JPH07500500A - Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂｂ）の病毒力に関連するタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂｂ）の病毒力に　連するタンパ アメリカ合衆国政府は、アメリカ合衆国公衆衛生研究所によって与えられた補助 金Ｎｏ、ＡＩ　２４４２４および補助金Ｎｏ、ＡＩ　２９７３１に従って、本発 明に特定の権利を有することができる。

及ｊ目とｉ屡 主ｊＢλ誌ｊＬ九野 本発明は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂｂ）に関連する抗原 タンパク質、特に、病毒力に関連するポリペプチドをエンコードしている核酸配 列に関するものである。

本発明は、Ｂｂ株の免疫原性ポリペプチドおよびそれと対応する抗体の産生方法 にも関わるものである。本発明の他の実施例は、ライム病を検出する方法とＢｂ 関連核酸から構成される形質転換細胞に関するものである。

ｍ歪旦１１ ライム病は、多臓器系疾患で、感染物質、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒｉ（Ｂｂ）のマダニによる伝染が原因となっている（Ｒａｈｎ　ａｎｄ　Ｍａ ｌａｗｉｓｔａ、　１９９１）。臨床疾患として認められたのは、ここ数十年の ことであるが（Ｓｔｅｅｒｅ　ｅｔａｌ、、１９７７）、ライム病に似た症例報 告は、２０世紀初期に遡る。本疾患の症例は、ヨーロッパ、アジア、化アメリカ において報告されている（Ｓｃｈｍｉｄ、　１９８５）。他の感染疾患と比べ、 総発生率は比較的低いが、重大な心臓血管、神経、および関節系の合併症の可能 性があること、診断と治療が困難であること、一部の地域において有病率が高い ことから、ライム病は、保健衛生上の大きな問題となっている。

Ｂｂ株が１つの均質なグループではなく、遺伝学的に多様で、それによって病毒 力、病原性および免疫原性のパターンに影響を及ぼす可能性があることを示す所 見が次々と得られている。その病毒力の要素、病原性の機序、免疫回避の機序は 不明である。患者治療レベルでは、臨床症状が多様で、鋭敏度と特異性が高い実 用的な標準診断テストが無いため、本疾患の診断は複雑なものとなっている。抗 菌療法は、特に疾患末期では、常に有効とは限らない。

Ｂｂ株間に差異があること、またｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養によって変化する ことから、細菌全体または特異的な関連タンパク質からワクチンまたは免疫診断 薬を開発するのは更に難しい。ＰＣＲ分析により、１組のオリゴヌクレオチドブ ライマーが化アメリカのＢｂ分離菌に特異的であり、更に１組が大部分のヨーロ ッパの分離菌に特異的であること、また３組目が全てのＢｂ株を認識することが 見いだされた（Ｒｏｓａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。

ライム病の診断と検出のための血清学的分析法は、鋭敏で特異的な診断法として 最も有望と考えられている。しかし、血清学的分析法は抗原としてＢｂ株全全体 使用しており、　“シグナル対ノイズ比”が低い。すなわち、陽性検体における 反応性は、陰性検体よりも低い。これは、特に疾患初期において顕著である。こ のため、多くの偽陰性結果が生じ、偽陽性結果が得られることもある。陰性対照 におけるバックグラウンドの反応性は、４１にフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉ ｎ）および６０Ｋ　“共通抗原”等の保存抗原に一部依存しているものと思われ る。これらのＢｂタンパク質は、他の細菌中に認められる類似タンパク質と高い 配列相同性をもつ。従って、正常人に抗フラジェリンおよび抗−６０に抗体が発 現することがしばしばある。従って、血清学的分析には、固有で反応性の高いＢ ｂ抗原が望ましいが、今のところ、その様な抗原は得られていない。

鋭敏度が高く、しかも特異的な単一の診断手段がないため、ライム病の診断は未 だに複雑で不確実である。

臨床徴候と病歴が診断の最も一般的な基盤となって（する。しかし、特異的で鋭 敏度が高く、再現性があり簡単に利用できる確認検査が早急に必要である。直接 検出法は感染を証明できるが、感染期間中典型的に認められる極めて低濃度のＢ ｂ株と、−貫して陽性を示す傾向のある部位（例えば心臓と膀胱）に到達できな しＸため、検査が妨害される。培養法は、鋭敏度は高いが、煩雑で、陽性結果が 得られるまで１〜３週間かかる。

ＰＣＲは、直接検出法（Ｌｅｂｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９９１）の観点から有 望と思われ、事実、Ｇｏｏｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ（１９９１）は、ＰＣＲ法を用 いて、活動性のライム病の患者の尿中にＢｂ　ＤＮＡを検出したことを報告して いる。しかし、ＰＣＲ分析の利用には、ある程度の技術が必要で、ＤＮＡ汚染の リスクが高いため、臨床検査において一般的に使用される様になる可能性は低い 。

ライム病の検出における更に別の問題としては、Ｂｂ株に接触した多数の人々が 、不顕性または無症候性の感染症を発症する点である。この数は、５０％に上る ものと推定されている（Ｓｔｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）。

例えば、ライム病の診断テストを開発するために、Ｂｂｂ異性抗原を作成する方 法が必要であることは明らかである。適切な分析法は存在しておらず、以下の幾 つかの基準を満たすべきである。（１）全ての病原性Ｂｂ株によって抗原が発現 されること。（２）全てのライム病患者において免疫応答が誘発されること。（ ３）感染初期において抗体反応が検出できる、高度な免疫原性を有すること。（ ４）　Ｂｂ株に固有の抗原であり、他の、抗原と交差反応しないこと。（５）病 原性を有する株に接触した人と、病原性を持たないＢｂ株に接触した人を区別す ること。

免匪二ｌ遣 本発明は、Ｂｂｂ異抗原、特に病毒力に関連し、ライム病の検出および診断法の 開発に有用な抗原の作成と利用に関する前述の、あるいは他の問題の１つ以上に 言及するものである。本発明は、その様な抗原の同定と、Ｂｂ抗原またはＢｂｂ 原由来の抗原性を有するポリペプチドをエンコードしているＢｂｂ酸配列の同定 と分離に関わるものである。これらの配列は、組み換え抗原ポリペプチドを産生 ずるために宿主細胞を形質転換する発現ベクターの作成に有用である。これらの 抗原が、特にライム病等のＢ、　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ関連疾患のワクチンま たは免疫診断薬として有用であることも、更に提案されている。

本発明の核酸セグメントは、病毒力を有するＢｂ株に関連する抗原性を有するア ミノ酸配列をエンコードしている。これらの配列が重要なのは、Ｂｂｂ伝子セグ メントの相補的部分と選択的にハイブリッド形成できるからである。予想される 応用法や、標的配列に対するプローブの選択性によって、ハイブリッド形成条件 は多様であることが望ましいであろう。高度な選択性が望ましい場合には、例え ば、比較的塩濃度が低く、および／または高温という様な比較的に緊縮性の条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリッド形成が可能であ る。

この様な条件の下で、プローブと鋳型または標的鎖の間のミスマツチは殆ど認容 されない。例えば、突然変異体を作成したり、突然変異体を検出したい時に、大 きな差異が存在する場合には、緊縮性の程度の低い条件を採用することができる 。

臨床診断の実施例において、病原性を有する細菌ＤＮＡとのハイブリッド形成を 定量するために、標識等の適切な手段と組み合わせて、本発明の核酸セグメント を利用することができる。典型的な検出方法は、例えば、直接的、間接的に検出 可能な放射性物質、酵素活性またはアビジン／ビオチンの様な他のマーカーリガ ンドを利用することができる。より望ましい診断法の実施例では、環境に悪影響 をもたらすと思われる放射性物質や他の試薬よりも、寧ろアルカリホスファター ゼやペルオキシダーゼの様な酵素標識の使用が望まれるであろう。例えば、酵素 標識は、多くは可視波長範囲において分光光度計で簡単に検出できる比色定量指 示基質を通常利用している。鋭敏度を増大させるために、発光基質も利用できる 。

ハイブリッド形成可能なりＮＡ上セグメントは、明らかにされた多くのＤＮＡセ グメント全てが含まれる。例えば、約１２個の塩基対を含む比較的短いセグメン トを使用することができる。あるいはプローブが目的の場合、目的とする個々の 応用例によるか、２０．３０、または４０個の塩基対程度の長いセグメントが望 ましい。ＰＣＲの様な応用例におけるプライマーとしては、短いセグメントが望 ましいが、プロットハイブリッド形成には、一般に長いセグメントが望ましい。

しかし、本発明のＤＮＡセグメントに関して明らかにされた配列は、ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２　（例えば、セグメント１５２から１８８）によって規定されてお り、突然変異体や変株に認められる様に、ある程度の変異や塩基の置換は予測さ れるが、これはハイブリッド形成の特徴に大きな影響は与えない。自然発生等に より生ずる塩基修飾を含むこの様な変異を、本発明の範囲に含めるものとする。

抗原産生に関する実施例において、Ｂｂ抗原のアミノ酸配列に由来する抗原ポリ ペプチドをエンコードしているＤＮＡセグメントが明らかにされている。この様 な応用例に特に望ましいのは、３０ｋＤａ　Ｂｂ抗原である。しかし、３５ｋＤ ａ　、　２４ｋＤａ　、　２０ｋＤａ等の抗原を含む他の様々なりｂ特異抗原が 同定され、ここに明らかにされている方法を用いて得られることが提案されてい る。今まで、３０ｋＤａの様に、病毒力に固有の関連性を持つと思われる抗原タ ンパク質は分離、精製されておらず、特徴も明らかにされていない。本発明によ って、例えば有用な分量の３０ｋＤａのタンパク質とその抗原決定基を得るため の組み換え技術が得られた。継代回数の少ない、病毒力を有するＢｂ株に関連す る３０ｋＤａの様な抗原の同定と選択が本発明によって可能となり、それによっ て、病毒力を有するＢｂ株の選択的検出法が現在可能となったことは、特に注目 すべきである。

３０ｋＤａ　Ｂｂ抗原は、特異的なアミノ酸配列の見地から明らかにされたが、 アミノ酸配列は分離株毎に異なることが見いだされるものと思われる。更に、例 えば、ＤＮＡによるコード配列の特定部位の突然変異誘発によって、その抗原能 力を打ち消さない様な方法で、基礎となるアミノ酸配列を変化させることが可能 であることは極めて明白である。

本発明は、Ｂｂに感染した場合に、ｉｎ　ｖｉｖｏで免疫応答を発現できる少な くとも部分精製された抗原Ｂｂタンパク質またはポリペプチドにも関係している 。これらのタンパク質はここに明らかにされたＤＮＡによってエンコードされた アミノ酸配列の全てまたは一部から構成されている。特に望ましい抗原タンパク 質は、図１に示されるＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する。このタ ンパク質は、その抗原決定基と同様に、ワクチン開発との関連性において、また 血清、精液および膣分泌液、尿、唾液、滲出液等の体液中のＢｂ抗体を検出する イムノアッセイにおける抗原として有用である。

他の面では、本発明はプラスミド、ファージ、ビールス等の組み換えベクターに 関係している。これらは、本発明によるＤＮＡセグメントから構成されており、 その様な配列を複製するために使用したり３、あるいはエンコードされた抗原ペ プチドまたはタンパク質を発現するためにも使用される。ベクターまたはプラス ミドは、選択された宿主細胞を形質転換するために使用することができる。細胞 を形質転換するたの適切なベクターを作成する場合、ゲノムフラグメント、ｃＤ ＮＡ、合成りＮＡ等の所望のＤＮＡセグメントは、幾つかのＢｂ株供給源のいず れからでも入手でき、利用することができる。実際に本発明において、発現ベク ターは、図２に示される様に、明らかにされた３０ｋＤａ抗原の１つ以上の抗原 決定基をエンコードしているＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：２のＤＮＡ配列の少なくとも 一部を組み込むことができる。

発現ベクターは、上記に明らかにされたＤＮＡセグメントのいずれかを組み込ん で作成できる。その様なりＮＡは、病毒力を有するＢｂ株に特異的な抗原タンパ ク質、あるいは試料中のＢｂ核酸を検出するためのハイブリッド形成プローブも エンコードしていることもある。目的とする抗原タンパク質によって異なるが、 長いＤＮＡセグメントでも短いＤＮＡセグメントでも使用できる。

明らかにされたＤＮＡによって発現された、あるいはエンコードされた３０ｋＤ ａタンパク質の抗原決定基領域には、比較的短いＤＮＡセグメントが含められて いるものと思われる。多様な発現ベクターは、例えば、異種遺伝子生成物および ／または形質転換細胞の同定に有用と思われる抗生物質耐性遺伝子の様な耐性遺 伝子の同定に有用なレポーター遺伝子生成物をエンコードしているＤＮＡセグメ ントを含み得る。

記述された様な組み換えベクターは、細菌の宿主細胞の形質転換のために特に好 ましい。従って、形質転換された細菌の宿主細胞を作成するための方法が明らか にされている。その方法には、一般に、適切な細菌の宿主細胞を選択し、目的の ＤＮＡセグメントを含むベクターを作成し、選択された細菌の宿主細胞を形質転 換するというステップが含まれる。ＢｂＳＥ、Ｃｏ１１　（大腸菌）、Ｂ、５ｕ ｂｔｉｌｕｓ　（枯草菌）等の数種類の細菌の宿主細胞と原核細胞を使用するこ とができる。

形質転換された細胞は、鑑別ハイブリッド形成によるスクリーニング、融合レポ ーター遺伝子生成物の同定、耐性マーカー、抗抗原抗体等の様々な方法を用いて 選択することができる。適切なりローンを同定後、例えば、発現に有利な条件、 あるいはＤＮＡが必要な場合には複製の条件という様に、状態に適した条件下で それを選択し、培養することができる。

本発明の別な点は、明らかにされたＤＮＡによってエンコードされた３０ｋＤａ の抗原タンパク質またはそのタンパク質の抗原決定基領域から抗体とワクチンを 作成することに関するものである。従って、本発明は、３０ｋＤａのＢｂタンパ ク質またはその抗原決定基に反応して産生され得る１つ以上の抗体、モノクロー ナルまたはポリクローナルに関するものである。この３０ｋＤａタンパク質とそ の抗原決定基に対する抗体反応の鋭敏度と特異性は、病毒力のない他のＢｂ抗原 から得られた抗体反応よりも優れている。病毒力のある菌株と病毒力の無い菌株 の両者から分離された幾つかのＢｂ抗原を用いた過去の研究では、特に感染初期 において、免疫蛍光法とＥＬＩＳＡ分析を行うと、低い鋭敏度を示している。

免疫診断法とワクチン作成の両者において、既知の免疫原性を有するタンパク質 またはポリペプチドのセグメントから抗原を作成することは、通常可能であり、 事実、より実際的な方法である。特定の抗原決定領域を使用して、抗原ポリペプ チド全体によって産生される反応と類似の反応を生じさせることが可能である。

抗原性または免疫原性を潜在的に有する領域は、多くの方法のいずれによっても 同定することができる。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−ＷｏｌｆまたはＫｙｔｅ−Ｄ ｏｏｌｉｔｔｌｅ抗原性分析またはＨｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ（１９８１） 疎水性分析等がある（Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　１９８２、ま たは米国特許第４，５５４，１０１号を参照）。疎水性分析では、それぞれのア ミノ酸残基に親水性の平均値を割り当て、これらの値から親水性の平均値を計算 し、親水性が最大となる領域を決定することができる。これらの方法の１つ以上 を使用して、抗原性があると予想される領域を、例えば３０ｋＤａポリペプチド のアミノ酸配列からめることができる。

３０ｋＤａ抗原の提案されている抗原決定領域には、６４−８７．１０６−１１ ４．２３−５４．１２８−１３３．１５２−１８８．２０８−２２６の位置に対 応する配列が含まれる。

本発明の抗原と免疫原は、Ｂｂに対する抗体を検出するための１つ以上の分析の 基礎を提供するのに有用である。過去の分析は、抗原としてＢｂ全全体使用して いた。Ｂｂに接触していない正常人の血清が、Ｂｂ抗原、特に他の細菌と共通の 抗原決定基を持つ抗原と反応する抗体を含んでいることがしばしばある。正常血 清においてこれらの交差反応する抗体によって偽陽性反応が起こるのを予防する ために、分析条件または反応の診断閾値を調節しなくてはならない。この様な調 節を行うと、分析の鋭敏度を低下させ、特にＢｂ感染初期において偽陰性反応を 引き起こす可能性がある。明らかにされた３０ｋＤａタンパク質またはその抗原 ポリペプチドを使用する分析法は、間接的なＥＬＩＳＡまたは抗体捕捉ＥＬＩＳ Ａ法においてＢｂ全全体あるいは、精製されたフラジェリンを使用する分析より も、鋭敏度と選択性の両者において優れた結果をもたらすものと期待される。

この様な抗原（Ｂｂ全全体フラジェリン、その他）との反応に基づくウェスタン イムノプロット分析は、Ｂｂに接触していないヒトの血清中に抗体が存在するた め、解釈が困難であった。これらの抗体は、Ｂｂ抗原、特に４１ｋＤａフラジエ リンと６０ｋＤａ共通抗原タンパク質と交差反応する。一般に、細菌全体または 精製フラジェリンを使用する分析には、他の細菌抗原と交差反応する抗原決定基 を持つ抗原が含まれる傾向がある。例えば、ＢｂのフラジェリンのＮおよびＣ末 端領域は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌） とＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）の配列と同じ配列を５２〜５ ５％含んでいる（Ｗａｌｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）。フラジェリン構 造の性質が高度に保存されているのがその良い例である。６０ｋ　ＤａＢｂタン パク質は、同様にＥ、ｃｏｌｉ（大腸菌）タンパク質と５８％が同じである（Ｓ ｈａｎａｆｅｌｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９９１）。この様な交差反応性が、３０ｋ Ｄａ抗原では無い様に思われ、これはＢｂ固有の抗原と思われる。

更に、組み換えによって得られた３０ｋＤａ　Ｂｂタンパク質は、Ｂｂ感染の検 出に特に望ましいものと予測される。

Ｂｂに接触していないヒトは、３０ｋＤａタンパク質の１つ以上の抗原決定基に 対する反応性が低いはずなので、これによって希釈度の低い血清を使用し、鋭敏 度を上げることが可能となる。これらのユニークな抗原を１つ以上組み合わせて 使用することによって、特異性を犠牲にせずに、鋭敏度を増強することもできる 。

望ましいイムノアッセイには、本技術において公知の様々な種類の酵素結合イム ノアッセイ（ＥＬＩＳＡＳ）、イムノプロット法等が含まれるものと考えられる 。しかし、その様な分析法だけでなく、有用な実施態様には、ＲＩＡおよびその 他の非酵素結合抗体結合分析または手技等も含まれることは明白である。

本発明の更に別の面は、試料中のＢｂ核酸の検出法に関するものである。試料中 のＢｂ核酸の存在は、それがエンコードしているポリペプチド生成物の存在によ って示される。従って、方法は、ここに明らかにされたポリペプチドのいずれか の少なくとも一部の存在を検出することが含まれる。適切な検出法には、例えば 免疫検出試薬、ＰＣＲ増幅、ハイブリッド形成等がある。

本発明の更に別の面は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２の明らかにされたＤＮＡの増幅 を開始することが可能な１つ以上のプライマーに関するものである。この様なプ ライマーは、明らかにされたＤＮＡ　、　またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＤＮ Ａセグメントの塩基配列を考慮に入れるか、あるいは、ＤＮＡによってエンコー ドされている精製ポリペプチドのアミノ酸配列から塩基配列をめることによって 、簡単に生成される。プライマーは、ハイブリッド形成プローブと類似している が、一般に比較的短いＤＮＡセグメントであり、通常約７〜２０個のヌクレオチ ドである。

ライム病の診断方法も、本発明に含まれる。１つの実施態様として、抗体に基づ く方法は以下の通りである。ライム病が疑われる患者の試料を入手し、その試料 を、明らかにされたＤＮＡによってエンコードされているＢｂタンパク質の１つ 以上の抗原決定基に接触させ、最後に、試料中に存在していると思われるＢｂタ ンパク質の１つ以上の抗原決定基と抗体との反応性を定量する。測定された反応 は、ライム病の存在を示している。

患者から入手できる典型的な試料は、ヒト血清、血漿、全血、脳を髄液、精液ま たは膣分泌液、滲出液等である。

抗体に基づく方法の幾つかの変法の開発が考えられている。例えば、３０にタン パク質またはその他のＢｂタンパク質を抗原として使用する間接ＥＬＩＳＡの様 な方法である。３０にタンパク質は、既に明らかにされ、精製された組み換えＤ ＮＡベクターによって大量に産生できる。抗原の最適濃度は、３０ｋＤａタンパ ク質分析法のチェッカーボード滴定と診断能によって決定することができる。こ の分析法は、感染段階が異なるマウスと、異なるＢｂ株によって感染したマウス の血清を検査することによって、更に検討される。これらの結果によって１　各 分析法の血清変化（ｓｅｒａ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に関する相対的時間経過 が示され、異なる菌株による感染が原因となって抗３０ｋＤａタンパク質抗体の 力価に変化を生ずるかどうかも示されるであろう。

同様に、３０ｋＤａポリペプチドの反応性を有する抗原決定基は、ＥＬＩＳＡ分 析における抗原として、あるいはウェル（ｗｅｌｌ）に結合した無傷の３０ｋＤ ａタンパク質に対する抗体の反応を抑制する点で有用と考えられる。抗原決定基 のペプチドは、以前に明らかにされた組み換えＤＮＡ技術によって、あるいは個 々のアミノ酸からのペプチド合成によって、産生ずることができる。いずれの場 合でも、特定のペプチドとの反応は、より多くの抗原決定基に対する抗体の存在 を示している。診断能に加えて、この方法は、３０ｋＤａタンパク質とその他の 病毒力に関連するタンパク質に対するモノクローナル抗体の特徴を明らかにする のに、特に有用であると考えられる。

本発明は、明らかにされたＤＮＡによってエンコードされている抗原タンパク質 の１つ以上の抗原決定基に対するモノクローナル抗体にも関わるものである。望 ましい実施態様において、この様な抗体は、他の細菌に認められる抗原と交差反 応しない。３０ｋＤａタンパク質とその他の病毒力に関係するタンパク質に対す るモノクローナル抗体は、産生、スクリーニングが可能なハイブリドーマを使用 して産生される。Ｂｂまたは組み換えＤＮＡベクターによって産生され、２次元 電気泳動またはその他の方法によって精製されるタンパク質は、ＢＡＬＢ／Ｃマ ウスの様な動物モデルの免疫感作に使用できる。反応性を有するクローンの選択 は、抗原として免疫感作タンパク質を使用する典型的なＥＬＩＳＡ分析法によっ て実施される。ウェスタンイムノプロットも、スクリーニングまたは確認分析に 使用できる。

この様なモノクローナル抗体は、以下の幾っがの点で有用と予想される。（１） 免疫蛍光法、組織切片のイムノペルオキシダーゼ染色の様な酵素免疫反応、アビ ジン−ビオチン指示薬酵素免疫分析、またはその他の技術による組織または体液 中のＢｂ株の検出、（２）　Ｂｂ株とクローンおよびＥ、Ｃｏ１１組み換え体の タンパク質の発現に関する迅速スクリーニング、（３）免疫電子顕微鏡によるタ ンパク質の構造的配置の決定、（４）ペプチドライブラリを用いる反応性抗原決 定基の同定、（５）補体と組み合わせたｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける殺菌作用の証 明とタンパク質欠失突然変異株の選択、（６）受動免疫感作による免疫防御作用 の評価、（７）付着または透通の阻止や、食細胞による増強または呑食および殺 傷による宿主細胞の相互作用の研究への使用、（８）疫学的研究、特に、タンパ ク質とタンパク質配列の発現におけるＢｂ株の多様性に関する研究に利用できる 可能性がある。

さらに別の面で、本発明は、Ｂｂ抗原検出キットに関わるものである。キットに は、抗原タンパク質３０ｋＤａ　。

またはその抗原決定基を含むタンパク質またはペプチドのいずれかと反応する抗 体と、抗体とそれに対する抗原の特異的免疫反応を検出する手段とが含まれる。

適切な手段の例として、抗原または抗体に直接付着させた標識、ヒトＩｇに対し 特異性を有する二次抗体、またはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ等がある。あ るいは、アビジン−ビオチンによって仲介される５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕｓ 　ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）結合も使用できる。

例えば、モノクローナル抗体は、酵素または蛍光化合物と複合体を形成したアビ ジンと反応する様に、ビオチン化することができる。

本発明の特定のキットの実施態様は、記述されたＢｂの３０ｋＤａ抗原、アミノ 酸配列の一部によって示されるその抗原決定基、または継代回数の少ない病毒力 を有するＢｂ株と継代回数の多い無毒性のＢｂ株との比較によって検出された他 の病毒力に関係するタンパク質に関連する抗原決定基の様な、非常に密接な関係 を有するタンパク質またはペプチドに対する抗体の検出に関わるものである。キ ット用の抗原は、Ｂｂの３０ｋＤａタンパク質、または、Ｅ、Ｃｏ１１または別 の細菌または細菌ウェスタンプロット分析以外の宿主中の組み換えＤＮＡベクタ ーによって産生されるその一部から構成される。あるいは、抗原は、Ｂｂ株から 直接、あるいは合成ペプチドとして精製することができる。分析用試料としては 、ヒトまたは動物の体液または他の組織試料を用い得る。

試料中の反応性抗体の存在は、抗原に結合している抗体を、下記の数多くの方法 で抗原複合体を検出することによって証明することができる。方法には、ＥＬＩ ＳＡ。

ＲＩＡ、蛍光法、凝集または沈降反応、比濁分析、アビジン−ビオチン反応を使 用するこれらの分析の全て等がある。反応性の程度は、対照試料との比較によっ て評価でき、反応性の程度は、現在または過去のＢｂ感染の基準として使用され る。分析法は、ライム病の経過中の反応性のモニターにも使用できる。例えば、 治療効果の評価に使用できる。

更に別の実施態様において、本発明は、試料中のＢｂ核酸検出キットに関するも のである。この場合キットには、３０ｋＤａの遺伝子に特異的な１つ以上の核酸 プローブと、その様なプローブとＢｂの核酸間の特異的な連合標識のようなハイ ブリッド形成を検出する手段が合図１は、継代回数の多いＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｒｉ　８３１株と継代回数の少ないＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　８３１株の 、−次方向でＮＥＰＨＧＥを使用する二次元ゲル電気泳動である。継代回数の多 い株において認められないか、発現が低いポリペプチドは、Ｍｒ（Ｘ１０３）に よって示される。これらには、４１が３０，０００　（図中３０．５と表示され ている）、３５゜０００．２４．０００．２０，０００のポリペプチドが含まれ る。フラジェリン、０ｓｐＡと０ｓｐＢのスポットも表示されている。

染色は銀染色である。

図２は、二次元ゲル電気泳動によって分離され、引き続きモノクローナル抗体と 特異的な抗血清を用いるイムノペルオキシダーゼ染色によって明らかにされた主 なり、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのポリペプチドの免疫反応性を示している。上記 に示される二次元ゲル電気泳動のゲルは、ＰＶＤＦ膜に移され、モノクローナル 抗体Ｈ６Ｂ　（ＯｓｐＢに特異的）、Ｈ５３３２（ＯｓｐＡ）　、Ｈ９７２４（ ４１にフラジェリン）、抗−２４にウサギ抗血清により染色された。８６８は、 継代性の低い株において２０にポリペプチドとも反応し、抗−２４に抗血清は基 本的な３５にスポットも認識した。３５にと２０にのスポットは、継代回数の多 い株においては認められないか、発現性が低かった。

図３は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの継代回数の少ない株の３ ０ｋＤａタンパク質の推定されたアミノ酸配列を示している。

図４は、Ｂｂ　８３１株のＤＮＡとＲＮＡのサザンおよびノーザンプロット分析 を示している。図４Ａは、３０ｋＤａタンパク質（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に 特異的なオリゴヌクレオチドによってプローブされた８３１株の継代回数の多い 分離株と継代回数の少ない分離株のＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ［による消化物のサザ ンプロット分析を示している。図４Ｂは、３０ｋＤａタンパク質に特異的なオリ ゴヌクレオチドによってプローブされた８３１株の継代回数の多い分離株と継代 回数の少ない分離株のＲＮＡ全体のノーザンプロット分析を示している。

図５は、３０ｋＤａ　Ｂｂタンパク質のＤＮＡと、推定されるアミノ酸配列の組 み合わせを示しており、推定される転写シグナル、臭化シアノジエンフラグメン トのアミノ酸配列（アンダーラインが付されている。）に対応する配列を含み、 オープンリーディングフレームを示している。

図６は、クローン化された３０Ｋ　ＤＮＡセグメントの制限マツプを示している 。Ｌｐａ３０は、３０に遺伝子（Ｂｂの３０　ｋＤａポリペプチドをエンコード している遺伝子）の位置と方向を示している。左端の２つのＨｉｎｄＩ［［切断 部位間の領域は、最初のクローン、Ｔｂ０８７を表している。

３０に配列の残りを得るためにクローンされた第二の領域は、２つのＰｓｔｌ切 断部位の間にある。制限エンドヌクレアーゼに使用された略語は、次の通りであ る。

Ｈｉ＝ＨｉｎｄｎＩ　；　Ｄ＝Ｄｒａｌ　；　Ｐ＝ＰｓｔＩ　；　Ｈａ＝Ｈａｅ ｍ　；　Ｒ＝ＲｓａＩ。

図７は、３０ｋＤａ　Ｂｂポリペプチドに関する様々な測定結果を示す幾つかの 図の合成図を示している。分析は、３０ｋＤａポリペプチドの２２７のアミノ酸 配列について実施された。

図８は、３０ｋＤａ　ＢｂポリペプチドのＣｈｏｕ７Ｆａｓｍａｎ親水性／疎水 性予想分析を示している。楕円形は、親水性が１．３以上と予想される領域を表 し、菱形は疎水性が１゜３以上と予想される領域を表している。

図９は、３０ｋＤａ　ＢｂポリペプチドのＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ抗原指標を表 す図を示している。楕円形は、抗原指標が１゜２以上を表している。

図１０は、３０ｋＤａ　ＢｂポリペプチドのＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ表面子想分 析を表す図を示している。楕円形は、予想表面確率が５，０以上を表している。

望ましい実施　の−細な説■ 本発明は、Ｂｂに関係する抗原タンパク質を、ライム病の診断あるいは予防手段 として利用することに関するものである。タンパク質は、Ｂｂの病毒力を有する 分離株にのみ関係があるものとして同定され、増幅手技に基づくテストの様な、 免疫診断と核酸の同定を含むライム病の数種類の診断テストの基礎となった。

本発明のＤＮＡは、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　（今後、Ｂｂ と呼ぶ）から分離された。この微生物は、直径約０．２ミクロン、長さ約１０〜 ３０ミクロンのらせん形の細菌である。他のスピロヘータと同様に、内膜、薄い ペプチドグリカン層、外膜、内膜と外膜の間の周辺細胞質フラジェリンを有する 。Ｂｂは、感染動物と媒介動物である節足動物だけに認められる偏性寄生生物で ある。Ｂｂに似た細菌が、鳥にも確認されており、鳥も動物貯蔵庫の役割を果た している可能性がある。Ｂｂ分離株の一部はクローン化されているが、多くの分 離菌はクローン化されておらず、殆どが培養開始時点でさえも異なる変異株の混 合物を呈することが多い。

Ｂｂは、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの様な他の回帰熱菌と類似している。

Ｂｂは、単一染色体を有し、これは線状立体構造と小さなサイズ（約９００キロ ベースペア）という２つの珍しい特徴を備えている。新鮮なりｂ分離菌には、４ 本までの線状プラスミドと６つまでの環状超らせんプラスミドが含まれている。

プラスミドの内容ｒｔ、ｎｂの種類によって大きく異なる。例えば、ある研究に おいては、プラスミドに類似性が認められたのは、１３株中２株だけであった。

プラスミドの一部は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養中に失われ、これは病毒力の 喪失と相関しているものと思われる。外面タンパク質０ｓｐＡと０ｓｐＢは、４ ９ｋｂｐ線状プラスミドにエンコードされている。発明者等によって発見された ３０にの病毒力に関係するタンパク質は、３８ｋｂｐプラスミドにエンコードさ れている。一般に、Ｂｂプラスミドの機能は不明である。

Ｂｂ株間の変異性は高度で、特にＢｂ分離株間では高く、培養が実施されたｉｎ 　ｖｉｔｒｏの継代回数に依存している。

一般に、Ｂｂ株間に発生する変異性には、２種類ある。

すなわち、（１）新鮮Ｂｂ分離株が有する本来の不均質性、（２）　ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの培養を原因とする人工的な変化、である。本来の不均質性の観点から、 現在、染色体のＤＮＡ配列に基づき少なくとも２種類のＢｂ株集団が存在するこ とを示す所見がある。これらのＤＮＡ配列に対するプライマーによって、ＤＮＡ には大きく分けて２種類あることが示されている。１つは北アメリカＢｂ分離株 に特異的なりＮＡであり、もう１つは多くのヨーロッパ分離株に特異的なりＮＡ である。更に、全てのＢｂ株を認識するプライマーが見つかっている。あらゆる 地域から得られた菌株間には、プラスミドの内容の観点から、またタンパク質の 様相の観点から、特にヨーロッパ分離株の０ｓｐＡと０ｓｐＢのタンパク質の分 子量の観点から、大きな変異性が認められる。

Ｂｂ株のｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養によって、プラスミドの喪失と、同時に動 物宿主における感染力と病毒力の喪失が生じる。典型的には、これらの変化は、 ｉｎ　ｖｉｔｒ。

の最初の１０〜１７回目以内に発生する。Ｂｂ株が“非選択的な”　ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの環境に導入されると、直ちに感染力を持たないクローンの変異株の発生 が始まり、最終的に培養株の病毒力が喪失するのは、これらの変異株が増殖した ことによるものと思われる。

ここに使用されている様に、Ｂｂ分離株は、　“継代回数の少ない株“あるいは “継代回数の多い株”と呼ばれている。Ｂｂ培養株を培養試験管内で増殖させ、 様々な回数の継代培養を行なった。一般に継代回数の少ない分離株は、１０回未 満の継代培養を行ない、継代回数の多い分離株は、しばしば１００回までの継代 培養が行われた。

３０ｋＤａタンパク質は、継代回数の少ない病毒力を有するＢｂ株において同定 されたが、同質遺伝子の継代回数の多い無毒性の株においては認められないが、 発現の程度が低い。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養においてＢｂ株が不安定であること から、それぞれの分離株について、継代回数の少ない（１０回未満）株が利用で き、その株の病毒力が証明できたことは重要であった。Ｂｂ感染症に高度に罹患 し易いことが知られている３週令のマウスの背中に１０４個の細菌を接種するこ とによって、病毒力が確認された。このプロトコルを使用して、継代回数の少な い病毒力を有するＢｂ株が、無毒性の、継代回数の多い株に認められない主要な タンパク質を発現することが明らかにされた。

Ｂｂタンパク質の検出には、二次元ゲル電気泳動の変法を用いた。ゲル上の最初 の一方向の分離時間を、通常の等電点電気泳動では１６時間であるのに対し約４ 時間と比較的短くしたため、タンパク質の移動は平衡状態に達しなかった。それ によって、特に塩基性タンパク質を集中させ、分解させることが可能となった。

第二の方向への分離には、ポリアクリルアミド勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用した 。ゲル上に可溶化したＢｂタンパク質と共に分子量マーカーの泳動を行って、分 子量を推定した。この方法によって、継代回数の少ない病毒力を有するＢｂ株に 特有の幾つかのポリペプチドの同定が可能となった。その様なポリペプチドには 、主要なタンパク質、酸性の３０にのタンパク質と２０にのポリペプチドが含ま れる。少なくともそれ以外に１つのポリペプチド、３５ｋＤａタンパク質は、継 代性の高いＢｂ株には存在しない様に見えることから、病毒力または感染力との 関係が考えられる。

ここに使用されている様に、分子量の近似値によって同定されるポリペプチドを エンコードしているＤＮＡセグメントは、対応する数と“Ｋ”という文字で表さ れる。従って、ここに使用されている様に、３０には、３゜ｋＤａのポリペプチ ドをエンコードしている遺伝子を表している。別の名称もここに使用されている 。３０に遺伝子は１ｐａ３０である。

３０ｋＤａタンパク質をエンコードしているＤＮＡセグメントを同定するために 、予備的二次元ゲル電気泳動によって、継代回数が少なく毒性のＢｂ株がら精製 されたタンパク質を分離し、引き続きアミノ酸配列決定に使用した。初期の研究 により、Ｎ−末端がブロックされていることが示された。臭化シアンによる切断 、得られたペプチドフラグメントの電気泳動による分離、およびペプチドのポリ ビニレン拡散膜への移送の後、標準配列決定法を用いて、配列分析を行った（Ｍ ａｔｓｕｄａｉｒａ、１９ｇ？）。２つのペプチドフラグメントは、配列がオー バーラツプしていた。１６個のアミノ酸配列が同定された（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１）。アミノ酸配列のコドンは、以下に基づく逆翻訳によって選択された。す なわち、（１）ＡまたはＴを含むコドンが優勢であるという結論、（２）幾つか のＢｂタンパク質について報告されているＤＮＡ配列に関する知識、である。Ａ またはＴを含むコドンを優先的に選択したのは、ＢｂのＧ＋Ｃの含有量が僅が２ ８〜３５％に過ぎないという観察結果に基づいている。３３個のヌクレオチドセ グメントが合成され、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に含まれる構造を有していた。

ＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴ　ＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴ　ＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧ　ＴＧＣ ３３個の残基を持つオリゴヌクレオチドプローブを、継代回数の少ない病毒力を 有するＢｂ株がら分離された３゜ｋＤａタンパク質をエンコードしているＤＮＡ を同定するプローブとして使用した。Ｂｂ　８３１株の継代回数の少ない培養株 から得られた細菌細胞を沈殿させ、フェノール／クロロホルムで溶解、抽出した 。Ｈｉｎｄｍによる消化と寒天ゲル上で大きさによる分別を行った後、０．５ｋ ｂのバンドを取り出し、別のゲルに移し、電気溶出を行った。ＤＮＡは、ｐＵｃ １９に組み入れられ、ライブラリが作成された。クローンが分離され、寒天ゲル 上でサザンプロットが行われ、放射能標識されたオリゴヌクレオチドプローブと ハイブリッド形成させた。検討された８７番目のクローンにおいてハイブリッド が形成された。

オリゴヌクレオチドプローブは、寒天ゲル電気泳動によって分離された１、Ｏｋ ｂ　ＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成した。１．０ｋｂ　ＤＮＡが分離さ れた単一のクローンには、９５０　ｂｐの挿入断片を持つプラスミドが含まれ、 作成されたオリゴヌクレオチドプローブは、挿入断片中の５００〜６００　ｂｐ のＰｓｔ　Ｉフラグメントと結合することによって、このプラスミドと結合した 。ＤＮＡ配列が決定され、推定されたアミノ酸配列が同定された。

推定されたアミノ酸配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示されている。

ヌクレオチドプローブを使用して、異なる地域の継代回数の少ないＢｂ分離株に ３０に遺伝子が存在し、発現するかどうかを明らかにした。プローブは、ＨＢ１ ９　（コネチカット）、ｐＫａ　Ｉ　（ミュンヘン、ドイツ）、Ｇ２５（スウェ ーデン）から得られた継代回数の少ない株からの、明らかな大きさをもつプラス ミドとハイブリッド形成した。従って、３０に遺伝子が、遠く離れた地域の株に 存在していることが明らかとなった。

Ｂｂ　Ｈ８１９株からもゲノムライブラリが作成された。ゲノムライブラリの作 成は、他のＢｂ株についても簡単に実施でき、８３１株から分離された３０ｋＤ ａタンパク質と類似、あるいは同一のタンパク質をエンコードしているＤＮＡを 分離するためのクローン作成に有用である。

例えば、病毒力に関係するタンパク質をエンコードしていると疑われるＤＮＡを 遺伝的に移すことができる。

すなわち、特定のタンパク質を発現することが証明されているプラスミドを介し て、ＤＮＡをＢｂの中に移すことができる。多様なりローンを用いて病毒力を証 明することは、タンパク質とプラスミドと病毒力の因果関係を示す証拠となる。

病毒力の検査は、通常１群３〜４匹のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス群に約１０６個の細 菌を接種して行った。それから、マウスの関節の浮腫を観察し、３週後に失血さ せ、屠殺した。関節炎の発生、セロコンバージョン、および心臓、膀胱、その他 の臓器からの陽性の培養物が、病毒力を証明した。このマウスモデルが現在最も 適切なライム病の動物モデルであると思われる（Ｂａｒｔｈｏｌｄ　ａｔａｌ、 　、　１９９０）。皮内感染を確立するためには僅かな細菌（約２０個）しか必 要とせず、マウスは、慢性の全身性スピロヘータ症と、共通の関節炎発症性と心 臓炎を示した。ラット、ハムスター、ウサギ等の他の動物モデルは、感染のため には高い投与量が必要で、比較的弱い病態を呈する（Ｍｏｏｄｙ　ｅｔ　ａｌ、 、１９９０）。感染させるために、免疫低下状態（新生児感染、ガンマ線照射） が必要な場合がある。更に、マウスモデルが、受動免疫と能動免疫の両者を証明 するために利用できることが明らかにされている（Ｆｉｒｋｉｇ　ｅｔ　ａｌ、 、１９９０）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、抗−〇ｓｐＡモノクローナル抗体と抗 −Ｎ４０抗血清を注射するか、組み換え０ｓｐＡタンパク質により免疫感作する ことによって、Ｂｂ　Ｎ４０株による感染から防御することができる（Ｆｉｒｋ ｉｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）。

３０にタンパク質の抗原性を決定した。該タンパク質を注射されたウサギから採 取した抗血清は、継代回数の少ないＢｂ　８３１株の二次元ゲル電気泳動イムノ プロットにおいて検出された様に、３０にタンパク質と反応することが明らかに された。正常のウサギ血清においては、反応性スポットは検出されなかった。こ の結果は、３０にポリペプチドおよび他の病毒力に関係して存在しうるタンパク 質と反応するモノクローナル抗体が産生されているという考え方に直ちに結びつ く。抗体は、マウスにおいて産生ずることができ、産生された抗体は、タンパク 質発現に関する菌株をスクリーニングし、構造的位置を決定し、これらのタンパ ク質に対する抗体の殺菌作用を検討するために使用することができた。

３０にタンパク質またはその抗原決定基の全て、タンパク質をエンコードしてい る対応するＤＮＡ　、機能的に類似のタンパク質とその抗原決定基を使用するこ とによって、あるいは適切なｍ　ＲＮＡを検出することによって、ライム病の分 析法が幾つか開発できるものと予測される。間接ＥＬＩＳＡ分析が、具体例９に 明らかにされ、３０ｋＤａタンパク質、または２０にタンパク質の様な他の抗原 Ｂｂタンパク質と共に使用することができた。これらの方法は、原則として、過 去に報告された方法と類似している（Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ８，１ ９８９；　Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ　ｅｔａｌ、、１９８４；およびＣｒａｆｔ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８４）　、　３０ｋＤａタンパク質配列の部分を表す反応性 抗原決定基を、類似の方法で利用することができた。

別の有望な分析法は、マイクロカプセル凝集法（ＭＣＡＴ）（Ａｒｉｍｉｔｓｕ 　ｅｔ　ａｌ、、１９９１）である。この方法では、顕微鏡レベルの大きさのポ リスチレンビーズにＢｂ抗原をコーティングし、患者の血清希釈液と共にインキ ュベートする。４℃で一晩インキュベート後、凝集パターンを測定する。抗原と してＢｂ全全体使用し、ＭＣＡＴがライム病患者と健康人を高度に区別すること が明らかにされた。慢性関節リューマチの患者（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、。

１９８８、およびＣｅｎｔｅｒｓ　Ｄｉｓ、　Ｃｏｎｔｒｏｌ、１９８８）とレ プトスピラ症の試料において（Ｂａｒｂｏｕｒ、　１９８８；およびＣｅｎｔｅ ｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、１９８９）偽陽性反応が得ら れたが、凝集力価のオーバーラツプは殆どなかった。３０ｋＤａタンパク質のみ 、あるいは９４Ｋ　、　３０Ｋ　、　２１に抗原等の他の抗原と組み合わせて３ ０ｋＤａタンパク質を使用する分析が実現可能なはずである。この様な組み合わ せによって、分析の鋭敏度が高まる可能性がある。

本発明によって、病毒力を有するＢｂ株だけに関係していると思われる抗原タン パク質をエンコードしているＤＮＡセグメントが明らかにされた。その様なりＮ Ａまたはその様々な部分の検出は、有用な分析法の基礎となるものと考えられる 。３０ｋＤａ抗原の遺伝子を検出する１つの方法は、遺伝子の既知の部分の選択 的増幅に基づいている。ある方法では、図２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の核酸配 列の知識に基づいて作成できる多くのプライマーのいずれかを使用して、ＰＣＲ 増幅を利用している。

一般に、この様なプライマーは比較的短く、例えば、トのそれぞれのセンスまた はアンチセンス鎖から得ることができる。これらのプライマーの合成は、標準的 なホスホルアミダイトに関する化学的方法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を利用している（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８１）。

本発明の一部は、ワクチンの作成と利用について考慮している。作成および利用 法に関する一般的な考え方は、明らかにされた３０ｋＤａ抗原、その抗原決定基 、およびそのサブフラグメントの作成と処方に応用できるものとして、論じられ ている。

ワクチンの調°と利用法 活性成分としてのペプチド配列を含むワクチンの作成法は、本技術分野において 一般に十分理解されている。米国特許第４，６０８，２５１号；第４，６０１， ９０３号；第４．５９９．２３１号、第４　、５９９２３０号、第４，５９６， ７９２号、第４，５７８，７７０号がその良い例で、全てここに参考文献として 含められる。典型的には、この様なワクチンは、注射可能な液体溶液または懸濁 液として作成される。注射前の液体中の溶液または懸濁液を調製するための固体 も調製できる。調製剤は乳化することもできる。活性免疫成分は、しばしば、製 剤学的に許容でき、活性成分と共に使用できる賦形剤と混合される。適切な賦形 剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である 。更に、必要な場合には、ワクチンに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ワクチン の有効性を高めるアジュバント（ａｄＪｕｖａｎｔ）等の少量の補助剤を含める ことができる。

ワクチンは、従来非経口的に、皮下注射または筋肉内注射等の注射によって投与 される。他の投与方法に適した別の処方としては、座薬、場合によっては経口投 与処方が含まれる。座薬の場合、従来の結合剤および担体に、例えば、ポリアル キレングリコールまたはトリグリセリドを含めることができる。この様な座薬は 、活性成分を０．５〜１０％、望ましくは１〜２％の範囲で含む混合物から形成 される。経口処方には、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプ ン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグ ネシウム等の通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成は、溶液、懸濁液 、錠剤、火剤、カプセル、徐放製剤または粉末の形態を取り、活性成分を１０〜 ９５％、望ましくは２５〜７０％含む。

タンパク質を中性または塩の形態でワクチンの中に入れて処方することができる 。製剤学的に許容できる塩には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ酸基によって 形成される）が含まれ、これは、塩酸または燐酸等の無機酸、あるいはオキザロ 酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸によって形成される。遊離炭酸基によって 形成される塩を、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸 化鉄等の無機塩基、またはイソプロピルアミン、　トリメチルアミン、２−エチ ルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基からも得ることがで きる。

ワクチンは、投与処方に合った方法で、治療効果と免疫原性を発揮する量を接種 される。投与量は、個人の抗体を合成する免疫システム能や目的とする防御の程 度等の投与される対象によって異なる。活性成分の正確な必要投与量は、医師の 判断に委ねられているが、適切な投与量範囲は、１回のワクチン接種当たり活性 成分量として数百マイクログラムのオーダーである。

初回投与とブースター投与の適切な投与法もあるが、初回投与後に引き続き接種 を行うか、別の投与を行うのが典型的である。

投与方法も多様である。従来のワクチン投与法のいずれでも適用できる。これら には、生理学的に許容できる固形基剤または生理学的に許容できる懸濁液の経口 投与、注射、その他等の非経口投与が含まれると考えられている。ワクチンの投 与量は、投与経路に依存しており、また、宿主の大きさによっても異なる。

ワクチンのアジュバント効果を得るための様々な方法には、通常００５〜０１％ 燐酸塩緩衝生理食塩水溶液として使用される水酸化アルミニウムまたは燐酸アル ミニウム等の薬剤を使用すること、０．２５％溶液として使用される糖の合成ポ リマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）と混合するこることによってワクチン中のタンパク 質を凝集すること、等が含まれる。アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ） 抗体を再活性化することによる凝集反応、Ｃ，ｐａｌ−Ｖｕｍの様な細菌細胞、 またはエンドトキシン、またはグラム陰性菌のリポ多糖成分等との混合、モノオ レイン酸マニド（アラセルＡ）の様な生理学的に許容できるオイル賦形剤中での 乳化、あるいは遮断基質として使用されるパーフルオロカーボン（フルオシルー ＤＡ）の２０パーセント溶液との乳化剤の調製、等も可能である。

多くの場合、複数回のワクチン投与が望ましく、通常はワクチン接種回数は６回 を超えず、より一般的には４回を超えず、１回以上が望ましく、通常少なくとも 約３回のワクチン接種を行う。ワクチン接種は通常、２週から１２週間隔で行い 、よ、り一般的には、３週から５週間隔である。抗体の防御レベルを維持するた めに、１〜５年間隔で、通常は３年間隔で、定期的なブースター投与を行うこと が望ましいであろう。免疫感作の経過を、上清抗原に対する抗原分析で追跡する ことができる。放射性核種、酵素、蛍光物質、その他の従来の標識を用いて標識 を行い、分析を実施することができる。これらの技術はよく知られており、この 種の分析法を例示する米国特許第３，７９１，９３２号、第４．１７４，３８４ 号、第３，９４９，０６４号等の広範にわたる特許に示されている。

本発明は、発現ベクターまたはプラスミドの構築における、明らかにされた核酸 セグメントの利用と、宿主細胞における利用にも関わるものである。以下に、こ の様な利用に関する一般的な考察と、本発明のこの面の実施に関する特別な考察 が示されている。

宿主細胞の培　とベクター 一般に、当然であるが、ＤＮＡ配列の最初のクローニングと本発明における有用 なベクターの構築には、原核細胞が望ましい。例えば、より具体的に明らかにさ れている下記に示される特定の菌株以外に、Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２２９４株（Ａ ＴＣＣＮｏ、３１４４６）　、Ｅ、Ｃｏ１１　Ｂ、　Ｅ、Ｃｏ１１　Ｘ　１７７ ６（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）等が例として挙げられる。これらの例は、当然 、限定ではなく、例示することを目的としている。

発現に関しても原核細胞が望ましい。前述の菌株の他に、Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ３１ １０　（Ｆ−、ラムグー、原栄養体、ＡＴＣＣＮｏ、２７３３２５）　、Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ（枯草菌）等の棹菌、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌ ａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　（ネズミチフス菌）または５ｅｒｒａｔｉａ　Ｍ ａｒｃｅｓａｎｓ　（霊菌）等のその他の腸内細菌、種々のシュードモナス属等 を使用することができる。

一般に、宿主細胞に適合する種から得られたレプリコンと制御配列を含むプラス ミドベクターが、これらの宿主細胞と共に使用される。ベクターは通常複製部位 と、形質転換された細胞において表現型選択を可能にするマーキング配列を持っ ている。例えば、Ｅ、Ｃｏ１１は、典型的には、Ｅ、Ｃｏ１１種がら得られるプ ラスミド、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される（例えば、Ｂｏｌｆｖａｒｅ ｔ　ａｌ、、１９７７参照）。ｐＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリンおよび テトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいるため、形質転換された細胞を同定する 簡単な手段となる。ｐＢＲプラスミド、またはその他の微生物のプラスミドまた はファージは、微生物によって使用される発現のためのプロモータも含まなくて はならない。あるいは含む様に修飾されなくてはならない。

組み換えＤＮＡ構築において最もよく使用されるこれらのプロモータには、Ｂ− ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータシステム（Ｃｈａｎｇ 　ａｔ　ａｌ、。

１９７８；　Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、１９７７；　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータシステム（Ｇｏ ｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９；　ＥＰＯＡｐｐｌ、　Ｐｕｂｌ、　Ｎｏ 、００３６７７６）が含まれる。これらは最も一般的に使用されているが、他の 微生物のプロモータが発見、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関す る詳細が発表されており、・熟練した研究者はそれらをプラスミドベクターと機 能的に結合することができる（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８０）。

原核細胞からの特定の遺伝子を、それ自身のプロモータ配列から、Ｅ、Ｃｏ１１ の中で効率的に発現させることができる。この場合、人工的な手段によって別の プロモータを添加する必要はない。

原核細胞の他に、酵母培養株の様な真核微生物も使用することができる。他の多 くの株も多く使用されているが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｓｅ（麦酒酵母菌）または普通のパン酵母が、真核微生物の中で最も多く使 用されている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に関しては、例えばプ ラスミドＹＲｐ７が多く使用されている（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、 、１９７９；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９；　Ｔｓｃｈｅｍｐ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０）。このプラスミドは、　トリプトファンの中で 成長する能力を欠失している酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７ ６またはＰＥＰ４−１等（Ｊｏｎｅｓ　、　１９７７）の選択マーカーとなるｔ ｒｐｌ遺伝子を既に含んでいる。

酵母宿主細胞のゲノムの特徴としてｔｒｐｌに欠陥がある場合には、トリプトフ ァンがない所で成長することによって形質転換を検出するための有効な環境が提 供される。

酵母ベクターの適切なプロモーティング配列には、３−ホスホグリセレートキナ ーゼのプロモータ（Ｈｉｔｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０）またはエノラー ゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソ メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース ホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ等 のその他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９６８；　Ｈｏ１ｌａｎｄ　 ｅｔ　ａｌ、、１９７８）のブロモ合、これらの遺伝子に関係する終結配列も、 発現させたい配列の発現ベクター３゛末端に結合し、ｍＲＮＡをポリアデニル化 し、終結させることができる。

成長条件によって制御される転写に関して更に利点を有するその他のプロモータ は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホスファターゼ、 窒素代謝に関係する分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３＝燐酸デヒドロゲ ナーゼと、マルトースとガラクトース利用に関与する酵素のプロモータ領域であ る。酵母に適合性を有するプロモータ、複製起点、終結配列を有するプラスミド ベクターならどれでも適している。

微生物の他に、多細胞生物から得られた細胞培養も宿主として使用できる。原則 として、その様な細胞培養ならどれでも、セキライ動物または無セキツイ動物の 培養に関わりなく使用できる。しかし、セキライ動物細胞に対して関心が高まっ ており、近年セキライ動物細胞を培養（組織培養）で増殖させることがルーチン 手技となりツツある（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　１９７３）ｏ　その様 な有用な宿主細胞系の例として、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系およびＫ１３８、ＢＨＫ　５ＣＯ５−７２９３、 ＭＤＣＫ細胞系等が挙げられる。

その様な細胞の発現ベクターには、通常（必要な場合には）複製起点、発現され る遺伝子の前に位置するプロモータ、並びに必要とされるリボゾーム結合部位全 て、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列が含まれる。

哺乳動物細胞を使用する場合、発現ベクターに対する調節機能はウィルス由来の 物質によって行われる。

例えば、よく使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２であり、 最も多く使用されるのは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）である。ＳＶ４０ ウィルスの初期および後期プロモータは、共にＳＶ４０ウイルスからフラグメン トとして容易に得られ、そのフラグメントにもＳＶ４０ウィルスの複製起点が含 まれるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８）。Ｈｉｎ ｄｌ１１部位からウィルスの複製起点に位置するＢｇｌ　１部位に向かって延び る約２５０　ｂｐの配列が含まれているならば、より小さい、あるいはより大き いＳＶ４０フラグメントも使用できる。更に、目的の遺伝子配列に通常関係を有 するプロモータまたは調節配列を利用することも可能であり、しばしば望ましい 。但し、この様な調節配列は、宿主細胞系に適合していなくてはならない。

複製起点は、ベクターを構築し、ＳＶ４０またはその他のウィルス（例えば、ポ リオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から得られる様な外因性複製起点を含める ことによって、あるいは宿主細胞の染色体複製機序によって供給することができ る。ベクターが宿主細胞染色体に統合されれば、後者で通常は十分である。

明らかにされたＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして使用することも本発明 の範囲内であると考えられる。その様な利用法を示す具体例は提示されているが 、以下に、本発明の明らかにされた核酸配列を利用するハイブリッド形成の応用 法に関する一般的な背景を示す。

のハイブリッド５　の　５、 既述の様に、いくつかの面から、本発明によって提供されるＤＮＡ配列の情報に よって、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ遺伝子配列と特異的にハイブリッド形成す る能力を有する比較的短いＤＮＡ　（またはＲＮＡ）配列を調製することができ る。これらの面から、適切な長さの核酸プローブは、図２に示される様なＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：２またはこれらの遺伝子のフランキング領域から得られる配列を 検討して調製される。この様な核酸プローブがＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ遺伝 子配列と特異的にハイブリッド形成できる能力があることから、これらの核酸プ ローブは、様′々な実施態様において特に有用である。最も重要なことは、一定 の試料中に病原体が存在することを検出するための様々な診断用分析に、プロー ブを使用できるという点である。しかし、突然変異種のプライマー、あるいは他 の遺伝子による生産物の調製に使用するプライマーを調製するために配列に関す る情報を利用することも、共に考慮されている。

本発明によるいくつかの利点を得るために、ハイブリッド形成の研究または分析 に使用される望ましい核酸配列は、図２に示される配列の様な選択された配列の 少なくとも１０個から４０個位のヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。少 なくとも１０個のヌクレオチドの長さがあれば、安定性と選択性を兼ね備えた二 重ラセン分子を形成するのに十分な長さのフラグメントを確保できる。しかし、 ハイブリッドの安定性と選択性を増大させるには、１０塩基長以上の長さ全体に わたり相補的配列を有する分子が一般に望ましく、これによって、得られる特異 的なハイブリッド分子の品質と程度が改善される。従って、一般に遺伝子が相補 的な１５〜２０個、あるいは必要な場合にはそれより長いヌクレオチドを持一つ 核酸分子が好んでデザインされる。この様なフラグメントは、例えば、化学的方 法によりフラグメントを直接合成することによって、あるいは米国特許第４，６ ０３，１０２号のＰＣＲ技術の様な核酸複製技術の応用によって、あるいは組み 換え生産のために選択された配列を組み換えベクターの中に導入することによっ て容易に調製することができる。

本発明によって、臨床試料中のＢｂに特異的なＲＮＡまたはＤＮＡを検出するた めの診断用ハイブリッド形成分析の基礎となる特定の利用法が見いだされる。従 って、感染の診断に使用できる臨床試料は、組織、血清、尿等の核酸を含むと思 われる試料ならばどれでもよい。

様々な組織ハイブリッド形成技術および方法が知られており、本発明のハイブリ ッド形成の考え方と組み合わせて使用することができる。それには、Ｆａｌｋｏ ｗ　ｅｔａｌ、米国特許第４，３５８，５３５号において説明されている様な分 析法が含まれる。

従って、本発明のヌクレオチド配列は、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ遺伝子セグ メントの相補的部分を有する二重ラセン分子を選択的に形成できるために重要で ある。どの様な応用を計画するかによって、標的とする配列に対するプローブの 選択性の程度を変えるために、異なるハイブリッド形成条件を使用したいと考え るであろう。

高度の選択性が必要な応用例には、ハイブリッドを形成するために比較的緊縮性 の条件を一般に使用しようとするであろう。例えば、５０℃から７０℃における ０、０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣ１の様な、塩濃度が比較的低く、および／また は高温の条件を選択するであろう。これらの条件は、特に選択的で、プローブと 鋳型または標的鎖の間のミスマツチは、あるとしても極僅かである。

勿論、応用例によっては、例えば基礎となる鋳型とハイブリッド形成した突然変 異株のプライマー鎖を使用して、突然変異株を調製したい場合には、ヘテロ二本 鎖の形成を可能にするには、緊縮性がより低いハイブリッド形成条件を必要とす る。この様な条件では、２０６Ｃ〜５５℃の温度において０．１５Ｍ〜０．９Ｍ の塩の様な条件を使用しようとするであろう。いずれにしても、より多量のホル ムアミドを添加することによって、条件をは、温度を上昇させるのと同様に、ハ イブリッド二重ラセンを不安定にさせる作用を有する。従って、ハイブリッド形 成条件は簡単に操作でき、目的とする結果に応じて一般に優れた方法となる。

臨床診断の実施態様において、標識の様な、ハイブリッド形成を測定する適切な 手段と組み合わせて、本発明の核酸配列が使用される。検出可能なシグナルを発 することができる放射能、酵素またはアビジン−ビオチンの様なその他のリガン ドを含む広範にわたる適切な指標が本技術分野において知られている。診断に関 する望ましい実施態様において、放射能またはその他の環境に悪影響を及ぼす試 薬の代わりに、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼの様な酵素標識 を使用したいと考える可能性が高い。酵素標識の場合、比色定量指示基質が知ら れている。これは、病原性を有する核酸を含む試料との特異的なハイブリッド形 成を同定するために、肉眼で、あるいは分光光度計によって観察できる手段を提 供するために使用できる。

酵素が分解すると光が消える発光基質も使用することができ、それによって鋭敏 度を上昇させることができる。

一般に、ここに既述されているハイブリッド形成プローブは、液中ハイブリッド 形成においても、また固相を使用する実施態様においても、試薬として有用であ ると考えられる。固相を使用する実施態様において、滲出液、体液（例えば、羊 水、脳を髄液）、または組織等のＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含むと思われる臨床 試料中の被験ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）を、選択されたマトリックスまたは表面 に吸着、あるいは付着させる。次に、この固定された一本鎖核酸を、希望の条件 下で、選択されたプローブと特異的にハイブリッド形成させる。選択される条件 は、要求される特定の基準に基づく特定の環境に左右される（例えば、Ｇ＋Ｃ含 有量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリッド形成プローブの大きさ、そ の他）。非特異的に結合したプローブ分子を除去するために、ハイブリッド形成 された表面を洗浄後、標識によって、特異的なハイブリッド形成が検出されるか 、あるいは定量さえ行われる。

本発明は、３０ｋＤａタンパク質に関連するいくつかの抗原ペプチドをエンコー ドしている核酸のクローニングについて述べている。ここに明らかにされている 方法と同様の方法を用いて、３０ｋＤａ抗原タンパク質の他に病毒力を有するタ ンパク質の同定が可能なはずである。１つの方法は、継代回数が少ない分離株か ら得られたｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリを作成することであろう。原 核細胞のメツセージ（ｍｅｓｓａｇｅｓ）には通常、ポリ八尾部（ｐｏｌｙ−Ａ 　ｔａｉｌｓ）が存在しないため、細菌からのｃＤＮＡＤＮＡライプ９は一般的 ではないが、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｈｅｒｍｓｉｉのｍＲＮＡからｃＤＮＡライブ ラリが作成されている。この技術は、無作為のプライマーと逆転写酵素を使用し て最初のｃＤＮＡを作成する。この点から、リンカ−が付着し、挿入断片が適切 なプラスミドまたはバクテリオファージベクターの中にクローン化される。この 技術は、　“消去（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）”技術と共に使用するのに適して いる。この方法では、継代回数が多い感染力の無い同じ遺伝子系列の分離株のＤ ＮＡを使用して、ｍＲＮＡからの継代回数が多い分離株と少ない分離株に共通の 転写物とハイブリッド形成させることができる。

３０ｋＤａ抗原の変種を作成する方法は、特定部位の突然変異誘発である。この 技術は、基礎となるＤＮＡの特異的な突然変異によって、ＯＭＰ抗原配列から得 られる個々のペプチド、あるいは生物学的機能が等しいタンパク質またはペプチ ドを調製するのに有用である。例えば、前述の１つ以上の考え方を取り入れて、 １つ以上のヌクレオチド配列の変化をＤＮＡに導入することによって、この技術 によって更に配列の変種を調製し、テストすることが簡単にできる。特定部位の 突然変異誘発によって、突然変異体を生産することができる。

これは、目的の突然変異のＤＮＡ配列をエンコードしている特異的なオリゴヌク レオチド配列を使用することによって、また、プライマー配列を十分大きくし、 横断している欠失接合部の両側に安定した二重ラセンを形成するために配列の複 雑度を提供するために、十分な量の隣接するヌクレオチドを使用することによっ て、達成される。典型的には、約１７〜２５個のヌクレオチドの長さのプライマ ーが望ましく、変更される配列の接合部の両側に約５〜１０個の長さの残基を有 するのが望ましい。

一般に、出版物によって示される様に（Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔａｔ、　、　１９ ８３）、特定部位の突然変異誘発は本技術分野においてよく知られている。望ま しくは、本技術は一般に、一本鎖と二本鎖のいずれの形態でも存在するファージ ベクターを用いる。特定部位の突然変異誘発において有用な典型的なベクターに は、Ｍ１３ファージ等のベクターが含まれる（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８１）。これらのファージは、市販されており容易に人手でき、その使用法 は、一般に本技術分野に精通している者にはよく知られている。

一般に、ここに示される方法による特定部位の突然変異誘発は、まず、３０ｋＤ ａ抗原をエンコードしているＤＮＡ配列をその配列の中に含む一本鎖ベクターを 得ることから開始される。目的の変異が達成された配列を持つオリゴヌクレオチ ドブライマーを、例えば、Ｃｒｅａｅｔ　ａｌ、（１９７８）の方法により、一 般に合成して調製する。次に、突然変異を持つ鎖の合成を完成させるために、こ のプライマーを、一本鎖ベクターとアニーリングさせ、Ｅ、Ｃｏ１１ポリメラー ゼ■クレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントの様なりＮＡポリメライジング酵素 を作用させる。そこで、ヘテロ二本鎖が形成され、その内の一方の鎖は元の変異 していない配列をエンコードし、もう一方の鎖は目的の変異を持つ。次に、この ヘテロ二本鎖ベクターを使用して、Ｅ、Ｃｏ１１細胞の様な適当な細胞を形質転 換し、変異配列を持つ組み換えベクターを含むクローンを選択する。

特定部位の突然変異誘発を用いる、選択された３０に遺伝子の配列変種の調製は 、潜在的に有用な３０に種を生産する１つの手段であり、３０に遺伝子の配列変 種が得られる別の方法もあるので、それに限定されることを意味するものではな い。例えば、目的の３０に遺伝子をエンコードしている組み換えベクターを突然 変異誘発因子で処理し、ヒドロキシルアミンを用いてプラスミドＤＮＡの突然変 異を起こすための配列変種（例えば、Ｅｉｃｈｅｎｌａｕｂ、　１９７９によっ て報告された方法を参照）を得ることができる。

以下の具体例は、本発明の詳細な説明することが目的であり、それらに限定する ことが目的ではない。本発明は、Ｂｂから得られた３０ｋＤａタンパク質につい て説明されているが、病毒力を有する菌株に固有の他の抗原タンパク質も同様の 方法で使用できるであろう。同定されたタンパク質とそれをエンコードしている ＤＮＡは、ライム病の選択的かつ鋭敏度の高い分析法を開発する際に、またヒト において病毒力を有するＢｂ感染を識別できるために、明らかに有用である。

只」（剖」 本具体例は、継代回数が少ない病毒力を有するＢｂ株において生産されるポリペ プチドと、同質遺伝子を持ち、継代回数が多い無毒性の株において生産されるポ リペプチドの差を示すものである。これは、哺乳動物宿主におけるＢｂの感染力 と病毒力に必須のタンパク質を同定することが目的であった。分離株が異なると 、病毒力と無関係な差異を有する可能性があるので、はっきり定義された、継代 回数が少ないＢｂ株と、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養を長時間行った後の同じ株 の間で比較を行った。

Ｂｂタンパク質を分離する際の初期の問題点の１つは、標準二次元ゲル電気泳動 の際に、０ｓｐＡおよび０ｓｐＢを含む幾つかの主要なタンパク質が喪失するこ とであった。

この喪失は、陰極の末端から発生し、陰極の変動に明らかに関係していた。非平 衡ｐｉ勾配電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）（０°Ｆａｒｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９７７）と呼ばれる等電点電気泳動の改変型によって、全ての主要なりｂポリペ プチドの分離に成功した。この技術は、全てのポリペプチドがゲルパターンに保 持される様に、より短い運転時間を利用している。

Ｂｂの　を　る　と無　の　のＮＥＰＨＧＥＢｂ　８３１株を、ＢＳＫ　ＩＩ培 地で継代培養し、対数期後期まで（７〜ｌＯ日間）３４℃でインキュベートした 。継代培養回数が少ないというのは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養が１０回より 少ない場合を、継代培養回数が多いというのり質分析に関しては、対数期後期の 培養物から得られたＢｂを、遠心分離により３回洗浄し、燐酸緩衝生理食塩水に 静かに再懸濁し、−７０℃で保存した。細菌（ゲル当たり２　ｘ　１０８個）を 音波破砕し、可溶化緩衝液に懸濁し、３ｍｍチューブゲル内でＮＥＰＨＧＥにか けた。ＮＥＰＨＧＥは、標準的な二次元ゲル電気泳動とは、主として電気泳動時 間が異なっている。等電点電気泳動（ＩＥＦ）は運転時間が１６時間であるのに 対し、ＮＥＰＨＧＥの運転時間は４００ボルトで４時間であった。タンパク質の 移動は平衡に達していなかったため、標準ＩＥＦでは分離されなかった多くのタ ンパク質が分離された。第二の方向ノケルは、分離を強化するために８〜２０パ ーセントのポリアクリルアミド勾配を用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥであった。

可溶化されたＢｂと分子量標準（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） を含む単一次元のレーンをチューブゲルの片方に配置した。ポリペプチドは、銀 染色によって肉眼で観察できた。あるいは、二次元ゲル電気泳動パターンをイム ノプロット分析を行うために、ＰＶＤＦ膜に移した（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、　 １９８７）。

ゲルスポットパターンは再現性が高く、中等度の濃度から高濃度のポリペプチド の殆どを明確に同定することができた。ゲルパターンを視覚的に比較し、定性的 に類似性と相違性を検出した。測定には使用しなかったが、Ｖｉｓａｇｅ　２０ ００イメ一ジ分析システム（Ｂｉｏｌｍａｇｅ・Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、マサチュ ーセッツ州）を使用して定量分析を実施できるものと考えられる。デンシトメー ター／コンピューターシステムを使用して、１０２４Ｘ　１０２４ピクセル（０ ，１８ｍｍ２／ピクセル）の画像群を走査、保存、解釈する。Ｖｉｓａｇｅイメ ージ分析ソフトウェアパッケージを利用して、二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ） スポットの同定、配列、定量に関するデータを収集し、分析する。

図１は、Ｂｂ　８３１株の継代回数が多い分離株と継代回数が少ない分離株を比 較したものである。これらの株は、それぞれ５回より少ない回数、１００回より 多い回数のｉｎ　ｖｉｔｒｏの継代培養が行われた。各パターンにおいて銀染色 により１００個のスポットが検出されたが、Ｔ、ｐａｌｌｉｄｕｍの場合と同様 に、二次元方向のパターンは数個の主要構造タンパク質が占めていた。移動起点 （酸性末端）に向かって主要スポットが線状を形成したのは、ＮＥＰＨＧＨによ る分離が平衡に達していないことによるものである。０ｓｐＡ、　０ｓｐＢ、　 ４１にフラジェリンはＭ、と、モノクローナル抗体との反応性によって同定され た（図２）。モノクローナル抗体Ｈ６ｇも、継代回数し、０ｓｐＢと２０にポリ ペプチドに共通の抗原決定基が存在することを示した。２４にポリペプチドに対 するウサギ抗血清は、継代回数の少ない８３１株において主要スポットと反応し た。この抗血清は、基本的な３５にポリペプチドとも反応した。

継代回数の少ない８３１株と継代回数の多い８３１株の最も顕著な違いは、継代 回数の少ない分離株においてＭ、が３０，５０Ｑの酸性の主要ポリペプチドが存 在する点であった。このポリペプチドは、３０にタンパク質と呼ばれ、５ＤＡ− ＰＡＧＥの次元では０ｓｐＡの直下にあるため、多くの報告されている５ＤＡ− ＰＡＧＥパターンにおいて、０ｓｐＡから十分分離されなかった。継代回数の多 い８３１株において、３０ｋＤａポリペプチドは認められなかった。モノクロー ナル抗体Ｈ６８と反応する２０にポリペプチドも、継代回数の多い８３１株には 存在しなかった。抗２４に抗血清と反応する塩基性３５にポリペプチドは、継代 回数の多い分離株において検出されなかったが、２４にタンパク質は少量発現し た。北アメリカ人の血液から分離されたＨ８１９株の明確に定義された継代回数 の少ない変異株と継代回数の多い変異株において、同様の結果が得られた（デー タは示されていない）。

え生月ユ 継代回数の少ないＢｂ株には認められるが、継代回数の多いＢｂ　８３１株に検 出されないポリペプチドが観察されたことから、この独特と思われるタンパク質 を分離し、特徴を明らかにする試みがなされた。具体例１に示される様に、この タンパク質は病毒力との関係が疑われる酸性の主要タンパク質である。

３０Ｋ　タンパク　の　１と１ｊυυ１匹人ＩＴ、ｐａｌｌｉｄｕｍポリペプチ ドの精製用に開発された（Ｎｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）大規模な二 次元電気泳動によって、約５マイクログラムの３０にタンパク質を継代回数の少 ない８３１株から精製した。１０１０個のＢｂ株を可溶化し、２４のチューブゲ ルにローディングし、ＮＥＰＨＧＥにかけた。

チューブゲルをクーマシープルーＧで染色し、３０にタンパク質に対応するタン パク質バンドを２Ｄゲルパターンとの比較によって決定し、注意深くスライスし て取り出した。取り出したバンドを５ＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液で平衡化し、合わせ て、単一の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけた。精製された３０にタン パク質を表すクーマシープルーＧ染色スポットを取り出し、電気溶出した。初期 の研究によって、Ｎ−末端がブロックされていることが明らかにされたので、３ ０にタンパク質調製液を臭化シアンで処理し、タンパク質をメチオニン残基にお いて内部で切断した。得られたフラグメントを２０％アクリルアミドＳＤＳベー ジゲル上で分離し、配列分析のためにＰＶＤＦ膜に移した（Ｍａｔｓｕｄａｉｒ ａ、　１９８７）。Ｍ、値がほぼ同じ２つの目立つペプチドからＮ−末端配列が 得られた。これらのペプチドは、僅か５個のアミノ酸を間に挟んで２つのメチオ ニン残基が存在するために、重複しているペプチドであることが判明した。これ らの２つのペプチドから得られた追加の配列は次の通りである。

Ｘ　Ｘ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓｌｌｅ　Ｘ　Ａｓｎ Ｘは、決定されていないアミノ酸残基を表している。

ｌ生■ユ 病毒力を有する継代回数の少ないＢｂ　８３１株に固有と思われるＢｂタンパク 質の部分的アミノ酸配列を決定後（具体例２を参照）、８３１株とその他の株の ＤＮＡ配列を検出する方法を開発しようとした。これは、オリゴヌクレオチドプ ローブを合成することによって達成された。オリゴヌクレオチドプローブは、既 に配列決定されているＢｂ遺伝子において最も多用されているコドンを使用して 、３０ｋＤａタンパク質から決定されたアミノ酸配列から得られた（具体例２を 参照）。

ＤＮＡハイブリッド形成 下記のヌクレオチド配列は、配列決定されたＢｂ遺伝子において最も多用されて いるコドンを使用して、３０にアミノ酸の配列から得られたものである。Ｂｂの Ｇ＋Ｃ含有量は２８〜３０％である。従って、ＡまたはＴを含むコドンの方がは るかに優勢である。

ＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴ　ＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴ　ＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧ　ＴＧＣ 継代回数の少ない８３１株と継代回数の多い８３１株のゲノムＢｂ　ＤＮＡ全体 のサザンプロットに相補的な配列が存在するかどうかを決定するために、放射性 同位元素標識したヌクレオチドをプローブとして使用した。厳格でない条件下に 、オリゴヌクレオチドは、継代回数の少ない８３１株に存在するが、継代回数の 多い８３１株には存在しないＨｉｎｄ　ｍ　ＤＮＡフラグメントとハイブリッド 形成した（図３参照）。

Ｂｂ株のプラスミド調製液のサザンプロットに対するオリゴヌクレオチドのＤＮ Ａハイブリッド形成を利用して、３０Ｋをエンコードしている配列は、みかけの 大きさが３８キロ塩基対のプラスミドに存在することが明らかにされた。このプ ラスミドは、線状と思われた。３０にタンパク質を欠失している継代回数の多い 株は、３８キロ塩基対のプラスミドも欠失していた。３０にオリゴヌクレオチド は、これらの株由来のプラスミド調製液のサザンプロットとはハイブリッド形成 しなかった。

ノーザンプロットによって、上記のプローブとハイブリッド形成したｍＲＮＡが 継代回数の少ない８３１株において発現されたが、継代回数の多い８３１株にお いては発現されなかったことが確認された（図４参照）。このオリゴヌクレオチ ドは、ＨＢ−１９（ヒトの血液からの分離株、米国）、ＰＢＩ　、Ｍｕｎｉｃｈ ８６　（ヒト脳を髄液からの分離株、　ドイツ）、Ｇ２５（スウェーデン）、Ｖ ｅｅｒｙ（米国、鳥からの分離株）等の継代回数の少ない他の幾つかのＢｂ株に おける類似のプラスミドともハイブリッド形成することが認められた。継代回数 の多いＢｂ株またはＢ。

ｒｒｅｌｉａ　ｈｅｒｍｓｉｉにおいて、対応するプラスミドは認められなかっ た。

旦１＋ 具体例２のオリゴヌクレオチドプローブが、継代回数の少ないＢｂ株に関連する 旧ｎｄｌｕ　ＤＮＡフラグメントとはハイブリッド形成するが、継代回数の多い ８３１株の場合にはハイブリッド形成しないことから、ＤＮＡが、継代回数の少 ないＢｂ株に典型的に関連性を有する３０ｋＤａポリペプチドをエンコードして いることが強く示唆される。従って、ＤＮＡの分子クローニングが行われた。

３０に′　−の　クローニング ３０に遺伝子のクローニングを行うために、アガロースゲル電気泳動によって１ ．　Ｈｘｎｄｍ　フラグメントのサイズを選択し、０．５〜２．６キロ塩基対の 大きさのバンドを電気溶出した。これらのフラグメントを、ＨｉｎｄＩ［Ｉによ って切断し、脱燐酸化したプラスミドｐＵｃ１９の中に結合させた。組み換えプ ラスミドでＥ、Ｃｏ１１　Ｊｍ１０９株を形質転換し、得られた組み換え体を厳 格ではない条件下にオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させることによって 、スクリーニングした。スクリーニングを繰り返した後、オリゴヌクレオチドと ハイブリッド形成した単一のクローン（ｐＴＢＯ８７Ａ）を分離した。ＴＢＯｌ ｌＶＡは、９５Ｇ−ｂｐのＢｂ株のＤＮＡ挿入断片を含み、オリゴヌクレオチド はこの挿入断片の中の５００〜６００のＰｓｔｌフラグメントと結合した。３０ に遺伝子の８０％と更に上流の翻訳されない３００塩基対のＤＮＡが得られた。

更に、３０に遺伝子の残りを含む１．５ｋｂのＰｓｊｌフラグメントが、ｐＵｃ １９の中にクローニングされた。

クローンＴｂｏ８７のジデオキシヌクレオチドの配列決定ニヨリ、図３、ＳＥＱ 　１０　ＮＯ：１　ノ２５７　個（１）　７　ミ／　酸Ｇエンコードしている長 いオープンリーディングフレームの存在が証明された。典型的な−３５と−１０ のσ７ｏ認識部位とシャインーダルガルノリボゾーム結合部位配列が開始コドン と推定される部分よりも上流に認められた（アンダーラインが付されている。） 。更に上流に−３５と−１０の配列が幾つが認められたことがら、通常と異なる 転写調節機序の存在が示唆される。

推定されるアミノ酸配列のＮ末端領域は、細菌リポタンパク質のシグナルペプチ ドの典型的なものであった。Ｎ−末端メチオニンの後に、リジン残基、疎水領域 、シグナルペプチダーゼ２　（ＳＦ３）認識配列のクラスターが続いた。後者の 配列、Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓは、多くの細菌に認められる共 通ｓＰ２認識配列（Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ）とは異なっていたが、Ｂ 、ｈｅｒｍｓｉｉの可変主要タンパク質Ｖｍｐ７とＶｍｐ２１の切断配列、Ｌｅ ｕ　Ｍｅｔ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓと近似していた。回帰熱菌のこれらの可変 表面抗原は、リポタンパク質であることが明らかにされている（Ｂｕｒｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ、、１９９０）。このリーダー配列が存在することは、成熟３０ｋＤ ａタンパク質が、細胞質膜を横切って転送され、Ｎ末端システィン残基に関係す る脂肪酸を介して細胞質膜および／または外膜に固定されることを示唆する。

３０に遺伝子を含むＴｂｏ８７クローンは、臭化シアンによって切断されるフラ グメントのアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチド配列とハイブリッド形成さ せて同定した。臭化シアンによって切断されるフラグメントと正確に対応する配 列は、推定されるアミノ酸配列の１１９−１２９の残基と同定され、遺伝子の同 一性が確認された。スクリーニングに使用されたオリゴヌクレオチドは、３３の 位置の３０において同一であった。

Ｇａｒｎｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９７ｇの方法を用いて、遺伝子の二次構造分 析を実施した。配列の９０％以上のアルファへソックス構造が予測された。α− へソックスとβ−シート分析を示すプロットが図７に示されている。グリコジル 化部位も、図７のプロット図に示されている。

クローン化ＤＮＡの制限地図が図６に示されている。

Ｉｐａ３０は、３０に遺伝子の位置と方向を示している。左側の２つのＨｉｎｄ ｌ１１部位の間の領域は、クローンＴｂｏ８７を表している。ＰｓｔＩ部位の間 のクローン化領域は、３０に配列の残りの部分を得るために、クローニングされ た領域を表している。

民生亘ｊ 異なる地域から得られた継代回数の少ない病毒力を有するＢｂ株に、３０に遺伝 子が存在するかどうかを検討した。これは、この遺伝子と３０ｋＤａ関連遺伝子 生成物が全般的に存在するかどうかを決定するために実施された。検討された全 ての株がこの遺伝子が存在することを示し、３０ｋＤａタンパク質と病毒力との 強方な関係が示唆された。

具体例３に示される３０にオリゴヌクレオチドを、ＨＢ１９（コネチカット）、 ＰＢＩ　、　Ｍｕｎｉｃｈ　８６　、ＰＫＡＩ　（ドイツ）、Ｇ２５（スウェー デン）等の継代回数の少ない分離株由来の見かけの大きさが３８〜４０キロベー スのプラスミドとハイブリッド形成させた。プラスミドは、分離、精製し、アガ ロースゲルにがけた後、サザンプロットを行い、Ｂａｒｂｏｕｒ（１９８ｇ）に よって報告された方法で調製されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド 形成させた。３０に遺伝子が、様々な地域の株に存在することが明らかにされた 。８３１株において発現された量とほぼ同量の３０にタンパク質が、８８１９株 によって発現された。

１１亘１ ゲノムＤＮＡライブラリを、比較される幾つかのＢｂ株とＤＮＡ配列から作成す ることができる。これは、他の病毒力特異抗原を同定し、Ｂｂ株に関連する病毒 力の基礎となる分子基盤を決定するのに役立つ。以下の具体例は、Ｂｂ　８８１ ９株のゲノムライブラリの作成法を示すものである。

継　回　の小ない感染力を有するＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　離のゲノムライ ブラリ ゲノムライブラリを作成するために、ヒト血液からの分離株の継代回数の少ない 分離株（Ｓｔｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）を使用した。この分離株は、 ラットとマウスに対し感染力があることが明らかにされている。これは、この分 離株で５ｃｉｄマウスを感染させることに成功したことによって、確認された。

４匹のマウスに、１０７個のスピロヘータを腹腔的接種した。１週間に１回、血 液をＢＳＫ　ｎ培地内で培養しくＢａｒｂｏｕｒ　、　１９８４）、３透口に安 楽死させた後、血液、膀胱、膵臓を培養した。全てのマウスが、全ての培養検査 と剖検検査でスピロヘータ血症であることが明らかにされた。８８１９株の継代 回数の多い分離株を、同じ接種時に５Ｃｉｄマウスに接種すると、血液の培養後 、または剖検時に、感染の所見を示したマウスは全くなかった。

継代回数の少ないＨＢ１９分離株を、ＢＳＫ　Ｉ［培地で増殖させた。フェノー ル／クロロホルム抽出液と標準法（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ９０）を用いて、ＤＮＡを全て抽出した。ラムダクローニングファクターＦＩＸ 　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）を 用いて、ゲノムＤＮＡライブラリを作成した。継代回数の少ない８８１９株のＤ ＮＡ全てを５ａｕ３Ａで部分消化し、Ｘｈｏ　Ｕ末端が部分的に塞がれたラムダ アームと結合させた。Ｓｐｉ選択によって、ベクター内のｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｄ ＮＡの１５−２３ｋｂｐの挿入断片のクローニングが行われた：Ｐ２ライソジエ ンにおいて３．９　Ｘ１０６個の一次ブラークが得られた。ベクターだけでは、 Ｐ２選択宿主に平板培養してもプラークは得られなかった。

Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの全ＤＮＡ含有量は、約１１００キロベースであっ た。ライブラリの大きさは、ゲノム全体の代表とするのに統計学的に十分な大き さであると考えられた。ライブラリは、０ｓｐＡ、　ＯｓｐＢ（Ｂｅｒｇｓｔｒ ｏｍ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）およびフラジェリンタンパク質（Ｓａｄｚｉｅｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、 １９９１）の遺伝子のプローブを用いて、スクリーニングされた。これらのプロ ーブのそれぞれに対するハイブリッド形成配列を含むクローンが、１０−２から １０−３の頻度でファージライブラリに存在したことから、ファージライブラリ は、ゲノムの代表である可能性があるという結論が下された。

民生■ユ ３０ｋＤａ主要ポリペプチドが、継代回数の少ない病毒力を有するＢｂ株と関連 していることが具体例１において明らかにされた。このポリペプチドに抗原性が あるのかどうか、従って診断を目的としたＢｂに特異的な抗体の開発とワクチン 開発に有用であるのか、という疑問が残っている。この具体例は、継代回数の少 ない病毒力を有するＢｂ株から分離された３０ｋＤａポリペプチドが、ウサギに おいて抗体反応を誘発することを証明するものである。

３０にタンパク　の抗原性 ウサギを、Ｂｂ　Ｂ３１株から得た３０ｋＤａタンパク質を２週に１回の間隔で 注射して、免疫感作した。各ウサギに蒸留水に入れた５μｇ　（１，７μｇ／ｋ ｇ）の抗原を注射した。抗原は二次元ゲル電気泳動で精製し、完全フロインドア ジュバント（初回注射）と、不完全フロインドアジュバント（その後の注射）に 乳化した。このウサギの抗血清は、継代回数の少ない８３１株の二次元ゲル電気 泳動イムノプロットのＢｂ　８３１株３０ｋＤａタンパク質に相当するスポット と反応したが正常ウサギ血清は反応しなかった。継代回数の多い８３１株の２Ｄ ＧＥイムノプロツトにおいて、反応性スポットは検出されなかった。

抗−３０ｋＤａ抗−血清と正常ウサギ血清は共に、幾つかのＢ　、　ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉポリペプチドとバックグラウンド反応が認められた。

λ生貝Ｊ この具体例は、抗体を産生ずるために３０ｋＤａタンパク質を利用することにつ いて説明している。この具体例では、モノクローナル抗体の作成法が示されてい るが、３０ｋＤａポリペプチドの抗原決定領域から得られるポリクローナル抗体 またはその他のモノクローナルも同様の方法で容易に得ることができる。

Ｂｂ　３０ｋＤａポリペプチドに対するモノクローナル抗体モノクローナル抗体 は、一般にＧｏｄｉｎｇ（１９８０）の方法に従って作成される。精製された３ ０ｋＤａ　Ｂｂポリペプチドを、ＤＮＡ　／セルロースと組み合わせ、初回免疫 感作のために完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔ ｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）に入れる。その後の免疫感作には、不完全フロインドア ジュバントを利用する。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを最初腹腔内投与により、その後は 筋肉内投与で免疫感作する。抗体産生をテストするために、血液をチェックする 。抗体力価が高い動物を選択し、膵臓を摘出し、細かく刻み、細胞を分離し、生 存可能かどうか検査する。次に、細胞融合を誘発するためのＰＥＧを使用して、 牌臓リンパ球を、市販されているＰ３−ＮＳＩ−Ａｇ４−１の様な非分泌型ミエ ローマ細胞系と細胞融合させる。

細胞を平板培養し、フィーディング培地にＨＡＴ培地を使用する。２回目または それ以降のクローニングにおいて、細胞を血清で生育させるのを止める。

予備スクリーニングは、ＥＬＩＳＡで行った。ハイブリド−マスクリーニングキ ットを使用することができる（例えば、ＢＲＬ、ベセスダ、メリーランド州）。

プレートをヤギ血清で覆う。次に、ハイブリドーマ培養物の上清を、対照プレー トと、その前に３０ｋＤａ抗原ポリペプチドで覆っておいたプレートに加える。

インキュベート後、プレートを洗浄し、β−ガラクトシダーゼ結合ヤギ抗−マウ ス抗体を１％ヤギ血清を含むＰＢＳに１：２００で希釈した溶液（ＢＲＬ試薬） を加え、更にインキュベートする。発色物質、ｐ−ニトロフェニルグルコースを 加え、約１時間インキュベートを続け、炭酸ナトリウム溶液を加えてクエンチン グする。ウェルを、ＥＬＩＳＡプレート読み取り器で４１０ｎｍで読み取る。陽 性反応は、ウェルが黄色に発色することによって示される。

ウェル当たり　０．５〜２個の細胞で平板培養を行い、次にウェル当たり０．３ 〜０．５個の細胞でリクローニング（ｒｅｃｌｏｎｉｎｇ）を行なうことにより 、陽性反応を示すウェルから細胞をクローニングする。陽性反応を示すクローン は、ハイブリドーマに使用されたのと同様のスクリーニング方法で認識される。

細胞のアイソタイピングは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　−７ウス免疫グロブリンサブタイプ同定キツトを用いて行 う。プレートを覆うのに２つの抗原を使用する。Ｃａｐｐｅｌのアフィニティー 精製されたヤギ抗−マウスＩｇＧ−重鎮と軽鎖を１：５０の希釈で使用する。第 二の抗原は３０ｋＤａ抗原Ｂｂポリペプチドである。一旦ハイブリドーマ細胞の クローニングに成功すると、それらは大量に増殖させることができる。抗体濃度 は１０〜１００μｌ／ｍｌになるものと予測される。

民生■ユ この具体例は、ライム病を検出するために考えられた免疫診断法を説明するもの である。この具体例は、ＥＬＩＳＡ型分析法に基づいているが、他の種類のイム ノアッセイも考えられる。病毒力を有するライム病に特異的なタンパク質と、そ のタンパク質または抗原性を持つ抗原決定基に対するモノクローナル抗体を利用 すれば、ライム病に特異的なテストを開発することができるので、イムノアッセ イは３０ｋＤａ抗原だけを利用することにはならすいことが理解されるであろう 。

ライム　のＥＬＩＳＡ ３０ｋＤａタンパク質またはその一部は、組み換えＤＮＡベクターによって大量 に生産され、精製される。あるいは、合成ペプチドを抗原として利用することが できる。

抗原の最適濃度は、連続２倍希釈法を用いて、チェッカーボード滴定によって決 定される。５０μｌの蒸留水または０．０５Ｍ　ＮａＨＣＯ３に入れた抗原を、 ポリスチレン微量力価プレートに添加し、３７℃で１８〜２０時間インキュベー トして乾燥させる。緩衝液だけでインキュベートしたウェルが抗原の対照となる 。使用前に、プレートをＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄する。

ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０中の上記の３つの血清プールの２倍希釈（ウェル当た り６０μｌ）を、開始時の希釈率を１：２５として、３本ずつ検査する。加湿室 において３７℃で１時間インキュベーション後、プレートを５回洗浄し、最適希 釈濃度のヤギ抗−ヒトＩｇＭまたは抗−ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ複合 体（に５００から１：２０００）と共にインキュベーションする。ｐ−ニトロフ ェニルホスフェートを基質として使用し、反応は、５０μｌの３Ｎ　ＮａＯＨに より３０分で止める。Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡ読み取り器を使用して、４ ０５ｎｍで吸光度を測定する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０を希釈剤として検査を 通して使用する。ブロック段階とインキュベーション段階全てに関して、より複 雑な希釈緩衝液（Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）を使用する ことによるバックグラウンド低下作用を評価する。Ｂｂ株全体を使用して、標準 免疫蛍光法（ＩＦＡ）とＥＬＩＳＡ分析を比較のために行う。ＥＬＩＳＡを繰り 返し行うことによって得られた結果の再現性によって、反応性のカットオフ値は 、陰性対照ウェル全体の吸光度の一定の差（例えば、０．２）か、または陰性対 照ウェルの上の３つの標準偏差のいずれかとして設定される。血清の力価は、反 応性を示す最後の希釈度として定義される。

一旦最適条件が確立されたら、真の陽性（感染初期と末期）、真の陰性、偽陽性 、偽陰性であることが証明された血清を含む定義された血清を入れた約１００個 のウェルから構成されるパネルの反応性を検査し、ＩＦＡとＢｂ株全体を使用す るＥＬＩＳＡ分析と比較する。イムノプロット反応性も測定する。３０に分析の 特異性と鋭敏度を、異なる感染段階で、異なる種類のＢｂ株で感染させたマウス の血清を検査することによって、更に検討することができる。これらの結果から 、各分析法のセロコンバージョンの相対的な経過が示され、異なる菌株による感 染が、抗−３０に力価の変動を引き起こすかどうかも明らかにされる。

３０ｋＤａ抗原の反応性を有する抗原決定基を、分離された３０ｋＤａタンパク 質から産生されるペプチドフラグメントを検査することによって、あるいはタン パク質のアミノ酸のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析によって同定することが できる。親水性を示す値が１．０以上は、２２−５４．６７−８７．１１１−１ １５．１２８−１３４．１５３−１７８．１８４−１８６．２０９−２２６のア ミノ酸セグメントの間に認められた。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性およびＫ ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）分析を使用して抗原領域を予測すると 、２３−５４．６４−８７．１゜６−１１４．１２８−１３３．１５２−１８８ ．２０８−２２６の領域が示された。親水性分析は、３０ｋＤａタンパク質の親 水領域を同定するために使用された（Ｈｏｐｐ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９８１） ）。タンパク質の疎水性および親水性領域の図解が、図８に示されている。対応 する露出した表面、の基が図１０に示されている。３０ｋＤａアミノ酸配列全体 に関するこれらのデータに基づく抗原性の予測図が図９に示されてコードしてい るＤＮＡの完全な配列が決定された。従って、このＤＮＡセグメントのプライマ ーは簡単に明らかにでき、ＰＣＲ法を利用して、組織、血液または血清等の生物 標本中の３０Ｋ　ＤＮＡまたはそのＤＮＡセグメントを増幅することができる。

以下の具体例は、感染患者から採取した試料中の３０Ｋ　ＤＮＡを鋭敏に測定す るために有用と考えられるＰＣＲ法に関する説明である。

ライム病の　いのある、におけるＢｂ　のオリゴヌクレオチドプライマーは、図 ２のＤＮＡ配列のセンスまたはアンチセンス鎖のセグメントから作成される。プ ライマーは、標準ホスホルアミダイト化学によって合成される。Ｔａｑ　ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　、ノーウオーク、コネチ カット州）、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオチド（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、ビスキャタウエイ、ニューシャーシー州）、１４　ｇ　２÷の 濃度と、増幅サイクルの長さ、回数、温度を最適な条件とする。

増幅反応は全て、最終容量１００μｌにおいて実施される。典型的な反応は、５ ０ｍＭ　ＫＣＩ、　１０ｍＭトリス塩酸、３　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ８，３， １００μｍ７ｍ１ゼラチン、７０ピコモルのプライマー、３００ＭＭデオキシリ ボヌクレオチド、２．５０のＴａｑポリメラーゼ、Ｂｂ株を含んでいる疑いのあ る生体体液試料を含み、プライマーが標的ＤＮＡに確実に接近できる様に処理さ れた（例えば、細胞溶解）。

反応は、サーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）内で以下 の様に４０サイクル行われる。　（１）　９４℃で１分１５秒間変性さＯ，（２ ）　６０℃で１分１５秒間、アニーリングし、（３）　７２℃で１分間の延長、 更に１０分間行い、分析まで保存する。汚染による偽陽性を予防するために、全 ての標本は、主検査室から離れたＰＣＲ専用施設内で層流ドラフト下に調製され る。

試料は、反応容量の１０分の１（１０μｌ）を取り出し、０．０８９Ｍ　トリス 塩酸、０．０８９Ｍホウ酸塩、０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液を含む １％アガロースゲル上で電気泳動を行イ、０２５Ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染 色して分析する。

ゲルは、紫外線下に写真を取り、一部は、サザンプロット分析のために、０２μ ｍの孔サイズのニトロセルロースに移す。他の標本は、　ドツトプロットＤＮＡ −ＤＮＡハイブリッド形成を行うために、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ　ｌ装置を使用して 、直接ニトロセルロースに加える。

ハイブリッド形成のためのＤＮＡプローブは、図２に示されるＤＮＡから選択さ れた多くのＤＮＡのいずれからでも作成される。プローブを、無作為の６個のヌ クレオチド標識を行い、　［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで放射能標識する。

サザンおよびドツトプロットハイブリッド形成をＩＭ　Ｎａｃｌ、１０％硫酸デ キストラン、１％ＳＤＳ　、　１００　μｇ／ｍｌの切断されたサケの精子ＤＮ ＡとＩ　Ｘ　１１０８ｃｐ／ｍｌの標識プローブ内で６５℃で一晩行う。ハイブ リッド形成後、プロットを２２℃で２　ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで３回洗浄 後、６５℃で同様の洗浄を２回行う。オートラジオグラフィーを一７０℃におい てエックス線フィルム上で、プローブの特異的活性により、１時間から２４時間 実施する。

本発明は、本発明の実行にあたって望ましい方法を構成する様に、発明者によっ て発見された特定の具体例に関して述べられている。本技術分野に精通する者は 、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、特定の例証された具体例におい て多数の修正と変更が可能であることを本報告に照らして理解するものと考える 。その様な修正方法は全て本請求の範囲内に含まれるものと考えられる。

参考文献 以下の参考文献は、背景技術を補足し、説明し、提供し、あるいはここに開示さ れた方法、技術、および／または組成物を教示する程度に、参照することによっ て本明細書の一部とする。

Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　ＤＮＡ、　２．１８３　（１９８３）Ａｎｄ ｅｒｓｏｎ、　Ｊ、Ｆ、、　Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ、　Ｌ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｍ ｃＡｎｉｎｃｈ。

Ｊ、Ｂ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６．２２０９−２２ １２　（１９８８）Ａｒｉｍｉｔｓｕ、　Ｙ、、　Ｔａｋａｓｈｉｍａ、　１． 、　Ｙｏｓｈｉｉ、　Ｚ、、　）ｌｉｇａｓｈｉ。

Ｙ、、　Ｋａｍｅｙａｍａ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、　Ｊ、、 　Ｊ、　ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、、　１６３．６８２−６８３　（１９９１）Ｂａ ｒｂｏｕｒ、　Ａ、Ｇ、、　Ｙａｌｅ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　５７．５ ２１−５２５Ｂａｒｂｏｕｒ、　Ａ、Ｇ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、　２６．４７５−４７８Ｂａｒｔｈｏｌｄ、　Ｓ、Ｗ、、　Ｂｅｃｋ、 　Ｄ、Ｓ、、　Ｈａｎｓｅｎ、　Ｇ、Ｍ、。

Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、　Ｇ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｍｏｏｄｙ、　Ｋ、Ｄ、、　 Ｊ、　ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ　出、　１３３−１３８　（１９９０）Ｂｅａｕｃａ ｇｅ、　Ｓ、Ｌ、、　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅ ｔ。

Ｌｅｔｔ、２２．　１８５９−１８６２　（１９８１）Ｂｅｒｇｓｔｒｏｅｍ、 　Ｓ、、　Ｂｕｎｄｏｃ、　Ｖ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｂａｒｂｏｕｒ、　Ａ、Ｇ、。

Ｍｏ１ｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３．　４７９−４８６　（１９８９）Ｂｏｌ ｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２．　９５　（１９７７）Ｂｕｒｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３．　１７１５−２６　（ １９９０）Ｃｅｎｔｅｒｓ　Ｄｉｓ、　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅ ａｓｅ−−Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ。

Ｍｏｒｂｉｄ、　Ｍｏｒｔａｌ、　Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｐ、　３７　（１）、１ −３　（１９８８）Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ 、Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ−−Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、１９８７　ａｎ ｄ　１９８ｇ、Ｍｏｒｂｉｄ、Ｍｏｒｔａｌ。

Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｐ、３８　（３９）、６６８−６７２　（１９８９）Ｃｈａ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３７５，６１５　（１９７８）Ｃｒａｆｔ 、　Ｊ、Ｅ、、　Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ、　Ｒ，Ｌ、、　ａｎｄ　５ｔｅｅｒｅ、 　Ａ、Ｃ，。

Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１４９．　７８９−７９５　（１９８４）Ｃｒｅａ 　ｅｔ　ａｌ、、１９７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ 、Ａ、。

７５：５７６５ Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３Ｆｉｋ ｒｉｇ、Ｅ、、Ｂａｒｔｈｏｌｄ、Ｓ、Ｗ、、Ｋａｎｔｏｒ、Ｆ、Ｓ、、ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ，Ａ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０，５５３−５５６　（１９ ９０）Ｇａｒｎｉｅｒ、Ｊ、、Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ、Ｄ、Ｊ、ａｎｄ　Ｒｏｂ ｓｏｎ、Ｂ、。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１２０．９７−１２０　（１９７Ｂ）Ｇｏｄｉｎｇ、 　Ｊ、Ｗ、、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３９゜Ｇｏ ａｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８．４０５ ７　（１９８０）Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、１９７９．　Ｎａｔｕｒｅ、２ ８１：５４４Ｇｏｏｄｍａｎｎ、　Ｊ、Ｌ、、　Ｊａｒｋｏｖｉｃｈ、　Ｐ、、 　Ｋｒａｍｂｅｒ、　Ｊ、Ｍ、　ａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ、Ｒ，Ｃ，、Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｉｍｍｕｎ、５９，２６９−２７８　（１９９１）ｌｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、 ’（１９６８）Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、７：１４９Ｈｉｎｎｅｂｕ ｓｃｈ、　Ｊ、、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｅｍ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｂａｒｂｏｕｒ、Ａ、 Ｇ、。

Ｍｏ１ｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４，８１１−８２０　（１９９０）Ｈｉｔ ｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５．２０７ ３　（１９８０）Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　１７：４９００Ｈｏｐｐ、　Ｔ、Ｐ、ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ、　Ｋ 、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８．　３８２４−３８２８　（１９８１）Ｉｔａｋｕｒａ　 ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．１０５６　（１９７７）Ｊｏｈｎｓ ｏｎ、　Ｒ，Ｃ，、ａｎｄ　Ｋｏｄｎｅｒ、　Ｃ，Ｂ、、　Ａｂｓｔｒ、　Ｇｅ ｎ、　Ｍｔｇ。

Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　Ｄａｌｌａｓ、　Ｅ−３５， ｐ、１２３　（１９９１）Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８４．　１２　（１ ９７７）Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　Ｌ　１４１　（１９ ７９）Ｋｕｒｔｉｉ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｍｕｎｄｅｒｌｏｈ、　Ｕ、Ｇ、、Ｊｏｈ ｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｃ，。

ａｎｄ　Ａｈｌｓｔｒａｎｄ、Ｇ、Ｇ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２５゜Ｋｙｔｅ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ，Ｆ、、Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、、１５７゜１０５−１３２　（１９８２）。

Ｌｅｂｅｃｈ、　Ａ、−Ｍ、、　Ｈｉｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｐ、、　Ｖｕｕｓｔ 、　Ｊ、　ａｎｄＭａｇｎａｒｅｌｌｉ、Ｌ、Ａ、、Ｍｅｅｇａｎ、Ｊ、Ｍ、、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｆ、。

ａｎｄ　Ｃｈａｐｐｅｌｌ、Ｗ、Ａ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２ ０゜Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ、Ｌ、Ａ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｆ、、ａｎｄ　 Ｂａｒｂｏｕｒ。

Ａ、Ｇ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１５９．　４３−４９　（１９８９）Ｍ ａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｐ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．１００３５−１ １００３８（１９８７）　ｅｔ　ａｌ、１９８１．Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａ ｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、ＥｄｉｔｏｒＡ、Ｗａｌｔｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｍｏｏｄｙ、に、Ｄ　、Ｂａｒｔｈｏｌｄ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｔｅｒｇｗｉｌｌｉ ｎｇｅｒ。

Ｇ、Ａ、、（１９９０）、＋Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ　ｉｎ　ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙａｎｉｍａｌｓ、ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　５ｐｅｃｉｅ ｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｐａｓｓａｇｅ　ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｎｏｒｒ ｉｓ、Ｓｊ、、Ｃｈａｒｏｎ、Ｎ、Ｗ、、Ｃｏｏｋ、Ｒ，Ｇ、、Ｆｕｅｎｔｅｓ 。

Ｍ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｌｉｍｂｅｒｇｅｒ、Ｒ，Ｊ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １７０゜０°Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、Ｚ、、　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｈ，Ｍ、、　 ａｎｄ　Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ。

Ｐ、Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　１２．　１１３３−１１４２　（１９７７）Ｒａｈｎ、Ｄ 、Ｗ、ａｎｄ　Ｍａｌａｗｉｓｔａ、Ｓ、Ｅ、、Ａｎｎａｌｓ　Ｉｎｔ、Ｍｅｄ 。

Ｓａｄｚｉｅｎｅ、　Ａ、、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｄ、Ｄ、、　Ｂｕｎｄｏｃ、　 Ｖ、Ｇ、、　Ｈｏ１ｔ。

Ｓ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｂａｒｂｏｕｒ、　Ａ、Ｇ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖ、 、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓＳｃｈｍｉｄ、　Ｇ、Ｐ、、　Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、　 Ｄｉｓ、　Ｌ　４１−４９　（１９８５）Ｓｈａｎａｆｅｌｔ、　Ｍ、−Ｃ，、 Ｈｉｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｐ、、　Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｃ，。

Ｍｅｎｓｉ、Ｎ、、Ｔｕｒｃｋ、ＣＪ、、Ｗｅｂｂ、Ｄ、、Ｙｓｓｅｌ、Ｈ，ａ ｎｄＰｅｌｔｚ、Ｇ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４６．　３９８５−３９９２ 　（１９９１）Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　２０．　２ ６９　（１９８０）Ｓｔｅｅｒｅ、Ａ、Ｃ，、Ｍａｌａｗｉｓｔａ、Ｓ、Ｅ、、 Ｓｙｎｄｍａｎ、Ｄ、Ｒ，ｅｔａｌ、、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、２０ ．　７−１７　（１９７？）Ｓｔｅｅｒｅ、Ａ、Ｃ，、Ｔａｙｌｏｒ、Ｅ、、Ｗ ｉｌｓｏｎ、Ｍ、Ｌ、、Ｌｅｖｉｎｅ。

Ｊ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓｐｉｅｌｍａｎ、Ａ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１５４ ゜５ｔｅｅｒｅ、Ａ、Ｃ，、Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ、Ｒ，Ｌ、、Ｋｏｒｎｂｌａｔ ｔ、Ａ、Ｎ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、３０８．　７３３−７４０ 　（１９８３）Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２８２． 　３９　（１９７９）Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　（１９７３）　Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、（ｅｄｓ、）Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、１０．　１５７　（１９８０ ）Ｗａｌｌｉｃｈ、　Ｒ，、Ｈｏｔｅｒ、Ｓ、Ｅ、、　Ｓｉｍｏｎ、　Ｍ、Ｍ、 、Ｅｂｎｅｔ、　Ｋ、。

Ｈｅｉｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、ａｎｄ　Ｋｒａｍｅｒ、　Ｍ、Ｄ、、Ｉｎｆｅｃｔ 、Ｉｍｍｕｎ、。

配列一覧表 （１）一般的情報・ （ｉ）出願者゛テキサスシステム大学評議員会（ｉｉ）発明者：　Ｎｏｒｒｉｓ 、　５ｔｅｖｅｎ　Ｊ。

Ｂａｒｂｏｕｒ、　Ａｌａｎ　Ｇ。

（ｉｆｆ）発明の名称：　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂｂ） の病毒力に関連するタンパク質 （ｉｖ）配列の数、２ （ｖ）問い合わせ先住所 （Ａ）受信人：　Ａｒｎｏｌｄ、　Ｗｈｉｔｅ　＆　Ｄｕｒｋｅｅ（Ｂ）街：　 Ｐ、０．Ｂｏｘ　４４３３（Ｃ）市゛ヒユーストン （Ｄ）州　テキサス （Ｅ）国−アメリカ合衆国 （Ｆ）ジップコード（郵便番号）　：　７７２１０（ｖｉ）コンピューター読み 取り可能形式（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　 ＩＢＮ　ＰＣ互換器（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ− ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア°ワードパーフェクト５．１（ｖｉｉ）現在の出願デ ータ （Ａ）出願番号、不明 （Ｂ）出願日：不明 （Ｃ）分類：不明 （ｖｉｉｉ）前回の出願データ （Ａ）出願番号：　ＵＳ　ＳＮ　０７７７Ｂ１，３５５（Ｂ）出願日：　１９９ １年１０月２２日（Ｃ）分類：４３５ （Ｌｘ）弁護士／代理人に関する情報 （Ａ）氏名：　Ｋｉｔｃｈｅｌｌ、　Ｂａｒｂａｒａ　Ｓ。

（Ｂ）登録番号：　３３，９２８ （Ｃ）照会／処理番号：υＴＦ）１１６２ＰＣＴ（ｘ）電気通信に関する情報 （Ａ）電話：　５１２−３２０−７２００（Ｂ）テレファックス：　５１２−４ ７４−７５７７（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列の特 徴・ （Ａ）長さ：　１０７９　塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の捩れの程度：不明 （Ｄ）形態：線状 （ｉｆ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５７アミノ酸 （Ｂ）種類゛アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｉｉｉ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：り　ｃＩ：　り　） ・　ＩＩＩＩＩＩ　Φ　−ロ ー（（−−Φ り　−−ツ　− ！＝　８　Φ　Φ　囁 ψ　−ベ ニＩ　ψ　ｃ　ｃ　ｇ ＠Ｉ　為ロ　−　ｆ ｔＪ　ｔＪＭ　＜　Ｃ５＆４ Φ　＆４ｍ　ｅ　＆４ ｇ　Φ　−１− Ｑｌ　（１）　ぺ、ぺ　Ｇ り　−　＞　：Ｉ　ロ ！　ＩＩＩ　ｍｅ　ａｔ ψ　Ｃ−１（ −り　り　り　− ！　Ｌｌ　（５−ト 一　論　鎖 プ　：Ｉ　ｅ　し　− 並ヨ切Φ− ぺ　切　ペ ク　ｅ　Ｑ、　り　プ ！　ｍｔｌ’１−Ｐ４ い　４！ｕ り　ＩＪ１　り　＃ａＩＩＩ ＯＪ　＞ ＩＪ　Ｊ　！：　’；＜　ゝ　′ ＠ＱＩ　−細　り 一　− 、，４イ　ν　ＩＪ １１　−　シ　Ｃ１，Ｉ 飄　−−−Φ　ロ ＩＪ　：Ｉ：　（！１　１３　ψト Φ　−ｓ　ｓ　ｇ −−＞　ｈ −〇　〉　−−漏 り　切　ｃ８１＋ φ　ζ０Ｆ−１為　ｌ −υ　Ｎ＠！ｊ　Ｊ　！−１ ｍ　＄、＋　ｃ　し　し ＞　ｌ　Ｉｌｌ　偵　Ｑｌ　Ｊ： Ｊ　ｔＡ　４Ｍ　−− 一　〇　ｃ　５　ｇ ＞　Ｐ４　ψ　−ロ　− 一　Ｈ（ｕ　鎖　ｅ −−〇　：Ｉ　：Ｉ　１：　−り　ロ　―−Φ−Φ　Φ　−〇　−φ　− 〉　り　―　−−Ｃ切　ｔ、ｐ−＞ 帽　切　Ｑｌ　い　Ｃ−コ　−α　膿 −＞　ψ　Ｎ　φ　の　−−切　ロ ペ　−　（−＜　Ｅ　（！ｌ　＞　（ヘコ　−　Φ　−ｏｅ　ｂ　ｍ　＠Ｉ −ｍ　−４＋　豐　φ　Φ　−− ｕ　＞　＋　ＶＪＦ−＋（り　ベ　Ｈ Ｉ１１１＋１１４Ｊａ＋　−り　−　い　１ト　−　ロ　ａ　ｐ−ｔ　Ｆ−Ｉ　 Ｆ−１１＋Ｉｗ　切−ぺ−Ｅ　１ｍ　＜　ｔ！ｌ　＜ｖ−１（１１１、ｌ　−切 　膿　彷　Φ　切　帽−Φ　−＞Ｆｌ　＞　−飄　− ＜　ｖＩ　＜　ｗ　−Ｊ　−−＜ Σ　） Σ　°　′ （／ｌ　１　＋Ｌ　ｅ　Ｍ　ｒ’　ｔ。

ＨＩＧ）ｌ　ＬＯＷ ２、Ｏｋｂ− ＷＳ Ｏ，５ｋｂ− ＦｆＧ、４Ａ ＨＩＧ）ｌ　ＬＯＷ ＦＩＧ、４Ｂ ＦＩＧ、８ ″Ｋｌ耐指歓 ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１０ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＥＱＩＤＮＯ：２によって定義されるＤＮＡ配列中の少なくとも７つの塩 基対のセグメントから構成され、かっ、高度に緊縮性の条件下に上記配列と結合 するＤＮＡセグメント。
2. ２．ＳＥＱＩＤＮＯ：２によって定義されるＤＮＡセグメントに対応する少なく とも２０の塩基対のセグメントから構成される請求項１に記載のＤＮＡセグメン ト。
3. ３．ＳＥＱＩＤＮＯ：２によって定義されるＤＮＡセグメントに対応する少なく とも３０の塩基対のセグメントから構成される請求項１に記載のＤＮＡセグメン ト。
4. ４．ＳＥＱＩＤＮＯ：２によって定義されるＤＮＡセグメントに対応する少なく とも４０の塩基対のセグメントから構成される請求項１に記載のＤＮＡセグメン ト。
5. ５．Ｂｂ株の３０ｋＤａ抗原のアミノ酸配列に由来する抗原ポリペプチドをエン コードしている請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
6. ６．抗原ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：１によって定義されている請求項１に 記載のＤＮＡセグメント。
7. ７．２３番目の位置のアミノ酸Ａｓｐから５４番目の位置のアミノ酸Ｇｌｎまで の配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載のＤＮ Ａセグメント。
8. ８．６４番目の位置のアミノ酸Ｌｅｕから８７番目の位置のアミノ酸Ａｌａまで の配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載のＤＮ Ａセグメント。
9. ９．１０６番目の位置のアミノ酸Ａｓｐから１１４番目の位置のアミノ酸Ａｓｎ までの配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載の ＤＮＡセグメント。
10. １０．１２８番目の位置のアミノ酸Ｌｙｓから１３３番目の位置のアミノ酸Ｓｅ ｒまでの配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載 のＤＮＡセグメント。
11. １１．１５２番目の位置のアミノ酸Ａｌａから１８８番目の位置のアミノ酸Ａｌ ａまでの配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載 のＤＮＡセグメント。
12. １２．２０８番目の位置のアミノ酸Ａｓｎから２２５番目の位置のアミノ酸Ｌｙ ｓまでの配列から構成されるアミノ酸配列をエンコードしている請求項１に記載 のＤＮＡセグメント。
13. １３．３０ｋＤａＢｂ抗原またはその抗原性を有するサブフラグメントをエンコ ードしているＤＮＡセグメント。
14. １４．請求項１〜請求項４のいずれか１つに記載のＤＮＡセグメントから構成さ れる組み換えベクター。
15. １５．ＤＮＡセグメントが、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの継代回数の少ない病 毒力を有する株において発現される抗原タンパク質をエンコードしている請求項 １４に記載の組み換えベクター。
16. １６．Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉによる感染が起こったときに 生じるｉｎ　ｖｉｖｏの免疫応答を引き起こすことができ、請求項１〜請求項４ のいずれか１つに記載のＤＮＡセグメントによってエンコードされているアミノ 酸配列から構成される抗原タンパク質。
17. １７．アミノ酸配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１によって定義される請求項１６に 記載のタンパク質。
18. １８．組み換えＤＮＡに由来するＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの実質上精製され た３０ｋＤａポリペプチドから構成される組成物。
19. １９．染色体外ＤＮＡセグメントから構成され、上記ＤＮＡがＢ．ｂｕｒｇｄｏ ｒｆｅｒｉの病毒力に関連する抗原ポリペプチドをエンコードしている組み換え 細胞。
20. ２０．染色体外ＤＮＡセグメントが３０ｋＤａタンパク質をエンコードしている 請求項１９に記載の組み換え細胞。
21. ２１．染色体外ＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ：２によって定義されている請求項２０ に記載の組み換え細胞。
22. ２２．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉまたはＥ．Ｃｏｌｉである請求項２１に記載 の組み換え細胞。
23. ２３．適切な細菌宿主細胞を選択し、 請求項１〜請求項４に記載のいずれかのＤＮＡセグメントを含むベクターまたは プラスミドを作成し、上記選択された細菌宿主細胞を形質転換することからなる 、形質転換細菌宿主細胞の作成方法。
24. ２４．プラスミドまたはベクターが、上記選択された細菌宿主細胞を形質転換し 、抗原タンパク質を発現することができる請求項２３に記載の方法。
25. ２５．抗原タンパク質が、該抗原によって免疫感作された動物において、免疫応 答を刺激する請求項２４に記載の方法。
26. ２６．請求項２３に記載の方法によって作成されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ の形質転換細胞。
27. ２７．請求項１〜請求項４のいずれかに記載のＤＮＡセグメントによってエンコ ードされている１つ以上のポリペプチドから調製される抗原を入手し、該抗原を 製薬的に許容できる希釈剤と混合することからなる免疫原性組成物の調製方法。
28. ２８．試料中に請求項１６または請求項１７に記載のポリペプチドの少なくとも 一部が存在することを検出することからなる、試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒｉの核酸を検出する方法。
29. ２９．請求項１に記載のＤＮＡの選択された部分の増幅を開始できる一連のプラ イマー。
30. ３０．ライム病であることが疑われる患者から試料を入手し、 請求項５に記載のＤＮＡによってエンコードされているＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒｉのタンパク質の抗原決定基に対する１つ以上の抗体に上記試料を接触させ、 上記抗体と、試料中に存在している可能性のあるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの タンパク質の１つ以上の抗原決定基との反応性（該反応性は、ライム病の存在を 示す。）を測定することからなるライム病の診断方法。
31. ３１．試料がヒト血清、脳脊髄液、精液または膣分泌液、またはリンパ液である 請求項２８または請求項３０に記載の方法。
32. ３２．請求項５に記載のＤＮＡによってエンコードされているポリペプチドの少 なくとも１つの抗原決定基に特異的であって、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの無 毒性のタンパク質と交差反応しないモノクローナル抗体。
33. ３３．請求項１６または請求項１７に記載の抗原ペプチドによって動物を免疫感 作することによって作成される請求項３２に記載のモノクローナル抗体。
34. ３４．Ｂｂ３０ｋＤａ抗原タンパク質の抗原決定基と反応する抗体と、該抗体と ３０ｋＤａ抗原タンパク質の抗原決定基との間の特異的な免疫反応を検出するた めの手段とから構成されている、試料中のＢｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｒｉの抗原を検出するためのキット。
35. ３５．３０ｋＤａ　Ｂｂ抗原タンパク質の抗原決定基を含むタンパク質またはペ プチドと、抗体と上記３０ｋＤａ　Ｂｂ抗原タンパク質の抗原決定基との間の特 異的な免疫反応を検出するための手段とからなる、試料中のＢｏｒｒｅｌｉａｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの抗体を検出するためのキット。
36. ３６．３０ｋＤａ遺伝子に特異的な核酸プローブと、該プローブとＢｂ株の核酸 との間の特異的なハイブリッド形成を検出するための手段とからなる、試料中の Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの核酸を検出するためのキット。