫区病人血清的敏感性与特异性

以纯化的rSjP7为包被抗原(1μg/ml)，分别检测日本血吸虫病人血清、华支睾吸虫病人血清、并殖吸虫病人血清和非流行区的正常人血清。以正常人血清的OD均值+2S.D.(正常人的标准差)为判断阴阳性的临界值，检测结果如表5所示，说明用纯化的rSjP7的抗原检测日本血吸虫病人血清抗体的检出率为75％；检测非流行区的正常人血清抗体的假阳性率为6.67％；而与华支睾吸虫病人和并殖吸虫病人血清之间出现轻微的交叉反应，其交叉反应率分别为6.67％和5％。从这些实验数据中可以看出该方法具有较高的敏感性与特异性，具有应用价值。

表5 rSjP7检测血清抗体的敏感性和特异性

d.血吸虫病人治疗前、后血清中的特异性抗体的检测

以纯化好的rSjP7作为包被抗原，对30个血吸虫病人的治疗前和治疗后血清以及正常人血清进行抗SjP7抗体的检测。图16显示了治疗前和治疗后病人血清中抗SjP7抗体的检测结果(这两种血清的OD值均扣除正常病人血清的OD值)。治疗前病人血清中抗SjP7抗体的水平很高，治疗后5个月的病人血清中抗SjP7抗体有较显著程度的下降。本实验以正常人血清的OD均值+2S.D.(正常人的标准差)为判断阴阳性的临界值，OD均值(正常人血清)＝0.212，S.D.＝0.074，临界值(CUTOFF)＝0.360。实验结果显示治疗前的病人血清阳性检出率为75％，而对应的治疗后的病人血清转阴率为17.39％。

实施例6试剂盒

将rSjP7以1.0μg/ml的浓度(rSjP7溶于PBS中)包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗板3次，每次3min；每孔加入100μl的1％BSA，于37℃封闭2h。用PBST洗板3次，每次3min。

将上述处理的酶标板晾干，装于合适的包装中，获得所述的试剂盒。

结论

应用RT-PCR技术检测到在尾蚴、童虫和成虫三个虫期中均存在SjP7基因的转录本，而通过Western blot实验则仅在童虫期检测到SjP7蛋白的存在，提示该蛋白可能具有明显的虫期表达特异性。

成功地在大肠杆菌系统中表达SjP7蛋白。纯化SjP7重组蛋白，Western blot实验分析表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。

通过免疫荧光定位实验表明天然的SjP7蛋白主要分布在日本血吸虫童虫的体表。

应用rSjP7作为包被抗原的ELISA方法检测感染早期的兔血清的敏感性为83.3％；检测日本血吸虫病人血清的敏感性为75％；检测非流行区正常人的假阳性率为6.67％；与华支睾吸虫病人和并殖吸虫病人的交叉反应率分别为6.67％和5％。这些结果表明SjP7重组蛋白具有较高的敏感性和特异性，具有良好的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，国家人类基因组南方研究中心，华东理工大学

<120>一种诊断日本血吸虫病的方法及试剂盒

<130>082358

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>559

<212>DNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<220>

<221>exon

<222>(54)..(476)

<400>1

gcgcaactta gctgcatccg caatttgcgt agaatatgtg ttccctctaa ata atg     56

                                                           Met

                                                           1

tca ata tct gag tcg ttt gat gtt ttt ttt gaa gat atg atc agt cct    104

Ser Ile Ser Glu Ser Phe Asp Val Phe Phe Glu Asp Met Ile Ser Pro

            5                   10                  15

tca gat gca gta aaa ata att acg ttt cag gaa gct atg ctt acc aag    152

Ser Asp Ala Val Lys Ile Ile Thr Phe Gln Glu Ala Met Leu Thr Lys

        20                  25                  30

ctt gaa aaa aca aat gag atg ctt cga acc gtt tct gaa ctc tct aat    200

Leu Glu Lys Thr Asn Glu Met Leu Arg Thr Val Ser Glu Leu Ser Asn

    35                  40                  45

gga aga tac cag ata tta ttt acc gaa ctg act gcg cat ata aaa aca    248

Gly Arg Tyr Gln Ile Leu Phe Thr Glu Leu Thr Ala His Ile Lys Thr

50                  55                  60                  65

ata gtg tcg ttg aaa aaa gaa atg gat gat att ttc aaa cgt att cgg    296

Ile Val Ser Leu Lys Lys Glu Met Asp Asp Ile Phe Lys Arg Ile Arg

                70                  75                  80

tcc ata aag aaa tta ttg tgt tca aac ttc cca gag gat atg gaa aga    344

Ser Ile Lys Lys Leu Leu Cys Ser Asn Phe Pro Glu Asp Met Glu Arg

            85                  90                  95

ctt agt caa cag tta tgt tgc aca gaa tgt gaa gat aaa gat cat gac    392

Leu Ser Gln Gln Leu Cys Cys Thr Glu Cys Glu Asp Lys Asp His Asp

        100                 105                 110

ttt act cca agt ggt tta caa acg tta aac tct act gca gtt cct aaa    440

Phe Thr Pro Ser Gly Leu Gln Thr Leu Asn Ser Thr Ala Val Pro Lys

    115                 120                 125

aca atg gaa act gtt tgt gaa gac tct ctt gaa taa gatcaatatt         486

Thr Met Glu Thr Val Cys Glu Asp Ser Leu Glu

130                 135                 140

gtgttaataa ccgttacact atgaatataa tattattatg ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa  546

 a                                                          547

<210>2

<211>140

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>2

Met Ser Ile Ser Glu Ser Phe Asp Val Phe Phe Glu Asp Met Ile Ser

1               5                   10                  15

Pro Ser Asp Ala Val Lys Ile Ile Thr Phe Gln Glu Ala Met Leu Thr

            20                  25                  30

Lys Leu Glu Lys Thr Asn Glu Met Leu Arg Thr Val Ser Glu Leu Ser

        35                  40                  45

Asn Gly Arg Tyr Gln Ile Leu Phe Thr Glu Leu Thr Ala His Ile Lys

    50                  55                  60

Thr Ile Val Ser Leu Lys Lys Glu Met Asp Asp Ile Phe Lys Arg Ile

65                  70                  75                  80

Arg Ser Ile Lys Lys Leu Leu Cys Ser Asn Phe Pro Glu Asp Met Glu

                85                  90                  95

Arg Leu Ser Gln Gln Leu Cys Cys Thr Glu Cys Glu Asp Lys Asp His

            100                 105                 110

Asp Phe Thr Pro Ser Gly Leu Gln Thr Leu Asn Ser Thr Ala Val Pro

        115                 120                 125

Lys Thr Met Glu Thr Val Cys Glu Asp Ser Leu Glu

    130                 135                 140

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

cgcggatcca tgtcaatatc tgagtcgttt g                           31

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ccgctcgagt tattcaagag agtcttcac                              29

Claims (10)

1.一种分离的血吸虫SjP7蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的血吸虫SjP7蛋白。

3.权利要求1所述的蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备检测血吸虫病的试剂或试剂盒。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的血吸虫为日本血吸虫或曼氏血吸虫。

5.一种检测血吸虫病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：

SjP7蛋白；或

特异性结合SjP7蛋白的抗体；或

特异性扩增SjP7基因的引物；或

特异性识别SjP7基因的探针。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：

固相载体，以及包被于固相载体上的SjP7蛋白；或者

固相载体，以及包被于固相载体上的特异性结合SjP7蛋白的抗体。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：检测抗原-抗体反应用试剂，或基因扩增用试剂。

8.一种制备检测血吸虫病的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将权利要求1所述的SjP7蛋白以0.5-2.0μg/ml的浓度包被固相载体，去除未发生包被的溶液，获得包被了SjP7蛋白的固相载体；和

(2)将(1)的包被了SjP7蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测血吸虫病的试剂盒。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)还包括：用血清白蛋白封闭所述包被了SjP7蛋白的固相载体。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的SjP7蛋白以0.8-1.2μg/ml的浓度包被固相载体。

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