JPH06500548A - エントアメーバヒストリティカ免疫優性表面抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エントアメーバヒストリティカ免疫優性表面抗原発明の背景 発明の技術分野 本発明は一般には、エンドアメーバ属の原生動物からの免疫優性表面抗原ポリペ プチドの使用方法及びその組成物に関するものであり、より詳しくは、エンドア メーバ属の原生動物による感染症を診断し、治療し、また阻止するのに役立つ試 薬の調製に関するものである。

背景技術の説明 エントアメーバヒストリティカ（ｅｎｔａｔｘｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｊｃ ａ　）は、一般的な病原性原生動物である。アメーバ症、即ちエントアメーバヒ ストリティカによる感染症により、自覚症状の無いキャリアに共生している状態 から、侵襲的感染による急性の下痢または腸外膜瘍の形成に至るまでの広範な疾 患形態が生ずる。例えば、Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ　（第１５版）の第１３章 を参照のこと。エントアメーバヒストリティ力は、運動性のトロフォゾイト（栄 養体）または休眠包子といった２つの形態で存在する。病原性アメーバによる感 染症は、腸の上皮の潰瘍化を引き起こし得るものであり、また腸壁を貫通して一 次的には肝臓に腸外膜瘍を形成し得る。米国における感染率は約１％であるが、 キャリア率は地球上の特定の領域では５０％を越えている可能性がある。

効果的な治療養生法が利用可能である場合、疾患及びその伝染を防止するには早 期診断が極めて重要である。しかしながら、自覚症状の無い感染症に対して治療 を開始することの是非に関しては、多くの論争が行われている。従って最近の研 究では、発病性の分子遺伝学的分析、及び高い予測値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　 ｖａｌｕｅ）を有すると共に臨床的に実行可能な態様で適用できる標識分子の定 義に焦点が絞られている。

発病性表現型に関連すると思われる幾つかの分子活性については部分的に特徴付 けされているが、発病におけるそれらの各々の役割は判っていない。最近になる まで、侵入性というものが、特定の株の安定な或いは可変の遺伝子型特性である かどうかは明らかでなかった。病原性株と非病原性株を同定するためには、解糖 酵素であるホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）　、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）及びホ スホグルコイソメラーゼ（ＰＣＩ）の電気泳動移動度における多様性が用いられ ている。

より最近では、ＤＮＡ配列の何れか、又は特異的抗原の検出に基づき病原性株を 識別するために、他の幾つかの試薬が提案されている。

Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　（１９８９）　２７：６７１−６７６ ；　Ｔａｎｎ１ｃｈ等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８９）　８６：５１１８−５１２２；及び ５ｔｒａｃｈｎａｎ等のＬａｎｃｅｔ　ｉ：５６１−５６２を参照のこと。しか しこれらの試験では一般に、分析に先立って新鮮な便サンプルから直接に、アメ ーバの無菌培養及びクローニングを行う必要がある。これらの培養過程は困難な ものであり、殆どの場合、達成されてはいない。これらのプローブのうち、すで に受け入れられているジモデーム（ｚｙｍｏｄｅｍｅ　）識別特性の如き現存す る基準と比較して、臨床的に定義された株分難物質の大規模スクリーニングによ り実証されたものは一つもない。更に、患者の分離物質からのアメーバの無菌化 及びクローニングは、より虚弱でない病原性株の成長を助けることが多く、病原 性を強めることが知られている。

従って、新鮮な分離物質中における病原性アメーバを識別可能な、直接的で正確 且つ迅速な試験を開発することが重要である。株の混合物により引き起こされる 病原性感染、或いは病原性株から非病原性株へと表現型的に相互転換（１ｎｔｅ ｒｃｏｎｖｅｒｔ）されたかもしれない感染症の、臨床的特徴付けを可能にする 診断用試薬が必要である。更に、アメーバによる感染症の治療及び防止のための 新規な試薬は、常に価値のあるものである。本発明は、これらの及びその他の重 要な試薬及びその効果的な使用方法を提供するものである。

発明の概要 エントアメーバヒストリティ力からの免疫優性表面抗原の様々な対立形質が識別 され、特徴付けられた。抗原をコードした遺伝子が分離され配列決定され、かく してその構造に関する詳細情報が与えられる。

ポリペプチド並びに核酸及びそのフラグメントの両者が提供される。

免疫優性表面抗原上のエピトープに対する、ポリクローナル及びモノクローナル の双方の非常に特異性の抗体標本が作製された。アメーバ症についての治療及び ワクチン接種方法も提供される。

図面の簡単な説明 図１＝５〜１５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画されたエンドアメーバ抽出物全 体のウェスターンプロットを示す。レーン２．７及び１２は多種寄生性（ｐｏｌ ｙｘｅｎｉｃ）病原性エントアメーバヒストリティ力分離物質５Ｄ−４、レーン ３，８及び１３は多種寄生性の非病原性エントアメーバヒストリティ力分離物質 ５Ｄ１１６、レーン４，９及び１４はエントアメーバヒストリティ力類似のラレ ド（Ｌａｒｅｄｏ）　、レーン５，１０及び１５はエントアメーバヒストリティ カｆＴＫ−９、レーン６．１１及び１６は抗膜分画血清でプローブされ（レーン ２〜６）混注ヒト免疫血清でプローブされ（レーン７〜１１）またモノクローナ ル抗体ＦＡ？でプローブされた（レーン１２〜１６）エントアメーバヒストリテ ィカＨＭＩ　：　ＩＭＳＳである。分子量は、キロダルトンで与えられている（ 分子量標準レーン１　：２００．９７．６８．４３．２８ｋＤａ）。

図２ニー次抗体によりｊｔｚ　ｌ／ｌ′Ｆθで標識されたエントアメーバヒスト リティカＨＭＩ　：　ＩＭＳＳ　トロフォゾイトの写真（拡大率８００倍）であ る。Ａ：希釈度が１：５００の混注ヒト抗エントアメーバヒストリティ力免疫血 清、Ｂ：λｃＭ１７フアージ溶解質に結合させることにより精製した混注ヒト抗 エントアメーバヒストリティカ免疫血清、Ｃ：希釈度がｌ：１ｏｏｏのモノクロ ーナルＦＡ？収穫溶液、Ｄ：希釈度が１：１Ｏ００のモノクローナル抗エントア メーバヒストリティ力アクチン抗体。二次抗体は、フルオレセイン−イソチオシ アネートヤギ抗ヒト及びフルオレセイン−イソチオシアネートヤギ抗マウスであ ざ。

図３：ｃＤＮＡクローンλｃＭ１７でプローブされたエントアメーバヒストリテ ィカ［（Ｍｌ　：　ＩＭＳＳのＲＮＡ転写プロットは、〜３ｋｂに移動した単一 のハイブリッド形成バンドを示す。ハイブリッド形成条件は、５０％ホルムアミ ド、０．２ｘＳＳＣ，４２℃である。図示のオートラジオグラフィーは、７２時 間の露光を必要とした。

図４：オリゴヌクレオチドプライマーＳＲ０１ｇ÷５Ｒ０２１及びＳＩ’１Ｏ１ ９＋５ＲＯ２２を用いたエントアメーバヒストリティ力分離物質／株からのゲノ ムＤＮＡの増幅により生成された、ＰＣＲ産物の制限酵素＜！ｃｏＲＶは小文字 、ｆｓｐ　Ｉは大文字）消化を示す。ａ／Ａ４４３．　ｂ／Ｂ４４４．　ｃ／Ｃ ：５ＤＩＩ６．　ｄ／Ｄ＝ＲＥＦ　２９１．　ｅ／Ｅ＝エントアメーバヒストリ ティ力類似のラレド、　ｆ／Ｆ＝＃４６゜ｇ／Ｇ＝ＨＫ９．　ｈ／Ｈ＝ＨＭ１： ＩＭＳＳである。

好適実施例の説明 本発明は、エンドアメーバ寄生性感染を診断し、治療し、及びワクチン接種する ための新規な組成物及び方法を提供するものである。本発明は部分的には、Ｍ１ ７タンパク質と指称される免疫原性の高い、即ち免疫優性な１２５ｋＤａのタン パク質の類を発見したことに基づくものであり、それらのタンパク質は、エント アメーバヒストリティ力のトロフォゾイト形態の膜上に局在されている。この１ ２５ｋＤａの抗原の特定の対立形質形態が分離され、アメーバの病原型に特徴的 なものであることが見い出された。抗原のそのような識別及び配列決定により、 ワクチン、ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントを含む新規な組成物の調 製を行う基礎が提供される。本発明による他の組成物には、種々の表面抗原及び 相同ポリペプチドをコードした核酸、これらのコードされたペプチドと相同の核 酸、更にはこれらのタンパク質、フラグメント及び相同ポリペプチドに対して生 育された抗体が含まれる。これらの組成物の使用方法は、生物学的機能に関連し た知見を考慮して提供される。

エンドアメーバ属は、幾つもの細胞的及び生物学的標識により定義されている。

これらの標識はアメーバ属を規定し、これは共通の特性を呈するものではあるが 、より良好な検出方法及び機能試験が開発された場合には変更されうるちのであ る。しかしながら、ここで使用するエンドアメーバという用語は、現在そこに分 類されている生物、或いはこの属に割り当てられている生物に特徴的な重要なエ ピトープ又は生物学的性質を共有するについて十分に類似している生物を包含す ることを意図したものである。

これらのエンドアメーバ株は、しばしば身体に侵入してアメーバ症を発生させる 。侵襲的感染には、腸内感染又は腸壁を貫通しての体内感染が含まれる。ここで 提供される試薬は、その両方のタイプの感染に対して有用なものである。

免疫優性の１２５ｋＤａの表面抗原は、エンドアメーバの種々の株から分離され た。表Ｉは、ＨＭＩ：ＩＭＳＳと指称される病原性味及びＲＥＦ２９１株と指称 される非病原性株からの、１２５ｋＤａの免疫優性表面抗原の二つの対立形質の ゲノム配列及び対応する２つの対立形質のアミノ酸配列を示すものである。以下 で詳述するように、他の対立形質が天然に存在し得ること、及びそのような他の 対立形質又はそのような対立形質の核酸若しくはアミノ酸配列から本組成物を誘 導し得ることが理解されよう。

表ＩニゲツムクローンｐＢＳｇＭ　１７−１から得られたコード領域及び片側（ ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域について推定されるアミノ酸配列及び核酸配列を示す。

内部のｌｃｏ　Ｒ１フラグメントの配列は、ゲノムクローン（ｐＢＳｇＭ１７− １／２）及びｃＤＮＡクローンλｃＭ１７両者について同一であった。以下に整 列して示すのは、非病原性分離物質ＲＥＦ２９１から導出されたＰＣＲ増輻産物 の部分的なヌクレオチド配列である。ヌクレオチドの置換には下線が引かれてお り、ＲＥＦ２９１から導出された部分的配列の下側にアミノ酸置換が示されてい る。Ｇｌｙ１８６とｌ１ｅ１８７　（Ａ５５ｇとＡ３５９に対応）との間、及び Ｐｈｅ８２５とＧ１ｎ８２６　（Ｃ２４７５とＣ２４７６に対応）との間に、２ つの境界が記されている。これらの境界は、領域Ｉ（アミノ、即ち前者の境界の ５゛末端）を領域ＩＩ　（画境界の間）から、そして領域ＩＩを領域ＩＩＩ　（ カルボキシ、即ち後者の境界の３°末端）から分離するものである。

この１２５ｋＤａの抗原のコード領域のヌクレオチド配列から推定されるアミノ 酸配列は、その高いＡｓｎ　（９０＝８．２％）　、Ｔｙｒ　（７０＝６．３％ ）、及びヒドロキシルアミノ酸残基（Ｓｅｔ、　８５−７．６％；　Ｔｈｒ、　 ９０＝８．１％）含量に関して特異なものである。全部で１７のＮ−結合グリコ シル化反応部位は１２５ｋＤａの抗原がグリコジル化されうろことを示唆すると 同時に、ウェスターンプロット分析により、この抗原が５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で密 なバンドとして移動することが示される。３５のアミノ酸からなる明らかに疎水 性のアミノ末端領域は、足場またはシグナル配列として利用されうる。既知の原 核生物及び真核生物のシグナル配列と比較すると、この領域は、正に帯電した単 一の残基を備えた例外的に長い（２０アミノ酸）Ｎ末端（ｎ）領域と、８アミノ 酸長の疎水性コア（ｈ）領域と、他のシグナル配列において見られるアミノ酸組 成と類似したアミノ酸組成を有する７アミノ酸長の極性Ｃ末端（ｃ）領域を含ん でいる。補外法（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によれば、これは抗原が周縁膜 タンパク質であるか、またはグリコホスホリピドアンカー等の他の手段により膜 中に固定されうろことを示唆している。或いはまた、疎水性アミン末端自体は、 付加的なトランス膜ドメインが識別される可能性がないことから、Ｃ末端を外側 に露出して抗原を膜中に固定するように利用されうる。

表１　パネル１ 表■、パネル２ 表１．パネル３ 表！、パネル４ ３３６５　ｃａｔｕｔａａａｔａａｔｇｔａｇｔｇｔｔａｔｔｕａａｕｔｔａｕ ｇａｇａａａａｔｔｕｇａｇｔｃｔａｔｔｔｃａｔｔａｃａ狽≠狽狽■≠≠狽モ ≠狽■≠浮■ Ｍ１７タンパク質は、膜に関連していることが判明している。これらのタンパク 質が多価の抗体分子で架橋されると、生きたトロフオゾイト（栄養体）は膜のキ ャッピングに特有の仕方でもってこの複合体をキャッピングする。図２を参照の こと。このような結果は、混注した患者の血清、ＦＡＴモノクローナル抗体、或 いは免疫選択した抗体標本でもって達成することができる。細胞はまた抗体の結 合に際して丸まるようであり、生物学的に破壊され易く、そして恐らく分割する ことさえできない。従ってこの免疫優性抗原は表面抗原であることが判明したも のであり、抗体の結合はトロフオゾイトの感染サイクルのかなりの破壊を生じ得 る。

本発明は一実施例において、この１２５ｋＤａの表面抗原に関連しており通常は ハプテン性又は抗原性であるポリペプチドであって、典型的には少なくとも６個 のアミノ酸、通常は少なくとも約９個のアミノ酸、そしてより普通には約１２個 又はより多くのアミノ酸が天然型の１２５ｋＤａの免疫優性表面抗原タンパク質 中に連続的に見い出されるものを提供する。より長いポリペプチド、即ち天然の タンノ々り質の実質的に全長まで、全長、及びより大きなものもまた用途を有す る。この連続的なアミノ酸はポリペプチドのどの領域内に位置していてもよいが 、し力）し好ましくは表Ｉの領域Ｉ又はＩＩＩにあり、特定の免疫優性表面抗原 タンパク質に特徴的な少なくとも一つのエピトープ部位に対応する。特徴的とい うことが意味するものは、そのエピトープ部位が、細胞サンプル中における露出 されたポリペプチドセグメントの免疫学的検出を相応の確実性をもって行うこと を可能にし、殆どの場合におし１て病原性形態の免疫優性表面抗原を他の関連す るタンパク質、例えば非病原性の株からの免疫優性表面抗原から免疫学的に識別 することを可能にするということである。このポリペプチドはまた、ワクチン中 、治療用組成物中、及びポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製に用いら れた場合に、宿主における免疫応答を誘起することができるものである。

本発明の組成物及び方法は、病原性のアメーバ性感染の識別及び治療のために特 に有用なものであるが、しかしまた病原性及び非病原性のアメーバ中に保持され ている表面抗原のエピトープを識別することも可能である。このような保持され ているエピトープの配列に基づくポリペプチド及び核酸プローブの使用は、病原 性及び非病原性アメーバの両方を検出し、治療することを可能にする。これとは 対照的に、病原性形態のみにおいて見い出されるエピトープに基づく組成物は、 病原性アメーバに特異な検出及び治療を可能ならしめる。逆に、非病原性形態に おいてのみ見い出されるエピトープは、非病原性アメーバに特異な検出及び治療 を可能とする。非病原性の株から病原性の株を識別するために特に重要な領域は 、表ＩＩＩに示すような、アミノ酸又はヌクレオチドの特徴の間の相違部位に配 置された領域である。

好ましい側面においては、ポリペプチド組成物は表Ｉに示した配列と同一か、或 いは等価なものである。等価ということの意味するところは、ポリペプチドの定 義という目的に関して、アミノ酸配列の実質的な同一性が少なくとも約ｌＯの残 基長にわたって存在し、そこにおいて対応する配列の各々の位置が残基と同一で あるか、或いは少なくとも残基の６０％、好ましくは残基の少なくとも約７０％ 、より好ましくは残基の約８０％の保存的置換度を有するということである。し がしながら、比較のための既知の方法に従って、比較される配列セグメントは場 合に応じた除去、付加、または置換により変性されていてもよい。

例えばウィスコンシン州マジソンのＵｎｉｖ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒによるＳｅ　ｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　 Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａ　ｅを参照のこと。

保存的置換は、ｇｌｙ、　ａｌａ；　ｖａｌ、　ｉｌｅ、　ｌｅｕ；　ａｓｐ、 　ｇｌｕ；ａｓｎ、　ｇｌｎ；　ｓｅｒ。

ｔｈｒ；　ｌｙｓ、　ａｒｇ；及びｐｈｅ、　ｔｙｒという群の中での置換であ る。

天然の免疫優性表面抗原タンパク質と免疫学的に交叉反応性の合成ポリペプチド （即ち免疫学的同族体）は、少なくとも二つの一般的な手法の何れによっても製 造することができる。第一に、約５０個よりも少ないアミノ酸、より通常は約２ ０個よりも少ないアミノ酸を有するポリペプチドは、生長鎖に対してアミノ酸を 連続的に添加するメリフィールド固相合成法により合成することができる。Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３）Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５： ２１４９−２１５６を参照のこと。このような合成ポリペプチドのアミノ酸配列 は通常、表■の好ましくは領域■又はＩＩＩに記載した配列に基づいている。

本発明のポリペプチドを合成するための第二の、そして好ましい方法は、免疫優 性表面抗原遺伝子の所望の部分をコードした、培養細胞中における組み換えＤＮ Ａ分子の表現を包含する。この遺伝子それ自体は、以下に記載するように天然で も合成のものでもよい。天然の遺伝子はここで記載するように、ｃＤＮＡ又はゲ ノムライブラリがら入手可能である。このようなセグメント又は遺伝子を用いる と、上述したペプチドに等価なペプチドをコードした他の関連する株又は配列か ら、さらなる相同性遺伝子配列を分離することができる。このような遺伝子は特 に、幾つかの可能性の中でも、関連するポリペプチドの他の対立遺伝子又は仮想 （ｐｈａｎｔｏｍ）遺伝子を発現するものである。そのような遺伝子からの配列 を用いることにより、記述した生物学的機能と等価な類似の生物学的機能を有す ると共に、リストしたセグメントを置換するセグメントを見い出すことができる 。特に、エピトープの類似性は、等価なペプチドを選択するための手段として働 く。

本発明の検出方法において有用となるためには、ポリペプチドは通常は実質的に 純粋な、即ち典型的には約５０％Ｖ／Ｖ又はそれを越える純度で、干渉するタン パク質及び汚染物質が実質的にない形態において入手される。好ましくは、免疫 優性表面抗原ポリペプチドは、少なくとも約８０％ｖ／ｖの純度で、そしてより 好ましくは少なくとも約９５％ｗ／ｗの純度において分離又は合成される。在来 のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも９９％ｖ／ｗの相同性ポリペプチド を得ることができる。例えばタンパク質は、免疫吸着アフィニティークロマトグ ラフィーを用いて、以下に記載する抗体を用いて精製することができる。かかる アフィニティークロマトグラフィーは、最初に抗体又は適当な親和性試薬を固体 担体に結合させ、次いでこの結合した抗体又は親和性試薬を免疫優性表面抗原タ ンパク質源、例えば免疫優性表面抗原を自然に産生ずるか、或いは組み換え免疫 優性表面抗原ＤＮＡ分子の導入の結果として免疫優性表面抗原を産生ずる原生動 物の溶解質と接触させることにより行われる。

有用な産生培地に含まれるものとしてはＬｕｃｋｏｖ及びＳｕｍｍｅｒｓ　（１ ９８８）Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏ　ｖ　６：　４７−５５参照の昆虫バクロウ ィルス（Ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系、或いはＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８ ７）　Ｇｅｎｅ　５６：　１２５−１３５及び５ｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔ ｔ（１９８６）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９二１１３−１３０参照のφ ｌＯプロモーターを備えたＴ７ポリメラーゼ遺伝子がある。これらの文献の各々 は、ここで参照したことによりその内容を本明細書に取り込むものとする。以下 に記載する組み換え核酸を表現している他の種々の高性能系が、ここにおいても たらされる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃ１ｏｎｉｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

本発明によれば、免疫優性表面抗原の明確な形態のポリペプチド配列の核酸配列 コード部分が分離され、特徴付けられた。免疫優性表面抗原をコードしている分 離されたＤＮＡセグメントは、自然発生の免疫表面抗原の生物学的（例えば免疫 学的）特性を示す、分離可能な量のポリペプチドをもたらすように発現させるこ とができる。他の有用な核酸は、天然又は合成の何れかのコード配列と実質的に 相同なものである。これらの相同ポリヌクレオチドは、表面抗原ペプチドをコー ドしている天然又は合成の核酸を位置決めし、又は特徴付けるためのプローブ又 はプライマーとして用途を有する。

核酸配列の実質的な相同性又は実質的な同一性は、ａ）そこには少なくとも約１ ０の連続するヌクレオチドからなる暴露されたセグメントとの間に約６５％より も大きな、典型的には約７５％よりも大きな、より典型的には約８５％よりも大 きな、好ましくは約９５％よりも大きな、そしてより好ましくは約９８％よりも 大きな相同性があること、或いはｂ）この相同核酸配列がこれに調和する配列又 はその相補性鎖に対して、厳しい温度及び塩濃度条件下においてハイブリッド形 成することの何れかを示すものである。この厳しい条件は、一般には、約２２° Ｃよりも高い、通常は約３０°Ｃよりも高い、そしてより普通には約４５°Ｃよ りも高い温度である。塩の濃度は、一般には約ＩＭよりも低く、通常は約５００ ｍＭよりも低く、好ましくは約２００ｍＭよりも低い。これらを組み合わせてな る条件は、塩濃度又は温度単独の何れよりも重要なものである。制限を規定する ために用いられる他のパラメータには、ハイブリッド形成混合物中に用いられる 緩衝溶液の組成の他に、配列中のＧＣ含有量、配列の相補性の程度及びハイブリ ッド形成に関与するセグメントの長さなどが含まれる。

核酸は表■で報告したＤＮＡ配列に直接に基づいて合成することができる。ポリ ヌクレオチドは既知の技術により合成することができる。

例えば短い一本鎖ＤＮＡ７ラグメントは、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｒｕｔｈ ｅｒｓ（１９８１）　Ｔｅｔｔ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：　１８５９−１８６ ２に記載されたホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法により 調製することができる。二本鎖フラグメントは次いで、相補性の鎖を合成し、こ れらの鎖を適当な条件の下で一緒にアニーリングすること、或いは適当なプライ マー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを用いて相補性の鎖を付加することの何れ かにより得ることができる。

合成の目的のためにプローブを生成し、又はポリヌクレオチドを増幅するために 、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いることができる。ここで参照することによっ てその内容を本明細書に取り込むＩｎｎ１ｓらの（Ｅｄ、）　（１９９０）　Ｐ ＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、を参照 のこと。

所望とする免疫優性表面抗原フラグメントについての天然又は合成のＤＮＡフラ グメントコードは、ｉｎ　ｖｊｔｒｏ細胞培養に導入され発現することのできる ＤＮＡ構造中に取り込まれていることがしばしばある。

通常、このＤＮＡ構造は酵母又は細菌のような単細胞宿主における複製に適した ものであるが、しかしまた培養された咽乳類、原生動物又はその他の真核細胞系 列のゲノム内に導入及び一体化することも意図されている。細菌又は酵母内へと 導入するために調製されたＤＮＡ構造は通常、宿主により認識された複製機構、 所望とするポリペプチド生成物をコードした適当な免疫優性表面抗原ＤＮＡフラ グメント、免疫優性表面抗原ＤＮＡ配列の５°末端に結合した転写及び翻訳開始 調節配列、及び免疫優性表面抗原ＤＮＡ配列の３′末端に結合した転写及び翻訳 終止調節配列を含む。転写調節配列は典型的には、宿主により認識される異種プ ロモーターを含む。好都合には、複製機構並びに転写及び翻訳ｍＴｏ配列を免疫 優性表面抗原ＤＮＡ配列の挿入部位と共に含む、利用可能な発現ベクターが用い られる。

免疫優性表面抗原ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質及びその変種の 合成及び生成について、以上に記述した。同様に、これらのエピトープをコード した配列をコードし、或いはこれと相同の核酸及びフラグメントについても記述 した。免疫優性表面抗原の特徴的な形態の発現はアメーバ症と関連しており、病 原性又は非病原性の感染の間での識別さえも達成されうる。以下でさらに例証す るように、病原性感染は病原性に特異な免疫優性表面抗原タンパク質のポリペプ チドエピトープの検出可能な発現により特徴付けられる。非病原性感染は同様に 、非病原性に特異なエピトープを用いて検出可能である。

特徴的なエピトープに対する抗体の生成は、病原性株と非病原性株の間で識別を 行うことを可能にする。感染の一般的な検出は、病原性株及び非病原性株の両方 に共通するエピトープを用いることができるが、識別を行うことは通常、表■に 示された異なるアミノ酸を含むエピトープに対して行われる。

腸の免疫優性表面抗原ポリペプチドを十分な量で人手したならば、その免疫優性 表面抗原タンパク質に特異なポリクローン性抗体をｊｎＶｌ’ｔｒＯ又はｌ″ｔ ｔｖｊｖｏの技術により生成することができる。ｌｎ　ｖｉｔｒｏの技術は、リ ンパ球を抗原性ポリペプチド又はフラグメントに対してｌｎｖｉｔｒｏで暴露す ることを含み、他方ｉｎ　ｖｔ’ｖｏの技術は、ポリペプチド又はフラグメント を、を推動物のような種々広範な標的免疫系の何れかへと注入することを必要と する。適したを推動物は典型的には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギそ の他の非ヒトである。約５から３０より多いアミノ酸、特に約５０から１００の アミノ酸を有するポリペプチドは、免疫原としてとして直接に働き得る。ポリペ プチドが約１０ｋＤよりも小さい場合、特に約６ｋＤよりも小さい場合には、そ のポリペプチドをより大きな分子と結合して、所望とする免疫応答を引き出すこ とが必要となろう。免疫原は次いで所定のスケジュールに従って動物へと注入さ れ、それらの動物は定期的に採血される。後に採血したものの方が、一般に力価 及び特異性が改良されている。注入は筋肉内、腹腔内、皮下などで行われ、フロ イントの不完全アジュバントのようなアジュバントが通常は用いられる。

本発明は、提供されるポリペプチドに対して作成される抗体を包含するものでは あるが、ここに提供されるエピトープに対して作成された抗体により特異的に認 識されるタンパク質をも包含する。従って、ＦＡＴモノクローナル抗体はまた、 特異的結合についての標的となる種類のタンパク質をも定義するものである。

所望の場合には、モノクローナル抗体は、所望とする特異性を有する抗体を産生 ずることのできる永続的な細胞系列を調製することにより得ることができる。Ｆ Ａ？モノクローナル抗体は、そのような細胞系列により産生される。かかる永続 的な細胞系列は、標的免疫系に応じて、各種の仕方で作成することができる。好 都合には、マウスのような小さなを椎動物を、今説明した方法により、所望とす る抗原でもって高度免疫する。次いでこのを椎動物を、通常は最終の免疫化の数 日後に殺し、牌臓を除去して、その牌臓細胞を永続化させる。永続化の仕方は重 要ではない。現在量も通常の技術は、最初にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７６）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：５１１−５１９により 記述されたところの、骨髄腫細胞融合パートナ−との融合である。他の技術に含 まれるものとしては、ＥＢＶ形質転換、例えば癌遺伝子、レトロウィルスその他 の裸のＤＮＡとの形質転換、或いは細胞系列及びモノクローナル抗体の産生の安 定な維持をもたらす他の何らかの方法がある。一般的な技術は、例えばＬａｎｅ 及びＨａｒｌｏｖ、　（１９８８）＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、およびＧｏ ｄｉｎｇ　（１９８６）　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ｌ’ ｒｉｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｆ’ｒａｃｔｉｃｅ、　（Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉ ｔｉｏｎ）　Ａｃａｄｅｍｉ■ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、に記述されているが、これらの文献は各々、ここで参照 することによりその内容を本明細書に取り込むものとする。抗体のｉ’ｔｔｒｔ ｔｒｏ産生についての新規な技術もまた適用することができる。例えばＨｕｓｅ ら（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：　１２７５−１２８１　Ｗａｒｄら （１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４−５４６を参照のこと。これらの 文献は各々、ここで参照することによりその内容を本明細書に取り込むものとす る。

融合パートナ−との融合を用いた場合、融合の仕方は通常は重要ではなく、種々 の技術を採用することができる。好都合には、牌臓細胞及び骨髄腫細胞を非イオ ン性界面活性剤、通常はポリエチレングリコール、及びダルベツコの変性イーグ ル媒質のような他の添加剤の存在下に数分間結合させる。融合の終わりに、細胞 を洗浄することにより非イオン性界面活性剤を手早く取り除く。融合した細胞は 小さな培養ウェル（通常はマイクロタイタープレート中の）へと、ウェル当たり 約１−５　Ｘ　１０’の範囲の比較的低い密度でもって、骨髄腫細胞に対して致 死性であると同時に雑種細胞の生長を支えるよう選ばれた選択的な培地中に迅速 に投入する。通常は、骨髄腫細胞系列は致死性剤に感応性、典型的にはＨＡＴ感 応性であるように突然変異されている。十分な時間、通常は１週間から２週間の 後に、雑種のコロニーを観察し、ハイブリッド形成が明らかな陽性のウェルを含 むプレートを識別する。

ウェル当たり一つだけのコロニーを有するプレート及びウェルを選択し、これら のウェルからの上溝を、所望とする腸の免疫優性表面抗原タンパク質又は分離し た抗原に対する結合活性について試験する。明らかなハイブリドーマが識別され たならば、その細胞系列は生育性培地として及び／又は凍結乾燥若しくは冷凍貯 蔵により維持することができる。

抗原についての所望とする用途に応じて、ハイブリドーマのさらなるスクリーニ ングを行うことが望ましい。高い力価を与えるハイブリドーマが望ましい。さら に、細胞障害性抗体、例えばＩｇＧ、、、　ＩｇＧ、、。

ＩｇＧ、及びＩｇＭを、病原性感染の治療的処置において用いるために選択する ことができる。免疫診断分析において用いるためには、抗原部位に対して非常に 高い特異性を有する抗体が望ましい。

所望とするハイブリドーマが選択されたならば、モノクローナル抗体を生長コロ ニーの上清から分離することができる。しかしながら、得られる抗体の収量は通 常、低いものである。この収量は種々の技術により、例えば細胞を受容するを椎 動物宿主の腹腔内へとハイブリドーマ細胞系列を注入することにより、増大させ ることができる。モノクローナル抗体は次いで、腹水溶液又は血液から収穫する ことができる。タンパク質性の及びその他の汚染物質は通常、在来の技術、例え ばクロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、抽出その他により、使用に先立ってモ ノクローナル抗体から除去される。

免疫原として使用されるポリペプチドを適切に選択することにより、所望とする 免疫優性表面抗原エピトープに対して高い特異性及び親和性を有する抗原を得る ことができる。選択されるポリペプチドは、所望とする免疫優性表面抗原タンパ ク質に固有であって、免疫優性表面抗原を密接に関連しているタンパク質から識 別することのできる一つまたはより多くのエピトープ部位を示すものでなければ ならない。そのような固有のエピトープは、表Ｉに開示された配列を含んでいる 細胞により発現されたポリペプチド上に見い出される。その一つの特定的な例が 、ＦＡ？モノクローナル抗体である。

本発明のポリペプチド及び抗原は、変性して又は変性なしで使用することができ る。しばしば、ポリペプチド及び抗原は、共有結合的又は非共有結合的の何れか でもって、検出可能な信号をもたらす物質を結合させることにより標識される。

多種多様な標識及び接合技術が知られており、科学的及び特許的な文献の両者に おいて広く報告されている。好適な標識に含まれるものとしては、放射性核種、 酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光物質、化学ルミネセンス物質、磁性粒 子その他がある。そのような標識の使用を教示している特許には、米国特許第３ ．８１７．８３７号、第３．８５０．７５２号、第３．９３９．３５０号、第３ ．９９６．３４５号、第４．２７７、４３７号、第４．２７５．１４９号及び第 ４．３６６、２４１号が含まれるが、これらの内容はここで参照することにより 本明細書に取り込むものとする。

上記のようにして調製された抗体及びポリペプチドは、生物学的標本、特に血液 、血漿、血清、尿、便その他を含む生検組織サンプル及び体液サンプルといった 細胞サンプルにおける、免疫優性表面抗原タンパク質を検出するために、種々の 免疫学的技術において使用することができる。アメーバ症感染は典型的には腸内 菌相において発生するから、選択すべきサンプルは日常的には便サンプルである 。サンプルの性質に応じて、液相分析及び固相免疫組織化学的染色技術の両者を 使用することができる。好都合には、組織サンプル、喀痰、及び肺洗浄サンプル を含む細胞サンプルについて、免疫組織化学的染色技術が用いられる。例えば、 どこの病院の病理学研究室においても日常的に行われているように、組織サンプ ルはホルマリン、Ｂ−５、或いは他の標準的な組織学的保存剤に固定し、脱水し てパラフィン中に埋封される。

パラフィン化した組織ブロックから次いで切片を切り取り、スライドガラス上に 載せる。免疫優性表面抗原タンパク質は、もし存在するならば、標識された免疫 優性表面抗原抗体に暴露することにより、または標識されていない免疫優性表面 抗原抗体と標識された二次的抗体に暴露することにより、細胞質又は細胞外空間 において検出されうる。

この抗原は表面抗原であり、細胞外に暴露されているものであるから、サンプル を変性することは不必要であり、非変性標的サンプルの分析が可能となる。この ことはまた、同じ試験サンプルのさらなる生的特徴付けを可能にしうる。喀痰及 び洗浄サンプルは典型的には同様な仕方で調製されるが、そこではサンプルは最 初に脱水剤、典型的には低分子量のアルコールに暴露することにより脱水される 。

液相イムノアッセイ又はウェスターンプロット分析もまた、特にタンパク質が体 液中に流入されている場合には、そのような液体、例えば血液又は便中において 免疫優性表面抗原タンパク質を検出するについて用途を見い出しうる。固体組織 及び喀痰サンプルもまた、タンノ々り質を放出させるために細胞サンプルを溶解 させることにより、液相系において分析することができる。タンパク質が放出さ れたならば、サンプルを適当な緩衝液中に入れ、このサンプルを適当なイムノア ・ソセイにかける。数多くの競合的及び非競合的なイムノアッセイが利用できる ものであり、また科学的及び特許的な文献に記載されている。

種々の診断試薬をどのようにして調製するか、特にポリクローナル及びモノクロ ーナル抗体並びに結合部位を有するこれらのフラグメントを説明したが、これら について使用する診断用キットもまた提供される。同様のキットは特定の核酸プ ローブを用いて調製することができる。これらのキットは典型的には、適切なサ ンプルに対して適用される検出試薬からなる少なくとも一つの区画を有する。試 薬は、浸漬スティック又は類似の物理的物質に付着させることができる。或いは また、試薬はサンプルを添加する溶液中に含有させることができる。活性成分を 含有している区画は、密封した封筒、プラスチック製の袋、小ビン、ビン、ジャ ー、アンプル、ウェル、或いはその他の何らかの保存用のパッケージでよい。

本発明の抗体はまた、治療及びその他の医学的適用において用途を見い出しつる 。例えば、免疫優性表面抗原抗体は、ジフテリア毒素及びリチンＡ鎖といった毒 素に結合させることができ、そして病原性二ントアメーバ感染を患う患者又は宿 主へと投与される。癌の治療に対して、抗体に接合されている毒素を用いること が一般的に、米国特許第４．０９３．６０７号、第４．３４０．５３５号、第４ ．３７９．１４５号及び第４．４５０．１５４号に記載されている。抗体単独で もまた、特に病原性表現型に寄与する免疫優性表面抗原タンパク質の幾つかの機 能性活性を阻止し又は妨害することにより、治療に対して用途を見い出し得るも のである。

本発明の特定の実施例においては、アメーバ感染に対する妨害を増大せしめるた めに、結合フラグメントはプロテアーゼ又はグリコシダーゼといった活性物質に 対して結合される。これらの結合フラグメントはトロフォゾイトに対して特異的 に結合し、活性物質は原生動物を破壊するように作用する。

本発明の組成物を用いて、エンドアメーバ感染に対するワクチンを製造すること ができる。これらのワクチンは受動的なものであり、アメーバの生長又は毒性を 妨害するＩｇを補充することからなる。或いはまた、ワクチンは能動的なもので あって、アメーバ感染の細胞毒素的又はその他の活性抑制による保護免疫をもた らす細胞応答を生ずる。

免疫優性表面抗原又はその免疫原等飾物を用いて調製されたワクチンは、（ａ） これらの抗原タンパク質を生ずるように組み換え的に変質され、或いはエンドア メーバそれ自体からの細胞が固定化された細胞、（ｂ）未精製細胞抽出物、（ｃ ）部分的又は完全に精製した免疫優性表面抗原標本からなることができる。免疫 優性表面抗原のセグメントを組み合わせた融合タンパク質は、容易に調製するこ とができる。幾つかの実施例では、これらの抗原を単一のタンパク質上の他の標 的抗原と融合させ、多数の感染ベクターに対する防御を誘起させることにより、 多重ワクチン接種を達成することができる。或いはまた、異なる抗原の「カクテ ル」を同時ｌこ投与又は接種することができる。これらの抗原は、周知の手順に よりワクチン投与量の形態で調製することができる。これらのワクチンは注射可 能な投与量の形態をとることができ、また筋肉内、静脈内又は皮下的に投与され うる。これらのワクチンはまた、吸気により鼻孔内に、又は活性成分を食品や水 と混合して錠剤形態をもたらすことにより口腔内に、というた形で投与すること ができる。これらのワクチンを投与、またはより典型的には接種のための手段は 、本明細書における教示から当業者には明らかなものである。

従って、本発明の範囲は如何なる特定の配給形態にも限定されるものではない。

皮下注射のような非経口的投与については、これらの免疫原を適当な生理学的に 受容可能な担体と組み合わせることができる。例えば免疫原は、種々のアジュバ ント又は免疫変質剤を備え又は備えていない、水、生理的食塩水、アルコール、 脂肪、ワックス又は緩衝されたビヒクル中で投与することができる。適当な免疫 学的アジュバント又は試薬には、水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、明春 （アラム）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジ ョン、水中油型エマルジョン、ムラミン酸ジペプチド、細菌エンドトキシン、リ ピドＸ、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｘｐａ ｒｖｕｚ　Ｃ／’ｒｏｐｌｏｔｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｉ　５ｃｎｅｓ　））　、 ボルデテラ・ベルラスシス（１ｏｒｄｅｔｏｌｌａ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）　 、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビ タミンＡ１サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥデキストラン、ブロ ック共重合体又はその他の合成アジュバントが含まれるが、しかしこれらに限定 されるものではない。これらのアジュバントは種々の供給源から市販され入手可 能である。例えば、メルックアジュバント６５　（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ、　Ｉｎｃ。

Ｒａｈｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）又はフロイントの不完全アジュバント及び完全アジ ュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉ ｃｈｉｇａｎ）などである。他の適当なアジュバントは、Ａｍｐｈｉｇｅｎ　（ 水中油型）　、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　（水酸化アルミニウム）、或いはＡｍｐ ｈｉｇｅｎとＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの混合物である。

アジュバントではないが、ＶＩＤＯ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｕｓ　ＤｉｓｅａｓｅＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、　５ａｓｋａｔｏｏｎ、　Ｃ ａｎａｄａ）により開発されたロータウィルスＶＰ６担体系もまた適当なもので ある。

免疫原及びアジュバントの比率は、両者が有効量で存在する限りは、幅広い範囲 にわたって変化させることができる。投与量当たりを基準として、免疫原の量は 宿主１ｋｇにつき約１．　Ｏｐｇから約１００ｍｇと広い範囲にわたることがで き、通常は少なくとも約１０ｐｇ、典型的には少なくとも約ｔｏｏｐｇ、そして 好ましくは宿主重量１ｋｇにつき少なくとも約１ｎｇであって、通常は約１ｍｇ 未満、典型的には約１ｍｇ未満、そしてより典型的には約１μｇ未満であり、好 ましくは宿主１ｋｇにつき約１１００ｎ未満である。好ましい範囲は投与量当た り約１０ｐｇから約１１００ｎである。好ましい投与量の大きさは通常は約０． ０１ｍ１と５ｍｌの間、好ましくは２０−５９ｋｇの生物に対して約０．５ｍｌ である。より小さい又は大きい動物に対する非経口投与についても、適当な比率 でもって投与量を調製することができるが、しかし投与量当たりの免疫原の量は 通常、より小さな動物に対してはより少ない。

免疫学的に経験のない動物に最初にワクチン接種を行うについては、２から６週 間の期間にわたる間隔を離した注射により、１から４投与量の間の系統的投与（ ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を行うことができる。典型的には、２投与員の系統的投与を 用いる。その場合、ワクチンの第二の投与量は、最初の投与量の数週間後、例え ば約２から４週間後に投与されねばならない。以前にエンドアメーバに暴露され たことがあり、或いは母体からの初乳抗体を受けている動物は、追加免疫の注射 を必要とするであろう。この追加免疫注射は、エンドアメーバのライフサイクル における易損性の時点と一致するように時期を見計らうのが好ましい。

周期的に再度ワクチン接種を行うことは、ある種の条件の下においては推奨され る。

ワクチンはまた、他の疾病に対する他のワクチンと組み合わせて、多価性ワクチ ンを作成することができる。ワクチンはまた他の薬物、例えば抗生物質と組み合 わせることもできる。薬学的に有効量のワクチンは、ウィルス性キャップジッド タンパク質複合体又は動物の免疫化に有用であることが理解されている希釈剤と いった、薬学的に受容可能な担体と共に用いることができる。

例えばＴｉｚａｒｄ、　Ｌ、、　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｖｅ ｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｏｇｙ。

２ｎｄ　Ｅｄ、　（１９８２）に記載されているような、当業者に周知の方法に 従って、他のワクチンを調製することができる。この文献は、ここで参照するこ とによりその内容を本明細書に取り込むものとする。

以下の実験例は例示の目的のために提示されるものであって、限定を行うための ものではない。

実　験　例 ■、エンドアメーバ分離物質及び細胞培養Ｉ１．　ヒト免疫血清 ＩＩｌ、　抗膜分画血清 ＴＶ、　モノクローナル抗体ＦＡＴ ■、　ウェスターンプロット分析 Ｖ１．　生きたトロフォゾイトによる抗体キャッピングＶＩＩ　ライブラリの調 製及びスクリーニングＶＩＩ１．　配列分析 ＩＸ、　プライマー延長配列分析 Ｘ、遺伝子複写番号 Ｘｌ、　非病原性エントアメーバヒストリティ力におけるＭｌ７に関連した配列 の検出 ＸＩｌ、　制限フラグメント長の多形性混注したヒト免疫血清を用いて、発病性 株エントアメーバヒストリティカｌ（Ｍｌ：ＩＭＳＳのλｇｔｌ　１発現ライブ ラリから、抗原（Ｍｌ７）をコードしたｃＤＮＡクローン（ｃＭ１７）を分離し た。Ｃｕ７のファージ溶解質に結合させることにより精製した単特異性の抗体と 、モノクローナル抗体ＦＡ１７とを、ウェスターンプロット分析により１２５ｋ Ｄａの抗原だけと反応させた。患者の血清、精製した単特異性抗血清及びモノク ローナル抗体ＦＡＴについて、表面結合及びキャップ形成が観察された。ｃＤＮ Ａクローンとハイブリッド形成することにより、対応するゲノムクローン（ｐＢ ｓｇＭ１７−１／２．／３）を分離した。これらは３３４５ｂｐの読み取り枠を 含んでおり、これはλｃＭ１７とのノザン法ハイブリッド形成により示されたと ころによれば、約３．０ｋｂの大きさのｍＲＮＡとよく一致する。これから導き 出されるアミノ酸配列は１２５５１３Ｄａのタンパク質を予想するものであり、 これは１７の潜在的なＮ−結合グリコシル化反応部位を含み、またチロシン及び アスパラギン残基に非常に富んでいる。明確に疎水性のアミノ末端領域は、膜の 足場又は信号配列として役立つ。エントアメーバヒストリティ力類似のラレドを 除き、非病原性及び病原性の分離物質のＰＣＲ診断を可能にする幾つかの制限酵 素が見い出された。

■、　エンドアメーバ分離物質及び細胞培養無菌化したエントアメーバヒストリ ティ力株（ＨＭＩ：ｆＭｓｓ、ＮＩＨ：ＨＫ９）及びエントアメーバヒストリテ ィヵ類似のラレドのトロフォゾイトを、Ｄｉａｍｏｎｄら（１９７８）による” Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｘｅｎｉｃ　Ｃｕ１ｔｉｖａｔ ｉｏｎｏｆ　Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ　ａｎｄ　０ｔｈｅ ｒ　Ｅｎｔａｍｏｅｂａ″　Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓａｃ。

Ｔｒｏ　、　Ｍｅｄ、　Ｈ、７２：　４３１−４３２ニＫｅ、載５ｔＬり如キＴ ＹＩ−８−３３培地テ生１ｔシた。多種寄生性の分離物質を、１０％のウシ血清 が補充され、培地１ｍｌ当たりに次の抗生物質、すなわちカナマイシン、エリス ロマイシン及びアンピシリンの各々を５μｇ含有する液状ロビンソン培地で生育 した。

９００ｒｐｍで遠心分離することによりアメーバをペレット化し、ｐＨ７，５の 燐酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で二度洗浄した。多種寄生性アメーバは、パー コール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　／ＰＢＳクッションを介し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ 遠心分離機で３０００ｒｐのにおいて遠心分離することによりさらに精製した。

分離物質ＳＤ４　（病原性、ジモデームＩＩ）及びＲＥＦ２９１及び５Ｄ１１６ 　（非病原性、ジモデームＩＩＩ及びＩ）は、サンディエゴのカリフォルニア大 学のシャロン・リード博士から提供されたものである。勾配をつけたＰＡＧＥを 用いたジモデーム分析により分類した、非病原性分離物質＃４３及び＃４４並び に病原性分離物質＃４６はメキシコ市において分離された。Ｍｅｚａら（１９８ ６）の’Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　 Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ　ｌ５ｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍＡｓｙｍｐｔｏｍａｔｉ ｃ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ：　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ａｃｒｙｌａｍｉ ｄｅ　Ｇｅ１ｓ、”　Ａｍ、　Ｊ。

ｄ工ｍユ３５：　１１３４−１１３９を参照のこと。これらはそれぞれサージエ アント（Ｓａｒｇｅａｕｎｔ）ジモデームＩ、Ｉ及びＩＩに対応している。

Ｔ１．　ヒト免疫血清 アメーバ性肝臓膿瘍の１０８人の患者からの血清を、メキシコ市にあるｒｎｓｔ ｉｔｕｔｏ　Ｎａｃｉｏｎａｌ　ｄｅ　ｌａ　Ｎｕｔｒｉｃｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌ ａ　Ｒａｚａ−ＩＭＳＳ　ＦｌｏｓｐｉｔａｌｓのＡ、　ｌ５ｉｂａｓｉ博士及 びＲ，Ｌａｎｄａ博士から入手した。患者についての肝臓膿瘍の診断は、臨床症 状、向流免疫電気泳動、ＥＬＩＳＡ及びＳ状結腸鏡検査により確立した。アメー バ症の履歴がなく、免疫プロットにより試験したところ抗アメーバ抗体に関して 陰性の供給者からのヒト血清を、対照として用いた。洗浄した細胞を、１０ｍＭ ＋７）ｐ−ヒドロキシ安息香酸第二水銀を含有するＰＢＳ及びラエムリ（Ｌａｅ ｍｌｉ）サンプル緩衝液中に懸濁し、５分間煮沸し、１０％又は５−１５％の勾 配の５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターへと電気泳動 的に転写することにより、トロフォゾイト全体のウェスターンプロットを作製し た。全ての血清は、アメーバ全体の抽出物上において、ウェスターンプロット分 析により評価した。１０８のサンプルがら最も高い力価を示す２９の血清を選択 し、混注した。

ＩＩｌ、　抗層分画血清 膜分画は、Ａｌｅｙら（１９８０）　ム」狂工肚Ｌ１５２：　３９１−４０４に 記載の如くにして調製し、ＰＢＳ及びフロイントの完全アジュバントで１：１に 希釈した。ウェスターンプロットにより分析して力価が１：５０００に達するま で、３００μｇでもってマウスを二週間毎に腹腔内的に免疫化した。

ＩＶ、　モノクローナル抗体ＦＡ？ ２　Ｘ　１０’のアメーバからのアメーバ抽出物の全部を、予備的な５−ｔ５％ の勾配の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ニトロセルロースへと電気泳動的に 転写した後、１２５ｋＤａの領域をプロットから切り出し、粉末状に粉砕し、Ｐ ＢＳ中に懸濁した。懸濁液の１００μｍをＰＢＳで１＝９に希釈し、二週間の間 隔を置いて腹腔内的にマウスへと３回注射し、融合前に最終的な追加免疫を行っ た。エントアメーバヒストリティ力のウェスターン法転写における１２５ｋＤａ のバンドとの陽性反応により、ハイブリドーマを選択した。クローンＦＡＴから の収穫溶液は、ウェスターンプロット分析においてｌ　：　１０００の希釈度で 使用した。

■、　ウェスターンプロット分析 ウェスターンプロット分析は、標準的な手順を用いて実行した。例えばＳａｍｂ ｒｏｏｋら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　＋　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参 照のこと。その内容は、ここで参照することにより本明細書に取り込むものとす る。エントアメーバヒストリティカの細胞抽出物全体を、１０８人の感染患者の 各々からの個々の血清サンプルと反応させた。血清の６２％より多くにおいて、 ７つの抗原（２２０，１９０，１６０，１２５−１２９，９６，７５，４６ｋＤ ａ）が検出された。

これらの７つの中でも、１２５ｋＤａの抗原が免疫優性であり、強く反応すると ともに血清サンプルの７０％より多くにより認識された。これらの分子量及び血 清学的反応性に基づき本発明者らが推定したところでは、２２０ｋＤａの抗原は Ｎ−アセチルグルコサミン付着性レクチンを示し、また１６０ｋＤａの抗原はＮ −アセチル−Ｄ−ガラクトサミン付着性レクチンを示し、そして９６ｋＤａの抗 原は膜内在性タンパク質を示している。無菌的に又は多種寄生的に生殖した病原 性エントアメーバヒストリティヵの分離物質、及び多種寄生的に生殖した非病原 性エントアメーバヒストリティ力の分離物質の細胞抽出物全体のウェスターンプ ロットを、２９のヒト免疫血清を混注した部分集合を用いて分析した。この血清 は、由来とは無関係に、全ての分離物質において１２５ｋＤａの抗原と強く反応 した。

図１を参照のこと。アメーバ形質膜に関して調製された多特異性の抗血清もまた 、１２５ｋＤａの抗原と強く反応した。部分的に精製した１２５ｋＤａの抗原に 関して調製されたモノクローナル抗体ＦＡ７は、１２５ｋＤａの抗原のエピトー プと特異的に反応した。ＦＡ７を用いたウェスターン法分析により、このエピト ープはエンドアメーバ属の種々の株及び種において検出された。モノクローナル 抗体ＦＡ７でプローブしたウェスターンプロットにおいては、殆どの分離物質に おいて低分子量で強さの異なる付加的なバンドが明らかであった。アメーバ抽出 物全体中には強いプロテアーゼが存在しており、未知の由来による処理中間生成 物を除外することはできないが、本発明者らは、それらは１２５ｋＤａの抗原の 崩壊生成物であると推定した。

Ｖｌ、　生きたトロフォゾイトによる抗体キャッピングヒト免疫血清、クローン ＦＡ７がらのハイブリドーマ収穫溶液、及び生成した単特異性抗血清を、１　： 　５００．　１　：　２０００及び未希釈のそれぞれにおいて、生きたトロフォ ゾイトへと添加した。キャップの形成（３７°Ｃで１０分間）の後、細胞を３． ７％のホルムアルデヒドで固定化し、ＰＢＳで洗浄して、フルオレセイン−イソ チオシアネートで標識した抗ヒト又は抗マウ刈ｇＧで染色した。抗アクチン産生 クローンがらの未希釈の収穫溶液は、非表面抗原に対する対照として使用した。

生きたトロフォゾイトは、抗体及び抗原の表面に結合した抗体−抗原複合体をキ ャッピングする。抗体−抗原キャップは、混注した患者の血清、モノクローナル 抗体ＦＡ？、或いはｃＤＮＡクローンλｃＭ１７のファージ溶解質に対する混注 ヒト血清の特異的結合及び溶出の後に回収した単特異性抗体で培養することによ り、ＨＭＩ：　ＩＭＳＳ　）ロフォゾイトにおいて誘起された。図２を参照のこ と。陰性の対照抗体（モノクローナル抗アクチン抗体）は、トロフォゾイト表面 に結合することも、またキャップ形成を誘起することもなかった。これらの結果 は、１２５ｋＤａの抗原がアメーバの表面に局在していることを示している。架 橋した抗原をキャッピングすることの他に、また細胞が丸まっていることが判明 した。このことは正常な生物学的機能が阻害されることを示すものであり、また 恐らくは、抗体に対する結合が、細胞分割及び感染サイクルの機能を含めて細胞 機能を破壊することを示している。

ＶＩｌ、　ライブラリーの調製及びスクリーニングエントアメーバヒストリティ 力株ＦＩＭＩ：ＩＭＳＳからのゲノムＤＮＡ及びポリ（Ａ）”ＲＮＡの分離、並 びにλｇｔｌｌ　ｃＤ　Ｎ　Ａライブラリーの構築については先に記述した。例 えば、Ｅｄｍａｎら（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：　３０２４−３０２８を参照のこと。エントアメー バヒストリティカＦＩＭＩ：ＩＭＳＳからのゲノムライブラリは、６００μｌの ＮａＩ　（ＧｅｎｅＣ１ｅａｎキット、ＢｉｏｌＯｌ）　ヲエツ’（：／ドルフ 管中ニオイテ２ｏｏＡｔｌ（大体２０μｇのＤＮＡ）のアガロースに埋封された 核に添加することにより作製し、５分間にわたって６０℃で培養した。２０μｌ のガラスミルクを添加し、十分に懸濁して、混合物を室温で５分間培養した。こ のサンプルは１分間渦動させてＤＮＡを剪断し、マイクロフユージ（ｍｉｃｒｏ ｆｕｇｅ）中で５分間回転させた。上清を取り除いた後、３０秒間渦動させるこ とによりペレットを１ｍｌの洗浄緩衝液中に懸濁させた。ガラスミルクをマイク ロフユージ中における５秒の回転によりペレット化し、上清を取り除いた。

洗浄を二回繰り返し、剪断され精製されたＤＮＡを３７℃で５分間培養すること により、ＴＥ　（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐｉ（８）　、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）　１００μｍ中へと溶出させた。回収及び剪断の度合いはアガロースゲル電 気泳動により評価した。！ｃｏＲＩリンカーの添加、メチル化、ベクターＺＡＰ ＩＩへの結紮、及びパッケージ化反応を含む後続する全ての段階は、標準的な手 順により実行した。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）：　Ｇｕｂｌｅｒ、 　Ｕ、及びＢ。

Ｊ、　Ｈｏｆｆｍａｎ　（１９８３）　Ｇｅｎｅ、　２５：　２６３−２６９＋ 及びＭｏｒｇａｎら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ。

３２９：　３０１−３０７を参照のこと。λｇｔｌｌＣＤ　Ｎ　Ａライブラリー （３Ｘ１０″フアージ）は、１：２００の希釈度において、２９人の患者からの 混注血清でスクリーニングした。ゲノムライブラリーは、３２ｐ−α−ｄＣＴＰ でｍ識したλｃＭ　１７のＥｃｏＲＩフラグメントでスクリーニングした。

４６の反応性クローンの各々をプラーク精製し、混注血清中に含まれる２９人の 患者の血清の各々及び抗層血清による認識に関して試験した。

クローンλｃＭ１７は２９人の患者の血清のうち２６と強く反応し、また抗層血 清と強く反応した。フィルターに結合したλｃＭ１７のファージ溶解質から溶出 させることにより、混注ヒト血清から単特異性抗体を選択した。この溶出液は、 アメーバ抽出物全体のウェスターンプロット分析により、１２５ｋＤａの単一の ポリペプチドと反応した。陰性対照として利用されるλｇｔｌ　１のファージ溶 解質は、アメーバ抗原と反応する抗体には結合しなかった。プラスミドはゲノム 性λＺＡＰＩＩクローンから取り出した。ファージＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ は、標準的な手法により精製した。

ＶＩＩｌ、配列分析 最初の２０７ｂｐを除き、遺伝子５１１７の全体の配列をゲノムクローンｐＢＳ ｇＭｌ？−１の両方の値上及びゲノムクローンｐＢｓｇＭ１７−２の一本の値上 で決定した。表１を参照のこと。ｃＤＮＡ挿入片を表している内部の！ｃｏＲＩ フラグメントもまた、プロメーガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）システムを用いて生成され た組の欠失鋳型を用いて、やはり両方の値上で配列決定した。二本鎖配列もまた 、無症候のコスタリカ難民から導出されＳ、Ｌ、　Ｒｅｅｄ博士により提供され た分離物質ＲＥＦ　２９１．ジモデームＩＩＩからのゲノムＤＮＡの増幅により 得た二つのＰＣＲフラグメントについて決定した。幾つかのオリゴヌクレオチド を、５ｅｑｕｅｎａｓｅシステム（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）又はＡＢ ＩＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）によ り、−零値ＤＮＡ　（Ｍ１３ｍｐ１８／１９）及び二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＢＳ ＫＳ（＋））配列決定反応においてプライマーとして使用した。

λｃＭ１７の１．９ｋＢの挿入片は、この挿入片全体にわたって広がる０ＲＦ（ 読み取り枠）を明らかにした。表Ｉを参照のこと。５゛の開始アミノ酸メチオニ ンの欠損、ポリ（Ａ）尾部の不存在、及びノーザンプロット分析による〜３ｋｂ のｍＲＮＡに対するハイブリッド形成は、λｃＭ　１７におけるアミノ末端及び カルボキシル末端配列の欠如を示している。図３を参照のこと。

ゲノムクローンを分離し、アミノ末端及びカルボキシル末端配列を得るために、 λｃＭ１７の１．９ｋｂ挿入片をプローブとして用いて、エントアメーバヒスト リティヵＩ（Ｍｌ：ＩＭＳＳがらのλＺＡＰＩＩライブラリーをスクリーニング した。三つのゲノムクローンが同定され、それらのうち二つをｃＤＮＡ配列から 誘導したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。ｃＤＮＡのヌク レオチド配列は、両方のゲノムクローンにおいて同一であった。付加的な５゛配 列の５５６ｂｐ、及び３゛配列の８７０ｂｐは、３３４５ｂｐのＯＩ？Ｆを産生 したが、これもまた両方のゲノムクローンにおいて同一であった。このＯＲＦ　 （遺伝子■１７）の大きさは、ノーザンプロット分析によりめた＃　３０００ｂ ｐのｍＲＮＡの大きさと相応に一致する。これから示唆されるアミノ酸配列は、 １２５ｋＤａのタンパク質を予言する。

遺伝子ＭＩ７の５゛側領域は、エントアメーバヒストリティ力他の遺伝子のうち で配列が決定されているただ二つのものであるアクチンとフェレドキシンの両方 の遺伝子の５゛側領域と著しい類似性を共有している。

表ＩＩを参照のこと。Ｍｌ７の転写開始部位は、オリゴヌクレオチド５ＲＯ９を 用いたプライマー延長配列分析により、開始コドンのアデニン残基１７ｂｐ５° へとマツピングした。５゛未翻訳領域はアクチン（Ｉｌｂｐ）及びフェレドキシ ン（９ｂｐ）遺伝子において、他の真核遺伝子転写産物と比較して、同様に非常 に短かった。共通の配列特徴である５°ＡＴＴＣＡ３’が、Ｍｌ７及びアクチン 遺伝子の両者の転写開始部位に存在し、この開始ヌクレオチドは他の真核生物に おいて最も多くみられるように、アデニン残基である。同じ特徴がまたフェレド キシン遺伝子の片側配列においても存在しているが、そのキャップ部位は５″ア デニン残基ではなく３°チミジンへとマツピングされた。これらの遺伝子の間で 共有されているさらなる配列特徴は、Ｍｌ７、アクチン本、アクチン９及びフェ レドキシン遺伝子の片側配列について、それぞれ−２９，，３１，−３２及び− ３２に存在しているＹＡＴＴＴＡＡＡである。この配列特徴は真核生物の遺伝子 において転写開始部位の２５−３０ｂｐ上流に位置するＧｏ　１　ｄｂｅ　ｒｇ −Ｆｌｏｇｎｅｓｓプロモーターの共通配列ＴＡＴＡＡＡＴＡとは一致しない。

それでもなお、この配列は三つのエントアメーバヒストリティ力遺伝子において 、配列及び相対位置の両方において類似しており、エントアメーバヒストリティ 力ではＲＮＡポリメラーゼの導入個所として作用するという共通性を示唆してい る。

表ＩＩ　：　Ｍｌ７、アクチン本（発表されている一つの配列）、アクチン９（ 発表されている別の配列）及びフェレドキシン５の遺伝子からの５′側配列の整 列を示す。−２９，−３１，−３２及び−３２のそれぞれにおける有望なＧｏｌ ｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ一致（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　）配列を括弧で囲んで ある。

ｍＲＮＡの５′末端は太字で示されて記号：の後に続いており、ＡＴＧメチオニ ン開始コドンが示されている。キャップ部位の周囲の配列の類似点は、ＡＴＴＣ ＡまたはＡＴＴＡＡである。

ｑ　Ｃ５＜　←　ｙ　ｌ−＋ｌ　Ｃ５１ａｔΦ１１Ｘ、　プライマー延長配列分 析 プライマー延長配列分析は、デオキシアデノシン５’　−［ａ−［”　Ｓ　］チ オ］三燐酸の存在下において、ＩＯμｇのボＩＪ（Ａ）’に富むＲＮＡへとアニ ーリングされたオリゴヌクレオチドプライマー５ＲＯ９である［５’　Ａ　Ａ　 ＣＴＡＣＴＣＣＴＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧ３’］を逆転写酵素仲介延 長することにより行われた。

Ｘ、遺伝子複写番号 Ｍ１７遺伝子及び限定的な片側領域のサザンプロット及び配列分析により、この 表面抗原が単一の複写遺伝子によりコードされていることが示された。ＩｇｌＩ ■及びＥｃｏ　ＲＶでもって一本鎖又は二本鎖消化において制限されたエントア メーバヒストリテイ力からのゲノムＤＮＡのサザンプロｙトを、λｃＭ１７のｌ ａｇ　Ｈ■−１ｇ１　ＩＬ　Ｉｇｌ　ＩＩ−Ｅｃｏ　ＲＶ及びＥｃｏ　ＲＶ７ラ グメントでプローブした。各々のプローブとは、それに固有の制限フラグメント のみがハイブリッド形成した。さらにまた、ゲノムクローン及びｃＤＮＡクロー ンの両者におけるヌクレオチド配列は同一であった。

Ｘｌ、　非病原性エントアメーバヒストリテイカにおけるＭ１７に関連した配列 の検出 ウェスターンプロット分析が示唆したところによれば、１２５ｋＤａの抗原、或 いはポリ又はモノクローナル抗血清により認識されるエピトープを共有している 密接に関連した抗原が、病原性及び非病原性の両方のエントアメーバヒストリテ イカ分離物質並びにエンドアメ−、＜ヒストリティカ類似のラレドにおいて見い 出された。サザンプロット分析によれば、ハイブリッド形成及び洗浄の条件が緩 い（２５％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ１３７°Ｃ）場合でさえも、ＭＩ７に関連 した配列を非病原性σエントアメーバヒストリテイカ分離物質並びにエンドアメ ーバヒス１リテイカ類似のラレドにおいて検出することは困難であった。

ＰＣＲは、Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＤＮＡサーモサイクラ−を 用いて行た。反応混合物（５０μｌ）は、５ＲＯ１８［５’ＧＣＡＡＣＴＡＧＴ ＧＴＴＩＧＴＴΔＴＡＣ３°］と５ＲＯ２１［５’ＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡ ＡＴＴＴＧＧ３’］及び５ＲＯ１９［５’ＧＴＡＴＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＡＧＴ ３’コ５ＲＯ２２［５’ＧＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴ３°］とい う二のオリゴヌクレオチドプライマ一対の各々を２５ｐｍｏｌと、大体５００ｎ ｇのツムＤＮＡと、四つのｄＮＴＰの全てを各々１．５ｍＭと、６０ｍＭのＫＣ Ｉと、２５＋ｎのトリス−ＨＣＩ（ｐＦＩ８）と、０から２０ｍＭのＳＩｇＣｌ 　ｚと、０．１％のウシ血清アルブミンと、１０％のＤＭＳＯとを含有していた 。この反応混合物をパラ：イン油滴で覆い、９４℃で１０分間変性し、２．５単 位のサーマスアクアテクス（ｒｈｅｒｚｕｓ　ａｑｕａｌｊｃｔｔｓ　）　Ｄ　 Ｎ　Ａポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）を添加し増幅を開始した。ＰＣＲパラメータ は３５の熱サイクルであり、９４℃におる１分間の変性、それに続＜４２℃で３ 分間のアニーリング期間と、て分間の傾斜（ｒａｍｐ　）及び７２°Ｃでの４分 間の延長期間からなる。増幅店物は！ｃｏＲＩ及びｆｐｅ　Ｉ制限酵素で制限し 、１％の低融点アガロ−スゲ電気泳動によりＭ１３へとサブクローニングすべく 精製した。

ｃＤＮＡクローンλｃＭｌＴ内に含まれる配列の殆どに及んでいる二つフラグメ ントを、オリゴヌクレオチド対５Ｒ０１９／５ＲＯ２２及び５ＲＯＩ８／５Ｒ２ １を非病原性分離物質ＲＥＦ　２９１から誘導されたゲノムＤＮＡ鋳型上のライ マーとして用いてＰＣＲ中で増幅した。サブクローニングされた二つ）　のＰＣ Ｒ増幅産物のヌクレオチド配列分析によれば、λｃＭ１７　（Ｈ旧：　ＩＭＳＳ ）の配列と比較すると、ＲＥＦ　２９１は１４１０の残基にわたり、１４５　（ １０，３％）のヌクレオチドの置換を生じていた。表Ｉを参照のこと。この置換 のっ　結果、４７０の残基（１２，１％）当たりで５７のアミノ酸の相違が生じ た。全、　体で３３４５ｂｐの旧７遺伝子配列に関して、公開されているタンパ ク質配列Ｃのコンピューター検索を行ったところ、λｃＭＩ７挿入片により表さ れると　内部遺伝子フラグメントはＴａｎｎ１ｃｈら（１９８９）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

っ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８６：　５１１８−５１２２によりエントアメーバヒスト リティカの非病原ゲ　性株及び病原性株から分離され、これらの著者が株の鑑別 のための潜Ｍ　在的な診断プローブとして提案しているＤＮＡフラグメントにつ いて推定されるタンパク質配列に類似のタンパク質配列をコードしている１　こ とが明らかになった。即ち、本発明者らがＴａｎｎ１ｃｈらのアミノ酸配列イ　 をλｃＭ１７のそれと比較した時に、本発明者らは病原性ＨＭＩ：ＩＭＳＳ分離 物て　質（１％）相互の間で５つの置換を検出した。表Ｏｒを参照のこと。Ｄけ 　ＮＡフラグメントのヌクレオチド配列はＴａｎｎ１ｃｈらにより公開されなか １　つたため、本発明者らはそのアミノ酸配列から、エンドアメーバヒス配　ト リティカｔ１ＭＩ：ＩＭＳＳ実験室株相互の間におけるこれら５つの相違のうル 　ち少なくとも３つは、一つより多いヌクレオチド置換から生じたものに違いな く、従ってｃＤＮＡ合成又は配列人為構造を表すことは考えらの　れないと結論 した。非病原性分離物質ＲＥＦ　２９１のＰＣＲ産物から導出され０　た４７０ のアミノ酸配列を分離物質ＳＡＷ　１７３４と比較した場合、６つのアミプ　ノ 酸置換（１，３％）が検出された。同じ４７０のアミノ酸全体にわたり、病原性 のＨＭＩ：ＩＭＳＳ株と非病原性のＳＡＷ　１７３４株の間では、６１のアミノ 酸残基（１２，９％）が相違していた。全体では、これら４つの分離物質を比較 した場合、４７０のアミノ酸の全長にわたり、６５の可変残基（１３，８％）が あった。表ＩＩＩを参照のこと。

表ＩＩＩ　：　ｃＤ　Ｎ　Ａ及びゲノムクローン（ｌ（Ｍｌ：ＩＭＳＳ本）及び ＰＣＲ増幅産物（ＲＥＦ２９１本）のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸 配列の整列をＴａｎｎ１ｃｈらにより公表されたアミノ酸配列０１ＭＩ：ＵＳＳ ：、　ＳＡＷ　１７３４３）と共に示す。維持されているアミノ酸はプレーンな 活字で、病原性分離物質を非病原性分離物質から区別する可変残基の位置は下側 に＊で示され、さらなる可変残基の位置は下側に“で示されている。

表−一−１ ＸＩｌ、　制限フラグメント長の多形性非病原性株ＳＡＷ　１７３４及びＲＥＦ 　２９１の部分的なＭ１７アミノ酸配列配相互に、それらの病原性対応物に対す るよりも非常に類似していた。そこで病原性アメーバ分離物質を非病原性アメー バ分離物質から確実に区別可能な制限長の多形性を定義する可能性を調べるため 、別の６つの株からの同一の遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅に着手した。オリ ゴヌクレオチドプライマー５ＲＯ１９，５ＲＯ２２，５Ｒ０１８及び５ＲＯ２１ を用い、株５Ｄ１１６゜ＳＤ４．　：４Ｓ、　＃４４．　＃４６及び１（Ｋ９の ゲノムＤＮＡから同じ大きさのＰＣＲ産物を増幅した。ＨＭＩ：ＩＭＳＳ及びＲ ＥＦ２９１からのこれらのフラグメントの、本発明者らによるヌクレオチド配列 に基づき、本発明者らは、特に制限酵素ｆｃｏ　ＲＶ、　ｆｓｐ　Ｉ　、　Ｐｖ ｕ　ＩＩ、　Ａｃｃ　Ｉ及び／ｌ１ｎｃｌＩが、ＰＣＲ産物を分離物質の病原性 又は非病原性表現型に相関することが予期し得る制限フラグメントへと分割する ことを予想した。ｊｃｏ　ＲＶ及びｆｓｐ　Ｉについてのそのような分析の一例 を提示する。図４を参照のこと。ｊｃｏ　ＲＶについての制限部位は、非病原性 ３４３．３４４及びＲＥＦ２９１には存在していないが、非病原性５Ｄ１１６及 びラレド、更には病原性ＨＭＩ：ＩＭＳＳ、　ＨＫ９．　ＳＤ４及び＃４６には 存在している。制限酵素ｆｓｐ　Ｉを用いた消化は、病原性（ＨＭｌ：ＩＭＳＳ 、　ＨＫ９．　ＳＤ４及び４６）株に対し、この規準によれば病原性として現れ るエントアメーバヒストリティカ類似のラレドを除いた非病原性（３４３，３４ ４，５Ｄ１１６及びＲＥＦ２９１）株について、明確なパターンを示している。

例えば図４を参照のこと。同様に、ＡｃＣＩによる制限は、この酵素に関して付 加的な制限部位を有するらしいラレドを除いて、病原性分離物質を非病原性分離 物質から区別する。１ｉｎｃＩＩによる消化は、非病原性分離物質３４３．８４ ４及びＲＥＦ２９１並びに病原性分離物質ＳＤ４中に同一の制限フラグメントを 示すが、共生的なラレド及び病原性分離物質＃４６．　ＨＭＩ：ＩＭＳＳ及びＦ ＩＫ９中には制限部位は示さない。

全ての刊行物及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願について特定的 且つ個々的に参照によりその内容を取り込むことを示したのと同じ程度でもって 、ここに参照することによりその内容を本明細書に取り込むものとする。本発明 は以上により完全に記述されたものであり、本技術分野において通常の知識を有 する者にとっては、請求の範囲の思想及び範噴から逸脱することなしに、本発明 について多くの変更及び修正を行うことが可能であることは明らかなものである 。

Ｆｌ（ｉ　１ ＦＩＧ、　３゜ Ｍａｂ　ｃｄｅ　ｆｇｈ　１ＡＢｃＤＥＦＧＨＩＮＦＩＧ、４ 国際調査報告 一一一一一＾呻に締−””、ＰＣＴ／ＬＩＳＱＩ１０ＳＱ７ＱＡｔｔａＣｈｍｅ ｎｔヒｏ　Ｆｏｒｍ　２１０　ＰＣＴ　１３９９１１０５９７９ｉｎｖｅｎＩ− ｉｏｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｎｏｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｆ ｏｒｍ　ａ　５ｉｎ９１ｅｉｎｖｅｎｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｐｔ、ＰＣＴ　Ｒｕ １ｅ　１３．１　ａｎｄ　１３．２　ｄｏ　ｎｏｔ　ｐｒｏ−ｖｉｄｅ　ｆｏｒ 　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ’　ｍａｔｈｏｄｓ、　４−一 一一−＾時１−１−　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０５９７９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｎ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５１０４　８６１９−４ＨＣ１２Ｎ　１５／ ３０　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、〜ＩＬ、　ＭＲ，ＳＮ 、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ 、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ。

ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＦＩ （７２）発明者　エドマン、アースラ アメリカ合衆国カリフォルニア州９４１１４サンフランシスコ、コルペット・ア ヴエニュー・３６０ （７２）発明者　ゴメスーパラシオ、イサウラ、メーツァメキシコ国ディ・エフ ・０３９２０メキシコ。

エクストラマドウーラ・ナンバー・１５４

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．侵入性アメーバ症に対するワクチン組成物であって、該組成物がエントアメ ーバヒストリティカの免疫優性表面抗原と免疫的交叉反応性を有するポリペプチ ドからなり、該ポリペプチドが感染され易い宿主に投与された場合に保護免疫を 誘発するのに有効な量において生理学的に受容可能な担体中に存在していること からなるワクチン組成物。
2. ２．前記免疫優性表面抗原が、表Ｉに示したアミノ酸配列を有する１２５ｋＤａ の抗原と実質的に相同である、請求項１のワクチン組成物。
3. ３．前記ポリペプチドが、表Ｉに示した配列からの少なくとも６つの連続するア ミノ酸からなる、請求項１のワクチン組成物。
4. ４．表Ｉの領域Ｉ又は領域ＩＩＩにコードされたポリペプチドをコードした配列 と相同であり、或いは 前記配列に対して厳しい条件下でアニーリングすることのできる配列からなる、 核酸組み換え組成物。
5. ５．前記配列が少なくとも約１５のヌクレオチドである、請求項４の組み換え組 成物。
6. ６．前記ポリペプチドが細胞外ドメインからなる、請求項４の組み換え組成物。
7. ７．前記核酸が実質的に大体３３４２のヌクレオチドタンパク質コード配列の全 体からなる、請求項４の組み換え組成物。
8. ８．請求項４の組み換え組成物からなる細胞。
9. ９．エントアメーバヒストリティカ表面抗原遺伝子を検出するための診断用キッ トであって、請求項４の組み換え組成物を含有する区画からなるキット。
10. １０．表Ｉの領域Ｉ又は領域ＩＩＩに開示された少なくとも６つの連続するアミ ノ酸の配列に相同な配列からなる実質的に純粋なポリペプチド。
11. １１．前記ポリペプチドが細胞外ドメインからなる、請求項１０の実質的に純粋 なポリペプチド。
12. １２．前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１０の実質的に純粋な ポリペプチド。
13. １３．前記ポリペプチドが表Ｉに記載のほぼ１１１４のアミノ酸からなるアミノ 酸配列の実質的に全体からなる、請求項１０の実質的に純粋なポリペプチド。
14. １４．エントアメーバヒストリティカの免疫優性表面抗原に特異的に結合するこ とのできる抗体。
15. １５．前記免疫優性表面抗原が、表Ｉに記載のアミノ酸配列を有する１２５ｋＤ ａの抗原と実質的に相同である、請求項１４の抗体。
16. １６．前記抗体がモノクローナル抗体ＦＡ７である、請求項１４の抗体。
17. １７．請求項１５の抗体により特異的に結合されるエピトープを有するタンパク 質。
18. １８．エントアメーバヒストリティカ抗原の検出のための診断用キットであって 、請求項１４の抗体を含む区画からなるキット。
19. １９．感染され易い宿主にワクチン接種して侵入性アメーバ症に対する免疫を授 けるための方法であって、前記宿主に対してエントアメーバヒストリティカの免 疫優性表面抗原と交叉反応性の免疫的活性を有するポリペプチドを投与すること からなる方法。
20. ２０．アメーバ感染に先立って前記宿主に投与が行われる、請求項１９の方法。
21. ２１．アメーバ感染の後に前記宿主に投与が行われる、請求項１９の方法。
22. ２２．前記免疫優性表面抗原が、表Ｉに記載のアミノ酸配列を有する１２５ｋＤ ａの抗原と実質的に相同である、請求項１９の方法。
23. ２３．前記ポリペプチドが、表Ｉに示した配列からの少なくとも６つの連続する アミノ酸からなる、請求項１９の方法。
24. ２４．エントアメーバ属のアメーバに感染した動物の治療方法であって、前記動 物に対して表Ｉに記載の少なくとも約６つの連続するアミノ酸の配列と実質的に 相同なセグメントを含有する組み換えタンパク質を注入する段階からなる方法。
25. ２５．前記注入が免疫応答を誘発する、請求項２４の方法。
26. ２６．前記配列が領域Ｉ又は領域ＩＩＩからのものである、請求項２４の方法。
27. ２７．前記配列が表Ｉに記載のアミノ酸配列の全長である、請求項２４の方法。
28. ２８．アメーバ感染に対して動物を免疫化する方法であって、前記アメーバ上で 見い出される膜結合タンパク質に共通する配列を有する免疫原生ペプチドを導入 し、該免疫原生ペプチドが前記アメーバの感染性に影響する免疫応答を誘発する ことからなる方法。
29. ２９．前記感染が腸外感染である、請求項２８の方法。
30. ３０．前記アメーバがエントアメーバ属からのものである、請求項２８の方法。
31. ３１．前記アメーバがエントアメーバヒストリティカである、請求項２８の方法 。
32. ３２．前記導入が薬学的担体と共に行われる、請求項２８の方法。
33. ３３．前記導入が免疫学的アジュバントと共に行われる、請求項２８の方法。
34. ３４．前記膜結合タンパク質が表Ｉに記載のタンパク質と相同である、請求項２ ８の方法。
35. ３５．前記免疫応答がＩｇＡの産生である、請求項２８の方法。
36. ３６．前記感染性への影響がアメーバ生殖の妨害である、請求項２８の方法。
37. ３７．非変性標的サンプルにおける病原性アメーバの検出方法であって、前記サ ンプル中において病原性アメーバに特徴的なエピトープの存在を検出することか らなる方法。
38. ３８．前記試検サンプルが生検サンプルである、請求項３７の方法。
39. ３９．前記検出が抗体を前記エピトープに結合させることにより行われる、請求 項３７の方法。
40. ４０．前記抗体が表Ｉに開示した配列からのエピトープに結合する、請求項３９ の方法。
41. ４１．前記エピトープが表Ｉの領域Ｉ又はＩＩＩに位置している、請求項３９の 方法。