WO1998030699A1 - Polynucleotide codant pour un polypeptide de 27 kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et a la prevention de la tuberculose - Google Patents

Polynucleotide codant pour un polypeptide de 27 kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et a la prevention de la tuberculose Download PDF

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WO1998030699A1
WO1998030699A1 PCT/FR1998/000017 FR9800017W WO9830699A1 WO 1998030699 A1 WO1998030699 A1 WO 1998030699A1 FR 9800017 W FR9800017 W FR 9800017W WO 9830699 A1 WO9830699 A1 WO 9830699A1
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dna
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polypeptide
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Jean-Luc Guesdon
Danièle CHEVRIER
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Institut Pasteur
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Polynucleotide encoding a 27kD polypeptide of mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex application to the diagnosis and prevention of tuberculosis.
  • the invention relates to a polypeptide of approximately 27kD corresponding to a structural protein found in mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • the invention also relates to a polynucleotide comprising a sequence coding for this polypeptide.
  • the invention also relates to the nucleotide fragments placed upstream and downstream of the sequence of said polynucleotide which comprise the regulatory and / or expression signals of this gene. It also relates to the use of the polypeptide or fragments thereof and of the polynucleotides coding for the latter for the production of means for in vitro detection of the presence of a mycobacterium belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample.
  • the invention finally relates to the use of the polypeptide or fragments thereof as well as polynucleotides coding for the latter as means intended for the preparation of an immunogenic composition capable of inducing a type B immune response or T, or a vaccine composition for the prevention and / or treatment of infections caused by mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex, in particular tuberculosis.
  • the tuberculosis complex is the group of mycobacteria that includes M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. af ⁇ canum and M. microti.
  • tuberculosis and other related mycobacteria are therefore difficult to make, for various reasons: the pulmonary diseases caused by different mycobacteria cannot be distinguished clinically, radiologically or histologically; mycobacteria are often present in small quantities and when they are in quantities detectable by the conventionally used methods, the disease is already in progress and the patients are contagious to those around them.
  • mycobacteria are often present in small quantities and when they are in quantities detectable by the conventionally used methods, the disease is already in progress and the patients are contagious to those around them.
  • due to the very long generation time of these bacteria 24 hours for M. tuberculosis compared to 20 minutes for E. coli
  • the culture of these organisms is difficult. Thus it takes 6 to 8 weeks to identify the germs (Bâtes et al, 1986) and more to obtain an antibiogram usable for the adequate treatment of patients.
  • the cultures when positive, have a specificity approaching 100% and allow the identification of the isolated mycobacterial species; however, as noted above, growth of mycobacteria in vitro can only be achieved in 3 to 6 weeks and when few mycobacteria are present at the site of infection, repeated cultures are necessary to ensure a positive result (Bâtes, 1979; Bâtes et al, 1986).
  • the identification technique by culture of the bacillus is long and costly because it requires the use of media as a source of carbon, of nitrogen, of numerous growth factors, such as Lowenstein-Jensen or Coletsos media. Colonies appear 15 to 30 days or even 60 days after sowing and must be observed twice a week for a period of two months.
  • the metabolic characteristics of the mycobacteria present in the sample also allow the species to be identified. Among the metabolic characteristics observed are the quantification of the biosynthesis of nicotinic acid (M. tuberculosis produces significantly greater amounts of nicotinic acid than other species), the search for catalase activity or the quantification of reduction nitrates (Bourgoing et al., 1994). b) Serological techniques may prove useful under certain conditions, but their use is sometimes limited by their low sensitivity and / or specificity (Daniel et al., 1987).
  • mycobacteria within a biological sample can also be determined by molecular hybridization with DNA or RNA using oligonucleotide probes specific for the sequences sought (Kiehn et al., 1987; Roberts et al., 1987; Drake et al., 1987).
  • the probes used consist of DNA, ribosomal RNA or non-mycobacterial DNA fragments. characterized and from a gene bank. The principle of these techniques is based on the polymorphism of the nucleotide sequences of the fragments used or on the polymorphism of the surrounding regions. In all cases, they require the use of cultures and are not directly applicable to biological samples.
  • the small quantity of mycobacteria present in a biological sample and consequently the small quantity of target DNA to be detected in this sample may require the use of a specific in vitro amplification of the target DNA before its detection using of the nucleotide probe.
  • the in vitro amplification techniques, in particular PCR have been described in the literature and their implementation and improvements have been the subject of patent applications.
  • the technique called PCR or amplification chain reaction using the polymerase which was first described in 1985 by Saiki et al. and which is the subject of European patents EP 201 184 and EP 200 362.
  • the PCR technique is now widely used for clinical diagnosis (Erlich, 1989; Innis, 1990; Rolfs, 1991), for example for typing tumors or tissue, or for the identification of pathogenic bacteria or viruses.
  • the specific amplification of DNA by the PCR technique can constitute the first step of a method for detecting the presence of mycobacterial DNA in a biological sample, the actual detection of the amplified DNA being carried out in a second time using an oligonucleotide probe capable of hybridizing specifically to the amplified DNA.
  • a particular embodiment of the detection of amplified DNA using a specific probe is represented by the so-called “sandwich” hybridization technique. This technique uses a first nucleotide probe (capture probe) fixed on a solid support, which is used to capture the gene or the gene fragment to be detected in the sample.
  • a second probe complementary to another region of the DNA to be detected, allows the detection of the latter via a marker such as a radioactive marker (Dunn et al., 1977; Ranki et al., 1983; Palva et al., 1984; Polsky-Cynkin et al., 1985).
  • the sandwich hybridization method can also be carried out in addition; " , ::: in a single step the sample to be analyzed and the detection probe in a container where the capture probe fixed on the support is located.
  • a method of detecting small amounts of mycobacteria, belonging to the tuberculosis complex, by gene amplification and hybridization directly on biological samples has been developed.
  • Said method uses the insertion sequence IS6770 (European patent EP 0 490 951 B1).
  • Thierry et al. in 1990 described a specific sequence of the Mycobacterium tuberculosis complex and called IS 6110.
  • Some authors have proposed to specifically amplify the DNA originating from Mycobacterium by using nucleic primers in an amplification method, such as the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Patel et al. described in 1990 the use of several nucleic primers chosen from a sequence known as a probe in the identification of M. tuberculosis.
  • tuberculosis of high sensitivity, by amplification of a DNA fragment of M tuberculosis located within the sequence IS6110 (European patent EP 461,045 ) using primers generating amplified DNA fragments of constant length, even when the choice of primers led to the amplification of long fragments (of the order of 1000 to 1500 bases) where the risk of interruption of the polymerization is high due to the effects of the secondary structure of the sequence.
  • Other primers specific for the sequence IS61 10 are described in European patent No. EP-0 490 951. The inventors have shown that certain clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis were free from the IS61 insertion sequence and therefore could not be detected using the oligonucleotides specific for this sequence.
  • Mycobacterium tuberculosis and which do not have the drawbacks of the sequences of the prior art.
  • the inventors have searched for sequences which can be found in all the mycobacteria belonging to the tuberculosis complex, including in strains which do not contain the sequence IS 61 10.
  • the inventors have thus characterized a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence present in all the tested strains of mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex, including in strains which do not contain the sequence IS6110.
  • This nucleotide sequence contains an open reading frame (ORF) encoding a 27 kD polypeptide.
  • ORF open reading frame
  • signals regulating the expression of the coding sequence have been identified upstream and downstream of the latter.
  • the invention relates to a polynucleotide of 2805 base pairs, specific for the tuberculosis complex.
  • This polynucleotide includes the sequence corresponding to a structural gene called? 27, which codes for a protein with a molecular weight of approximately 27 kDa, appreciated with a margin of error of 10%.
  • structural gene for the purposes of the present invention is meant a polynucleotide encoding a protein, a polypeptide or a fragment thereof, said polynucleotide comprising only the sequence corresponding to the framework open reading frame (ORF), which excludes the sequences on the 5 'side of the open reading frame (ORF) which direct the initiation of transcription.
  • ORF framework open reading frame
  • the invention relates to a polynucleotide characterized in that it is chosen from: a) a polynucleotide comprising at least 8 consecutive nucleotides of the following sequence of nucleotides (SEQ LD N ° 1):
  • polynucleotide or nucleic acid according to the present invention is understood to mean both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • polynucleotide of complementary sequence is meant any DNA whose nucleotides are complementary to those of SEQ ID N ° 1 or part of SEQ
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows: the hybridization is carried out at a preferential temperature of 65 ° C., in the presence of buffer 6 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05M Na citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin.
  • the washing steps can, for example, be as follows:
  • the invention also relates to a polynucleotide comprising the open reading frame coding for a polypeptide with a molecular weight of the order of 27 kD.
  • a polynucleotide comprising the open reading frame coding for a polypeptide with a molecular weight of the order of 27 kD.
  • it consists of a sequence having an open reading frame (ORF) which comprises at its 5 ′ end the AT G codon, and at its 3 ′ end the TGA codon.
  • said polynucleotide comprises nucleotides 934-1665 of the polynucleotide of sequence SEQ LD No. 1 and the fragments thereof, as well as the sequences which have at least 80% homology with said polynucleotide or said fragments.
  • percentage of homology within the meaning of the present invention is meant a percentage of identity between the bases of the two homologous polynucleotides, this percentage being purely statistical and the differences between the two polynucleotides being distributed randomly and over their entire length.
  • polynucleotide of sequence SEQ ID NX was named p27 by the inventors and in particular includes the following restriction sites: AluI, BamHI, BstI, EcoRII, HaelII, SacII, Sali. Table I: Restriction sites of SEQ ID N ° 1
  • fragments of the polynucleotide of sequence SEQ LD No. 1 are the following fragments:
  • the above fragments both comprise the entire open reading frame coding for the P27 protein.
  • the invention thus relates to a polynucleotide characterized in that it is chosen from: a) a polynucleotide comprising at least 8 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence (SEQ DN 2) as follows: ATGCCCAATTTCTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCC GGGTTCTGGCCCGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGG AAAAGACGAAGGTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGT CAGTCGTCGCAGGCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGAC CGCCGAGCACGCCCATAAGACCGCGATCCAGCTCACGGCGAACGCC
  • the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprises the regulatory and / or expression signals of the structural gene p27, located respectively on the 5 'and 3' side and in the vicinity of this gene.
  • sequences of the transcription and translation signals of the p27 gene have been determined. These are the following sequences: a sequence of Shine-Dalgarno type of attachment to the ribosome is the following sequence, going from the nucleotide in position nt 919 to the nucleotide in position nt 925 of SEQ ID N ° 1: 5'-AGGGAGT -3; the box -10 of the promoter of the p27 gene is the following sequence, going from the nucleotide in position nt 802 to the nucleotide in position nt 807 of SEQ LD No. 1: 5'-GAAATT-3 ';
  • the box -35 of the promoter of the p27 gene can consist of one of the following sequences:
  • a transcription terminator sequence having a “dyad symetry” type structure is the following sequence, going from the nucleotide in position nt 1909 to the nucleotide in position nt 1959 of SEQ ID N ° 1: 5'-
  • the present invention thus relates to a nucleic acid characterized in that it comprises the natural regulation and / or expression signals of the 27 kD protein of M tuberculosis, located near the SEQ LD N ° 2, on side 5 'and on the 3' side of SEQ LD N ° 2.
  • such a polynucleotide will contain at least one sequence comprising the sequence of nucleotides ranging from the nucleotide in position nt 776 to the nucleotide nt 1665 of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to a nucleotide fragment characterized in that it is capable of hybridizing under stringent conditions with a sequence as defined above.
  • the mycobacterial polypeptide according to the invention has the following amino acid composition:
  • the present invention also relates to a 27 kD polypeptide, designated P27, of M tuberculosis, characterized in that it is chosen from: a) a polypeptide whose sequence comprises the chain of amino acids SEQ LD No. 3 next :
  • Such a polypeptide is capable of being recognized specifically by the antibodies present in the serum of patients infected with mycobacteria belonging to the Mycobcaterium tuberculosis complex.
  • fragments of the polypeptide P27 of sequence LD No. 3 which can be obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme, such as trypsin or chymotrypsin or collagenase, or by a chemical reagent, such as cyanogen bromide (CNBr) or by placing the P27 polypeptide in a very acidic environment, for example at pH 2.5.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin or chymotrypsin or collagenase
  • a chemical reagent such as cyanogen bromide (CNBr)
  • peptide fragments according to the invention are the fragments appearing in Annex 2 of the description.
  • each of the fragments can be deduced from the fact of the indication, for each of the fragments, respective positions of the N-terminal amino acid and of the C-terminal amino acid, the numbering being in accordance with that of the P27 polypeptide of sequence SEQ ID No. 3.
  • the column “Chg” corresponds to the net charge of the peptide fragment considered
  • the "Aro” column indicates the number of amino acids of aromatic type contained in this peptide fragment
  • the “Acid” and “Base” columns indicate respectively the number of acidic or basic amino acids contained in said peptide fragment
  • the “tallow” column indicates the number of Cysteine residues in the peptide fragment
  • the “Phil" and “Phob” columns indicate the number of hydrophilic or hydrophobic residues present in the peptide fragment considered.
  • Preferred peptide fragments according to the invention, for use in diagnosis or in vaccination are the fragments contained in regions of the P27 polypeptide capable of being naturally exposed to the solvent and thus exhibiting significant immunogenicity properties.
  • Such peptide fragments can be prepared indifferently by chemical synthesis, from hosts transformed with an expression vector according to the invention containing a nucleic acid allowing the expression of said fragments, placed under the control of regulatory elements and / or appropriate expression or by chemical or enzymatic cleavage, as has been more particularly described above.
  • regions of the P27 polypeptide with a high antigenicity index can be identified. These are the following regions, designated by the positions of the amino acids N- and C-terminal, in accordance with the numbering of SEQ LD N ° 3, the amino acid in position 1 being methionine coded by the codon ATG:
  • regions of the P27 polypeptide detailed above constitute the preferred regions which a preferred peptide fragment according to the invention should contain.
  • Such a fragment can advantageously comprise one or more of these regions potentially exposed to the solvent and having a high immunogenic capacity.
  • polypeptides homologous to the polypeptide of sequence SEQ LD No. 3 are also included in the invention.
  • homologous polypeptide for the purposes of the present invention, is meant a polypeptide comprising one or more deletions and / or substitutions of amino acids in the sequence SEQ LD No. 3.
  • substitution one or more amino acids - consecutive or non-consecutive - are replaced by “equivalent” amino acids.
  • equivalent amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, essentially modifying the immunogenic properties of the corresponding peptides.
  • the equivalent amino acids will be those which make it possible to obtain a polypeptide of modified sequence which allows the in vivo induction of antibodies capable of recognizing the polypeptide of sequence SEQ ID No. 3 or one of its frag m ents defined above.
  • These equivalent aminoacyles can be determined either on the basis of their structural homology with the aminoacyles for which they are substituted, or on the results of the cross immunogenicity tests to which the different peptides are liable to give rise.
  • substitutions which may be carried out without resulting in a profound modification of the immunogenicity of the corresponding modified peptides, the replacements, for example, of leucine by valine or isoleucine, aspartic acid by glutamic acid, glutamine by asparagine, arginine by lysine etc., the reverse substitutions being naturally possible under the same conditions.
  • the invention also relates to a nucleic acid characterized in that it codes for a polypeptide of sequence SEQ LD No. 3 or a polypeptide homologous to the polypeptide of sequence SEQ LD No. 3 or also a fragment of the latter, as defined above. - above.
  • the P27 sequence has sequence homologies with a protein of
  • M. leprae 408 amino acids, rich in serine (Serine-Rich Antigen), from M. leprae, designated Sra (Vega-Lopez et al., 1993). It was thus determined, on the one hand that the homology between the sequence of P27 and the Sra sequence of M. leprae is restricted to the first 207 N-terminal amino acids and on the other hand that the percentage of homology between P27 and the protein Sra (estimated PM: 42.5 KD) is 34% of these 207 amino acids (Fig. 4).
  • the M. leprae protein Sra itself has a low degree of homology with a hypothetical 51 kD antigen of M tuberculosis described by Shinnick in 1987, in particular in the N-terminal region.
  • the P27 protein While the M. leprae Sra protein has 30% serine in a central region, the P27 protein only has 5% serine but, on the other hand, has 12% alanine. Consequently, the protein P27 according to the invention cannot be assimilated to a member of the family of proteins rich in serine of the type of the protein Sra of leprae.
  • the theoretical isoelectric point of the P27 protein was determined using Isoelectric software (sold by Genetics Computer Group, Inc., 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 5371 1, USA). It is 4.59 (Fig. 3), which makes it possible to classify P27 among the acid proteins
  • the invention also relates to nucleotide fragments complementary to the preceding ones, as well as fragments modified with respect to the preceding ones, by removal or addition of nucleotide (s) in a proportion of approximately 15% relative to the length of the above fragments and / or modified in terms of the nature of the nucleotides, provided that the modified nucleotide fragments retain a capacity for hybridization with the DNA sequence of M. tuberculosis, analogous to that presented by the corresponding unmodified fragments, under the conditions of stringency defined above.
  • nucleotide fragment corresponding to the preceding definition will have at least 8 nucleotides, preferably at least 12 nucleotides, and even more preferably at least 20 consecutive nucleotides of SEQ LD No. 1.
  • fragments can be used as primers for carrying out amplification reactions, or as probes.
  • sequences SEQ LD N ° 1 and SEQ LD N ° 2 or the fragments obtained from these sequences can thus be used to select nucleotide primers, in particular for the PCR technique.
  • oligodeoxyribonucleotide or oligoribonucleotide primers advantageously have a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 12 nucleotides, and again more preferably at least 20 nucleotides. In particular, primers with a length of between 8 and 30 and preferably 12 and 22 nucleotides are preferred.
  • One of the two primers is complementary to the strand (+) [go primer] of the matrix and the other primer is complementary to the strand (-) [return primer].
  • the primers do not have a secondary structure or sequence complementary to each other.
  • the length and the sequence of each primer must be chosen so that the primers do not hybridize with other nucleic acids originating from prokaryotic or eukaryotic cells, in particular with nucleic acids originating from mycobacteria. not belonging to the tuberculosis complex nor with human DNA or RNA which could possibly contaminate the biological sample.
  • the amplified fragments can be identified after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after capillary electrophoresis, or even after a chromatographic technique (gel filtration, hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography).
  • the specificity of the amplification can be checked by molecular hybridization using as probes the nucleotide sequences SEQ LD No. 1 or SEQ LD No. 2, fragments thereof, plasmids containing these sequences or fragments thereof. , oligonucleotides complementary to these sequences or fragments of sequences or amplification products.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • amplified nucleotide fragments are also part of the invention.
  • amplicons may or may not be labeled with radioactive elements or with non-radioactive molecules, such as enzymes or fluorescent elements.
  • Particularly interesting primers respond to the following sequences, the nucleotide positions indicated corresponding to the numbering of the p27 gene of SEQ LD No. 2:
  • n ° 2 nt 669 to nt 651 of SEQ LD N ° 2 (return primer);
  • Primer n ° 4 nt 668 to nt 651 of SEQ LD N ° 2 (return primer);
  • - Primer n ° 5 nt 564 to nt 582 of SEQ LD N ° 2 (primer go);
  • n ° 6 nt 667 to nt 650 of SEQ LD N ° 2 (return primer);
  • n ° 8 nt 600 to nt 583 of SEQ LD N ° 2 (return primer);
  • Primer n ° 1 1 nt 572 to nt 589 of SEQ ID N ° 2 (primer go); Primer n ° 12 nt 686 to nt 668 of SEQ LD N ° 2 ('return primer);
  • Primer n ° 39 nt 577 to nt 594 of SEQ LD N ° 2 (primer go);
  • Primer n ° 40 nt 689 to nt 671 of SEQ ID N ° 2 ⁇ primer back);
  • Primer n ° 41 nt 422 to nt 439 of SEQ ID N ° 2 (primer go);
  • Primer n ° 42 nt 601 to nt 584 of SEQ LD N ° 2 ⁇ primer back).
  • Such nucleotide primers can be used two by two in order to amplify specific regions of SEQ LD No. 1 or SEQ LD No. 2.
  • Couple P10 Primer n ° 17 and Primer n ° 18
  • Couple PI 1 Primer n ° 19 and Primer n ° 18
  • Couple PI 5 Primer n ° 24 and Primer n ° 25
  • Couple PI 6 Primer n ° 26 and Primer n ° 27
  • the primers appear in detail in appendix 1 with their characteristics, in particular the Tm of the primer.
  • the invention also relates to the nucleotide fragments obtained by amplification of the polynucleotide of sequence SEQ LD No. 1 or SEQ LD No. 2 using a pair of primers according to the invention, more particularly using l 'Any of the pairs of primers PI to P25 according to the invention.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as alternatives to PCR.
  • the SDA (Strand Displacement Amplification) technique or strand displacement amplification technique is an isothermal amplification technique, the principle of which is based on the ability of a restriction enzyme to cut the one of the two strands of its recognition site which is in a hemiphosphorothioate form and on the property of a DNA polymerase to initiate the synthesis of a new strand of DNA from the 3 'OH end created by l restriction enzyme and to move the previously synthesized strand which is downstream.
  • the method has two main stages: a). Synthesis, in the presence of dCTP-alpha-S, of DNA molecules flanked by restriction sites which can be cut by an appropriate enzyme, b). Exponential amplification of these DNA molecules thus modified, by enzymatic cleavage, strand displacement and copying of the displaced strands. The cutting, moving and copying steps are repeated a sufficient number of times in order to obtain good sensitivity.
  • the protocol of the SDA technique is simple: the target DNA present in the sample to be analyzed is denatured by heat in the presence of all the reagents except the enzymes (restriction enzyme and polymerase) which are added to the reaction medium after the denaturation stage.
  • the restriction enzyme HincII (Walker et al, 1992)
  • the SDA technique is simpler to perform than PCR (a water bath is sufficient) and it is faster than other amplification techniques.
  • SDA has been applied mainly to the detection of Mycobacterium tuberculosis. Its detection threshold is equivalent to a mycobacterial genome containing 10 copies of the sequence
  • Another object of the present invention is therefore the use of the oligonucleotide primers according to the invention in a DNA or RNA amplification method according to the SDA technique above.
  • two pairs of primers are used: a pair of external primers (B1, B2) consisting of a specific sequence of SEQ LD N ° 1 or SEQ LD N ° 2 or their complementary sequence, and a pair of internal primers (Si, S2) consisting of a fusion oligonucleotide between a specific sequence of SEQ LD N ° 1 or SEQ LD N ° 2 or their fused complementary sequence to a nucleotide sequence containing a site recognized by a restriction endonuclease, for example the enzyme BsoB1.
  • the primers according to the invention in an SDA type amplification method, it is possible, to produce a primer which can be used in an SDA reaction, add, at the 5 ′ end of the region of the specific primer of SEQ LD No. 1 or SEQ LD No. 2 according to the invention, a non-specific sequence of SEQ LD No. 1 or SEQ LD No. 2 containing a restriction site, and more particularly a site of restriction recognized by the endonuclease HincII or BsoBl.
  • Such an additional sequence containing the restriction site recognized by the ifaoBI endonuclease is advantageously the nucleotide sequence GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, the nucleotides represented in bold characters corresponding to the recognition site of the enzyme BsoB1.
  • a primer according to the invention which can be used in the context of an SDA type amplification can be produced from the sequence of primer n ° 1, and will consist of the sequence GCATCGAATGCATGTCTCGGGTATGCTCAACACCGTGTTC. in which the nucleotides represented in bold type corresponding to the recognition site of the BsoB1 enzyme and the underlined nucleotides correspond to the specific sequence of the target DNA, in this case the sequence consisting of nucleotides nt547 to nt564 inclusive of SEQ LD No. 2.
  • the second primer used will be the primer # 2 modified as described above.
  • a second set of primers, amplifying the other end of the target nucleic acid, will be produced as described above.
  • the detection probe will be chosen in such a way that it hybridizes with the amplicon generated.
  • Such a detection probe will advantageously have for sequence a sequence of at least 12 nucleotides, and in particular 15 nucleotides, such as for example the sequence between the nucleotides at positions nt565 and nt650 of SEQ LD No. 2 or of the complementary sequence of the sequence between nucleotides nt565 and nt650 of SEQ LD N ° 2.
  • a specific detection probe corresponding to the above definition will advantageously consist of the sequence between nucleotides 580 and 598 of SEQ LD N ° 2 or of the sequence complementary to the sequence between the nucleotides nt580 and nt598 of SEQ LD No. 2.
  • the invention therefore also relates to nucleotide primers in accordance with the primers described above for the implementation of a DNA amplification technique by strand displacement (SDA).
  • SDA strand displacement
  • tuberculosis Prior to the addition of HincII, exo ' Klenow and MgCl 2 , the incomplete reactions (40 ⁇ l) are heated at 95 ° C for 2 min in order to denature the target DNA, then are placed at a temperature of 40 ° C for 2 min in order to hybridize the primers. After the addition of 10 ⁇ l of the enzyme mixture consisting of 5 ⁇ l of MgCl 2 at 77 mM, 0.2 ⁇ l of exo ' Klenow (10 U / ⁇ l), 2 ⁇ l HincII (75 U / ⁇ l) and 2 , 8 ⁇ l of 50% glycerol, the reaction mixture is incubated at 40 ° C for 2 h.
  • tuberculosis Prior to the addition of ifaoBI, exo ' Bca and MgCl 2 , the incomplete reactions (40 ⁇ l) are heated at 95 ° C for 2 min in order to denature the target DNA and then are placed at 56 ° C for 2 min in order to hybridize the primers.
  • polynucleotides of sequences SEQ ID NM and SEQ LD No. 2 and their nucleotide fragments described above, in particular the primers according to the invention can also be used in other methods of amplification of a nucleic acid target, such as:
  • TAS Transcription-based Amplification System
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • polynucleotides of sequences SEQ LD No. 1 and SEQ ID No. 2 as well as their oligonucleotide fragments can also be used in techniques for amplification or modification of the nucleic acid serving as a probe, such as:
  • the target polynucleotide to be detected is an RNA, for example an mRNA
  • an enzyme of reverse transcriptase type in order to obtain a cDNA from TARN contained in the biological sample.
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • Nucleotide probes according to the invention are specific for detecting mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex, more precisely because these mycobacteria have in their genome at least one copy of SEQ LD No. 1 or of SEQ LD No. 2 or a fragment of them.
  • the term “specific probes according to the invention” means any oligonucleotide hybridizing with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, and more particularly any oligonucleotide hybridizing with the sequence SEQ LD No. 2 coding for a 27 kD polypeptide in M.
  • nucleotide probes according to the invention advantageously have a length of at least 8 nucleotides, more particularly a length of between 8 and 200 nucleotides.
  • nucleotide probes chosen from the following oligonucleotides: a) AGGAGGTCATCC ATC TCGTGC C, b) AAG GAG AGG GGG CCC ATC GAA C.
  • nucleotide probes according to the invention specifically hybridize with a DNA or RNA molecule comprising all or part of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 under conditions of high stringency hybridization.
  • stringency conditions of the hybridization step for the purpose of specifically detecting a target DNA of a mycobacterium belonging to the mycobacterium tuberculosis complex can advantageously be as follows:
  • Hybridization is carried out at a preferred temperature of 65 ° C., in the presence of a 6 ⁇ SSC buffer, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of DNA from salmon sperm.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05 M Na citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% plyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin.
  • the washing steps can, for example, be as follows:
  • the unlabeled sequences can be used directly as probes, however the sequences are generally marked with a radioactive element (P, S,
  • probes which can be used for numerous applications.
  • a non-radioactive molecule biotin, acetylaminofluorene, digoxigenin, 5-bromo-deoxyuridine, fluorescein
  • non-radioactive labeling of probes are described, for example, in French patent No. 78.10975 or by Urdea et al. or by Sanchez-Pescador et al. in 1988. In the latter case, one can also use one of the marking methods described in patents FR 2 422 956 and FR 2 518 755.
  • the hybridization technique can be carried out in various ways (Matthews et al., 1988). The most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from the cells of mycobacteria on a support (nitrocellulose, nylon, polystyrene, ...) and in incubating, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. . After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the method appropriate (measurement of radioactivity, fluorescence or enzyme activity linked to the probe).
  • the labeled nucleotide probes according to the invention can have a structure such that they make it possible to amplify the radioactive or non-radioactive signal.
  • An amplification system corresponding to the definition above will include detection probes in the form of branched DNA (branched DNA) such as those described by Urdea et al. in 1991.
  • branched DNA branched DNA
  • several types of probes will be used, in particular a capture probe, in order to immobilize the target DNA or RNA on a support, and a detection probe.
  • the detection probe binds “branched” DNA with a branched structure.
  • the connected DNA is capable of attaching oligonucleotide probes which are themselves coupled to alkaline phosphatase molecules.
  • a probe for example a dioxetane-phosphate derivative.
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support in a covalent or non-covalent manner, and serves to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested. If necessary, the solid support is separated from the sample and the duplex formed between the capture probe and the target nucleic acid is then detected using a second probe, called the "detection probe", marked with an easily detectable element.
  • oligonucleotide fragments can be obtained from the sequences according to the invention, by cleavage with restriction enzymes, or by chemical synthesis according to conventional methods, for example according to the method described in European patent No. EP-0305929 (Millipore Corporation ) or by other methods.
  • An appropriate mode of preparation of the nucleic acids of the invention comprising a maximum of 200 nucleotides (or 200 bp in the case of double-stranded nucleic acids) comprises the following steps: - DNA synthesis using the automated method of beta-cyanethylphosphoramidite described in 1986, - Cloning of the nucleic acids thus obtained into an appropriate vector and recovery of the nucleic acid by hybridization with an appropriate probe.
  • a mode of preparation, by chemical route, of nucleic acids according to the invention of length greater than 200 nucleotides (or 200 bp in the case of double-stranded nucleic acids) comprises the following steps:
  • the nucleotide probes used for the recovery of the nucleic acid sought in the above-mentioned methods generally consist of 8 to 200 nucleotides of the sequence SEQ ID NX or SEQ LD N ° 2 or sequences complementary to SEQ LD N ° 1 or SEQ LD N ° 2 and are likely to hybridize with the desired nucleic acid under the hybridization conditions defined above.
  • the synthesis of these probes can be carried out according to the automated method of beta cyanethylphosphoramidites described in 1986.
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used within a detection device comprising a matrix library of oligonucleotides.
  • a matrix bank may consist of a matrix of probe oligonuleotides fixed on a support, the sequence of each probe of a given length being located one or more bases offset from the previous probe. , each of the probes of the matrix arrangement thus being complementary to a sequence distinct from the target DNA or RNA to be detected and each probe of known sequence being fixed in a predetermined position of the support.
  • the target sequence to be detected can advantageously be radioactive or non-radioactive. When the labeled target sequence is brought into contact with the matrix device, the latter forms hybrids with the probes of complementary sequences.
  • a nuclease treatment, followed by washing, makes it possible to eliminate the probe-target sequence hybrids which are not perfectly complementary. Because of the precise knowledge of the sequence of a probe at a determined position of the matrix, it is then possible to deduce the nucleotide sequence of the target DNA or RNA sequence. This technique is particularly effective when arrays of large oligonucleotide probes are used.
  • An alternative to the use of a labeled target sequence may consist of the use of a support allowing “bioelectronic” detection of the hybridization of the target sequence on the probes of the matrix support, when said support is constituted or comprises a material capable of acting, for example, as an electron donor at the positions of the matrix at which a hybrid has been formed. Such an electron donor material is for example gold.
  • the detection of the nucleotide sequence of the target DNA or RNA is then determined by an electronic device.
  • An exemplary embodiment of a biosensor, as defined above, is described in European patent application No. EP-0 721 016 in the name of Affymax technologies NV or also in American patent No. US 5,202,231 to name of Drmanac.
  • the subject of the invention is also the hybrid polynucleotides resulting: - either from the formation of a hybrid molecule between an RNA or a DNA (genomic DNA or cDNA) originating from a biological sample with a probe or a primer according to the invention ,
  • cDNA within the meaning of the present invention means a DNA molecule obtained by causing an enzyme of reverse transcriptase type to act on an RNA molecule, in particular a messenger RNA molecule (mRNA), according to the techniques described in Sambrook et al. in 1989.
  • the present invention also relates to a family of recombinant plasmids, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence in accordance with the invention. According to an advantageous embodiment of said plasmid, it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 or a fragment thereof, for example the fragment of sequence SEQ ID No. 2. According to a preferred arrangement of said embodiment, said plasmid comprises said sequence associated with a pUC vector.
  • pMT05 A particular recombinant plasmid, meeting the definition above, was named pMT05 by the inventors.
  • Another object of the present invention is a vector suitable for the cloning and / or expression and / or insertion of a sequence, characterized in that it comprises a nucleotide sequence described above at a nonessential site for its replication, if necessary under the control of regulatory elements capable of intervening in the expression of the 27 kD polypeptide, in a determined host.
  • vectors are for example plasmids, phages, cosmids, phagemids, YACs.
  • a preferred vector is the plasmid pMT05 transfected into the E. coli strain TG1, the transfected strain being designated under the name TGMT05 having been deposited at the CNCM on November 19, 1996 under the number 1-1786
  • This plasmid has an insert of 6 kb comprising in particular SEQ ID N ° 1 and SEQ LD N ° 2, as well as a sequence of the genome of M tuberculosis naturally present upstream of the 5 ′ end of SEQ LD N ° 1.
  • the vector pMT05 above was constructed from the vector pUC18 and the 6kb DNA insert of Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
  • a recombinant cell host according to the invention is characterized in that it is modified by a nucleotide sequence or a vector described above.
  • the cell host is modified by this sequence under conditions allowing the expression of a functional p27 polypeptide, as regards its recognition by antibodies specifically recognizing it.
  • a preferred cell host according to the invention is the strain of E. coli TGMT05, deposited at the CNCM on November 19, 1996 under the number 1-1786.
  • the p27 gene can be inserted into an appropriate expression vector to produce the P27 polypeptide in vitro. This can be fixed on a microplate to develop a serological test intended to search, for diagnostic purposes, specific antibodies in patients with tuberculosis.
  • the present invention relates more particularly to a process for the preparation of a polypeptide of the invention comprising the following steps: - if necessary, the prior amplification according to the PCR technique of the quantity of nucleotide sequences coding for said polypeptide to using two DNA primers chosen so that one of these primers is identical to the first 10 to 25 nucleotides of the nucleotide sequence encoding said polypeptide, while the other primer is complementary to 10 to 25 last nucleotides (or hybridizes with these last 10 to 25 nucleotides) of said nucleotide sequence, or vice versa so that one of these primers is identical to the last 10 to 25 nucleotides of said sequence, while the other primer is complementary to the first 10 to 25 nucleotides (or hybridizes with the first 10 to 25 nucleotides) of said nucleotide sequence, followed by the introduction n of said sequences thus amplified in an appropriate vector, - the cultivation, in an appropriate culture medium, of a
  • amino acid by amino acid the synthesis preferably begins with the condensation of the C-terminal amino acid with the amino acid which corresponds to the neighboring aminoacyl in the desired sequence and so on. , step by step, up to the N-terminal amino acid.
  • a peptide chain using a very porous polymer resin, on which the first C-terminal amino acid of the chain is fixed. This amino acid is attached to the resin via its carboxylic group and its amine function is protected, for example by the t-butyloxycarbonyl group.
  • the protective group of the amine function is removed by washing the resin with an acid.
  • the protecting group for the amine function is the t-butyloxycarbonyl group, it can be removed by treatment of the resin with trifluoroacetic acid.
  • the second amino acid which provides the second aminoacyl of the sequence sought is then coupled, from the C-terminal aminoacyl residue on the deprotected amine function of the first C-terminal amino acid attached to the chain.
  • the carboxyl function of this second amino acid is activated, for example by dicyclohexylcarbodiimide, and the amine function is protected, for example by t-butyloxycarbonyl.
  • the first part of the peptide chain sought, which comprises two acids, is thus obtained. amino, and whose terminal amine function is protected.
  • the amine function is deprotected and it is then possible to fix the third aminoacyl, under conditions analogous to those of the addition of the second C-terminal amino acid.
  • a subject of the invention is also a 27 kD polypeptide, the P27 polypeptide, as obtained from a recombinant cellular host according to the preceding definition, the P27 polypeptide being characterized in that its peptide backbone comprises the sequence of amino acids SEQ LD N ° 3.
  • the invention also relates to a protein characterized in that it comprises an amino acid sequence modified with respect to SEQ LD N ° 3, by deletion, insertion or replacement of one or more amino acids, since the protein thus modified is recognized by antibodies specific for the P27 polypeptide.
  • peptide fragment of the P27 polypeptide characterized in that it corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NX or to any part of this sequence.
  • peptide fragments of the invention exhibit antigenic properties and are therefore recognized by antibodies directed against the P27 polypeptide.
  • such a peptide fragment of the P27 polypeptide will comprise a region of P27 exposed to the solvent and will have a length of at least 20 amino acids.
  • these antigens are specific for the P27 polypeptide and are therefore not recognized by antibodies specific for other mycobacterial proteins.
  • the invention further relates to hybrid proteins having at least part of SEQ ID No. 3 and a sequence of a peptide or a protein capable of inducing an immune response in humans or animals.
  • the antigenic determinant is such that it is capable of inducing a humoral and / or cellular response.
  • Such a determinant can be of various natures and in particular be a fragment of protein antigen, advantageously glycoprotein, used with a view to obtaining immunogenic compositions capable of inducing the synthesis of antibodies directed against multiple epitopes.
  • hybrid molecules can consist in part of a molecule carrying sequence SEQ LD N ° 3 or of sequence included in SEQ LD N ° 3 associated with a part, in particular an epitope of diphtheria toxin, tetanus toxin, a surface antigen of the hepatitis B virus (patent FR 79 21811), the VP1 antigen of the polio virus or any other toxin or viral or bacterial antigen.
  • a bacterial antigen as defined above will be all or part of the immunogenic protein of 45/47 kD from M. tuberculosis (international application PCT / FR 96/0166).
  • a viral antigen will preferably be a surface or envelope protein of a hepatitis virus, for example the hepatitis B surface protein in one of its S forms, S-preSl, S-preS2 or S-preS2-preSl or a protein from a hepatitis A virus, or from non-A, non-B hepatitis, such as a hepatitis C virus , E or delta.
  • a hepatitis virus for example the hepatitis B surface protein in one of its S forms, S-preSl, S-preS2 or S-preS2-preSl or a protein from a hepatitis A virus, or from non-A, non-B hepatitis, such as a hepatitis C virus , E or delta.
  • a viral antigen as defined above will be all or part of one of the glycoproteins encoded by the genome of the HIV-1 virus (patents GB 8324800, EP 84401834 or EP 85905513) or of the HIV-2 virus (EP 87400151), and in particular all or part of a protein selected from gag, pol, nave or env of HIV-1 or HIV-2.
  • the methods of synthesis of the hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid DNAs coding for the protein or peptide sequences sought.
  • One can, for example, advantageously refer to the technique for obtaining genes coding for fusion proteins described by Minton in 1984.
  • the polypeptide P27, or the fragments of the polypeptide P27, according to the invention can advantageously be used.
  • the biological sample consists of a fluid, for example a human or animal serum.
  • a preferred method involves immunoenzymatic processes according to the ELISA technique, or immunofluorescent, or radioimmunological (RIA) or equivalent.
  • the invention also relates to the P27 polypeptide or any fragment thereof, labeled using an adequate marker of the enzymatic, fluorescent, radioactive type, etc.
  • Such methods include, for example, the following steps:
  • the invention also relates to a kit or kit for the in vitro diagnosis of an infection with a mycobacterium belonging to the tuberculosis complex, comprising: - the P27 polypeptide or an antigenic fragment thereof,
  • these reagents may also carry a marker, or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent, more particularly in the case where the p27 polypeptide, or the antigenic fragment of the latter, is not labeled,
  • a reference biological sample devoid of antico ⁇ s recognized by the P27 polypeptide or the antigenic fragment thereof
  • a reference biological sample (positive control) containing a predetermined amount of antico ⁇ s recognized by the P27 polypeptide or the antigenic fragment thereof.
  • the P27 polypeptide according to the invention makes it possible to prepare monoclonal or polyclonal antico ⁇ s characterized in that they specifically recognize the P27 polypeptide or a peptide fragment of P27.
  • the monoclonal antibodies can advantageously be prepared from hybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975.
  • the polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse, with a polypeptide according to the invention associated with an adjuvant of the immune response, then purification of the specific antico ⁇ s contained in the serum of the immunized animals on an affinity column on which has previously been fixed the polypeptide having served as antigen.
  • the polyclonal antico ⁇ s according to the invention can also be prepared by purification on an affinity column, on which the P27 polypeptide or a fragment thereof has previously been immobilized, of the antico ⁇ s contained in the serum of patients infected with a mycobacterium belonging at the tuberculosis complex.
  • the invention therefore relates to a method for the specific detection of the presence of an antigen of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the biological sample (tissue or biological fluid) taken from an individual with an antibody directed against the P27 polypeptide, under conditions allowing an in vitro immunological reaction between said antibodies and the specific polypeptides of the mycobacteria of the tuberculosis complex possibly present in the biological sample, b) demonstration of the antigen-antico ⁇ s complex formed.
  • this reagent can also carry a marker, or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent, more particularly in the case where the monoclonal antico ⁇ s or above mentioned polyclonal is not marked;
  • Another subject of the present invention relates to an immunogenic composition, characterized in that it comprises the P27 polypeptide or also one or more antigenic fragments thereof.
  • Another immunogenic composition according to the invention is characterized in that it comprises one or more polypeptides or fragments of polypeptides according to the invention and / or one or more hybrid proteins in accordance with the invention.
  • the immunogenic composition defined above constitutes a vaccine, when it is presented in association with a pharmaceutically acceptable vehicle and optionally one or more adjuvants of immunity such as alum or a representative of the family of muramyl peptides or the incomplete adjuvant of Freund.
  • This type of vaccination is carried out with a particular plasmid derived from an E. coli plasmid which does not replicate in vivo and which codes only for the vaccinating protein.
  • the main functional components of this plasmid are: a strong promoter (for example that of CMV), a cloning site suitable for inserting the gene of interest, a termination-polyadenylation sequence, an origin of prokaryotic replication to produce the recombinant plasmid in vitro and a selection marker (eg, the ampicillin resistance gene) to facilitate the selection of bacteria that contain the plasmid. Animals have been immunized by simply injecting naked plasmid DNA into the muscle.
  • tuberculosis such as, for example, the p27 gene, object of the present invention
  • the p27 gene can be easily inserted into the vector plasmids VU (Montgomery et al, 1993), pcDNA3 (Invitrogen, R & D Systems) or pcDNAl / Neo (Invitrogen) which have the characteristics necessary for vaccine use.
  • the invention thus relates to an immunogenic composition characterized in that it comprises one or more hybrid polypeptides as previously defined in association with a pharmaceutically compatible vehicle and, where appropriate, one or more adjuvants of immunity.
  • the invention also relates to a vaccine composition intended for the immunization of humans or animals against a bacterial or viral infection, such as tuberculosis or hepatitis, characterized in that it comprises one or more hybrid polypeptides as previously defined in association with a pharmaceutically compatible vehicle and, where appropriate, one or more adjuvants of immunity.
  • the vaccine composition in the case of a hybrid protein between P27 and the hepatitis B surface antigen, will be administered, in humans, at a rate of 0.1 to 1 ⁇ g of purified hybrid protein per kilogram of the patient's weight, preferably 0.2 to 0.5 ⁇ g / kg of patient weight, for a dose intended for a given administration.
  • each dose injected will preferably contain half the weight amount of the hybrid protein contained in a dose intended for a patient not affected by system disorders immune.
  • the vaccine composition will be administered several times, over a period of time, by the intradermal or subcutaneous route.
  • three doses as defined above will be administered to the patient respectively at time tO, time tO + 1 month and time tO + 1 year.
  • three doses will be administered to the patient respectively at time tO, time tO + 1 month and time tO + 6 months.
  • mice In mice, in which a weight dose of the vaccine composition comparable to the dose used in humans is administered, the antico ⁇ s reaction is tested by sampling the serum followed by a study of the formation of a complex between the antico ⁇ s present in the serum and the antigen of the vaccine composition, according to the usual techniques.
  • the invention also relates to an immunogenic composition characterized in that it comprises a polynucleotide or an expression vector according to the invention, in combination with a vehicle allowing its administration to humans or animals.
  • the subject of the invention is also a vaccine intended for immunization against a bacterial or viral infection, characterized in that it comprises a polynucleotide or an expression vector according to the invention, in combination with- : a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a vaccine intended for immunization against a bacterial or viral infection
  • Such immunogenic or vaccine compositions are in particular described in international application No. WO 90/11092 (Vical Inc.) and also in international application No. WO 95/11307 (Institut Pasteur).
  • the polynucleotide constituting the immunogenic composition or the vaccine composition according to the invention can be injected into the host after being coupled to compounds which promote the penetration of this polynucleotide inside the cell or its transport to cell nucleus.
  • the resulting conjugates can be encapsulated in polymer microparticles, as described in international application No. WO 94/27238 (medisorb Technologies International).
  • the polynucleotide preferably a DNA
  • the polynucleotide is complexed with DEAE-dextran (Pagano et al., 1967) or with nuclear proteins (Kaneda and al., 1989), with lipids (Felgner et al, 1987) or also encapsulated in liposomes (Fraley et al., 1980).
  • the polynucleotide according to the invention can be introduced in the form of a gel facilitating its transfection into cells.
  • Such a gel composition may be a poly-L-lysine and lactose complex, as described by Midoux in 1993, or even Poloxamer 407 TM, as described by Pastore in 1994.
  • the polynucleotide or the vector according to invention can also be suspended in a buffer solution or be associated with liposomes.
  • such a vaccine will be prepared according to the technique described by Tacson et al. or Huygen et al. in 1996 or according to the technique described by Davis et al. in international application No. WO 95/1 1307 (Whalen et al).
  • Such a vaccine will advantageously be prepared in the form of a composition containing a vector according to the invention, comprising all or part of SEQ ID No. 2 placed under the control of regulatory elements allowing its expression in humans or 'animal.
  • the DNA fragment corresponding to the p27 gene (SEQ LD No. 2) of the plasmid pMT05 is first of all subcloned into an appropriate expression vector, more particularly an expression vector containing signals from regulation and expression recognized by the enzymes of eukaryotic cells and also containing an origin of active replication in prokaryotes, for example in E. coli, which allows its prior amplification. Then the purified recombinant plasmid obtained is injected into the host, for example by the intramuscular route.
  • Such a vaccine will advantageously comprise, in addition to the recombinant vector, a saline solution, for example a sodium chloride solution.
  • a saline solution for example a sodium chloride solution.
  • a vaccine composition as defined above will, for example, be administered parenterally or intramuscularly.
  • the present invention also relates to a method for rapid detection and identification of M. tuberculosis in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps:
  • DNA from the biological sample or “DNA contained in the biological sample” means either the DNA present in the biological sample considered, ie the cDNA obtained after the action of an enzyme of reverse transcriptase type on the RNA present in said biological sample.
  • Another object of the present invention consists in a method for the specific detection of bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing into contact an oligonucleotide probe according to l one of claims 5 or 6 with a biological sample, the DNA contained in the biological sample, or the cDNA obtained by reverse transcription of the RNA of the biological sample, having, if necessary, previously been made accessible hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the DNA or cDNA of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex; b) detection of the hybrid formed between the oligonucleotide probe and the DNA of the biological sample.
  • the invention also relates to a method for the specific detection of bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing into contact an oligonucleotide probe immobilized on a support according to the claim 7 with a biological sample, the DNA of the biological sample having, if appropriate, been made available beforehand for hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the DNA of a bacterium of the complex Mycobacterium tuberculosis; b) bringing the hybrid formed between the oligonucleotide probe immobilized on a support and the DNA contained in the biological sample, if appropriate after removing the DNA from the biological sample which has not hybridized with the probe, with a labeled oligonucleotide probe as defined above.
  • the detection method is characterized in that, before step a), the DNA of the biological sample is amplified using a pair of primers as previously described.
  • Another form of implementation of the detection method according to the invention consists of a method for the specific detection of the presence of a bacterium belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the steps following: a) bringing the biological sample into contact with a pair of primed nucleic acid fragments, the DNA contained in the sample having been, if necessary, previously made accessible for hybridization, under conditions allowing hybridization of the primers to the DNA of a bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex; b) amplification of the DNA of the bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex; c) demonstration of the amplification of DNA fragments corresponding to the fragment framed by the primers, for example by gel electrophoresis or by means of an oligonucleotide probe
  • the subject of the invention is also a method for the specific detection of the presence of a bacterium belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample by displacement of strand, characterized in that it comprises the following steps: contact of the biological sample with two pairs of primers specifically intended for the SDA type amplification described above, the DNA contained in the sample having been, if necessary, previously made accessible for hybridization, in conditions allowing hybridization of the primers to the DNA of a bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex; b) amplification of the DNA of the bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex; c) demonstration of the amplification of DNA fragments corresponding to the fragment framed by the primers, for example by gel electrophoresis or by means of an oligonucleotide probe according to the invention.
  • the invention also relates to a kit for the implementation of the method described above, intended for the detection of the presence of a bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe according to the invention; b) the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction; c) where appropriate, a pair of primers according to the invention as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction (genomic DNA, plasmid DNA or cDNA) of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • a DNA amplification reaction genomic DNA, plasmid DNA or cDNA
  • the subject of the invention is also a kit or kit for detecting the presence of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe, called a probe capture, according to the invention; b) an oligonucleotide probe, called the revelation probe, as described above; c) where appropriate, a pair of primers according to the invention as well as the reagents necessary for an amplification reaction of the DNA of a bacterium of the complex
  • the invention also relates to a kit or kit for the amplification of the DNA of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex present in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: a) a pair of fragments of nucleic acid primers according to the invention; b) the reagents necessary to carry out a DNA amplification reaction; c) optionally a component making it possible to verify the sequence of the amplified fragment, more particularly an oligonucleotide probe as described above.
  • Figure 1 Map of the cosmid pHC 79, constructed from the plasmid pBR322. It has the cos sequences of the lambda phage, allowing the packaging of a DNA insert with a size of 30 to 40 kb. It has two antibiotic resistance genes: an ampicillin resistance gene and a tetracycline resistance gene, which carries a unique restriction site for the Sali endonuclease.
  • Figure 2 Map of plasmid pMT05 containing SEQ LD No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • SEQ ID No. 1 The 5 'end of SEQ LD No. 1 is located at the nucleotide immediately following the last nucleotide of the sequence IS61 10, represented by the box IS61 10 in this figure, and the 3' end of SEQ ID No. 1 is located downstream of the p27 sequence represented by the p27 box in this figure.
  • SEQ ID No. 2 corresponds to the box designated p27 in the figure.
  • FIG. 3 Comparison of the amino acid sequences of the “Sra” protein of M. leprae and the P27 protein of M tuberculosis.
  • Figure 6 Frequency histogram by absorbance class (in percentage).
  • Example 1 Construction of the M. tuberculosis genomic library
  • the genomic DNA of M. tuberculosis H37rv is partially digested by the restriction endonuclease Sali by causing 0.03 U of enzyme to act per ⁇ g of DNA for 1 hour at 37 ° C in the buffer composed of 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol.
  • the genomic DNA thus digested is separated by electrophoresis on 0.6% agarose gel, the fragments between 30 and 40 kb electroeluted and precipitated in ethanol after extraction with phenol / chloroform (1/1).
  • the vector is the cosmid pHC79. It is digested in the same way and dephosphorylated to avoid any autoligation.
  • the ligation is carried out by mixing 1.5 ⁇ g of vector and 3 ⁇ g of DNA fragments 30/40 kb (i.e. a vector / insert molar ratio of 1/2), the reaction is left to
  • the recombined cosmids are packaged in vitro and used to transform bacteria (HB101).
  • the transformed bacteria are incubated for 1 hour at 37 ° C. in LB medium and then spread on selective Agar medium containing 50 ⁇ g / ml of Ampicillin. Colonies resistant to Ampicillin are all tested for their sensitivity to Tetracycline, in fact the 30/40 kb DNA fragment is inserted into the vector so as to inactivate the tetracycline resistance gene (Tet) and to conserve the ampicillin resistance gene (Amp).
  • Example 2 Screening of the library and determination of the sequence II is carried out a mini DNA preparation on the first 455 colonies of transformed bacteria resistant to ampicillin (Amp 1 * ) and sensitive to tetracycline (tet s ) according to the alkaline lysis technique. These DNAs are tested by PCR using the primers SRA1: GCC CGA GAT CAA CTC CAC CC and SRA2: ACA TCT GTT CGT AGT CGG CC whose sequences had been previously determined in the laboratory. Six cosmid clones present an amplification fragment in a large quantity and the size of which is that expected (410 bp).
  • Each of these clones is subcultured on solid medium LB + ampicillin 50 ⁇ g / ml and the well individualized colonies are subcultured on an ordered dish.
  • a mini-preparation of the first 4 recombinant colonies of each of the clones is carried out.
  • the DNAs of these mini-preparations are subjected to a PCR with the primers SRA1 / SRA2 and tested in agarose gel.
  • Six subclones are selected and stored in glycerol at -80 ° C.
  • the DNA of each of the 6 selected subclones is hydrolyzed individually by 7 restriction enzymes, subjected to electrophoresis and transferred according to the Southern method and then hybridized with the PCR fragment SRA1 / SRA2.
  • This fragment was previously purified by chromatography (FPLC) followed by electrophoresis, electroelution and labeling with 32p by multipriming.
  • FPLC chromatography
  • Pst I restriction enzyme which is chosen because a single band whose size is estimated at approximately 7-7.4 kb hybrid with the SRA1 / SRA2 probe.
  • the clone J41 1 is selected, a maxi-preparation is carried out followed by a preparative hydrolysis of J411 with Pst I, the digested product is put to migrate in an agarose gel at 1.2%, the band the size of which is then estimated at 7-7.4 kb is cut and then electroeluted, the electroeluted fragment is checked on 0.8% agarose gel, the size of this fragment is estimated at approximately 6 kb.
  • This fragment was cloned into a vector pUC18, the recombinant plasmid is used to transform E. coli TG1 bacteria.
  • the colonies of the transformed TG1 bacteria were ordered on an LB + ampicillin dish and 24 mini-preparations were made to check the presence of the insert.
  • the clone J41 1 / Pst 1/8 is retained and cultured to prepare a large quantity of recombinant plasmid, this is called pMT05.
  • the strain containing the plasmid pMT05 is called TGMT05 and deposited at the C. N. C. M. on November 19, 1996 under the number 1-1786.
  • the sequence of part of the fragment (2805 base pairs) was carried out by the Sanger method.
  • the upstream part of this sequence contains an IS 6110 sequence and the MT308 fragment.
  • a schematic map of the plasmid pMT05 is shown in Fig. 2.
  • Example 3 Search for specific oligonucleotide primers of the / ⁇ gene? 7
  • the PRIME software allowed us to select 25 pairs of primers (see appendix 1).
  • the position of the primers corresponds to the numbering of the bases of the p27 gene (SEQ ID No. 2).
  • the mycobacterial suspensions are centrifuged at 12,000 x g for 15 minutes.
  • the DNA is extracted by resuspending the pellet with 50 ⁇ l of 0.1 M NaOH containing 2 M NaCl and 0.5% SDS.
  • the mixture is incubated at 95 ° C for 15 minutes, to the reaction mixture is added 400 ⁇ l of 0.1 M Tris-HCl pH 7.
  • the DNA is extracted 3 times with phenol / chloroform, precipitated with ethanol and taken up in 50 ⁇ l of Tris 10 mM, EDTA 0, lmM pH 8
  • M. kansasii M. mtracellulare, M. avium, M. paratuberculosis, M. bovis, M. chelonae, M. gordonae, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. simiae, M. tuberculosis (strain H37Rv ), M. tuberculosis (strain 729), M. tuberculosis (strain 761), M tuberculosis (strain 808), M. tuberculosis strain 327), M. tuberculosis (strain 14)
  • the strain 50 mentioned in the preamble to the description, corresponds to a clinical isolate available at the Tuberculosis Institute, Hanoi, Vietnam.
  • Strains 729, 761, 808 and 327 correspond to clinical isolates originating respectively from: - Pham Ngoc Thach Hospital, Ho Chi Min Ville, Vietman (strains 729, 761, 808); - Center Muraz, Bobo-Dioulasso, Burkina-Fasso (strain 327)
  • Amplification is carried out by the in vitro amplification technique according to Saiki et al. (Science, 1988, 239, 487-491) using 12.5 pmol of each of the oligonucleotide primers and 50 ng of DNA from different strains of mycobacteria with 2 U of Taq polymerase in a buffer containing 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 200 ⁇ M deoxyribonucleotides and 100 ⁇ g / ml of gelatin. The final volume of the reaction is 100 ⁇ l.
  • the parameters of the PCR steps were chosen as follows.
  • a DNA fragment corresponding to the expected size is observed with the DNAs of the following mycobacteria: M. tuberculosis (strain H37Rv), M. tuberculosis (strain 729), M. tuberculosis (strain 761), M. tuberculosis (strain 808) , M. tuberculosis strain (327), M. tuberculosis (strain 14), M. bovis; the pair 3-4 gives a fragment between 234 and 281 bp and the pair 7-8 a fragment whose size is between 118 and 194 bp. On the other hand, this fragment is not visible when the analyzed DNA is extracted from the following strains: M. kansasii, M.
  • the parameters of the PCR are as follows
  • the amplified fragment is detected using the non-radioactive sandwich-type hybridization technique, as described in Chev ⁇ er et al (1993), using the following nucleotide probes 5 'phosphorylated capture probe
  • a detection threshold is determined. At least 7 wells are DNA-free controls which contain only the probes and the hybridization buffer. The mean and standard deviation of the values obtained makes it possible to calculate a threshold value with the formula ⁇ + 4 x ⁇ n • all samples which have an absorbance below this threshold will be considered negative
  • the specificity is analyzed by testing different strains of mycobacteria
  • DNAs (approximately 120 ng), purified from different mycobacterial cultures, were used as a PCR template with the primers on the p27 gene, then the PCR products were hybridized on a microplate.
  • the p27 gene is present only in the genome of mycobacteria belonging to the tuberculosis complex and all strains of M. tuberculosis have this gene, unlike the insertion sequence IS 6110 initially used for the diagnosis of tuberculosis and whose use has been abandoned since the discovery of strains not carrying this sequence.
  • the p27 gene is therefore of major interest for the diagnosis of tuberculosis.
  • Different strains of M tuberculosis which do not have the sequence IS 6110 are available. These are strains from Burkina Faso, Vietnam or France. It should be noted that the strain found in France comes from a patient of Vietnamese origin (analysis done at CBMS).
  • PCRs were carried out with primers on the p27 gene on the one hand and on the IS 6110 sequence on the other:
  • Validation is carried out on DNA extractions made from clinical isolates from patients from Burkina Faso, the isolates belong to the tuberculosis species.
  • Each class is represented by the percentage of its workforce in the table below:
  • Threshold 39 (average calculated on the different experiences)
  • the results obtained at the CBMS were achieved with the Sanofi Diagnostics Pasteur kit (SDP), kit using primers from the insertion sequence IS6110, and / or with the COBAS AMPLICOR TM kit, this kit being produced with selected primers on the gene encoding 16S RNA.
  • SDP Sanofi Diagnostics Pasteur kit
  • kit using primers from the insertion sequence IS6110 and / or with the COBAS AMPLICOR TM kit, this kit being produced with selected primers on the gene encoding 16S RNA.
  • the p27 gene has a specificity which makes it usable for the diagnosis of tuberculosis: it is not present in mycobacteria not belonging to the tuberculosis complex and it is present in all isolates belonging to this complex.
  • the p27 gene, or one of its fragments according to the invention could advantageously replace the sequence IS 6110 for the diagnosis of the presence of bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • Amplification is carried out using 12.5 pmol of each of the oligonucleotide primers and 50 ng of DNA from different strains of M. tuberculosis with 2 U of Taq polymerase in a buffer containing 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8 , 3, 1.5 mM MgCl2, 200 ⁇ M deoxyribonucleotides and 100 ⁇ g / ml gelatin. The final volume of the reaction is 100 ⁇ l.
  • the parameters of the PCR steps were chosen as follows: X min at 94 ° C, 1 min at 60 ° C, 1 min at 72 ° C. Forty cycles are performed using a thermal cycler. After the last cycle, the samples are kept at 72 ° C for 10 min and then stored at 4 ° C.
  • the amplification results are analyzed by electrophoresis. Ten ⁇ l of the amplified samples are deposited on a 2% agarose gel in a TAE buffer (0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA) and 1 ⁇ g / ml EtBr. The amplified fragments are visualized under UV.
  • SDA chain displacement amplification reaction
  • the underlined sequences correspond to the specific sequences of the p27 gene of M. tuberculosis, the sequences in bold characters correspond to the recognition sites of the restriction enzyme Bso Bl used in the SDA technique (Spargo et al., Molecular and Cellular Probes, August 1996, 10, 247-256).
  • Tm 77.0 degrees Celsius difference between the Tm of the primers 1.0 degrees Celsius optimal hybridization temperature: 54.1 degrees Celsius Annex 1 (cont'd 1)
  • Tm 77.0 degrees Celsius difference between the Tm of the primers 1.6 degrees Celsius optimal hybridization temperature: 55.0 degrees Celsius Annex 1 (continuation 3)
  • Tm 75.6 degrees Celsius difference between the Tm of the primers: 1.6 degrees Celsius optimum hybridization temperature: 53.3 degrees Celsius Annex 1 (contd. 5)
  • Tm 79.0 degrees Celsius difference between the Tm of the primers: 0.5 degrees Celsius optimal hybridization temperature: 56.5 degrees Celsius Annex 1 (continuation 9)
  • % GC of the primer 52.6 55.0 Tm of the primer (degrees Celsius): 57.6 57.6
  • Tm 77.4 degrees Celsius difference between the Tm of the primers 1.2 degrees Celsius optimal hybridization temperature: 55.3 degrees Celsius Annex 1 (cont'd 12)
  • Tm 79.0 degrees Celsius difference between the Tm of the primers 1.5 degrees Celsius
  • optimal hybridization temperature 55.8 degrees Celsius

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Abstract

La présente invention concerne notamment les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide P27 de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, ainsi que le polypeptide correspondant. Ces éléments sont utiles notamment dans le diagnostic, la prévention et le traitement d'affection provoquées par des mycobactéries, en particulier la tuberculose.

Description

Polynucléotide codant pour un polypeptide de 27kD de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et à la prévention de la tuberculose.
L'invention concerne un polypeptide d'environ 27kD correspondant à une protéine de structure retrouvée dans les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis. L'invention vise aussi un polynucléotide comprenant une séquence codant pour ce polypeptide. L'invention concerne également les fragments nucléotidiques placés en amont et en aval de la séquence dudit polynucléotide qui comprennent les signaux de régulation et/ou d'expression de ce gène. Elle concerne également l'utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci et des polynucléotides codant pour ces derniers pour la réalisation de moyens de détection in vitro de la présence d'une mycobactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique. L'invention vise enfin l'utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci ainsi que des polynucléotides codant pour ces derniers en tant que moyens destinés à la préparation d'une composition immunogène, susceptible d'induire une réponse immunitaire de type B ou T, ou d'une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement d'infections provoquées par des mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, en particulier la tuberculose. On appelle complexe tuberculosis, le groupe de mycobactéries qui comprend M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. afήcanum et M. microti.
Au moins 56 espèces différentes appartiennent au genre Mycobacterium, parmi celles-ci environ 10 sont pathogènes ou opportunistes pour l'homme ou l'animal. La tuberculose continue d'être un problème de santé publique dans le monde. Aujourd'hui, cette maladie est la cause de 2 à 3 millions de morts dans le monde et environ 8 millions de nouveaux cas sont observés chaque année (Bouvet, 1994). Dans les pays développés M. tuberculosis est la cause la plus commune des infections mycobactériennes. En France il apparaît environ 10 000 nouveaux cas par an et parmi les maladies à déclaration obligatoire c'est la tuberculose qui comprend le plus grand nombre de cas. La vaccination par le BCG est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre, à 0 % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à Chingleput, publiés en 1972 dans Indian J. Med. Res.). De plus, l'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux antituberculeux et l'existence d'une corrélation entre les patients atteints de tuberculose et patients immunodéprimés, par exemple atteints du SIDA, rendent nécessaire la mise au point de méthodes rapides, spécifiques et fiables pour le diagnostic de la tuberculose. Par exemple, une étude épidémiologique réalisée en Floride, et dont les résultats ont été publiés en 1993 dans AIDS thérapies, a montré que 10 % des malades atteints de SIDA sont atteints de tuberculose au moment du diagnostic du SIDA ou 18 mois avant celui-ci. Chez ces malades, la tuberculose apparaît dans 60 % des cas sous une forme disséminée donc non reperable par les critères de diagnostic classiques comme la radiographie pulmonaire ou l'analyse de crachats.
Actuellement, une certitude sur le diagnostic apporté par la mise en évidence de bacilles cultivables dans un prélèvement provenant du malade n'est obtenue que pour moins de la moitié des cas de tuberculose. Même dans les cas de tuberculose pulmonaire, qui représente 80 à 90 pour cent des malades atteints de tuberculose et qui est la forme de la maladie pour laquelle la mise en évidence de bacilles est la plus facile, l'examen des expectorations n'est positif que dans moins de la moitié des cas. Le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactéries apparentées est donc difficile à réaliser, et cela pour différentes raisons : les maladies pulmonaires causées par différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement; les mycobactéries sont souvent présentes en faible quantité et lorsqu'elles sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage. De plus, en raison du temps de génération très long de ces bactéries (24h pour M. tuberculosis comparé à 20 mn pour E. coli), la culture de ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes (Bâtes et al, 1986) et davantage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades.
D'autres techniques sont utilisables en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne : a) L'identification directe des micro-organismes au microscope ; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de micro-organismes doit être présent dans l'échantillon (> 10 /ml) pour permettre une détection fiable (Bâtes, 1979). Selon cette technique, l'examen est réalisé directement sur un prélèvement (crachats, urines, liquide céphalo-rachidien, ...). Les bacilles sont observés par coloration de Ziehl ou fluorescente selon la méthode Smithwick modifiée (à l'Auramine), comme décrit par Kent et al. en 1985.
Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 % et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée ; néanmoins, comme précisé ci-dessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif (Bâtes, 1979 ; Bâtes et al, 1986). La technique d'identification par culture du bacille est longue et coûteuse car celle-ci nécessite l'emploi de milieux comme source de carbone, d'azote, de nombreux facteurs de croissance, tels que les milieux Lowenstein-Jensen ou Coletsos. Les colonies apparaissent 15 à 30 jours, voire 60 jours après l'ensemencement et doivent être observées avec une fréquence bi-hebdomadaire pendant une période de deux mois. Les caractéristiques métaboliques des mycobactéries présentes dans le prélèvement permettent également d'identifier l'espèce en présence. Parmi les caractéristiques métaboliques observées figurent la quantification de la biosynthèse de l'acide nicotinique (M. tuberculosis produit des quantités sensiblement plus importantes d'acide nicotinique que les autres espèces), la recherche d'une activité catalase ou encore la quantification de la réduction des nitrates (Bourgoing et al., 1994). b) Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est parfois limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles (Daniel et al., 1987). c) La présence de mycobactéries au sein d'un échantillon biologique peut aussi être déterminée par hybridation moléculaire avec de l'ADN ou de l'ARN en utilisant des sondes d'oligonucléotides spécifiques des séquences recherchées (Kiehn et al., 1987 ; Roberts et al., 1987 ; Drake et al., 1987). Plusieurs études ont montré l'intérêt de cette technique pour le diagnostic des infections à mycobactéries. Les sondes utilisées sont constituées d'ADN, d'ARN ribosomique ou de fragments d'ADN mycobactériens non caractérisés et provenant de banque de gènes. Le principe de ces techniques repose sur le polymorphisme des séquences nucléotidiques des fragments utilisés ou sur le polymorphisme des régions avoisinantes. Dans tous les cas, elles nécessitent l'utilisation de cultures et ne sont pas applicables directement sur les échantillons biologiques.
La faible quantité de mycobactéries présentes au sein d'un échantillon biologique et en conséquence la quantité faible d'ADN cible à détecter dans cet échantillon peut nécessiter le recours à une amplification spécifique in vitro de l'ADN cible avant sa détection à l'aide de la sonde nucléotidique. Les techniques d'amplification in vitro, notamment la PCR ont été décrites dans la littérature et leur mise en oeuvre et perfectionnements ont fait l'objet de demandes de brevet. La technique dite PCR ou réaction d'amplification en chaîne à l'aide de la polymérase, qui a été décrite pour la première fois en 1985 par Saiki et al. et qui fait l'objet des brevets européens EP 201 184 et EP 200 362. La technique PCR est désormais largement mise en oeuvre pour le diagnostic clinique (Erlich, 1989 ; Innis, 1990 ; Rolfs, 1991), par exemple pour le typage de tumeurs ou de tissu, ou pour l'identification de bactéries pathogènes ou de virus.
L'amplification spécifique de l'ADN par la technique PCR peut constituer la première étape d'un procédé de détection de la présence d'un ADN mycobactérien dans un échantillon biologique, la détection proprement dite de l'ADN amplifié étant effectuée dans un second temps à l'aide d'une sonde oligonucleotidique capable de s'hybrider spécifiquement à l'ADN amplifié. Un mode de réalisation particulier de la détection de l'ADN amplifié à l'aide d'une sonde spécifique est représenté par la technique d'hybridation dite « sandwich ». Cette technique met en oeuvre une première sonde nucléotidique (sonde de capture) fixée sur un support solide, qui sert à capturer le gène ou le fragment de gène à détecter dans l'échantillon. Une deuxième sonde (sonde de détection), complémentaire d'une autre région de l'ADN à détecter, permet la détection de ce dernier par l'intermédiaire d'un marqueur tel qu'un marqueur radioactif (Dunn et al., 1977 ; Ranki et al., 1983 ; Palva et al., 1984 ; Polsky-Cynkin et al., 1985). La méthode d'hybridation sandwich peut être également réalisée en ajouta;",::: en une seule étape l'échantillon à analyser et la sonde de détection dans un conteneur où se trouve la sonde de capture fixée sur le support. Il s'agit dans ce cas d'une méthode d'hybridation sandwich dite « simultanée » (Brevet EP-0486 661 au nom de Biomérieux, Ranki et al., 1983 ; Palva et al., 1984 ; Polsky-cynkin et al., 1985). La technique d'hybridation sandwich a déjà été mise en oeuvre dans un test de détection de la présence d'ADN de mycobactéries dans un échantillon. Ainsi, un test de détection, par hybridation sandwich, de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis a été décrit par Chevrier et al. en 1993.
Un procédé de détection de faibles quantités de mycobactéries, appartenant au complexe tuberculosis, par amplification génique et hybridation directement sur des échantillons biologiques a été mis au point. Ledit procédé utilise la séquence d'insertion IS6770 (Brevet européen EP 0 490 951 Bl). Thierry et al. ont décrit en 1990 une séquence spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis et nommée IS 6110. Certains auteurs ont proposé d'amplifier spécifiquement l'ADN provenant de Mycobacterium en utilisant des amorces nucléiques dans une méthode d'amplification, telle que la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Patel et al. ont décrit en 1990 l'utilisation de plusieurs amorces nucléiques choisies à partir d'une séquence connue en tant que sonde dans l'identification de M. tuberculosis. Cependant, la longueur des fragments obtenue en utilisant ces amorces était différente de la longueur théorique attendue et plusieurs fragments de taille variable étaient obtenus. De plus, les auteurs ont observé l'absence d'hybridation des produits amplifiés avec le plasmide ayant servi à déterminer les amorces. Ces résultats indiquent que ces amorces ne seraient pas appropriées dans la détection de la présence de M. tuberculosis dans un échantillon biologique et confirment la nature critique du choix des amorces. La même année, J.L. Guesdon et D. Thierry ont décrit une méthode de détection de M. tuberculosis, de grande sensibilité, par amplification d'un fragment d'ADN de M tuberculosis localisé au sein de la séquence IS6110 (Brevet européen EP 461 045) à l'aide d'amorces générant des fragments d'ADN amplifié de longueur constante, même lorsque le choix des amorces conduisait à l'amplification de fragments longs (de l'ordre de 1000 à 1500 bases) où le risque d'interruption de la polymérisation est élevée en raison des effets de la structure secondaire de la séquence. D'autres amorces spécifiques de la séquence IS61 10 sont décrites dans le brevet européen N° EP-0 490 951. Les inventeurs ont montré que certains isolats cliniques de Mycobacterium tuberculosis étaient exempts de la séquence d'insertion IS61 10 et ne pouvaient donc être détectés à l'aide des oligonucléotides spécifiques de cette séquence. L'absence de la séquence IS6110 chez certaines souches de M. tuberculosis peut conduire ainsi à des résultats de diagnostic faussement négatifs. Parmi les isolats ne contenant pas la séquence IS6110, peuvent être cités les souches 729, 761, 808, 327 et 50, de M. tuberculosis, qui constituent des isolats cliniques plus partiuclièrement décrits ci-après dans les exemples. Ces résultats confirment une observation similaire faite par Yuen et al. en 1993. L'impossibilité de détecter ces souches pathogènes potentiellement présentes dans un échantillon biologique prélevé sur un patient est ainsi susceptible de conduire à des difficultés de diagnostic et à la sélection de souches exemptes de la séquence IS6110.
En conséquence, les inventeurs se sont attachés à rechercher des séquences communes aux différentes souches de mycobactéries appartenant au complexe de
Mycobacterium tuberculosis et qui ne comportent pas les inconvénients des séquences de l'art antérieur. En particulier, les inventeurs ont recherché des séquences qui peuvent être retrouvées dans toutes les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis, y compris chez les souches qui ne contiennent pas la séquence IS 61 10.
Les inventeurs ont ainsi caractérisé un polynucléotide constitué par une séquence de nucléotides présente chez toutes les souches testées de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, y compris chez les souches qui ne contiennent pas la séquence IS6110. Cette séquence de nucléotides contient un cadre ouvert de lecture (ORF) codant pour un polypeptide de 27 kD. De plus, des signaux de régulation de l'expression de la séquence codante ont été identifiés en amont et en aval de cette dernière. Ainsi, l'invention concerne un polynucléotide de 2805 paires de bases, spécifique du complexe de tuberculosis. Ce polynucléotide inclut la séquence correspondant à un gène de structure appelé ?27, qui code pour une protéine de poids moléculaire d'environ 27 kDa, apprécié avec une marge d'erreur de 10 %.
Par gène de structure aux fins de la présente invention, on entend un polynucléotide codant pour une protéine, un polypeptide ou encore un fragment de ces derniers, ledit polynucléotide ne comprenant que la séquence correspondant au cadre ouvert de lecture (ORF), ce qui exclut les séquences du côté 5' du cadre ouvert de lecture (ORF) qui dirigent l'initiation de la transcription.
Plus particulièrement, l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ LD N° 1) :
TTGGGCCGCCGTAAGGAATGCGTCATGAGCGACTTCGCATCACGGGCGACCAATCATTA ATTTGTCAAACCCTTTGAGATGCACTACTTGTCCACATTTTGTACACGAAATACCTAAC ACACTATGGTGCACATCACGCACTTCCACGTTCCGTATTCGGTGTACGATTTGTCACGC AACTAAGCGTTCAAGAGGGAGTACTATGACTCACCAAAAGTAAAAGATGACATAGAAAT AGAAGAGTCGTGGTTCCGGTGCGGGTAGCTCCCGATGGCTTGACTGTGGTAAGCACCAG TGGCGTGTTCCCCGTGGTTGAGACCAGGAAGTTTTAAAGTCCTACAGCCCGCGGTATTC CGCAGAGGACATTGTGTGCATTTCGCACCTTCGGGTGGGAGAAATCGGGATGATCTCAC CACCGGCCACCGGGTGGCGCACTTTGTACCCTTCGATTCCGTTATTCGGCGGATTTAAG CAGTTCGCACCATTACCAAGCAGCCAATGAGGAAGAGCGCAGGTGACTAGGTCGCTTGA TCTTTCCCTGTGCAGTAGCTCGGGTTCTTTGAGTTTCGAGGAGGAGAAACCACATGTCC TTTGTGAATGTAGACCCATTTGGATGTTGGCGGCCGTGCGACACTGGAGTCCCTTGGTT CCCACATGGCGGTAAGCAATGCCGCGGTGGCCTCGGTGACCACCAAGGTTCCTCCCCCG GCCGCCGACTACGTATCAAAAAAGTTATCGCTGTTCTTTAGTAGCCACGGGCAGCAGTA CCAGGTGCAAGCCGCTCGGGCACGGCCTTTCATCGAAATTGGTCCGGACCCTGGGCCGA ATTGCGCTTGCGTATGAGGAAGTCGAGAATCGCCAACAACGAAGGTTTCTAACGTGTCG CCAGTTACGCACGAGTGGCTACCAGCGAGTACAAGGGAGTAACGAATTATGCCCAATTT CTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGTTCTGGCC CGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACGAAG GTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCA GGCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACG CCCATAAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCG GCGATGGTGCCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGC AATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAAC AGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCG ATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGACTACGACGAGGC CTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAGAACGCAAAAGAGGAGGTCATCC ATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAACTCGTAACCAAGGTAGAC AAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTTTCATACAAGGAACA TCCTAAGTTTTGATTCGGGAACATCCTAAGAAACGGGGGGCGTCGCCGTTGGAGACGTC GCAACGTGTCCGCAGTCCCAAGGGCAACAGTGAAGGGCCCACGGTGCGATCCCCAACAC CCGGCTAGAGTGCGCATAATATTTTCCCGCCTCGGCTCAAGGCGTGCACCCCCATCACC GCTAACCATGCTGTGTATCAACAGATTTCATTGTCCCGGCCGTCGCGCGACCGACCAAT AGGGTGAGTTCCATGTGCGATATCGCCTAACAGCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGAT GTGATTATTGATTACGTGGATCACCATGTGGGTGATCGCGGTCGACAGCTTTGGTACCG AGCACATCGCCACAACGCGCGGTACGAATCTAGTACACAAATCCGCACCAGCCGCCATG CGACTTCGCAGGTCATAGCCCCGCAGAGTCGCCGAACCTGCCGCAGTGACAAAAGTCAG GACGGCCGGCGACGCGTCGAGCCGGGGTTAGGCGCAGTTAACGTCGCAGCGGGGTCCCA GACACGCGTCGGACTTTCGGACTCAGCCCGACGATTCGCCGTCAGACTGCGGGCTTTCC TGGTCTACCAGCAACGCTTGCAGGGCGGAGCCGGTGATGCGCCGGAACGCGCGCCGTGG CCGGTTGGCATCGAGAACGGCCACCTCTAAGCTGGCCACGCCAAGGGTGGGTTGATCAC CACCCGAGGTGTCGGCACTGCCGGCCCGCAATGCAGCGACCGCGATACGCAGGGCGTCG GTCAGGCTGGCGTTCTCGGCATACGACTCTTTGAGCGCGTTGGCGATCGGCTCCGTGGT GCCGCCCATCACCACGAAATGCGGCTCGTCGGCGATCGACCCGTCGTAGGTAATACGAT ACAACTCAGGGCGTTTCGTCTCGCCGTAATGCGCCACCTCGGCCACACACAACTCAACC TCGTAGGGCTTGGCCTGTTCGGTGAAGATGGTGCCTAGAGTCTGCGCGTAGACATTGGC CAACTGCCGACCCGTGACGTCACGACGGTCATAGGCGTAACCGCGGGTGTCGGCGAACT GGATCCCGCCGCGGCGCAAATTGTCGAACTCGTTGAACTTGCCCGCAGCCGCAAAACCC ACCCGATCGTAGAGCTCACTGATCTTCTGCAG b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).
On entend par polynucléotide ou acide nucléique, selon la présente invention, aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs.
Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N° 1 ou d'une partie de la SEQ
LD N° 1, et dont l'orientation est inversée. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : l'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M citrate de Na et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes :
- deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ;
- un lavage de 30 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon de 1 x SSC et 0,1 % SDS.
L'invention concerne également un polynucléotide comprenant le cadre ouvert de lecture codant pour un polypeptide d'un poids moléculaire de l'ordre de 27 kD. Selon un mode de réalisation préféré dudit polynucléotide, il est constitué d'une séquence présentant un cadre de lecture ouvert (ORF) qui comporte à son extrémité 5' le codon AT G, et à son extrémité 3 ' le codon TGA.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit polynucléotide comprend les nucléotides 934-1665 du polynucléotide de séquence SEQ LD N° 1 et les fragments de celui-ci, ainsi que les séquences qui présentent au moins 80 % d'homologie avec ledit polynucléotide ou lesdits fragments. Par pourcentage d'homologie au sens de la présente invention, on entend un pourcentage d'identité entre les bases des deux polynucléotides homologues, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur.
Le polynucléotide de séquence SEQ ID NX a été dénommé p27 par les inventeurs et comprend notamment les sites de restriction suivants : AluI, BamHI, BstI, EcoRII, HaelII, SacII, Sali. Tableau I : Sites de restriction de la SEQ ID N° 1
Figure imgf000012_0001
A titre illustratif, des fragments préférés du polynucléotide de séquence SEQ LD N° 1 selon l'invention sont les fragments suivants :
- le fragment obtenu en faisant agir les enzymes de restrictions Dral et EcoRV, coupant respectivement aux nucléotides nt 331 et nt 1910 de la séquence SEQ LD N° 1 ;
- le fragment obtenu en faisant agir les enzymes de restriction Dral et Kpnl, coupant respectivement aux nucléotides nt 331 et nt 2005 de la séquence SEQ LD N° 1.
Les fragments ci-dessus comprennent tous les deux la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour la protéine P27.
Pour les conditions de mise en oeuvre des enzymes de restriction dans le but d'obtenir des fragments nucléotidiques des polynucléotides selon l'invention, on se référera avantageusement à l'ouvrage de Sambrook de 1989. L'invention concerne ainsi un polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides (SEQ D N° 2) suivant : ATGCCCAATTTCTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCC GGGTTCTGGCCCGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGG AAAAGACGAAGGTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGT CAGTCGTCGCAGGCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGAC CGCCGAGCACGCCCATAAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGC AGGCTAGAGCGGCGATGGTGCCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACA GTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGC CGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCG TGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGAC TACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAGAACGCAAAAGA GGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAACTCGTAA CCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTTTCA TACAAGGAACATCCTAAGTTTTGA b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).
Le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1 comprend les signaux de régulation et/ou d'expression du gène de structure p27, situés respectivement du côté 5' et 3' et à proximité de ce gène.
Par comparaison avec les séquences connues, et plus particulièrement avec les séquences qui ont été déterminées chez les mycobactéries, les séquences des signaux de transcription et de traduction du gène p27 ont été déterminées. Il s'agit des séquences suivantes : - une séquence de type Shine-Dalgarno de fixation au ribosome est la séquence suivante, allant du nucléotide en position nt 919 au nucléotide en position nt 925 de la SEQ ID N° 1 : 5'-AGGGAGT-3 ; - la boîte -10 du promoteur du gène p27 est la séquence suivante, allant du nucléotide en position nt 802 au nucléotide en position nt 807 de la SEQ LD N° 1 : 5'-GAAATT-3' ;
- la boîte -35 du promoteur du gène p27 peut être constituée par l'une des séquences suivantes :
• la séquence allant du nucléotide en position nt 776 au nucléotide en position nt 781 de la SEQ LD N° 1 : 5'-AAGCCG-3\
• la séquence allant du nucléotide en position nt 783 au nucléotide en position nt 788 de la SEQ LD N° 1 : 5'-TCGGGC-3' ; - une séquence terminateur de la transcription ayant une structure de type « dyad symetry » est la séquence suivante, allant du nucléotide en position nt 1909 au nucléotide en position nt 1959 de la SEQ ID N° 1 : 5'-
TATCGCCTAACAGCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGATGTGATTATTG AT
-3'. La présente invention concerne ainsi un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend les signaux de régulation et/ou d'expression naturels de la protéine de 27 kD de M tuberculosis, localisés à proximité de la SEQ LD N° 2, du côté 5' et du côté 3' de la SEQ LD N° 2.
Avantageusement, un tel polynucléotide contiendra au moins une séquence comprenant l'enchaînement de nucléotides allant du nucléotide en position nt 776 au nucléotide nt 1665 du polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1.
De manière générale, l'invention a également pour objet un fragment nucléotidique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un polypeptide issu d'une mycobactérie, caractérisé en ce qu'il est présent uniquement chez les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, qu'il possède un poids moléculaire d'environ 27 kilodaltons et un point isoélectrique situé dans l'intervalle pi =
4,5 +/- 1,5. En outre, le polypeptide mycobactérien selon l'invention possède la composition suivante en acides aminés :
Tableau H : Composition en acides aminés du polypeptide P27
Figure imgf000015_0001
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide de 27 kD, désigné P27, de M tuberculosis, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ LD N° 3 suivant :
MPNFWALPPELNSTRLYLGPGSGPLLAAAQGWNALASELEKTKVGLQSALDTLLE SYRGQSSQALIQQTLPYVQWLTTTAEHAHKT QLTAAANAYEQARAAN1VPPA MVRANRVQTTVLKAL TvVTGQFST ADKEADYEQMWFQDALVMENY EAVQ E QSTSHFEDPPEMADDYDEAWMLNT DYHNENAKEEVIHL DVNKERGP LELVTKVDKEGTLRLVYDGEPTFSYKEHPKF
b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27 ; c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b) au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27.
Un tel polypeptide, tel que défini précédemment, est susceptible d'être reconnu spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients infectés par des mycobactéries appartenant au complexe de Mycobcaterium tuberculosis.
Font ainsi partie de l'invention les fragments du polypeptide P27 de séquence LD N° 3, qui peuvent être obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, telle que la trypsine ou la chymotrypsine ou la collagénase, ou par un réactif chimique, tel que le bromure de cyanogène (CNBr) ou encore en plaçant le polypeptide P27 dans un environnement très acide, par exemple à pH 2,5. A ce titre, des fragments peptidiques selon l'invention sont les fragments figurant à l'Annexe 2 de la description. Dans l'Annexe 2, figure une analyse, à l'aide du logiciel Pepsort™ (commercialisé Par Genetics Computer Group, Inc., 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 53711, USA), des fragments peptidiques obtenus après coupure enzymatique ou chimique respectivement par la trypsine (Tryp.), la chymotrypsine (Chymo), la clostripaïne (Clos. = Trypsine ayant une lysine bloquée), le bromure de cyanogène (CNBr), ITodobenzoate (LBzo), la protéase de Myxobacter (Myxo.), un milieu à pH 2,5 (pH2.5), la Proline endopeptidase (Proen.), la Protéase de Staphylocoque (Staph.), la trypsine dont les résidus Lysine sont bloqués (TrypK), la Trypsine dont les résidus Arginine sont bloqués (TrypR), et l'Endoprotéinase Asp-N (AspN). Pour chacun des réactifs de coupure, les fragments peptidiques générés sont classés, dans l'ordre croissant, en fonction de leur poids moléculaire (Mol. Wt.) et la séquence peptidique de chacun des fragments peut être déduite du fait de l'indication, pour chacun des fragments, des positions respectives de l'acide aminé N-terminal et de l'acide aminé C- terminal, la numérotation étant conforme à celle du polypeptide P27 de séquence SEQ ID N° 3. La colonne « Chg » correspond à la charge nette du fragment peptidique considéré, la colonne « Aro » indique le nombre d'acides aminés de type aromatique contenus dans ce fragment peptidique, les colonnes « Acid » et « Base » indiquent respectivement le nombre d'acides aminés acides ou basiques contenus dans ledit fragment peptidique, la colonne « Suif» indique le nombre de résidus Cystéine dans le fragment peptidique et les colonnes « Phil » et « Phob » indiquent le nombre de résidus hydrophiles ou hydrophobes présents dans le fragment peptidique considéré. Des fragments peptidiques préférés selon l'invention, pour une utilisation en diagnostic ou en vaccination, sont les fragments contenus dans des régions du polypeptide P27 susceptibles d'être naturellement exposées au solvant et de présenter ainsi des propriétés d'immunogénicité importante. De tels fragments peptidiques peuvent être préparés indifféremment par synthèse chimique, à partir d'hôtes transformés par un vecteur d'expression selon l'invention contenant un acide nucléique permettant l'expression desdits fragments, placé sous le contrôle des éléments de régulation et/ou d'expression appropriés ou encore par clivage chimique ou enzymatique, comme cela a été plus particulièrement décrit ci-dessus.
Une analyse de l'hydrophilicité du polypeptide P27 a été réalisée à l'aide du logiciel Peptidestructure™ (commercialisé Par Genetics Computer Group, Inc., 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 5371 1, USA), sur la base d'un calcul du caractère hydrophile de chaque acide aminé (1 à 243) de la SEQ LD N° 3, la fenêtre de calcul ayant été fixée à 7 acides aminés consécutifs de la SEQ LD N° 3. Les résultats de cette analyse sont présentés à l'annexe 3, où sont détaillés, pour chacun des acides aminés (AA) de position définie dans la SEQ LD N° 3 (Pos), l'indice d'hydrophilicité (HyPhil) et l'indice correspondant au degré d'antigénicité (Al-Ind). Plus l'indice d'hydrophilicité est élevé, plus l'acide aminé considéré est susceptible d'être exposé au solvant dans la molécule native, et est en conséquence susceptible de présenter un degré d'antigénicité élevé. Ainsi, un enchaînement d'au moins sept acides aminés possédant un indice élevé d'hydrophilicité (> 0,3) peut constituer la base de la structure d'un peptide candidat immunogène selon la présente invention. Les résultats présentés à l'Annexe 3, dans la colonne « Glycos », ont permis d'identifier un site de glycosylation potentiel, indiqué G, au niveau de l'asparagine en position 12 sur la SEQ LD N° 3.
A partir des données de l'Annexe 3, on peut identifier huit régions du polypeptide P27 présentant un indice d'antigénicité élevé. Il s'agit des régions suivantes, désignées par les positions des acides aminés N- et C-terminal, conformément à la numérotation de la SEQ LD N° 3, l'acide aminé en position 1 étant la méthionine codée par le codon ATG :
- Région 9-15 (7 acides aminés) ;
- Région 54-62 (9 acides aminés) ; - Région 77-87 (11 acides aminés) ;
- Région 95-101 (7 acides aminés) ;
- Région 111-116 (6 acides aminés) ;
- Région 127-145 (19 acides aminés) ;
- Régionl53-158 (6 acides aminés) ; - Région 164-183 (20 acides aminés) ;
- Région 188-199 (12 acides aminés) ;
- Région 205-212 ( 8 acides aminés) ; et
- Région 229-243 (15 acides aminés).
Les régions du polypeptide P27 détaillées ci-dessus constituent les régions préférentielles que devra contenir un fragment peptidique préféré selon l'invention. Un tel fragment peut avantageusement comprendre une ou plusieurs de ces régions potentiellement exposées au solvant et à forte capacité immunogène.
Font également partie de l'invention les polypeptides homologues au polypeptide de séquence SEQ LD N° 3 ainsi que les fragments de tels polypeptides homologues. Par polypeptide homologue aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide comprenant une ou plusieurs délétions et/ou substitutions d'acides aminés dans la séquence SEQ LD N° 3. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés - consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés immunogènes des peptides correspondants. En d'autres termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'un polypeptide de séquence modifiée qui permet l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 ou l'un de ses fragments ci-dessus définis. Ces aminoacyles équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacyles auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'immunogénicité croisée auxquels les différents peptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'immunogénicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.
L'invention concerne aussi un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de séquence SEQ LD N° 3 ou un polypeptide homologue au polypeptide de séquence SEQ LD N° 3 ou encore un fragment de ces derniers, tel que définis ci- dessus. La séquence de P27 présente des homologies de séquence avec une protéine de
408 acides aminés, riche en serine (Serine- Rich Antigen), de M. leprae, désignée Sra (Vega-Lopez et al., 1993). Il a ainsi été déterminé, d'une part que l'homologie entre la séquence de P27 et la séquence de Sra de M. leprae est restreinte aux 207 premiers acides aminés N-terminaux et d'autre part que le pourcentage d'homologie entre P27 et la protéine Sra (P. M. estimé : 42,5 KD) est de 34 % sur ces 207 acides aminés (Fig. 4). La protéine Sra de M. leprae présente elle-même un faible degré d'homologie avec un antigène hypothétique de 51 kD de M tuberculosis décrit par Shinnick en 1987, en particulier dans la région N-terminale. Alors que la protéine Sra de M. leprae possède 30 % de serine dans une région centrale, la protéine P27 ne possède que 5 % de serine mais possède en revanche 12 % d'alanine. En conséquence, la protéine P27 selon l'invention ne peut être assimilée à un membre de la famille des protéines riches en serine du type de la protéine Sra de leprae.
Le point isoélectrique théorique de la protéine P27 a été déterminé grâce au logiciel Isoelectric (commercialisé Par Genetics Computer Group, Inc., 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 5371 1, USA). Il est de 4,59 (Fig. 3), ce qui permet de classer P27 parmi les protéines acides L'invention vise aussi des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotide(s) dans un proportion d'environ 15 % par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de M. tuberculosis, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés, dans les conditions de stringence définies ci- dessus.
Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 8 nucléotides, de préférence au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides consécutifs de la SEQ LD N° 1.
Ces fragments peuvent être mis en oeuvre en tant qu'amorces pour la réalisation de réactions d'amplification, ou en tant que sondes.
Les séquences SEQ LD N° 1 et SEQ LD N° 2 ou les fragments obtenus à partir de ces séquences peuvent ainsi être utilisés pour sélectionner des amorces nucléotidiques, notamment pour la technique PCR.
Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4 683 202. Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont avantageusement une longueur d'au moins 8 nucléotides, de préférence d'au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides. On préférera en particulier des amorces d'une longueur comprise entre 8 et 30 et de préférence 12 et 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaires du brin (+) [amorce aller] de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-) [amorce retour]. Il est important que les amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques provenant de mycobactéries n'appartenant pas au complexe de tuberculosis ni avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer l'échantillon biologique. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une électrophorèse capillaire, ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les séquences nucléotidiques SEQ LD N° 1 ou SEQ LD N° 2, des fragments de celles-ci, des plasmides contenant ces séquences ou des fragments de celles-ci, des oligonucléotides complémentaires de ces séquences ou fragments de séquences ou des produits d'amplification.
Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
Ainsi, font également partie de l'invention les fragments nucléotidiques amplifiés (« amplicons ») définis ci-dessus. Ces sondes et amplicons peuvent être marqués ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives, telles que des enzymes ou des éléments fluorescents.
Des amorces particulièrement intéressantes répondent aux séquences suivantes, les positions de nucléotides indiquées correspondant à la numérotation du gène p27 de la SEQ LD N° 2 :
- Amorce n° 1 : nt 547 à nt 564 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 2 : nt 669 à nt 651 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 3 : nt 554 à nt 571 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 4 : nt 668 à nt 651 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ; - Amorce n° 5 : nt 564 à nt 582 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 6 : nt 667 à nt 650 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 7 : nt 454 à nt 471 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 8 : nt 600 à nt 583 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 9 : nt 571 à nt 589 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ; - Amorce n° 10 : nt 686 à nt 667 de la SEQ LD N° 2(amorce retour) ;
- Amorce n° 1 1 : nt 572 à nt 589 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ; Amorce n° 12 nt 686 à nt 668 de la SEQ LD N° 2 < 'amorce retour) ;
Amorce n° 13 nt 574 à nt 591 de la SEQ LD N° 2 j 'amorce aller) ;
Amorce n° 14 nt 573 à nt 591 de la SEQ LD N° 2 ( ^'amorce aller) ;
Amorce n° 15 nt 566 à nt 584 de la SEQ LD N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 16 nt 673 à nt 655 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 17 nt 567 à nt 584 de la SEQ LD N° 2 ( 'amorce aller) ;
Amorce n° 18 nt 666 à nt 646 de la SEQ LD N° 2 ( ^amorce retour) ;
Amorce n° 19 nt 564 à nt 582 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 20 nt 575 à nt 592 de la SEQ LD N° 2 ( 'amorce aller) ;
Amorce n° 21 nt 352 à nt 369 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 22 nt 594 à nt 577 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 23 nt 687 à nt 668 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 24 nt 424 à nt 441 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 25 nt 600 à nt 583 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 26 nt 414 à nt 431 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 27 nt 668 à nt 651 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 28 nt 422 à nt 439 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 29 nt 584 à nt 567 de la SEQ LD N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 30 nt 419 à nt 436 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 31 nt 577 à ht 595 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 32 nt 601 à nt 584 de la SEQ LD N° 2 ( 'amorce retour) ;
Amorce n° 33 nt 451 à nt 470 de la SEQ LD N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 34 nt 670 à nt 651 de la SEQ LD N° 2 ( ^amorce retour) ;
Amorce n° 35 nt 447 à nt 466 de la SEQ LD N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 36 nt 713 à nt 696 de la SEQ LD N° 2 ( 'amorce retour) ;
Amorce n° 37 • nt 563 à nt 582 de la SEQ LD N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 38 • nt 673 à nt 655 de la SEQ LD N° 2 ^amorce retour) ;
Amorce n° 39 : nt 577 à nt 594 de la SEQ LD N° 2 'amorce aller) ;
Amorce n° 40 : nt 689 à nt 671 de la SEQ ID N° 2 ^amorce retour) ;
Amorce n° 41 : nt 422 à nt 439 de la SEQ ID N° 2 'amorce aller) ;
Amorce n° 42 : nt 601 à nt 584 de la SEQ LD N° 2 ^amorce retour). De telles amorces nucléotidiques peuvent être utilisées deux à deux afin d'amplifier des régions spécifiques de la SEQ LD N° 1 ou de la SEQ LD N° 2. A titre d'exemple, on pourra, dans une réaction d'amplification de l'ADN, mettre en oeuvre l'un des couples d'amorces suivants : - Couple PI : Amorce n° 1 et Amorce n° 2 ;
- Couple P2 : Amorce n° 3 et Amorce n° 4 ;
- Couple P3 : Amorce n° 5 et Amorce n° 6 ;
- Couple P4 : Amorce n° 7 et Amorce n° 8 ;
- Couple P5 : Amorce n° 9 et Amorce n° 10 ; - Couple P6 : Amorce n° 11 et Amorce n° 12
- Couple P7 : Amorce n° 13 et Amorce n° 12
- Couple P8 : Amorce n° 14 et Amorce n° 10
- Couple P9 : Amorce n° 15 et Amorce n° 16 ;
- Couple P10 : Amorce n° 17 et Amorce n° 18 - Couple PI 1 : Amorce n° 19 et Amorce n° 18
- Couple P12 : Amorce n° 20 et Amorce n° 10
- Couple PI 3 : Amorce n° 21 et Amorce n° 22
- Couple P14 : Amorce n° 20 et Amorce n° 23
- Couple PI 5 : Amorce n° 24 et Amorce n° 25 - Couple PI 6 : Amorce n° 26 et Amorce n° 27
- Couple PI 7 : Amorce n° 28 et Amorce n° 29
- Couple PI 8 : Amorce n° 30 et Amorce n° 22
- Couple P19 : Amorce n° 31 et Amorce n° 10
- Couple P20 : Amorce n° 7 et Amorce n° 32 ; - Couple P21 : Amorce n° 33 et Amorce n° 34
- Couple P22 : Amorce n° 35 et Amorce n° 36
- Couple P23 : Amorce n° 37 et Amorce n° 38
- Couple P24 ; Amorce n° 39 et Amorce n° 40
- Couple P25 : Amorce n° 41 et Amorce n° 42. Les amorces figurent en détail dans l'annexe 1 avec leurs caractéristiques notamment les Tm de l'amorce. L'invention vise également les fragments nucléotidiques obtenus par amplification du polynucléotide de séquence SEQ LD N° 1 ou SEQ LD N° 2 à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention, plus particulièrement à l'aide de l'un quelconque des couples d'amorces PI à P25 selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternatives à la PCR.
La technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) est une technique d'amplification isotherme dont le principe est fondé sur la capacité d'une enzyme de restriction de couper l'un des deux brins de son site de reconnaissance qui se trouve sous une forme hémiphosphorothioate et sur la propriété d'une ADN polymérase d'initier la synthèse d'un nouveau brin d'ADN à partir de l'extrémité 3 'OH créée par l'enzyme de restriction et de déplacer le brin préalablement synthétisé qui se trouve en aval. La méthode comprend deux étapes principales : a). Synthèse, en présence de dCTP-alpha-S, de molécules d'ADN flanquées par des sites de restriction qui peuvent être coupés par une enzyme appropriée, b). Amplification exponentielle de ces molécules d'ADN ainsi modifiées, par coupure enzymatique, déplacement de brin et copiage des brins déplacés. Les étapes de coupure, de déplacement et de copiage sont répétées un nombre suffisant de fois afin d'obtenir une bonne sensibilité.
Ainsi, le protocole de la technique SDA est simple : l'ADN cible présent dans l'échantillon à analyser est dénaturé par la chaleur en présence de tous les réactifs exceptées les enzymes (enzyme de restriction et polymérase) qui sont ajoutées au milieu réactionnel après l'étape de dénaturation. Initialement réalisée avec l'enzyme de restriction HincII (Walker et al, 1992), cette technique est désormais mise en oeuvre avec une endonucléase de restriction isolée à partir de Bacillus stearothermophilus (BsoBl), et un fragment sans activité exonucléase 5' → 3' d'une ADN polymérase isolée de Bacillus cladotenax (çxo'Bca) [= exo-moins-iteα]. Ces deux enzymes peuvent opérer à 60°C et le système est désormais optimisé pour permettre l'utilisation de dUTP et la décontamination par l'UDG. Lors de la mise en oeuvre de cette technique, comme décrit par Spargo et al. en 1996, le temps de doublement de l'ADN cible est de 26 secondes et son taux d'amplification atteint 10 après 15 minutes d'incubation à 60°C.
La technique SDA est plus simple à réaliser que la PCR (un bain marie est suffisant) et elle est plus rapide que les autres techniques d'amplification. La SDA a été appliquée essentiellement à la détection de Mycobacterium tuberculosis. Son seuil de détection est équivalent à un génome mycobactérien contenant 10 copies de la séquence
IS61110.
Un autre objet de la présente invention est donc la mise en oeuvre des amorces oligonucléotidiques selon l'invention dans un procédé d'amplification d'ADN ou d'ARN selon la technique SDA ci-dessus. Pour la mise en oeuvre de la technique SDA, deux couples d'amorces sont utilisées : un couple d'amorces externes (Bl, B2) constituées d'une séquence spécifique de la SEQ LD N° 1 ou de la SEQ LD N° 2 ou de leur séquence complémentaire, et un couple d'amorces internes (Si, S2) constituées d'un oligonucléotide de fusion entre une séquence spécifique de la SEQ LD N° 1 ou de la SEQ LD N° 2 ou de leur séquence complémentaire fusionnée à une séquence nucléotidique contenant un site reconnu par une endonucléase de restriction, par exemple l'enzyme BsoBl.
A titre d'exemple de la mise en oeuvre des amorces selon l'invention dans un procédé d'amplification de type SDA, on peut, pour réaliser une amorce utilisable dans une réaction SDA, ajouter, à l'extrémité 5' de la région de l'amorce spécifique de SEQ LD N° 1 ou SEQ LD N° 2 selon l'invention, une séquence non spécifique de SEQ LD N° 1 ou SEQ LD N° 2 contenant un site de restriction, et plus particulièrement un site de restriction reconnu par l'endonucléase HincII ou BsoBl. Une telle séquence additionnelle contenant le site de restriction reconnu par l'endonucléase ifaoBI est avantageusement la séquence de nucléotides GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBl.
A titre illustratif, une amorce selon l'invention utilisable dans le cadre d'une amplification de type SDA peut être réalisée à partir de la séquence de l'amorce n° 1, et sera constituée de la séquence GCATCGAATGCATGTCTCGGGTATGCTCAACACCGTGTTC. dans laquelle les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBl et les nucléotides soulignés correspondent à la séquence spécifique de l'ADN cible, en l'occurrence la séquence constituée des nucléotides nt547 à nt564 inclus de la SEQ LD N° 2. Dans ce cas précis, la seconde amorce utilisée sera l'amorce n° 2 modifiée comme décrit ci-dessus. Un second jeu d'amorces, amplifiant l'autre extrémité de l'acide nucléique cible, sera réalisé comme décrit ci-dessus.
La sonde de détection sera choisie de telle manière à ce qu'elle hybride avec l'amplicon généré. Une telle sonde de détection aura avantageusement pour séquence une séquence d'au moins 12 nucléotides, et en particulier 15 nucléotides, comme par exemple la séquence comprise entre les nucléotides aux positions nt565 et nt650 de la SEQ LD N° 2 ou de la séquence complémentaire de la séquence comprise entre les nucléotides nt565 et nt650 de la SEQ LD N° 2. Une sonde de détection spécifique répondant à la définition ci-dessus sera avantageusement constituée de la séquence comprise entre les nucléotides 580 et 598 de la SEQ LD N° 2 ou de la séquence complémentaire de la séquence comprise entre les nucléotides nt580 et nt598 de la SEQ LD N° 2.
D'autres amorces préférées selon l'invention utilisables pour une réaction d'amplification de type SDA sont, par exemple, les suivantes :
Position sur la SEQ ID N° 2 Bla GAGATGGCCGACGAC 517-531
B2a CCCATCGTAGACGAG 693-679
S la ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCTCAACACCGTGTTC 550-564 S2a CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTCTTTGTCTACCTTG 665-651 B2b CCCCCTCTCCTTGTT 633-619
S2b CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGATGGATGACCTCC 605-59 lr
Les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gène ? 7 de M. tuberculosis, les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso Bl utilisée dans la technique SDA (Spargo et al., 1996). Des amorces similaires, utilisables dans une technique d'amplification de type SDA peuvent être réalisées à partir de l'une quelconque des amorces selon l'invention et plus particulièrement avec l'une quelconque des amorces n° 1 à 42 selon l'invention.
L'invention a donc également pour objet des amorces nucléotidiques conformes aux amorces décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une technique d'amplication d'ADN par déplacement de brin (SDA).
De manière préférentielle, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase HincII, les réactions SDA HincII/exo'Klenow [= HincLI/exo- moins-Klenow] sont réalisées dans un volume de 50 μl en présence de concentrations finales de 7,7 mM MgCl2, 0,2 mM de chaque dGTP, dCTP, dATP-alpha-S, 0,5 mM dUTP, 100 μg/ml de sérum albumine bovine acétylee, 10 ng/μl d'ADN de placenta humain, 50 mM K2HPO , pH 7,6, 10 % (v/v) diméthylsulfoxyde, 5 % (v/v) glycerol, 0,5 μM de chacune des deux amorces SI, S2, 0,05 μM de chacune des amorces Bl, B2, 3 unités/μl de HincII, 0,04 U/μl de exo'Klenow et des quantités variées de l'ADN cible de M. tuberculosis. Prélablement à l'addition de HincII, de exo'Klenow et de MgCl2, les réactions incomplètes (40 μl) sont chauffées à 95°C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible, puis sont placées à la température de 40°C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 μl du mélange d'enzymes constitué de 5 μl de MgCl2 à 77 mM, 0,2 μl de exo'Klenow (10 U/μl), 2 μl HincII (75 U/μl) et de 2,8 μl de glycerol à 50 %, le mélange réactionnel est incubé à 40°C pendant 2 h. Des fractions aliquotes de chaque échantillon sont ajoutées directement à 5 μl de tampon non-dénaturant (20 % Ficoll, 0,25 % de bleu de bromophénol). L'analyse est ensuite effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % non dénaturant suivie d'une coloration au bromure d'éthidium et d'une visualisation des bandes par illumination du gel d'électrophorèse aux rayons ultra-violet.
De manière avantageuse, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase BsoBl, les réactions SDA ifooBI/exo'Bca [= BsoBVexo- moins-Bca] sont réalisées dans un volume de 50 μl en présence de concentrations finales de 6mM MgCl2, 0,2 mM de chacun des dGTP, dATP, 0,5 mM dUTP, 1,4 mM dCTP- alpha-S, 100 ng/μl de sérum albumine bovine acétylee, 10 ng/μl d'ADN de placenta humain, 35 mM K2HPO4 pH 7,6, 10 % (v/v) de glycerol, 0,5 μM de chacune des amorces SI et S2, 0,05 μM de chacune des amorces Bl et B2, 3,2 U/μl BsoBl, 0,16 U/μl de exo'Bca et des quantités variées d'ADN cible de M. tuberculosis. Préalablement à l'addition de ifaoBI, de exo'Bca et de MgCl2, les réactions incomplètes (40 μl) sont chauffées à 95°C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible puis sont placées à 56°C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 μl du mélange enzymatique constitué de 5 μl de MgCl2 60 mM, 0,8 μl exo'Bca (10 U/μl), 1 μl BsoBl (160 U/μl) et 3,2 μl de tampon de dilution (10 mM Tris HC1, 10 mM MgCl2> 50 mM NaCl, 1 mM DTT), les réactions sont incubées à 56°C pendant 20 min. Des fractions aliquotes de 10 μl de chacun des échantillons sont ajoutées directement à 5 μl de tampon non dénaturant et analysé comme décrit ci-dessus.
Les polynucléotides de séquences SEQ ID NM et SEQ LD N° 2 et leurs fragments nucléotidiques ci-dessus décrits, en particulier les amorces selon l'invention, peuvent également être mis en oeuvre dans d'autres procédés d'amplification d'un acide nucléique cible, tels que :
- la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989 ;
- la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990 ; - la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991 ;
- la technique TMA (Transcription Mediated Amplification).
Les polynucléotides de séquences SEQ LD N° 1 et SEQ ID N° 2 ainsi que leurs fragments oligonucléotidiques peuvent aussi être employés dans des techniques d'amplification ou de modification de l'acide nucléique servant de sonde, telles que :
- la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable ;
- la technique de RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992 ;
- la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990 ; - la technique d'amplification à la Q-beta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996.
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de TARN contenu dans l'échanillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
Des sondes nucléotidiques selon l'invention sont spécifiques pour détecter les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, plus précisément du fait que ces mycobactéries possèdent dans leur génome au moins une copie de la SEQ LD N° 1 ou de la SEQ LD N° 2 ou un fragment de celles-ci. Par les sondes spécifiques selon l'invention, on entend tout oligonucléotide hybridant avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, et plus particulièrement tout oligonucléotide hybridant avec la séquence SEQ LD N° 2 codant pour un polypeptide de 27 kD chez M. tuberculosis, et ne présentant pas de réaction d'hybridation croisée ou d'amplification (PCR) avec des séquences présentes chez des mycobactéries n'appartenant pas au complexe de tuberculosis. Des sondes nucléotidiques préférées selon l'invention ont avantageusement une longueur d'au moins 8 nucléotides, plus particulièrement une longueur comprise entre 8 et 200 nucléotides.
Parmi les sondes nucléotidiques selon l'invention, sont tout particulièrement préférées les sondes nucléotidiques choisies parmi les oligonucléotides suivants : a) AGGAGGTCATCC ATC TCGTGC C, b) AAG GAG AGG GGG CCC ATC GAA C.
Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN comprenant tout ou partie de la SEQ ID N° 1 ou de la SEQ LD N° 2 dans des conditions d'hybridation de forte stringence. A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de détecter spécifiquement un ADN cible d'une mycobactérie appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, peuvent avantageusement être les suivantes :
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0, 15 M NaCl et 0,05 M citrate de Na et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de plyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes :
- deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ;
- un lavage de 30 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon de 0, 1 x SSC et 0, 1 %
SDS.
Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif ( P, S,
H, 5I) ou par une molécule non radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromo-désoxyuridine, fluorescéine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications.
Des exemples de marquages non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français N° 78.10975 ou par Urdea et al. ou par Sanchez-Pescador et al. en 1988. Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de mycobactéries sur un support (nitrocellulose, nylon, polystyrène, ...) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent possible une amplification du signal radioactif ou non radioactif. Un système d'amplification répondant à la définition ci-dessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché (« branched DNA ») telles que celles décrites par Urdea et al. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou l'ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN « branché » présentant une structure ramifiée. L'ADN branché, à son tour, est capable de fixer des sondes oligonucléotidiques qui sont elles-mêmes couplées à des molécules de phosphatase alcaline. Puis l'activité de cette enzyme est mise en évidence grâce à un substrat chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-phosphate. Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support de manière covalente ou non covalente, et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen N° EP-0305929 (Millipore Corporation) ou encore par d'autres procédés.
Un mode de préparation approprié des acides nucléiques de l'invention comportant au maximum 200 nucléotides (ou 200 pb s'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes : - la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des béta- cyanéthylphosphoramidite décrite en 1986, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée.
Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques selon l'invention de longueur supérieure à 200 nucléotides (ou 200 pb lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes :
- l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leur extrémité de sites de restrictions différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit en 1983,
- le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée.
Les sondes nucléotidiques utilisées pour la récupération de l'acide nucléique recherché dans les procédés sus-mentionnés, sont constituées généralement de 8 à 200 nucléotides de la séquence SEQ ID NX ou SEQ LD N° 2 ou des séquences complémentaires des SEQ LD N° 1 ou SEQ LD N° 2 et sont susceptibles de s'hybrider avec l'acide nucléique recherché dans les conditions d'hybridation définies précédemment. La synthèse de ces sondes peut être effectuée selon la méthode automatisée des béta cyanethylphosphoramidites décrite en 1986.
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être mises en oeuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonuléotides sondes fixés sur un support, la séquence de chaque sonde d'une longueur donnée étant située en décalage d'une ou plusieurs bases par rapport à la sonde précédente, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle- ci forme des hybrides avec les sondes de séquences complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquence cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires. Du fait de la connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la séquence nucléotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible. Cette technique est particulièrement efficace lorsque sont utilisées des matrices de sondes oligonucléotidiques de grande taille.
Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l'utilisation d'un support permettant une détection « bioélectronique » de l'hybridation de la séquence cible sur les sondes du support matrice, lorsque que ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électron est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucléotidique de l'ADN ou ARN cible est alors déterminée par un dispositif électronique. Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini ci-dessus, est décrit dans la demande de brevet européen N° EP-0 721 016 au nom de Affymax technologies N. V. ou encore dans le brevet américain N° US 5.202.231 au nom de Drmanac. L'invention a aussi pour objet les polynucléotides hybrides résultant : - soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou ADNc) provenant d'un échantillon biologique avec une sonde ou une amorce selon l'invention,
- soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou ADNc) provenant d'un échantillon biologique avec un fragment nucléotidique amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention.
Par ADNc au sens de la présente invention, on entend une molécule d'ADN obtenue en faisant agir une enzyme de type transcriptase inverse sur une molécule d'ARN, en particulier une molécule d'ARN messager (ARNm), selon les techniques décites dans Sambrook et al. en 1989. La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1 ou un fragment de celle-ci, par exemple le fragment de séquence SEQ ID N° 2. Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC. Un plasmide recombiné particulier, répondant à la définition ci-dessus, a été dénommé pMT05 par les inventeurs.
Un autre objet de la présente invention est un vecteur approprié pour le clonage et/ou l'expression et/ou l'insertion d'une séquence, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ci-dessus décrite en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression du polypeptide de 27 kD, chez un hôte déterminé.
Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides, des phages, des cosmides, des phagemides, des YAC. Un vecteur préféré est le plasmide pMT05 transfecté dans la souche TG1 de E. coli, la souche transfectée étant désignée sous le nom TGMT05 ayant été déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786 Ce plasmide possède un insert de 6 kb comprenant notamment la SEQ ID N° 1 et la SEQ LD N° 2, ainsi qu'une séquence du génome de M tuberculosis présente naturellement en amont de l'extrémité 5' de la SEQ LD N° 1.
Le vecteur pMT05 ci-dessus a été construit à partir du vecteur pUC18 et de l'insert d'ADN de 6kb de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
Ces vecteurs sont utiles pour transformer ou transfecter des hôtes cellulaires afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention. Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence nucléotidique ou un vecteur ci-dessus décrits.
De préférence, l'hôte cellulaire est modifié par cette séquence dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide p27 fonctionnel, s'agissant de sa reconnaissance par des anticorps le reconnaissant spécifiquement. Un hôte cellulaire préféré selon l'invention est la souche de E. coli TGMT05, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786.
Il est aujourd'hui facile de produire des protéines en quantité relativement importante par génie génétique en utilisant comme vecteurs d'expression des plasmides, des phages, des phagemides. Le gène p27 peut être inséré dans un vecteur d'expression approprié pour produire in vitro le polypeptide P27. Celle-ci pourra être fixée sur une microplaque pour développer un test sérologique destiné à rechercher, dans un but de diagnostic, les anticorps spécifiques chez les patients atteints de tuberculose.
Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention comprenant les étapes suivantes : - le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide de deux amorces d'ADN choisies de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s' hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s' hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, suivie de l'introduction desdites séquences ainsi amplifiées dans un vecteur approprié, - la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'invention comprenant la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, et - la séparation, à partir du susdit milieu de culture, dudit polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé. Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par Houbenweyl en 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions aminés de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire
(notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par des groupes t-butylester.
Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal.
Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par Merrifield.
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t- butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.
Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t- butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.
On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t- butyloxycarbonyle On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acides aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans des conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal.
On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine, par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique. L'invention a aussi pour objet un polypeptide de 27 kD, le polypeptide P27, tel qu'obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant selon la définition précédente, le polypeptide P27 étant caractérisé en ce que son ossature peptidique comprend la séquence d'acides aminés SEQ LD N° 3.
L'invention vise aussi une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés modifiée par rapport à la SEQ LD N° 3, par delétion, insertion ou remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que la protéine ainsi modifiée est reconnue par des anticorps spécifiques du polypeptide P27.
Entre également dans le cadre de l'invention, tout fragment peptidique du polypeptide P27 caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés SEQ ID NX ou à toute partie de cette séquence. Avantageusement, des fragments peptidiques de l'invention présentent des propriétés antigéniques et sont donc reconnus par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27.
De manière préférentielle, un tel fragment peptidique du polypeptide P27 comprendra une région de P27 exposée au solvant et aura une longueur d'au moins 20 acides aminés.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ces antigènes sont spécifiques du polypeptide P27 et ne sont donc pas reconnus par des anticorps spécifiques d'autres protéines de mycobactéries.
L'invention est en outre relative à des protéines hybrides présentant au moins une partie de la SEQ ID N° 3 et une séquence d'un peptide ou d'une protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal. Avantageusement, le déterminant antigénique est tel qu'il est susceptible d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire.
Un tel déterminant peut être de diverses natures et notamment être un fragment d'antigène protéique, avantageusement glycoprotéique, utilisé en vue d'obtenir des compositions immunogènes susceptibles d'induire la synthèse d'anticorps dirigés contre des épitopes multiples.
Ces molécules hybrides peuvent être constituées en partie d'une molécule porteuse de séquence SEQ LD N° 3 ou de séquence comprise dans la SEQ LD N° 3 associée à une partie, en particulier un épitope de la toxine diphtérique, la toxine tétanique, un antigène de surface du virus de l'hépatite B (brevet FR 79 21811), l'antigène VP1 du virus de la poliomyélite ou toute autre toxine ou antigène viral ou bactérien.
Avantageusement, un antigène bactérien tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de la protéine immunogène de 45/47 kD de M. tuberculosis (demande internationale PCT/FR 96/0166).
Un antigène viral, tel que défini ci-dessus, sera préférentiellement une protéine de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite, par exemple la protéine de surface de l'hépatite B sous l'une de ses formes S, S-préSl, S-préS2 ou S-préS2-préSl ou encore une protéine d'un virus de l'hépatite A, ou d'une hépatite non-A, non-B, tel qu'un virus de l'hépatite C, E ou delta.
Plus particulièrement, un antigène viral tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de l'une des glycoprotéines codées par le génome du virus HIV-1 (brevets GB 8324800, EP 84401834 ou EP 85905513) ou du virus HIV-2 (EP 87400151), et en particulier tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi gag, pol, nef ou env de HIV-1 ou de HIV-2. Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des ADNs hybrides codant pour les séquences protéiques ou peptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par Minton en 1984. Le polypeptide P27, ou les fragments du polypeptide P27, selon l'invention, peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans un procédé de détection in vitro d'anticorps dirigés contre le polypeptide P27 dans un échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) susceptible de les contenir, ce procédé comprenant la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide selon l'invention dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, et la détection in vitro des complexes antigène-anticorps éventuellement formés.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum humain ou animal.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, ou immunofluorescents, ou radio- immunologiques (RIA) ou équivalent.
Ainsi, l'invention concerne également le polypeptide P27 ou tout fragment de celui-ci, marqué à l'aide d'un marqueur adéquat du type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc..
De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes :
- dépôt de quantités déterminées d'une composition polypeptidique selon l'invention dans les puits d'une plaque de microtitration, - introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être analysé,
- incubation de la microplaque,
- introduction dans les puits de la plaque de microtitration d'anticorps marqués dirigés contre des immunoglobulines humaines ou animales, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, par exemple à 550 nm,
-détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolyse.
L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par une mycobactérie appartenant au complexe de tuberculosis, comprenant : - le polypeptide P27 ou un fragment antigénique de celui-ci,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique,
-les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ces réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide p27, ou le fragment antigénique de ce dernier, n'est pas marqué,
- le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticoφs reconnus par le polypeptide P27 ou le fragment antigénique de celui-ci,
- le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticoφs reconnus par le polypeptide P27 ou le fragment antigénique de celui-ci.
Le polypeptide P27 selon l'invention permet de préparer des anticoφs monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement le polypeptide P27 ou un fragment peptidique de P27. Les anticoφs monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticoφs polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticoφs spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticoφs polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé le polypeptide P27 ou un fragment de celui-ci, des anticoφs contenus dans le sérum de patients infectés par une mycobactérie appartenant au complexe de tuberculosis. L'invention vise en conséquence un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) prélevé chez un individu avec un anticoφs dirigé contre le polypeptide P27, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre lesdits anticoφs et les polypeptides spécifiques des mycobactéries du complexe de tuberculosis éventuellement présents dans l'échantillon biologique, b) mise en évidence du complexe antigène-anticoφs formé.
Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de souches de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, par exemple M. tuberculosis, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un anticoφs polyclonal ou monoclonal ci-dessus décrit, le cas échéant marqué ; - le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique ;
- un réactif permettant la détection des complexes antigène-anticoφs produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'anticoφs monoclonal ou polyclonal sus-mentionné n'est pas marqué ;
- le cas échéant, des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé.
Un autre objet de la présente invention concerne une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend le polypeptide P27 ou encore un ou plusieurs fragments antigéniques de celui-ci. Une autre composition immunogène selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'invention et/ou une ou plusieurs protéines hybrides conformes à l'invention.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition immunogène ci-dessus définie est constitutive d'un vaccin, lorsqu'elle est présentée en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants de l'immunité tels que l'alun ou un représentant de la famille des muramyl peptides ou encore l'adjuvant incomplet de Freund.
Aujourd'hui, divers types vaccins sont disponibles pour protéger l'homme contre des maladies infectieuses : micro-organismes vivants atténués (M bovis - BCG pour la tuberculose), micro-organismes inactivés (virus de la grippe), des extraits acellulaires (Bordetella pertussis pour la coqueluche), protéines recombinées (antigène de surface du virus de l'hépatite B), des polyosides (pneumocoques). Des vaccins préparés à partir de peptides de synthèse ou de micro-organismes génétiquement modifiés exprimant des antigènes hétérologues sont en cours d'expérimentation. Plus récemment encore, des ADNs plasmidiques recombinés portant des gènes codant pour des antigènes protecteurs ont été proposés comme stratégie vaccinale alternative. Ce type de vaccination est réalisé avec un plasmide particulier dérivant d'un plasmide de E. coli qui ne se réplique pas in vivo et qui code uniquement pour la protéine vaccinante. Les principaux composants fonctionnels de ce plasmide sont : un promoteur fort (par exemple celui du CMV), un site de clonage approprié pour insérer le gène d'intérêt, une séquence de terminaison-polyadénylation, une origine de réplication procaryote pour produire le plasmide recombiné in vitro et un marqueur de sélection (par exemple le gène de résistance à l'ampicilline) pour faciliter la sélection des bactéries qui contiennent le plasmide. Des animaux ont été immunisés en injectant simplement l'ADN plasmidique nu dans le muscle. Cette technique conduit à l'expression de la protéine vaccinale in situ et à une réponse immunitaire de type cellulaire (CTL) et de type humoral (anticoφs). Cette double induction de la réponse immunitaire est l'un des principaux avantages de la technique de vaccination avec de l'ADN nu. Huygen et al. (1996) et Tascon et al. (1996) ont réussi a obtenir une certaine protection contre M. tuberculosis en injectant des plasmides recombinés contenant des gènes de M. leprae (hsp65, 36kDa pra) comme inserts. M. leprae est l'agent responsable de la lèpre. L'utilisation d'un insert spécifique de M. tuberculosis (comme par exemple le gène p27, objet de la présente invention) conduirait probablement à une meilleure protection contre la tuberculose. Le gène p27 peut être facilement inséré dans les plasmides vecteurs VU (Montgomery et al, 1993), pcDNA3 (Invitrogen, R & D Systems) ou pcDNAl/Neo (Invitrogen) qui possèdent les caractéristiques nécessaires pour une utilisation vaccinale.
L'invention vise ainsi une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels que précédemment définis en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité. L'invention vise aussi une composition vaccinale destinée à l'immunisation de l'homme ou l'animal à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou l'hépatite, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels que précédemment définis en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité. Avantageusement, dans le cas d'une protéine hybride entre P27 et l'antigène de surface de l'hépatite B, la composition vaccinale sera administrée, chez l'homme, à raison de 0, 1 à 1 μg de protéine hybride purifiée par kilogramme du poids du patient, de préférence 0,2 à 0,5 μg/kg de poids du patient, pour une dose destinée à une administration donnée. Dans le cas de patients atteints de troubles du système immunitaire, en particulier les patients immunodéprimés, chaque dose injectée contiendra préférentiellement la moitié de la quantité pondérale de la protéine hybride contenue dans une dose destinée à un patient n'étant pas affecté de troubles du système immunitaire.
De préférence, la composition vaccinale sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps, par voie intradermique ou sous-cutanée. A titre d'exemple, trois doses telles que définies ci-dessus seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au temps tO + 1 an.
Alternativement, trois doses seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au temps tO + 6 mois.
Chez la souris, chez laquelle une dose pondérale de la composition vaccinale comparable à la dose utilisée chez l'homme est administrée, la réaction anticoφs est testée par prélèvement du sérum suivi d'une étude de la formation d'un complexe entre les anticoφs présents dans le sérum et l'antigène de la composition vaccinale, selon les techniques usuelles.
L'invention concerne également une composition immunogène caractérisée en ce qu 'elle comprend un polynucléotide ou un vecteur d'expression selon l'invention, en association avec un véhicule permettant son administration à l'homme ou l'animal.
L'invention a encore pour objet un vaccin destiné à l'immunisation à l' encontre d'une infection bactérienne ou virale, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide ou un vecteur d'expression selon l'invention, en association ave-: un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions immunogènes ou vaccinales sont notamment décrites dans la demande internationale N° WO 90/11092 (Vical Inc.) et également dans la demande internationale N° WO 95/11307 (Institut Pasteur).
Le polynucléotide constitutif de la composition immunogène ou de la composition vaccinale selon l'invention peut être injecté à l'hôte après avoir été couplé à des composés qui favorisent la pénétration de ce polynucléotide à l'intérieur de la cellule ou son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules polymères, comme décrit dans la demande internationale N° WO 94/27238 (medisorb Technologies International). Selon un autre mode de réalisation de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide, de préférence un ADN, est complexé avec du DEAE-dextran (Pagano et al., 1967) ou avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., 1989), avec des lipides (Felgner et al, 1987) ou encore encapsulés dans des liposomes (Fraley et al., 1980). Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide selon l'invention peut être introduit sous la forme d'un gel facilitant sa transfection dans les cellules. Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-L-lysine et de lactose, comme décrit par Midoux en 1993, ou encore le Poloxamer 407™, comme décrit par Pastore en 1994. Le polynucléotide ou le vecteur selon l'invention peuvent aussi être en suspension dans une solution tampon ou être associés à des liposomes.
Avantageusement, un tel vaccin sera préparé conformément à la technique décrite par Tacson et al. ou Huygen et al. en 1996 ou encore conformément à la technique décrite par Davis et al. dans la demande internationale N° WO 95/1 1307 (Whalen et al ). Un tel vaccin sera avantageusement préparé sous la forme d'une composition contenant un vecteur selon l'invention, comprenant tout ou partie de la SEQ ID N° 2 placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression chez l'homme ou l'animal.
Pour réaliser un tel vaccin, le fragment d'ADN correspondant au gène p27 (SEQ LD N° 2) du plasmide pMT05 est tout d'abord sous-cloné dans un vecteur d'expression approprié, plus particulièrement un vecteur d'expression contenant des signaux de régulation et d'expression reconnus par les enzymes des cellules eucaryotes et contenant également une origine de réplication active chez les procaryotes, par exemple chez E. coli, qui permet son amplification préalable. Puis le plasmide recombinant purifié obtenu est injecté à l'hôte, par exemple par voie intramusculaire. On pourra par exemple utiliser, en tant que vecteur d'expression in vivo de l'antigène d'intérêt, le plasmide pcDNA3 ou le plasmide pcDNAl/neo, tous les deux commercialisés par Invitrogen (R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). On peut aussi utiliser le plasmide VUns.tPA, décrit par Shiver et al. en 1995.
Un tel vaccin comprendra avantageusement, outre le vecteur recombinant, une solution saline, par exemple une solution de chlorure de sodium.
Une composition vaccinale telle que définie ci-dessus sera par exemple administrée par voie parentérale ou par voie intramusculaire.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- 1 - Isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique.
- 2 - Amplification spécifique de l'ADN des mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis. - 3 - Analyse des produits d'amplification. Ceux-ci peuvent être analysés par différentes méthodes. Deux méthodes sont données à titre d'exemple ci-dessous.
- 3a - Analyse électrophorétique en gel d'agarose des produits d'amplification. Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l'ADN de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis.
- 3b - Analyse par la technique d'hybridation moléculaire en utilisant une sonde nucléique dont la séquence est déduite de la séquence spécifique. Cette sonde sera avantageusement marquée par un élément non radioactif (sonde froide) ou radioactif.
Aux fins de la présente invention, on entendra par « ADN de l'échantillon biologique » ou « ADN contenu dans l'échantillon biologique », soit l'ADN présent dans l'échantillon biologique considéré, soit l'ADNc obtenu après l'action d'une enzyme de type transcriptase inverse sur l'ARN présent dans ledit échantillon biologique.
Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 ou 6 avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN ou l'ADNc d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) détection de l'hybride formé entre la sonde oligonucleotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention vise également un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucleotidique immobilisée sur un support selon la revendication 7 avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde oligonucleotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde, avec une sonde oligonucleotidique marquée telle que définie précédemment.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de détection défini précédemment, celui-ci est caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces tel que précédemment décrit. Une autre forme de mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple de fragments d'acide nucléique amorces, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucleotidique selon invention. L'invention a aussi pour objet un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique par déplacement de brin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec deux couples d'amorces spécifiquement destinées à l'amplification de type SDA décrites ci-dessus, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucleotidique selon l'invention.
L'invention concerne aussi un nécessaire ou kit pour la mise .en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, destiné à la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucleotidique selon l'invention ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN (ADN génomique, ADN plasmidique ou ADNc) d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucleotidique, dite sonde de capture, selon l'invention ; b) une sonde oligonucleotidique, dite sonde de révélation, telle que décrite précédemment ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis. L'invention concerne encore un kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un couple de fragments d'acide nucléique amorces selon l'invention ; b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucleotidique telle que décrite précédemment.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants : FIGURES
Figure 1 : Carte du cosmide pHC 79, construit à partir du plasmide pBR322. Il possède les séquences cos du phage lambda, permettant l'empaquetage d'un insert d'ADN d'une taille de 30 à 40 kb. Il possède deux gènes de résistance aux antibiotiques : un gène de résistance à l'ampicilline et un gène de résistance à la tétracycline, porteur d'un site de restriction unique pour l'endonucléase Sali.
Figure 2 : Carte du plasmide pMT05 contenant la SEQ LD N°l et la SEQ ID N° 2.
L'extrémité 5' de la SEQ LD N° 1 est localisée au nucléotide suivant immédiatement le dernier nucléotide de la séquence IS61 10, représentée par la boîte IS61 10 sur cette figure, et l'extrémité 3' de la SEQ ID N° 1 est localisée en aval de la séquence de p27 représentée par la boîte p27 sur cette figure. La SEQ ID N° 2 correspond à la boîte désignée p27 sur la figure.
Figure 3 : Comparaison des séquences en acides aminés de la protéine « Sra » de M. leprae et de la protéine P27 de M tuberculosis.
Figure 4 : Représentation graphique des résultats obtenus au Tableau V.
Figure 5 : Représentation graphique des résultats obtenus au Tableau VI.
Figure 6 : Histogramme de fréquence par classe d'absorbance (en pourcentage).
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction de la banque génomique M. tuberculosis L'ADN génomique de M. tuberculosis H37rv est digéré partiellement par l'endonucléase de restriction Sali en faisant agir 0,03 U d'enzyme par μg d'ADN pendant 1 heure à 37°C dans le tampon composé de 100 mM de NaCl, 50 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, les fragments entre 30 et 40 kb electroélués et précipités en éthanol après extraction au phénol/chloroforme (1/1).
Le vecteur est le cosmide pHC79. Il est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation. La ligation s'effectue en mélangeant 1,5 μg de vecteur et 3 μg de fragments d'ADN 30/40 kb (soit un rapport molaire vecteur/insert de 1/2), la réaction est laissée à
14°C pendant 18h après avoir ajouté 5 U de T4 DNA ligase dans un tampon composé de
0,066 mM de TRIS-HC1 pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol et 1 mM d'ATP.
Les cosmides recombinés sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries (HB101). Les bactéries transformées sont incubées lh à 37°C en milieu LB puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 50 μg/ml d'Ampicilline. Les colonies résistantes à l'Ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la Tétracycline, en effet le fragment d'ADN 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tétracycline (Tet) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp).
Exemple 2 : Criblage de la banque et détermination de la séquence II est effectué une mini préparation d'ADN sur les 455 premières colonies de bactéries transformées résistantes à l'ampicilline (Amp1*) et sensibles à la tétracycline (tets) selon la technique de lyse alcaline. Ces ADN sont testés par PCR en utilisant les amorces SRA1 : GCC CGA GAT CAA CTC CAC CC et SRA2: ACA TCT GTT CGT AGT CGG CC dont les séquences avaient été déterminées préalablement dans le laboratoire. Six clones cosmidiques présentent un fragment d'amplification en quantité importante et dont la taille est celle attendue (410 pb). Chacun de ces clones est repiqué sur milieu solide LB + ampicilline 50 μg/ml et les colonies bien individualisées sont repiquées sur une boîte ordonnée. Il est effectué une mini-préparation des 4 premières colonies recombinantes de chacun des clones. Les ADNs de ces mini-préparations sont soumis à une PCR avec les amorces SRA1/SRA2 et testés en gel d'agarose. Six sous- clones sont sélectionnés et conservés en glycerol à -80°C.
L'ADN de chacun des 6 sous-clones sélectionnés est hydrolyse individuellement par 7 enzymes de restriction, soumis à une électrophorèse et transféré selon la méthode de Southern puis hybride avec le fragment de PCR SRA1/SRA2. Ce fragment a été préalablement purifié par une chromatographie (FPLC) suivie d'une électrophorèse, d'une électroélution et d'un marquage au 32p par multipriming. C'est l'enzyme de restriction Pst I qui est retenue car une seule bande dont la taille est estimée à environ 7-7,4 kb hybride avec la sonde SRA1/SRA2.
Le clone J41 1 est sélectionné, une maxi-préparation est réalisée suivie d'une hydrolyse préparative de J411 par Pst I, le produit digéré est mis à migrer dans un gel d'agarose à 1 ,2 %, la bande dont la taille est alors estimée à 7-7,4 kb est découpée puis électroéluée, le fragment électroélué est contrôlé sur gel d'agarose à 0,8 %, la taille de ce fragment est estimée à environ 6 kb.
Ce fragment a été clone dans un vecteur pUC18, le plasmide recombiné est utilisé pour transformer des bactéries E. coli TG1. Les colonies des bactéries TG1 transformées ont été ordonnées sur boîte LB + ampicilline et 24 mini-préparations ont été réalisées pour contrôler la présence de l'insert. Le clone J41 1/Pst 1/8 est retenu et cultivé pour préparer une grande quantité de plasmide recombiné, celui-ci est dénommé pMT05. La souche contenant le plasmide pMT05 est dénommée TGMT05 et déposée à la C. N. C. M. le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786. La séquence d'une partie du fragment (2805 paires de bases) a été réalisée par la méthode de Sanger. La partie en amont de cette séquence contient une séquence IS 6110 et le fragment MT308.
Des couples d'amorces issues du fragment MT308 (MT26/MT27 et MT5/MT6), de riSô*770 (ISTB1/MT10 et MT7 MT3), du fragment de 933 pb en aval de VIS6II0 (Q/R) et à la séquence adjacente de 1872 pb (SRA1/SRA2, anti O/X9 et B/Xl l) ont permis de vérifier la présence de ces séquences sur le plasmide pMT05. Une carte schématique du plasmide pMT05 est représentée à la Fig.2.
Exemple 3 : Recherche des amorces oligonucléotides spécifiques du gène /λ? 7 Le logiciel PRIME nous a permis de sélectionner 25 couples d'amorces (cf. annexe 1 ). La position des amorces correspond à la numérotation des bases du gène p27 (SEQ ID N° 2).
Nous avons décidé de synthétiser les amorces suivantes pour réaliser, à titre d'exemple, ies tests PCR. Tableau ED. : Amorces pour la PCR
Figure imgf000052_0001
Exemple 4 • Isolement de l'ADN mvcobactérien
Les suspensions de mycobactéries sont centrifugées à 12 000 x g pendant 15 minutes. L'ADN est extrait par remise en suspension du culot avec 50 μl de NaOH 0,1 M contenant du NaCl 2 M et du SDS 0,5 %. Le mélange est incubé à 95°C pendant 15 minutes, au mélange réactionnel on ajoute 400 μl de Tris-HCl 0,1 M pH 7. L'ADN est extrait 3 fois au phénol/chloroforme, précipité à l'ethanol et repris dans 50 μl de Tris lO mM, EDTA 0, lmM pH 8
Exemple 5 Amplification de l'APN mycobactérien avec les couples d'amorces 1-2 . 3-4 et 7-8 issues de la séquence (SEQ LD N° 2) donnant respectivement les produits n° 1. n° 2 et n° 4
La spécificité de la méthode a été analysée directement sur différentes souches de mycobactéries et sur des ADNs purifiés à partir de mycobactéries de collection. La méthode a été ensuite validée sur des isolats cliniques fournis par le Centre de Biologie Médicale Spécialisée de l'Institut Pasteur (C B M S)
I- Analyse de la spécificité de la méthode
A) Utilisation des couples d'amorces 3-4 et 7-8
L'analyse de la spécificité des couples 3-4 et 7-8 sur les ADNs mycobactériens suivants a été réalisée : M. kansasii, M. mtracellulare, M. avium, M. paratuberculosis, M. bovis, M. chelonae, M. gordonae, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. simiae, M. tuberculosis (souche H37Rv), M. tuberculosis (souche 729), M. tuberculosis (souche 761), M tuberculosis (souche 808), M. tuberculosis souche 327), M. tuberculosis (souche 14) La souche 50, mentionnée en préambule de la description, correspond à un isolât clinique disponible à l'Institut de la tuberculose, Hanoi, Vietnam.
Les souches 729, 761, 808 et 327 correspondent à des isolats cliniques provenant respectivement de : - Hôpital Pham Ngoc Thach, Ho Chi Min Ville, Vietman (souches 729, 761, 808) ; - Centre Muraz, Bobo-Dioulasso, Burkina-Fasso (souche 327)
L'amplification est réalisée par la technique d'amplification in vitro selon Saiki et al. (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 12,5 pmoles de chacune des amorces oligonucléo diques et 50 ng d'ADN de différentes souches de mycobactéries avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon contenant 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 200 μM de désoxyribonucléotides et 100 μg/ml de gélatine. Le volume final de la réaction étant de 100 μl. Les paramètres des étapes de PCR ont été choisis de la façon suivante . 1 mn à 94°C, 1 mn à 55°C, 1 mn à 72°C Trente cycles sont réalisés en utilisant un thermocycleur Après le dernier cycle les échantillons sont maintenus à 72°C 10 mn puis stockés à 4°C. Les résultats de l'amplification sont analysés par électrophorèse Dix μl des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2 % dans un tampon TAE (0,04M Tris -acétate, 0,001 M EDTA) et 1 μg/ml EtBr. Les fragments amplifiées sont visualisées sous UV.
Un fragment d'ADN correspondant à la taille attendue est observé avec les ADNs des mycobactéries suivantes : M. tuberculosis (souche H37Rv), M. tuberculosis (souche 729), M. tuberculosis (souche 761), M. tuberculosis (souche 808), M. tuberculosis souche (327), M. tuberculosis (souche 14), M. bovis ; le couple 3-4 donne un fragment compris entre 234 et 281 pb et le couple 7-8 un fragment dont la taille est comprise entre 118 et 194 pb. Par contre ce fragment n'est pas visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes : M. kansasii, M. mtracellulare, M. avium, M. paratuberculosis, M. chelonae, M. gordonae, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. simiae Les résultats obtenus montrent que le gène p27 n'est présent que chez les bactéries appartenant au complexe tuberculosis D'autre part, ce gène est présent chez les souches n° 729, 761, 808, 327 de Mycobacterium tuberculosis non détectables par les amorces issues de la séquence IS6II0 (brevet EP 0 490 951 B l) En effet, la PCR réalisée sur ces quatre souches avec le couple 3-4 ou le couple 7-8 donne le fragment d'ADN attendu, aucun fragment de PCR n'est observé avec les amorces MT7 et MT3 issues de VIS61I0
B) Utilisation du couple d'amorces 1-2
L'analyse de la spécificité de la méthode a été réalisée en utilisant le couple d'amorces 1-2 suivant, issues de la séquence du gène p27
- ATG CTC AAC ACC GTG TTC,
- CCC CTC TTT GTC TAC CTT G
Les paramètres de la PCR sont les suivants
- Dénaturation 94 °C, 1 minute , - Hybridation . 55 °C, 1 minute ,
- Extension 72°C, 1 minute
La séquence complète du fragment amplifié par PCR (123 paires de bases) est la suivante
ATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAGAACGCAAAAGAGGAGGT CATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAACTCGTA ACCAAGGTAGACAAAGAGGGG
Le fragment amplifié est détecté grâce à la technique d'hybridation non radioactive de type " sandwich ", telle que décrite dans Chevπer et al (1993), en utilisant les sondes nucléotidiques suivantes Sonde de capture phosphorylee en 5'
AGG AGG TCA TCC ATC TCG TGC C
Sonde de détection biotinylée en 5'
AAG GAG AGG GGG CCC ATC GAA C Pour chaque manipulation, on détermine un seuil de détection 7 puits au minimum sont des témoins sans ADN qui ne contiennent que les sondes et le tampon d'hybridation La moyenne et l'écart-type des valeurs obtenues permet de calculer une valeur seuil avec la formule χ + 4 x σn • tous les échantillons qui ont une absorbance inférieure a ce seuil seront considérés négatifs
Les résultats présentés ci-dessous sont calculés en faisant la moyenne des échantillons déposés en double.
La spécificité est testée sur différentes matrices . extractions rapides d'ADN à partir de colonies (souches de mycobactéries et souches de Mycobacterium tuberculosis sans IS 6110) et ADN purifiés par une méthode conventionnelle
1) Souches de mycobactéries
La spécificité est analysée en testant différentes souches de mycobactéries
Pour cela, des extractions d'ADN mycobactériens ont été réalisées à partir de souches de la Collection de l'Institut Pasteur Tableau IV : Référence des souches de mycobactéries utilisées
Souche Référence Institut Pasteur
M. africanum 140030001 M. asiaticum 141080001 M. avium 140310002 M. bovis 140020001 M. bovis BCG 140040001 M. chelonae 140420023 M. βavescens 140230001 M. gordonae 140210001 M. kansasii 140110001 M. marmum 140120001 M. scrofulaceum 140220001 M. simiae 141020001 M. szulgai 140240001 M. terrae 140320001 M. xenopi 140350001 Tableau V : Etude de la spécificité sur des souches de mycobactéries
Figure imgf000056_0001
On constate que les valeurs des absorbances obtenues pour les souches du groupe tuberculosis sont très nettement supérieures à la moyenne des absorbances des souches non tuberculosis.
Les valeurs des absorbances obtenues avec des souches non tuberculosis permettent de déterminer le seuil de positivité de la méthode.
2) ADNs mvcobactériens
Des ADNs (environ 120 ng), purifiés à partir de différentes cultures mycobactériennes, ont été utilisés comme matrice en PCR avec les amorces sur le gène p27, puis les produits de PCR ont été hybrides sur microplaque.
Tableau VI : Etude de la spécificité sur des ADNs de mycobactéries
Figure imgf000057_0001
Les résultats obtenus après amplification réalisée sur les ADNs purifiés permettent de confirmer que le gène p27 est spécifique du groupe tuberculosis. 3) Souches de M tuberculosis sans IS 6110
Le gène p27 est présent uniquement dans le génome des mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis et toutes les souches de M. tuberculosis possèdent ce gène, contrairement à la séquence d'insertion IS 6110 initialement utilisée pour le diagnostic de la tuberculose et dont l'utilisation a été abandonnée depuis la découverte de souches ne portant pas cette séquence. Le gène p27 présente ainsi un intérêt majeur pour le diagnostic de la tuberculose. Différentes souches de M tuberculosis qui ne possèdent pas la séquence IS 6110 sont disponibles. Il s'agit de souches provenant du Burkina Faso, du Vietnam ou de France. Il est à noter que la souche trouvée en France provient d'un patient d'origine vietnamienne (analyse faite au CBMS).
Des PCRs ont été réalisées avec d'une part des amorces sur le gène p27 et d'autre part sur la séquence IS 6110 :
Tableau VIT : Etude de la spécificité sur des souches sans séquence IS 6110.
Figure imgf000058_0001
Ainsi, il a pu être vérifié l'absence de la séquence IS 6110 et la preuve de la présence du gène p27 dans le génome des cinq isolats prélevés sur des malades atteints de tuberculose. Il est important de noter que l'utilisation des amorces issues de la séquence IS 6110 aurait conduit à une erreur grave de diagnostic (absence de tuberculose chez des malades infectés par M tuberculosis).
D'après les résultats obtenus, la spécificité du gène p27 est démontrée. Par ailleurs, les amorces de PCR et les sondes pour l'hybridation sont satisfaisantes dans la méthode utilisée. Pour valider l'utilisation de la séquence du gène p27 pour le diagnostic, la méthode a été testée sur un grand nombre de souches de M. tuberculosis isolées sur des malades. II - Validation sur des isolats cliniques de la méthode utilisant le gène p27
La validation est effectuée sur des extractions d'ADN faites à partir d'isolats cliniques provenant de patients du Burkina Faso, les isolats appartiennent à l'espèce tuberculosis.
Au total, 147 échantillons ont été testés. Les résultats obtenus après hybridation ont été regroupés dans des classes d'absorbance.
Chaque classe est représentée par le pourcentage de son effectif dans le tableau ci-dessous :
Tableau VTLI : Pourcentage des effectifs par classe d'absorbance
Figure imgf000059_0001
Seuil : 39 (moyenne calculée sur les différentes expériences)
On constate que tous les échantillons testés sont positifs, leur absorbance étant supérieure au seuil théorique calculé. Plus de 50 % de l'effectif total a une absorbance comprise entre 100 et 500, plus de 99 % des ADNs donnent une absorbance supérieure à 100. Ces résultats démontrent la présence du gène p27 dans tous les échantillons testés.
HT - Validation de la méthode sur des échantillons biologiques Afin de tester l'utilisation de la séquence du gène p27 pour le diagnostic rapide de la tuberculose, 66 échantillons biologiques provenant du service de biologie moléculaire du CBMS ont été analysés par cette méthode et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus au CBMS.
Les résultats obtenus au CBMS ont été réalisés avec le kit de Sanofi Diagnostics Pasteur (SDP), kit employant des amorces issues de la séquence d'insertion IS6110, et/ou avec le kit COBAS AMPLICOR™, ce kit étant réalisé avec des amorces choisies sur le gène codant pour l'ARN 16S.
Les 44 échantillons trouvés négatifs avec les kits SDP et COBAS AMPLICOR™ ont également donné une réponse négative vis-à-vis du gène p27 : l' absorbance était inférieure au seuil de détection.
Les résultats obtenus pour les 21 échantillons positifs sont résumés dans le tableau IX. Les échantillons sont considérés positifs lorsqu'au moins un des volumes d'extraction donne une absorbance supérieure au seuil de posivité, chaque échantillon est testé sur trois volumes (50, 25 et 5 μl). L'échantillon 280 correspond à la souche sans séquence IS 6110 isolée au CBMS
(cf. tableau VII).
Tableau IX : Comparaison des échantillons considérés comme positifs avec la méthode utilisant le gène p27 avec les résultats obtenus avec le kit SDP et COBAS AMPLICOR™
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
IV - Conclusion
L'ensemble des résultats obtenus précédemment montre que le gène p27 possède une spécificité qui le rend exploitable pour le diagnostic de la tuberculose : il n'est pas présent chez les mycobactéries n'appartenant pas au complexe tuberculosis et il est présent chez tous les isolats appartenant à ce complexe. Ainsi, le gène p27, ou un de ses fragments selon l'invention, pourrait avantageusement remplacer la séquence IS 6110 pour le diagnostic de la présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis.
Exemple 6 : Amplification de l'ADN mycobactérien avec différents couples d'amorces issues de la séquence SEQ ID N° 1 et de 1TS 6110
Deux paires d'amorces ont été sélectionnées (cf. tableau ci-dessous) dans la séquence (SEQ LD N° 1) et utilisées comparativement avec les amorces MT7 et MT3 issues de 1TS 6110 dans un test PCR réalisé avec l'ADN des souches suivantes : M. tuberculosis (souche H37Rv), M. tuberculosis (souche 729), M. tuberculosis (souche 761), M. tuberculosis (souche 808), M. tuberculosis (souche 327). Tableau X : Couples d'amorces spécifiques de la séquence SEQ ID N°
Figure imgf000063_0001
L'amplification est réalisée en utilisant 12,5 pmoles de chacune des amorces oligonucléotidiques et 50 ng d'ADN de différentes souches de M. tuberculosis avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon contenant 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 200 μM de désoxyribonucléotides et 100 μg/ml de gélatine. Le volume final de la réaction étant de 100 μl. Les paramètres des étapes de PCR ont été choisis de la façon suivante X mn à 94°C, 1 mn à 60°C, 1 mn à 72°C. Quarante cycles sont réalisés en utilisant un thermocycleur. Après le dernier cycle les échantillons sont maintenus à 72°C 10 mn puis stockés à 4°C.
Les résultats de l'amplification sont analysés par électrophorèse. Dix μl des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2 % dans un tampon TAE (0,04M Tris -acétate, 0,001M EDTA) et 1 μg/ml EtBr. Les fragments amplifiés sont visualisés sous UV.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous Tableau XI : Résultats de l'amplification par PCR de l'ADN de plusieurs souches de M tuberculosis à l'aide des couples d'amorces respectivement spécifiques de IS 6110 (M7/MT3) ou de la séquence SEQ ID N° 1 (SRA1/SRA2 et XI 1/b).
Figure imgf000064_0001
Ces résultats montrent clairement que les amorces issues de la séquence SEQ LD N° 1 permettent de détecter et/ou d'identifier les souches de Mycobacterium tuberculosis non détectables par les amorces issues de la séquence IS 6110 (brevet EP 0 490 951 Bl). En effet, les PCRs réalisées sur les quatre souches M. tuberculosis n° 729, 761, 808 et 327 avec les couples SRA1/SRA2 et XI 1/B donnent les fragments d'ADN attendus, aucun fragment de PCR n'est observé avec les amorces MT7 et MT3 issues de FIS 6110.
Exemple 7 : Amplification par déplacement de chaîne (Strand Displacement Amplification)
Il existe aujourd'hui plusieurs méthodes d'amplification génique utilisable pour le diagnostic de maladies infectieuses, parmi celles-ci la SDA offre certains avantages : un taux d'amplification de 10^ est atteint en 15 minutes seulement, la réaction est isotherme. Nous avons donc défini, à partir du gène p27 (SEQ ID N° 2), des amorces pour réaliser la technique SDA. Tableau XII : Exemples d'amorces utilisables dans une réaction d'amplification par déplacement de chaîne (SDA).
Figure imgf000065_0001
Les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gène p27 de M. tuberculosis, les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso Bl utilisée dans la technique SDA (Spargo et al., Molecular and Cellular Probes, August 1996, 10, 247-256).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Bibliographie
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Annexe 1 : Amorces sélectionnées
Produit : P 1
Amorces
5, 3,
Amorce aller (18-mer) 547 ATGCTCAACACCGTGTTC 564 Amorce retour (19-rner) 669 CCCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller
%GC de l'amorce: 50.0 52.6 Tm de l'amorce (degrés Celsius): 55.3 54.8
Produit
Longueur: 123 %GC: 53.7 Tm: 76.9 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.4 degrés Celsius
Produit: 'P2
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 554 ACACCGTGTTCGACTATC 571 Amorce retour (18-mer) : 668 CCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
%GC de 1 ' amorce : 50.0 50.0 Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.3 50.4
Produit
Longueur 115
%GC 53.9
Tm 77.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.1 degrés Celsius Annexe 1 (suite 1)
Produit: P3
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer) : 564 CGACTATCACAACGAGAAC 582 Amorce retour (18-mer) : 667 CCTCTTTGTCTACCTTGG 650
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.4 50.4
Produit
Longueur: 104 %GC: 53.8 Tm: 76.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 53.4 degrés Celsius
Produit: P4
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 454 GAGAACTATTGGGAAGCC 471 Amorce retour (18-mer) : 600 GATGACCTCCTCTTTTGC 583
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 52.1 52.9
Produit
Longueur: 147 %GC 54.4 Tm: 78.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.9 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.5 degrés Celsius Annexe 1 (suite 2)
Produit: P5
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer): 571 CACAACGAGAACGCAAAAG 589 Amorce retour (20-mer) : 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 58.0 57.6
Produit
Longueur 116 %GC 54.3
Tm 77.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.4 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.4 degrés Celsius
Produit: P6
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 572 ACAACGAGAACGCAAAAG 589 Amorce retour (19-mer) : 686 TAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 54.9 53.3
Produit
Longueur 115
%GC 53.9
Tm 77.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.6 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.0 degrés Celsius Annexe 1 (suite 3)
Produit: P7
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 574 AACGAGAACGCAAAAGAG 591 Amorce retour (19-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 54.1 53.3
Produit
Longueur 113 %GC 54.0
Tm 77.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.7 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.0 degrés Celsius
Produit: P8
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer) : 573 CAACGAGAACGCAAAAGAG 591 Amorce retour (20-mer) : 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 57.2 57.6
Produit
Longueur: 114 %GC: 54.4 Tm: 77.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.4 degrés Celsius
température optimale d'hybridation: 56.3 degrés Celsius Annexe 1 (suite 4)
Produit: P9
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer): 566 ACTATCACAACGAGAACGC 584 Amorce retour (19-mer) : 673 TGGTCCCCTCTTTGTCTAC 655
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 53.7 55.0
Produi
Longueur 108 %GC 53.7
Tm 75.9 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.4 degrés Celsius
Produit: P10
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 567 CTATCACAACGAGAACGC 584 Amorce retour (21-mer) : 666 CTCTTTGTCTACCTTGGTTAC 646
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 42.9 orce (degrés Celsius): 52.5 50.9
Produit
Longueur: 100
%GC: 53.0
Tm: 75.6 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.6 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 53.3 degrés Celsius Annexe 1 (suite 5)
Produit: P11
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer): 564 CGACTATCACAACGAGAAC 582 Amorce retour (21-mer) : 666 CTCTTTGTCTACCTTGGTTAC 646
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 42.9
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.4 50.9
Produit
Longueur 103
%GC 53.4
Tm 75.8 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 53.4 degrés Celsius
Produit: PI 2
Amorces
5, 3,
Amorce aller (18-mer) : 575 ACGAGAACGCAAAAGAGG 592 Amorce retour (20-mer) : 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 56.5 57.6
Produit
Longueur: 112 %GC: 54.5 Tm: 76.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.1 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.4 degrés Celsius Annexe 1 (suite 6)
Produit: PI 3
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 352 ACAGTGTTGAAGGCAATC 369 Amorce retour (18-mer) : 594 CTCCTCTTTTGCGTTCTC 577
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.5 53.4
Produi
Longueur 243 %GC 54.3
Tm 80.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 2.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.7 degrés Celsius
Produit: P14
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 575 ACGAGAACGCAAAAGAGG 592 Amorce retour (20-mer) : 687 GTAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 56.5 54.5
Produit
Longueur: 113 %GC: 54.9 Tm: 77.4 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 2.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.6 degrés Celsius Annexe 1 (suite 7)
Produit: P15
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 424 CAGATGTGGTTCCAAGAC 441 Amorce retour (18-mer) : 600 GATGACCTCCTCTTTTGC 583
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.7 52.9
Produit
Longueur 177 %GC 54.2
Tm 79.1 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.0 degrés Celsius
Produit: P16
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 414 CGACTACGAACAGATGTG 431 Amorce retour (18-mer) : 668 CCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 50.3 50.4
Produit
Longueur: 255 %GC: 54.9 Tm: 80.4 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.1 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.5 degrés Celsius Annexe 1 (suite 8)
Produit: P17
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 422 AACAGATGTGGTTCCAAG 439 Amorce retour (18-mer): 584 GCGTTCTCGTTGTGATAG 567
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.3 52.5
Produi
Longueur 163
%GC 54.6
Tm 78.3 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.2 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.3 degrés Celsius
Produit: P18
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 419 ACGAACAGATGTGGTTCC 436 Amorce retour (18-mer) : 594 CTCCTCTTTTGCGTTCTC 577
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0 orce (degrés Celsius): 54.0 53.4
Produit
Longueur: 176
%GC: 54.0
Tm: 79.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.5 degrés Celsius Annexe 1 (suite 9)
Produi t : P 1 9
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer) : 577 GAGAACGCAAAAGAGGAGG 595 Amorce retour (20-mer) : 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 52.6 55.0 Tm de l'amorce (degrés Celsius) : 57.6 57.6
Produi
Longueur: 110 %GC: 54.5 Tm: 76.3 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.1 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.8 degrés Celsius
Produit: P20
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 454 GAGAACTATTGGGAAGCC 471 Amorce retour (18-mer) : 601 GGATGACCTCCTCTTTTG 584
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0 Tm de l'amorce (degrés Celsius): 52.1 52.8
Produit
Longueur: 148 %GC: 54.7 Tm: 78.3 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 0.7 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.6 degrés Celsius Annexe 1 (suite 10)
Produit: P21
Amorces
5' 3'
Amorce aller (20-mer) : 451 ATGGAGAACTATTGGGAAGC 470 Amorce retour (20-mer) : 670 TCCCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 55.8 56.8
Produit
Longueur 220
%GC 55.0
Tm 79.5 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 57.5 degrés Celsius
Produit: P22
Amorces
5' 3'
Amorce aller (20-mer) : 447 AGTGATGGAGAACTATTGGG 466 Amorce retour (18-mer) : 713 TTGTATGAAAACGTGGGC 696
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 44.4
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 54.1 55.4
Produi
Longueur 267
%GC 54.3
Tm 80.2 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 57.4 degrés Celsius Annexe 1 (suite 11)
Produit: P23
Amorces
5' 3'
Amorce aller (20-mer) : 563 TCGACTATCACAACGAGAAC 582 Amorce retour (19-mer) : 673 TGGTCCCCTCTTTGTCTAC 655
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 52.6
Tm ce l'amorce (degrés Celsius): 53.7 55.0
Produit
Longueur 111
%GC 54.1
Tm 76.1 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.5 degrés Celsius
Produit: P24
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 577 GAGAACGCAAAAGAGGAG 594 Amorce retour (19-mer) : 689 TCGTAGACGAGTCTGATGG 671
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 53.4 54.6
Produit
Longueur 113
%GC 54.9
Tm 77.4 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.2 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.3 degrés Celsius Annexe 1 (suite 12)
Produit: P25
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 422 AACAGATGTGGTTCCAAG 439 Amorce retour (18-mer) : 601 GGATGACCTCCTCTTTTG 584
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.3 52.8
Produit
Longueur 180
%GC 53.9
Tm 79.0 degrés Celsius différence entre les Tm des amorces: 1.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.8 degrés Celsius
/30699
80 Annexe 2
Carte peptidique de la protéine p27KD
Digesc with: Try .
Pos Frcm To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob
20 243 - 244 147.2 0.0 1 0 0 0 0
3 42 - 43 247.3 1.0 0 0 1 0 2 0
14 209 - 210 303.3 0.0 0 1 1 0 2 0
8 112 - 114 359.4 1.0 0 0 1 0 2 1
16 219 - 221 360.4 0.0 0 1 1 0 2 1
11 133 - 136 445.5 0.0 0 1 1 0 2 2
19 239 - 242 509.6 0.0 0 1 1 0 4 0
17 222 - 226 574.6 0.0 0 1 1 0 3 2
9 115 - 121 788.0 1.0 0 0 1 0 4 3
15 211 - 218 856.0 0.0 0 1 1 0 4 4
7 102 - 111 1042.3 1.0 0 0 1 2 3 7
10 122 - 132 1326.5 1.0 3 0 1 0 5 6
13 197 - 208 1391.6 -2.0 0 3 1 0 7 5
18 227 - 238 1418.6 -1.0 3 2 1 0 6 6
4 44 - 58 1664.9 -1.0 1 2 1 0 7 8
6 86 - 101 1691.8 0.0 1 1 1 0 7 9
1 1 - 15 1773.0 0.0 2 1 1 9 6
2 16 - 41 2627.0 -1.0 2 2 1 0 9 17
5 59 - 85 3037.4 0.0 2 1 1 0 16 11
12 137 - 196 7239.7 15.0 10 16 1 4 33 27
Digest with: Chymo .
Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob
26 244 - 244 0.0 0.0 0 0 0 0 0 0
10 126 - 126 165.2 0.0 1 0 0 0 0 1
14 145 - 145 165.2 0.0 1 0 0 0 0 1
2 5 - 5 204.2 0.0 1 0 0 0 0 1
16 155 - 155 204.2 0.0 1 0 0 0 0 1
24 236 - 237 268.3 0.0 1 0 0 0 1 1
21 189 - 190 295.3 •1.0 1 1 0 0 1 1
11 127 - 129 350.4 0.0 1 0 0 0 1 2
7 73 - 75 431.5 0.0 1 0 0 0 1 2
1 1 - 4 507.6 0.0 1 0 0 1 2 2
19 179 - 182 519.5 •2.0 1 2 0 0 2 2
13 141 - 144 592.7 •1.0 1 1 0 1 2 2
23 230 - 235 664.7 •2.0 1 2 0 0 4 2
20 183 - 188 723.9 0.0 1 0 0 1 2 4
25 238 - 243 784.9 1.0 1 1 2 0 5 1
15 146 - 154 1082.2 •2.0 1 2 0 1 4 5
18 169 - 178 1181.2 •5.0 1 5 0 1 7 3
12 130 - 140 1268.3 •1.0 1 3 2 0 7 4
3 6 - 17 1373.5 0.0 1 1 1 0 7 5
4 18 - 32 1394.6 0.0 1 0 0 0 4 11
17 156 - 168 1446.5 2.0 1 2 0 0 8 5
6 58 - 72 1689.9 1.0 1 0 1 0 9 6
8 76 - 97 2297.5 0.0 1 1 1 0 11 11
5 33 - 57 2694.0 2.0 1 4 2 0 13 12
9 98 - 125 3122.7 3.0 1 1 4 2 13 15
22 191 - 229 4483.1 2.0 1 8 6 0 23 16 i-1 y >-> o o σv i -. *^ o uι -J oo -' o κ) w w ro σ\ i ιn i H W
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Annexe2 (suite 2)
Digest with: pH2.5.
To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob 244 8533.5 -9.0 8 17 8 2 43 30 170 18946.2 -6.0 17 17 11 5 84 86
Digest with: ProEn.
To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob - 9 115.1 0.0 0 0 0 0 ι 0 - 107 115.1 0.0 0 0 0 0 1 0 - 172 115.1 0.0 0 0 0 0 1 0 - 2 246.3 0.0 0 0 0 1 T_ 1 - 244 275.4 1.0 1 0 1 0 1 1 - 24 316.3 0.0 0 0 0 0 2 2 - 8 746.9 0.0 2 0 0 0 2 4 - 212 914.0 0.0 0 2 2 0 6 2 - 241 1008.1 0.0 2 1 1 0 6 2 - 20 1262.4 0.0 1 1 1 0 6 5 - 233 2374.7 2.0 1 5 3 0 11 10 - 106 3828.3 0.0 3 2 2 1 16 19 - 204 3839.2 8.0 4 9 1 2 17 15 - 71 5013.6 -1.0 23 24 - 171 7543.4 -5.0 10 33 31
Digest with: Staph.
To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf 1 =hil i =hob - 198 147.1 1.0 0 1 0 0 1 0 - 40 260.3 1.0 0 1 0 0 1 1 - 160 445.5 1.0 0 1 0 0 2 2 - 173 456.4 2.0 0 2 0 0 4 0 - 197 460.5 0.0 0 1 1 0 3 1 - 141 496.5 2.0 1 2 0 0 2 2 - 244 509.6 1.0 1 0 1 0 3 1 - 214 570.6 0.0 0 1 1 0 3 2 - 156 610.6 1.0 2 1 0 0 2 2 - 180 857.8 4.0 1 4 0 1 4 3 - 239 870.9 0.0 2 1 1 0 5 2 - 222 931.1 0.0 0 2 2 0 5 3 - 169 1019.1 1.0 1 1 0 0 6 3 - 232 1122.2 1.0 1 2 1 0 4 6 - 10 1201.4 1.0 2 1 0 1 5 5 - 209 1262.5 1.0 0 2 1 0 6 5 - 152 1397.6 2.0 2 2 0 2 4 7 - 55 1615.9 0.0 0 2 2 0 8 7 - 193 1639.8 2.0 3 2 0 1 6 7 - 98 1810.0 0.0 1 1 1 0 8 9 - 38 2828:1 0.0 2 1 1 0 11 17 - 81 2970.3 0.0 3 1 1 0 15 11 - 137 4374.1 4.0 3 2 6 2 19 20 Annexe 2 (suite 3)
Digest with: TrypK.
rom To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob
243 - 244 147.2 0.0 1 0 0 0 0 1
42 - 43 247.3 1.0 0 • 0 1 0 2 0
219 - 221 360.4 0.0 0 1 1 0 2 1
239 - 242 509.6 0.0 0 1 1 0 4 0
209 - 218 1141.3 0.0 0 2 2 0 6 4
197 - 208 1391.6 -2.0 0 3 1 0 7 5
122 - 136 1754.0 1.0 3 2 0 7 8
222 - 238 1975.2 -1.0 3 3 2 0 9 8
86 - 121 3827.4 3.0 1 1 4 2 16 20
1 - 41 4382.0 -1.0 4 3 2 1 18 23
44 - es 4684.2 -1.0 3 3 2 0 23 19
137 - 196 7239.7 15.0 10 16 1 4 33 27
Digest with: TrypR.
rom To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob
112 - 114 359.4 1.0 0 0 1 0 2 1
102 - 111 1042.3 1.0 0 0 1 2 3 7
211 - 226 1755.0 0.0 0 3 3 0 9 7
1 - 15 1773.0 0.0 2 1 1 1 9 6
227 - 244 2039.3 -1.0 4 3 2 0 10 7
115 - 132 2096.4 2.0 3 0 2 0 9 9
16 - 58 4503.1 -1.0 3 4 3 0 18 25
59 - 101 4711.2 0.0 3 2 2 0 23 20
133 - 210 9326.1 17.0 10 21 4 4 44 34
Digest with: A≤pN.
rom To Mol Wt Chg Aro Acid Base Suif Phil Phob
176 - 176 133.1 1.0 0 1 0 0 1 0
177 - 178 296.3 •1.0 1 1 0 0 1 1
135 - 138 461.5 1.0 0 2 1 0 3 1
170 - 175 658.7 2.0 0 2 0 1 4 2
139 - 146 1146.2 2.0 3 2 0 1 4 4
220 - 229 1193.4 0.0 1 2 2 0 5 5
179 - 188 1225.4 2.0 2 2 0 1 4 6
230 - 244 1663.8 1.0 3 3 2 0 10 4
205 - 219 1697.0 0.0 0 3 3 0 9 6
189 - 204 1907.1 3.0 1 4 1 0 10 6
147 - 169 2697.9 5.0 3 5 0 1 12 11
1 - 50 5280.0 0.0 4 3 3 1 22 28
51 - 134 9317.5 3.0 7 4 7 2 42 42 Annexe 3
AA GlycoS HyPhil AI -Ind
M 0.100 0 .450
P 0.260 0 .450
N . -0.083 0 .250
F . -0.614 -0 .050
W . -0.114 0 .100
A . -0.114 -0 .300
L . -0.114 -0 .300
P . -0.357 -0 .150
P 0.014 0 .650
E 0.386 1 .200
I 1.029 1 .300
N 3 1.443 1 .300
S 0.571 1 .150
T 0.257 0 .600
R 0.357 0 .300
I . -0.086 -0 .300
Y 0.029 0 .300
L . -0.014 -0 .300
G . -0.543 -0 .450
P 0.157 1 .250
G 0.200 1 .250
S 0.100 0 .850
G . -0.500 -0 050
P . -0.986 -0 450
I . -1.300 -0 600
L -1.671 -0 600
A -1.229 -0 600
A -1.400 -0 600
A -0.629 -0 600
Q 0.414 0 300
G 0.414 0 300
W 0.129 0 300
N 0.129 0 300
A -0.257 -0 300
L 0.186 0. 300
A -0.486 -0. 600
S -0.486 -0. 600
E 0.329 0. 600
L 0.971 0. 900
E 1.786 0. 900
K 1.071 0. 900
T 0.629 0. 900
K 0.629 0. 750
V 0.629 0. 750
G 0.186 0. 300
L -0.171 -0. 300
Q -1.271 -0. 600
S -0.171 -0. 300
A -0.129 0. 000
L -0.129 -0. 150
D -1.171 -0. 450 Annexe 3 (suite 1)
52 T . -0.786 -0 .450
53 L . -0.414 -0 .450
54 L 0.314 0 .450
55 E 0.457 1 .000
56 S 0.414 1 .200
57 Y 1.457 1 .500
58 R 2.114 1 .700
59 G 1.729 1 .700
60 Q 2.114 1 .500
61 S 1.671 1 .100
62 S 0.486 0 .800
63 Q . -0.214 -0 .150
64 A . -0.214 -0 .300
65 L 0.171 0 .300
66 I 0.157 0 .300
67 Q . -0.886 -0 .450
68 Q . -0.400 -0 .450
69 T 0.329 0 .600
70 L 0.371 0 .300
71 P 0.371 0 .300
72 Y 0.000 0 .300
73 V . -0.643 -0 .600
74 Q 0.000 0 .300
75 w . -0.129 -0 .300
76 L . -0.214 -0 .150
77 T 0.129 0 .450
78 T 0.129 0 .450
79 T 0.457 0 .600
80 A 0.743 0 .900
81 E 1.100 0 .750
82 H 1.557 0 .750
83 A 1.557 0 .750
84 H 1.557 0 .750
85 K 0.414 0. .300
86 T 0.457 0. .450
87 A 0.171 0. .300
88 I -0.186 -0, .300
89 Q -1.000 -0. .600
90 L -1.357 -0. .600
91 T -1.357 -0. .600
92 A -0.214 -0. .300
93 A -0.971 -0. 600
94 A -0.243 -0. 300
95 N 0.157 0. 450
96 A 0.914 0. 750
97 Y 0.914 0. 750
98 E 1.814 0. 750
99 Q 1.057 0. 750
100 A 1.057 0. 750
101 R 0.600 0. 600
102 A -0.500 -0. 600
103 A -0.771 -0. 600
104 M -0.286 -0. 300
105 V -1.186 -0. 600
106 P -1.200 -0. 600
107 P -1.543 -0. 600
108 A -0.629 -0. 600
109 M -0.286 -0. 300
110 V -0.014 -0. 300
111 R 0.400 0. 450
112 A 0.057 0. 300
113 N 0.829 0. 750
114 R 1.529 0. 900
115 V 0.986 0. 900
116 Q 0.643 0. 750
117 T -0.400 -0. 450 Annexe 3 (suite 2)
118 T . -0.486 -0 .300
119 V . -0.143 -0 .300
120 L . -1.286 -0 .600
121 K . -0.886 -0 .600
122 A . -0.857 -0 .600
123 I . -0.657 -0 .600
124 N . -0.057 0 .100
125 W . -0.114 0 .100
126 F . -0.257 -0 .300
127 G 0.500 0 .700
128 Q 0.100 0 .700
129 F 0.614 0 .900
130 S 0.371 0 .450
131 T 0.057 0 .450
132 R 0.057 0 .600
133 I 1.014 0 .750
134 A 1.400 0 .900
135 D 1.043 0 .750
136 K 0.900 0 .900
137 E 1.729 0 .900
138 A 2.486 0 .900
139 D 2.486 0 .750
140 Y 1.657 0 .750
141 E 1.286 0 .750
142 Q 1.143 0 .600
143 M 1.143 0 .750
144 W 1.457 0 .750
145 F 0.700 0 600
146 Q . -0.343 -0 .300
147 D . -0.671 -0 600
148 A . -1.071 -0 600
149 L . -0.171 -0 300
150 V . -0.171 -0 300
151 M . -0.486 -0 600
152 E . -0.100 -0 300
153 N 0.943 0 950
154 Y 1.286 0 950
155 W 0.957 0 600
156 E 0.957 0 600
157 A 0.957 0 600
158 V 0.514 0 600
159 Q . -0.257 -0 300
160 E . -0.257 -0 300
161 A 0.114 0 450
162 I 0.814 0. 750
163 Q 0.429 0. 450
164 S 0.386 0. 450
165 T 0.243 0. 800
166 s 1.386 1. 100
167 H 1.386 0. 900
168 F 1.500 0. 750
169 E 1.629 0. 900
170 D 2.014 0. 900
171 P 1.286 1. 100
172 P 1.429 1. 100
173 E 1.429 0. 900
174 M 1.429 0. 750
175 A 1.386 0. 750
176 D 1.657 0. 900
177 D 1.657 0. 900
178 Y 1.671 0. 900
179 D 2.057 0. 900
180 E 1.286 0. 750
181 A 0.243 0. 300
182 W 0.557 0. 600
183 M 0.157 0. 300 Annexe 3 (suite 3)
184 L . -0.943 -0 .600
185 N . -1.086 -0 .600
186 T . -0.714 -0 .600
187 V . -0.257 -0 .300
188 F 0.743 0 .600
189 D 0.743 0 .600
190 Y 1.143 0 .950
191 H 2.243 0 .950
192 N 2.386 0 .900
193 E 2.443 0 .900
194 N 2.757 0 .900
195 A 2.800 0 .900
196 K 1.700 0 .900
197 E 0.557 0 .750
198 E 0.514 0 .750
199 V 0.229 0 .300
200 I . -0.929 -0 .600
201 H . -1.200 -0 .600
202 L . -1.200 -0 .600
203 V . -1.200 -0 .600
204 P . -0.057 -0 .150
205 D 0.043 0 .600
206 V 1.086 0 .900
207 N 2.329 0 .900
208 K 2.157 0 900
209 E 1.886 0 900
210 R 1.843 0 900
211 G 1.843 0 900
212 P 0.743 0 750
213 I -0.357 -0 150
214 E -0.900 -0 600
215 L -0.400 -0 300
216 V -1.229 -0 600
217 T -0.086 -0 150
218 K -0.029 0 000
219 V 1.014 0 900
220 D 1.671 0 900
221 K 1.671 0 900
222 E 0.471 0 600
223 G 1.714 0 900
224 T 0.671 0 750
225 I -0.486 -0 450
226 R -0.800 -0 600
227 L -0.357 -0 300
228 V -0.400 -0 300
229 Y 0.743 0 600
230 D 0.329 0 800
231 G 0.971 1. 100
232 E 1.171 0. 900
233 P 1.100 0. 900
234 T 0.786 1. 100
235 F 1.286 0. 950
236 S 1.286 0. 750
237 Y 1.514 0. 750
238 K 1.643 0. 900
239 E 2.600 0. 900
240 H 2.086 0. 900
241 P 2.217 1. 700
242 K 1.880 1. 700
243 F 1.475 1. 300 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR
(B) RUE: 28 RUE DU DOCTEUR ROUX
(C) VILLE: PARIS CEDEX 15 (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75724
(ii) TITRE DE L'INVENTION: POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE DE 27KD DE MYCOBACTERIES APPARTENANT AU COMPLEXE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. APPLICATION AU DIAGNOSTIC ET A
LA PREVENTION DE LA TUBERCULOSE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2805 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TTGGGCCGCC GTAAGGAATG CGTCATGAGC GACTTCGCAT CACGGGCGAC CAATCATTAA 60
TTTGTCAAAC CCTTTGAGAT GCACTACTTG TCCACATTTT GTACACGAAA TACCTAACAC 120
ACTATGGTGC ACATCACGCA CTTCCACGTT CCGTATTCGG TGTACGATTT GTCACGCAAC 180
TAAGCGTTCA AGAGGGAGTA CTATGACTCA CCAAAAGTAA AAGATGACAT AGAAATAGAA 240
GAGTCGTGGT TCCGGTGCGG GTAGCTCCCG ATGGCTTGAC TGTGGTAAGC ACCAGTGGCG 300
TGTTCCCCGT GGTTGAGACC AGGAAGTTTT AAAGTCCTAC AGCCCGCGGT ATTCCGCAGA 360
GGACATTGTG TGCATTTCGC ACCTTCGGGT GGGAGAAATC GGGATGATCT CACCACCGGC 420
CACCGGGTGG CGCACTTTGT ACCCTTCGAT TCCGTTATTC GGCGGATTTA AGCAGTTCGC 480
ACCATTACCA AGCAGCCAAT GAGGAAGAGC GCAGGTGACT AGGTCGCTTG ATCTTTCCCT 540
GTGCAGTAGC TCGGGTTCTT TGAGTTTCGA GGAGGAGAAA CCACATGTCC TTTGTGAATG 600
TAGACCCATT TGGATGTTGG CGGCCGTGCG ACACTGGAGT CCCTTGGTTC CCACATGGCG 660
GTAAGCAATG CCGCGGTGGC CTCGGTGACC ACCAAGGTTC CTCCCCCGGC CGCCGACTAC 720
GTATCAAAAA AGTTATCGCT GTTCTTTAGT AGCCACGGGC AGCAGTACCA GGTGCAAGCC 780
GCTCGGGCAC GGCCTTTCAT CGAAATTGGT CCGGACCCTG GGCCGAATTG CGCTTGCGTA 840
TGAGGAAGTC GAGAATCGCC AACAACGAAG GTTTCTAACG TGTCGCCAGT TACGCACGAG 900
TGGCTACCAG CGAGTACAAG GGAGTAACGA ATTATGCCCA ATTTCTGGGC GTTGCCGCCC 960
GAGATCAACT CCACCCGGAT ATATCTCGGC CCGGGTTCTG GCCCGATACT GGCCGCCGCC 1020
CAGGGATGGA ACGCTCTGGC CAGTGAGCTG GAAAAGACGA AGGTGGGGTT GCAGTCAGCG 1080
CTCGACACGT TGCTGGAGTC GTATAGGGGT CAGTCGTCGC AGGCTTTGAT ACAGCAGACC 1140
TTGCCGTATG TGCAGTGGCT GACCACGACC GCCGAGCACG CCCATAAGAC CGCGATCCAG 12 C0 CTCACGGCAG CGGCGAACGC CTACGAGCAG GCTAGAGCGG CGATGGTGCC GCCGGCGATG 1260
GTGCGCGCGA ACCGCGTGCA GACCACAGTG TTGAAGGCAA TCAACTGGTT CGGGCAATTC 1320
TCCACCAGGA TCGCCGACAA GGAGGCCGAC TACGAACAGA TGTGGTTCCA AGACGCGCTA 1380
GTGATGGAGA ACTATTGGGA AGCCGTGCAA GAGGCGATAC AGTCGACGTC GCATTTTGAG 1440
GATCCACCGG AGATGGCCGA CGACTACGAC GAGGCCTGGA TGCTCAACAC CGTGTTCGAC 1500
TATCACAACG AGAACGCAAA AGAGGAGGTC ATCCATCTCG TGCCCGACGT GAACAAGGAG 1560
AGGGGGCCCA TCGAACTCGT AACCAAGGTA GACAAAGAGG GGACCATCAG ACTCGTCTAC 1620
GATGGGGAGC CCACGTTTTC ATACAAGGAA CATCCTAAGT TTTGATTCGG GAACATCCTA 1680
AGAAACGGGG GGCGTCGCCG TTGGAGACGT CGCAACGTGT CCGCAGTCCC AAGGGCAACA 1740
GTGAAGGGCC CACGGTGCGA TCCCCAACAC CCGGCTAGAG TGCGCATAAT ATTTTCCCGC 1800
CTCGGCTCAA GGCGTGCACC CCCATCACCG CTAACCATGC TGTGTATCAA CAGATTTCAT 1860
TGTCCCGGCC GTCGCGCGAC CGACCAATAG GGTGAGTTCC ATGTGCGATA TCGCCTAACA 1920
GCCGGCTCCC GTACTCCCGT GGCCGATGTG ATTATTGATT ACGTGGATCA CCATGTGGGT 1980
GATCGCGGTC GACAGCTTTG GTACCGAGCA CATCGCCACA ACGCGCGGTA CGAATCTAGT 2040
ACACAAATCC GCACCAGCCG CCATGCGACT TCGCAGGTCA TAGCCCCGCA GAGTCGCCGA 2100
ACCTGCCGCA GTGACAAAAG TCAGGACGGC CGGCGACGCG TCGAGCCGGG GTTAGGCGCA 2160
GTTAACGTCG CAGCGGGGTC CCAGACACGC GTCGGACTTT CGGACTCAGC CCGACGATTC 2220
GCCGTCAGAC TGCGGGCTTT CCTGGTCTAC CAGCAACGCT TGCAGGGCGG AGCCGGTGAT 2280
GCGCCGGAAC GCGCGCCGTG GCCGGTTGGC ATCGAGAACG GCCACCTCTA AGCTGGCCAC 2340
GCCAAGGGTG GGTTGATCAC CACCCGAGGT GTCGGCACTG CCGGCCCGCA ATGCAGCGAC 2400 CGCGATACGC AGGGCGTCGG TCAGGCTGGC GTTCTCGGCA TACGACTCTT TGAGCGCGTT 2460
GGCGATCGGC TCCGTGGTGC CGCCCATCAC CACGAAATGC GGCTCGTCGG CGATCGACCC 2520
GTCGTAGGTA ATACGATACA ACTCAGGGCG TTTCGTCTCG CCGTAATGCG CCACCTCGGC 2580
CACACACAAC TCAACCTCGT AGGGCTTGGC CTGTTCGGTG AAGATGGTGC CTAGAGTCTG 2640
CGCGTAGACA TTGGCCAACT GCCGACCCGT GACGTCACGA CGGTCATAGG CGTAACCGCG 2700
GGTGTCGGCG AACTGGATCC CGCCGCGGCG CAAATTGTCG AACTCGTTGA ACTTGCCCGC 2760
AGCCGCAAAA CCCACCCGAT CGTAGAGCTC ACTGATCTTC TGCAG 2805
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 732 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGCCCAATT TCTGGGCGTT GCCGCCCGAG ATCAACTCCA CCCGGATATA TCTCGGCCCG 60
GGTTCTGGCC CGATACTGGC CGCCGCCCAG GGATGGAACG CTCTGGCCAG TGAGCTGGAA 120
AAGACGAAGG TGGGGTTGCA GTCAGCGCTC GACACGTTGC TGGAGTCGTA TAGGGGTCAG 180
TCGTCGCAGG CTTTGATACA GCAGACCTTG CCGTATGTGC AGTGGCTGAC CACGACCGCC 240
GAGCACGCCC ATAAGACCGC GATCCAGCTC ACGGCAGCGG CGAACGCCTA CGAGCAGGCT 300
AGAGCGGCGA TGGTGCCGCC GGCGATGGTG CGCGCGAACC GCGTGCAGAC CACAGTGTTG 360 AAGGCAATCA ACTGGTTCGG GCAATTCTCC ACCAGGATCG CCGACAAGGA GGCCGACTAC 420
GAACAGATGT GGTTCCAAGA CGCGCTAGTG ATGGAGAACT ATTGGGAAGC CGTGCAAGAG 480
GCGATACAGT CGACGTCGCA TTTTGAGGAT CCACCGGAGA TGGCCGACGA CTACGACGAG 540
GCCTGGATGC TCAACACCGT GTTCGACTAT CACAACGAGA ACGCAAAAGA GGAGGTCATC 600
CATCTCGTGC CCGACGTGAA CAAGGAGAGG GGGCCCATCG AACTCGTAAC CAAGGTAGAC 660
AAAGAGGGGA CCATCAGACT CGTCTACGAT GGGGAGCCCA CGTTTTCATA CAAGGAACAT 720
CCTAAGTTTT GA 732
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 243 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Pro Asn Phe Trp Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Thr Arg Ile 1 5 10 15
Tyr Leu Gly Pro Gly Ser Gly Pro Ile Leu Ala Ala Ala Gin Gly Trp 20 25 30
Asn Ala Leu Ala Ser Glu Leu Glu Lys Thr Lys Val Gly Leu Gin Ser 35 40 45
Ala Leu Asp Thr Leu Leu Glu Ser Tyr Arg Gly Gin Ser Ser Gin Ala 50 55 60 Leu Ile Gin Gin Thr Leu Pro Tyr Val Gin Trp Leu Thr Thr Thr Ala 65 70 75 80
Glu His Ala His Lys Thr Ala Ile Gin Leu Thr Ala Ala Ala Asn Ala 85 90 95
Tyr Glu Gin Ala Arg Ala Ala Met Val Pro Pro Ala Met Val Arg Ala 100 105 110
Asn Arg Val Gin Thr Thr Val Leu Lys Ala Ile Asn Trp Phe Gly Gin 115 120 125
Phe Ser Thr Arg Ile Ala Asp Lys Glu Ala Asp Tyr Glu Gin Met Trp
130 135 140
Phe Gin Asp Ala Leu Val Met Glu Asn Tyr Trp Glu Ala Val Gin Glu
145 150 155 160
Ala Ile Gin Ser Thr Ser His Phe Glu Asp Pro Pro Glu Met Ala Asp 165 170 175
Asp Tyr Asp Glu Ala Trp Met Leu Asn Thr Val Phe Asp Tyr His Asn 180 185 190
Glu Asn Ala Lys Glu Glu Val Ile His Leu Val Pro Asp Val Asn Lys 195 200 205
Glu Arg Gly Pro Ile Glu Leu Val Thr Lys Val Asp Lys Glu Gly Thr 210 215 220
Ile Arg Leu Val Tyr Asp Gly Glu Pro Thr Phe Ser Tyr Lys Glu His 225 230 235 240
Pro Lys Phe

Claims

REVENDICATIONS
1) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ ID N° 1) :
TTGGGCCGCCGTAAGGAATGCGTCATGAGCGACTTCGCATCACGGGCGACCAATCATTA ATTTGTCAAACCCTTTGAGATGCACTACTTGTCCACATTTTGTACACGAAATACCTAAC ACACTATGGTGCACATCACGCACTTCCACGTTCCGTATTCGGTGTACGATTTGTCACGC AACTAAGCGTTCAAGAGGGAGTACTATGACTCACCAAAAGTAAAAGATGACATAGAAAT AGAAGAGTCGTGGTTCCGGTGCGGGTAGCTCCCGATGGCTTGACTGTGGTAAGCACCAG TGGCGTGTTCCCCGTGGTTGAGACCAGGAAGTTTTAAAGTCCTACAGCCCGCGGTATTC CGCAGAGGACATTGTGTGCATTTCGCACCTTCGGGTGGGAGAAATCGGGATGATCTCAC CACCGGCCACCGGGTGGCGCACTTTGTACCCTTCGATTCCGTTATTCGGCGGATTTAAG CAGTTCGCACCATTACCAAGCAGCCAATGAGGAAGAGCGCAGGTGACTAGGTCGCTTGA TCTTTCCCTGTGCAGTAGCTCGGGTTCTTTGAGTTTCGAGGAGGAGAAACCACATGTCC TTTGTGAATGTAGACCCATTTGGATGTTGGCGGCCGTGCGACACTGGAGTCCCTTGGTT CCCACATGGCGGTAAGCAATGCCGCGGTGGCCTCGGTGACCACCAAGGTTCCTCCCCCG GCCGCCGACTACGTATCAAAAAAGTTATCGCTGTTCTTTAGTAGCCACGGGCAGCAGTA CCAGGTGCAAGCCGCTCGGGCACGGCCTTTCATCGAAATTGGTCCGGACCCTGGGCCGA ATTGCGCTTGCGTATGAGGAAGTCGAGAATCGCCAACAACGAAGGTTTCTAACGTGTCG CCAGTTACGCACGAGTGGCTACCAGCGAGTACAAGGGAGTAACGAATTATGCCCAATTT CTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGTTCTGGCC CGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACGAAG GTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCA GGCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACG CCCATAAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCG GCGATGGTGCCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGC AATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAAC AGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCG ATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGACTACGACGAGGC CTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAGAACGCAAAAGAGGAGGTCATCC ATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAACTCGTAACCAAGGTAGAC AAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTTTCATACAAGGAACA TCCTAAGTTTTGATTCGGGAACATCCTAAGAAACGGGGGGCGTCGCCGTTGGAGACGTC GCAACGTGTCCGCAGTCCCAAGGGCAACAGTGAAGGGCCCACGGTGCGATCCCCAACAC CCGGCTAGAGTGCGCATAATATTTTCCCGCCTCGGCTCAAGGCGTGCACCCCCATCACC GCTAACCATGCTGTGTATCAACAGATTTCATTGTCCCGGCCGTCGCGCGACCGACCAAT AGGGTGAGTTCCATGTGCGATATCGCCTAACAGCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGAT GTGATTATTGATTACGTGGATCACCATGTGGGTGATCGCGGTCGACAGCTTTGGTACCG AGCACATCGCCACAACGCGCGGTACGAATCTAGTACACAAATCCGCACCAGCCGCCATG CGACTTCGCAGGTCATAGCCCCGCAGAGTCGCCGAACCTGCCGCAGTGACAAAAGTCAG GACGGCCGGCGACGCGTCGAGCCGGGGTTAGGCGCAGTTAACGTCGCAGCGGGGTCCCA GACACGCGTCGGACTTTCGGACTCAGCCCGACGATTCGCCGTCAGACTGCGGGCTTTCC TGGTCTACCAGCAACGCTTGCAGGGCGGAGCCGGTGATGCGCCGGAACGCGCGCCGTGG CCGGTTGGCATCGAGAACGGCCACCTCTAAGCTGGCCACGCCAAGGGTGGGTTGATCAC CACCCGAGGTGTCGGCACTGCCGGCCCGCAATGCAGCGACCGCGATACGCAGGGCGTCG GTCAGGCTGGCGTTCTCGGCATACGACTCTTTGAGCGCGTTGGCGATCGGCTCCGTGGT GCCGCCCATCACCACGAAATGCGGCTCGTCGGCGATCGACCCGTCGTAGGTAATACGAT ACAACTCAGGGCGTTTCGTCTCGCCGTAATGCGCCACCTCGGCCACACACAACTCAACC TCGTAGGGCTTGGCCTGTTCGGTGAAGATGGTGCCTAGAGTCTGCGCGTAGACATTGGC CAACTGCCGACCCGTGACGTCACGACGGTCATAGGCGTAACCGCGGGTGTCGGCGAACT GGATCCCGCCGCGGCGCAAATTGTCGAACTCGTTGAACTTGCCCGCAGCCGCAAAACCC ACCCGATCGTAGAGCTCACTGATCTTCTGCAG b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).
2) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ ID N° 2) :
ATGCCCAATTTCTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCC GGGTTCTGGCCCGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGG AAAAGACGAAGGTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGT CAGTCGTCGCAGGCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGAC CGCCGAGCACGCCCATAAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGC AGGCTAGAGCGGCGATGGTGCCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACA GTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGC CGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCG TGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGAC TACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAGAACGCAAAAGA GGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAACTCGTAA CCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTTTCA TACAAGGAACATCCTAAGTTTTGA b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).
3) Polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide P27 d'une mycobactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis.
4) Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les signaux pour la régulation et/ou pour l'expression du polypeptide P27 de Mycobacterium tuberculosis.
5) Sonde oligonucleotidique pour la détection spécifique d'un micro-organisme appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 8 bases consécutives d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
6) Sonde oligonucleotidique selon la revendication 5, caractérisée en qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
7) Sonde oligonucléotide selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les oligonucléotides suivants : a) ATG CTC AAC ACC GTG TTC, b) CCC CTC TTT GTC TAC CTT G.
8) Sonde oligonuléotidique selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que celle-ci est marquée par un composé radioactif ou par un composé non radioactif. 9) Sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que celle-ci est immobilisée sur un support, de manière covalente ou non covalente.
10) Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
11) Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'une séquence du génome et/ou d'une séquence d'ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un micro-organisme appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 8 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'au moins 20 bases consécutives d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
12) Amorce nucléotidique selon la revendication 1 1, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'une des amorces suivantes :
- Amorce n° 1 : nt 547 à nt 564 de la SEQ ED N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 2 : nt 669 à nt 651 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 3 : nt 554 à nt 571 de la SEQ TD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 4 : nt 668 à nt 651 de la SEQ ID N° 2 (amorce retour) ; - Amorce n° 5 : nt 564 à nt 582 de la SEQ LD N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 6 : nt 667 à nt 650 de la SEQ ID N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 7 : nt 454 à nt 471 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 8 : nt 600 à nt 583 de la SEQ LD N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 9 : nt 571 à nt 589 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ; - Amorce n° 10 : nt 686 à nt 667 de la SEQ ED N° 2(amorce retour) ;
- Amorce n° 1 1 : nt 572 à nt 589 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 12 : nt 686 à nt 668 de la SEQ ID N° 2 (amorce retour) ;
- Amorce n° 13 : nt 574 à nt 591 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 14 : nt 573 à nt 591 de la SEQ ID N° 2 (amorce alleX; - Amorce n° 15 : nt 566 à nt 584 de la SEQ ID N° 2 (amorce aller) ;
- Amorce n° 16 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ID N° 2 (amorce retour) ; Amorce n° 17 nt 567 à nt 584 de la SEQ ID N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 18 nt 666 à nt 646 de la SEQ ED N° 2 ( ^amorce retour) ;
Amorce n° 19 nt 564 à nt 582 de la SEQ ED N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 20 nt 575 à nt 592 de la SEQ ID N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 21 nt 352 à nt 369 de la SEQ ED N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 22 nt 594 à nt 577 de la SEQ ED N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 23 nt 687 à nt 668 de la SEQ ED N° 2 ( 'amorce retour) ;
Amorce n° 24 nt 424 à nt 441 de la SEQ ED N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 25 nt 600 à nt 583 de la SEQ ED N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 26 nt 414 à nt 431 de la SEQ ED N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 27 nt 668 à nt 651 de la SEQ ED N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 28 nt 422 à nt 439 de la SEQ ED N° 2 ( 'amorce aller) ;
Amorce n° 29 nt 584 à nt 567 de la SEQ ED N° 2 ( 'amorce retour) ;
Amorce n° 30 nt 419 à nt 436 de la SEQ ED N° 2 ( amorce aller) ;
Amorce n° 31 nt 577 à nt 595 de la SEQ ED N° 2 ( 'amorce aller) ;
Amorce n° 32 nt 601 à nt 584 de la SEQ ED N° 2 ( amorce retour) ;
Amorce n° 33 nt 451 à nt 470 de la SEQ ED N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 34 nt 670 à nt 651 de la SEQ ED N° 2 ( ^amorce retour) ;
Amorce n° 35 nt 447 à nt 466 de la SEQ ID N° 2 ( ^ amorce aller) ;
Amorce n° 36 nt 713 à nt 696 de la SEQ ID N° 2 ( ^ amorce retour) ;
Amorce n° 37 nt 563 à nt 582 de la SEQ ED N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 38 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ED N° 2 ( 'amorce retour) ;
Amorce n° 39 nt 577 à nt 594 de la SEQ ED N° 2 ( ^amorce aller) ;
Amorce n° 40 nt 689 à nt 671 de la SEQ ED N° 2 'amorce retour) ;
Amorce n° 41 : nt 422 à nt 439 de la SEQ ED N° 2 ^amorce aller) ;
Amorce n° 42 : nt 601 à nt 584 de la SEQ ED N° 2 ^amorce retour).
13) Couple d'amorces nucléotidiques, caractérisé en ce qu'il est constitué de deux amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 10 à 12. 14) Couple d'amorces selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit des couples suivants :
- Couple PI : Amorce n° 1 et Amorce n° 2 ;
- Couple P2 : Amorce n° 3 et Amorce n° 4 - Couple P3 : Amorce n° 5 et Amorce n° 6
- Couple P4 : Amorce n° 7 et Amorce n° 8
- Couple P5 : Amorce n° 9 et Amorce n° 10 ;
- Couple P6 : Amorce n° 11 et Amorce n° 12
- Couple P7 : Amorce n° 13 et Amorce n° 12 - Couple P8 : Amorce n° 14 et Amorce n° 10
- Couple P9 : Amorce n° 15 et Amorce n° 16
- Couple P10 : Amorce n° 17 et Amorce n° 18
- Couple PI 1 : Amorce n° 19 et Amorce n° 18
- Couple P12 : Amorce n° 20 et Amorce n° 10 - Couple PI 3 : Amorce n° 21 et Amorce n° 22
- Couple P14 : Amorce n° 20 et Amorce n° 23
- Couple PI 5 : Amorce n° 24 et Amorce n° 25
- Couple P16 : Amorce n° 26 et Amorce n° 27
- Couple P17 : Amorce n° 28 et Amorce n° 29 - Couple PI 8 : Amorce n° 30 et Amorce n° 22
- Couple P19 : Amorce n° 31 et Amorce n° 10
- Couple P20 : Amorce n° 7 et Amorce n° 32 ;
- Couple P21 : Amorce n° 33 et Amorce n° 34
- Couple P22 : Amorce n° 35 et Amorce n° 36 - Couple P23 : Amorce n° 37 et Amorce n° 38
- Couple P24 : Amorce n° 39 et Amorce n° 40
- Couple P25 : Amorce n° 41 et Amorce n° 42.
15) Amorce nucléotidique pour la mise en oeuvre d'une amplification d'ADN par déplacement de chaîne, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une amorce selon l'une des revendications 10 à 14, couplée, le cas échéant, à un oligonucléotide contenant un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction.
16) Amorce nucléotidique selon la revendication 15, caractérisée en ce que le site de reconaissance pour une endonucléase de restriction est un site de reconnaissance pour l'enzyme HincII.
17) Amorce nucléotidique selon la revendication 15, caractérisée en ce que le site de reconaissance pour une endonucléase de restriction est un site de reconnaissance pour l'enzyme Bso Bl.
18) Amorce nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi les oligonucléotides suivants :
Bla: GAGATGGCCGACGAC B2a: CCCATCGTAGACGAG
S la: ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCTCAACACCGTGTTC S2a: CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTCTTTGTCTACCTTG B2b: CCCCCTCTCCTTGTT
S2b: CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGATGGATGACCTCC dans lesquels les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gène p27 de M. tuberculosis et les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso Bl.
19) Polypeptide de mycobactérie, caractérisé en ce qu'il est présent chez les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis et en ce qu'il possède un poids moléculaire de 27 kilodaltons +/- 10 % et un point isoélectrique de 4,5 +/- 1,5.
20) Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés
SEQ ED N° 3 suivante : MPNFWALPPEINSTRIYLGPGSGPELAAAQGWNALASELEKTKVGLQSALDTLLE SYRGQSSQALIQQTLPYVQWLTTTAEHAHKTAIQLTAAANAYEQARAAMVPPA MVRANRVQTTVLKAINλVFGQFSTRIADKEADYEQMWFQDALVMENYWEAVQ EAEQSTSHFEDPPEMADDYDEAWMLNTVFDYHNENAKEEVIHLVPDVNKERGP EELVTKVDKEGTERLVYDGEPTFSYKEHPKF, b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27, c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b) au moins une mofidication par delétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27.
21) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'une des revendications 19 et 20.
22) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression et/ou d'insertion caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'acide nucléique ou un ADN selon l'une des revendications 1 à 4 et 21.
23) Vecteur recombinant selon la revendication 22. caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pMT05 contenu dans la souche de E. coli TGMT05, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786.
24) Hôte recombinant, caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4 et 21 ou un vecteur selon l'une des revendications 22 et 23.
25) Hôte recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche de E. coli TGMT05, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 soαs le numéro I- 1786. 26) Polypeptide recombinant selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte recombinant selon l'une des revendications 24 et 25.
27) Protéine hybride, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins la séquence d'un polypeptide selon l'une des revendications 19 et 20 et une séquence d'un peptide ou d'une protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal.
28) Protéine hybride selon la revendication 27, caractérisée en ce que le peptide ou la protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire contient au moins un déterminant antigénique capable d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire.
29) Protéine hybride selon la revendication 28, caractérisée en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de la protéine de 45/47 kD de Mycobacterium tuberculosis.
30) Protéine hybride selon la revendication 28, caractérisée en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de l'antigène de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite ou de l'antigène VP1 du virus de la poliomyélite.
31) Protéine hybride selon la revendication 28, caractérisée en ce que le déterminant antigénique est constitué de tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi les protéines gag, pol, nef ou env de HTV-1 ou HIV-2.
32) Polynucléotide codant pour une protéine hybride selon l'une des revendications 27 à 31.
33) Protéine hybride selon l'une des revendications 27 à 31 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine recombinante obtenue par l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 32. 34) Anticorps polyclonal ou monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 19, 20 et 26 à 31.
35) Anticorps selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps marqué.
36) Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'une des revendications 19, 20 et 26 et/ou une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 27 à 31.
37) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'une des revendications 19, 20 et 26 et/ou une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 27 à 31, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant un adjuvant de l'immunité approprié.
38) Vaccin destiné à l'immunisation à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou l'hépatite, comprenant un vecteur contenant un polynucléotide selon la revendication 21 ou un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4 et 32, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.
39) Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 à 8 avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) détection de l'hybride formé entre la sonde oligonucleotidique et l'ADN de l'échantillon biologique. 40) Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tubercidosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucleotidique immobilisée sur un support selon la revendication 9 avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde oligonucleotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde, avec une sonde oligonucleotidique marquée selon la revendication 8.
41) Procédé de détection selon la revendication 40, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'une des revendications 13 ou 14.
42) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon l'une des revendications 13 ou 14, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis ; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucleotidique marquée selon l'une des revendications 5 à 8.
43) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec deux couples d'amorces selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucleotidique marquée selon l'une des revendications 5 à 8.
44) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 34 ou 35 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
45) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'anticorps dirigés contre le polypeptide P27 d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un polypeptide Xon l'une des revendications 19, 20 et 26 , b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé 46) Procédé d'expression d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 20 ou 33, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) insertion d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4, 21 ou 32 dans un vecteur d'expression, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle de signaux de régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote ; b) transformation de l'hôte cellulaire par le vecteur d'expression obtenu à l'étape a) ; c) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à l'étape b) ; d) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucléotide porté par le vecteur recombinant.
47) Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 à 8 ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des revendications 13 ou 14 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN (ADN génomique, plasmidique ou ADNc) d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
48) Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucleotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 9 ; b) une sonde oligonucleotidique, dite sonde de révélation, selon l'une des revendications 5 à 8 ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des revendications 13 ou 14 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
49) Kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un couple de fragments d'acide nucléique selon l'une des revendications 13 ou 14 ; b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 à 9.
50) Kit ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'une des revendications 34 ou 35 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène- anticorps formé.
51) Kit ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'anticoφs dirigés contre le polypeptide P27 d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un polypeptide selon l'une des revendications 19, 20 et 26 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène- anticorps formé. 52) Kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) deux couples d'amorces selon l'une des revendications 15 à 18 ; b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucleotidique selon l'une des revendications 5 à 9.
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