FR2758144A1

FR2758144A1 - Polynucleotide codant pour un polypeptide de 27 kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et a la prevention de la tuberculose

Info

Publication number: FR2758144A1
Application number: FR9700100A
Authority: FR
Inventors: Jean Luc Guesdon; Daniele Chevrier
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1997-01-08
Publication date: 1998-07-10
Anticipated expiration: 2017-01-08
Also published as: FR2758144B1; AU5869098A; WO1998030699A1

Abstract

La présente invention concerne notamment les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide P27 de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, ainsi que le polypeptide correspondant. Ces éléments sont utiles notamment dans le diagnostic, la prévention et le traitement d'affections provoquées par des mycobactéries, en particulier la tuberculose.par.

Description

Polynucléotide codant pour un polypeptide de 27kD de mycobactéries appartenant au
complexe de Mycobacterium tuberculosis. Application au diagnostic et à la prévention de la
tuberculose.

L'invention concerne un polypeptide d'environ 27kD correspondant à une protéine de structure retrouvée dans les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis. L'invention vise aussi un polynucléotide comprenant une séquence codant pour ce polypeptide. L'invention concerne également les fragments nucléotidiques placés en amont et en aval de la séquence dudit polynucléotide qui comprennent les signaux de régulation ct/ou d'expression de ce gène. Elle concerne également l'utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci et des polynucléotides codant pour ces derniers pour la réalisation de modelas de détection in vitro de la présence d'une mycobactérie appartenant au complexe de .\k'cvhacteriztn? tuberculosis dans un échantillon biologique. L'invention vise enfin l utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci ainsi que des polynucléotides codant pour ces derniers en tant que moyens destinés à la préparation d'une composition immunogène, susceptible d'induire une réponse immunitaire de type B ou T, ou d'une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement d'infections provoquées par des mycobactéries appartenant au complexe de Mycobaclerium tuberculosis, en particulier la tuberculose.

On appelle complexe tuberculosis, le groupe de mycobactéries qui comprend M. bois-BCG, M. bovin M tuberculosis, M africanum et M mio-oli.

Au moins 56 espèces différentes appartiennent au genre Mycobacterium, parmi cellesci environ 10 sont pathogènes ou opportunistes pour l'homme ou I'animal. La tuberculose continue d'être un problème de santé publique dans le monde. Aujourd'hui, cette maladie est la cause de 2 à 3 millions de morts dans le monde et environ 8 millions de nouveaux cas sont observés chaque année (Bouvet, 1994). Dans les pays développés M tuberculosis est la cause la plus commune des infections mycobactériennes. En France il apparaît environ 10 000 nouveaux cas par an et parmi les maladies à déclaration obligatoirc c'est la tuberculose qui comprend le plus grand nombre de cas. La vaccination par le l3CG est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ dc 80% dans les pays occidentaux comme l Angleterre, à 0% en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à Chingleput., publiées en 1972 dans Indian J. Med. Res.). De plus, I'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux antituberculeux et l'existence d'une corrélation entre les patients atteints de tuberculose et patients immunodéprimés, par exemple atteints clu SIDA rendent nécessaire la mise au point de méthodes rapides, spécifiques et fiables pour le diagnostic de la tuberculose.

Par exemple, une étude épidémiologique réalisée en Floride, et dont les résultats ont été publiés en 1993 dans AIDS thérapies, a montré que 10% des malades atteints de SIDA sont atteint de tuberculose au moment du diagnostic du SIDA ou 18 mois avant celui-ci. Chez ces malades, la tuberculose apparaît dans 60% des cas sous une forme disséminée donc non repérable par les critères de diagnostic classiques comme la radiographie pulmonaire ou l'analyse de crachats.

Actuellement, une certitude sur le diagnostic apporté par la mise en évidence de bacilles cultivables dans un prélèvement provenant du malade n'est obtenue que pour moins de la moitié des cas de tuberculose. Même dans les cas de tuberculose pulmonaire, qui représente 80 à 90 pour cent des malades atteints de tuberculose et qui est la forme de la maladie pour laquelle la mise en évidence de bacilles est la plus facile, I'examen des expectorations n'est positif que dans moins de la moitié des cas. Le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactéries apparentées est donc difficile à réaliser, et cela pour différentes raisons : les maladies pulmonaires causées par différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement; les mycobactéries sont souvent présentes en faible quantité et lorsqu'elles sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage. De plus, en raison du temps de génération très long de ces bactéries (24h pour M. tuberculosis comparé à 20 mn pour E. coli), la culture de ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes (Bates et al., 1986) et davantage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades.

D'autres techniques sont utilisables en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne
a). L'identification directe des microorganismes au microscope; cette technique est rapide. mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échantillon ( > 104/mol) pour permettre un détection fiablc (13axes, 1979). Selon cette technique, I'examen est réalisé directement sur un prélèvement (crachats, urines, liquide ccphalo-rachidien...). Les bacilles sont observés par coloration de Ziehl ou fluorescente selon la méthode Smithwick modifiée (à l'Auramine), comme décrit par Kent et al. en 1985..

Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100% et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée; néanmoins, comme précisé cidessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif (Bates, 1979; Bates et al., 1986). La technique d'identification par culture du bacille est longue et coûteuse car celle-ci nécessite l'emploi de milieux comme source de carbone, d'azote, de nombreux facteurs de croissance, tels que les milieux Lowenstein-Jensen ou Coletsos. Les colonies apparaissent 15 à 30 jours, voire 60 jours après l'ensemencement et doivent être observées avec une fréquence bi-hebdomadaire pendant une période de deux mois. Les caractéristiques métaboliques des mycobactéries présentes dans le prélèvement permettent également d'identifier l'espèce en présence. Parmi les caractéristiques métaboliques observées figurent la quantification de la biosynthèse de l'acide nicotinique (M. tuberculosis produit des quantités sensiblement plus importantes d'acide nicotinique que les autres espèces), la recherche d'une activité catalase ou encore la quantification de la réduction des nitrates (Bourgoing et al., 1994).
b). Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est parfois limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles (Daniel et al., 1987).
c). La présence de mycobactéries au sein d'un échantillon biologique peut aussi être déterminée par hybridation moléculaire avec de I'ADN ou de l'ARN en utilisant des sondes d'oligonucléotides spécifiques des séquences recherchées (Kiehn et al., 1987; Roberts et al.,
1987; Drake et al., 1987). Plusieurs études ont montré l'intérêt de cette technique pour le diagnostic des infections à mycobactéries. Les sondes utilisées sont constituées d'ADN, d'ARN ribosomique ou de fragments d'ADN mycobactériens non caractérisés et provenant de banque de gènes. Le principe de ces techniques repose sur le polymorphisme des séquences nucléotidiques des fragments utilisés ou sur le polymorphisme des régions avoisinantes. Dans tous les cas, elles nécessitent l'utilisation de cultures et ne sont pas applicables directement sur les échantillons biologiques.

La faible quantité de mycobactéries présentes au sein d'un échantillon biologique et en conséquence la quantité faible d'ADN cible à détecter dans cet échantillon peut nécessiter le recours à une amplification spécifique in vitro de l'ADN cible avant sa détection à l'aide de la sonde nucléotidique. Les techniques d'amplification in vitro. notamment la PCR ont été décrites dans la littérature et leur mise en oeuvre et perfectionnements ont fait l'objet de demandes de brevet. La technique dite PCR ou réaction d amplification en chaîne à l'aide de la polymérase, qui a été décrite pour la première fois en 1985 par Saiki et al. et qui fait l'objet des brevets européens EP 201184 et EP 200 362. La technique PCR est désormais largement mise en oeuvre pour le diagnostic clinique (Erlich, 1989; Innis. 199(); Roufs, 1991), par exemple pour le typage de tumeurs ou de tissu, ou pour l'identification de bactéries pathogènes ou de virus.

L'amplification spécifique de l'ADN par la technique PCR peut constituer la première etape d'un procédé de détection de la présence d'un ADN mycobactérien dans un échantillon biologique, la détection proprement dite de l'ADN amplifié étant effectuée dans un second temps à l'aide d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement à l'ADN aiplifiè. Un mode de réalisation particulier de la détection de l'ADN amplifié à l'aide d'une sonde spécifique est représenté par la technique d'hybridation dite sandwich . Cette technique met en oeuvre une première sonde nucléotidique (sonde de capture) fixée sur un support solide, qui sert à capturer le gène ou le fragment de gène à détecter dans l'échantillon. tJne deuxième sonde (sonde de détection), complémentaire d'une autre région de l'ADN à détecter, permet la détection de ce dernier par l'intermédiaire d'un marqueur tel qu'un marqueur radioactif(Dunn et al., 1977; Ranki et al., 1983; Palva et al., 1984; Polsky-Cynkin et al., 1985). La méthode d'hybridation sandwich peut être également réalisée en ajoutant en une seule étape l'échantillon à analyser et la sonde de détection dans un conteneur où se trouve la sonde de capture fixée sur le support. Il s'agit dans ce cas d'une méthode d'hybridation sandwich dite simultanée (Brevet EP-0486 661 au nom de Biomérieux,
Ranki et al., 1983; Palva et al., 1984, Polsky-cynkin et al., 1985). La technique d'hybridation sandwich a déjà été mise en oeuvre dans un test de détection de la présence d'ADN de mycobactéries dans un échantillon. Ainsi, un test de détection, par hybridation sandwich, de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacteritzm tuherculosi.v a été décrit par
Chevrier et al. en 1993.

Un procédé de détection de faibles quantités de mycobactéries, appartenant au complexe tuberculosis, par amplification génique et hybridation directement sur des échantillons biologiques a été mis au point. Ledit procédé utilise la séquence d'insertion IS611() (Brevet européen EP 0 490 951 B1). Thierry et al. ont décrit en 1990 une séquence spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis et nommée IS 6110. Certains auteurs ont proposé d'amplifier spécifiquement l'ADN provenant de Mycobacterium en utilisant des amorces nucléiques dans une méthode d'amplification, telle que la réaction de polymérase en chaîne (I > CR). Patcl et al. ont décrit en 1990 I'utilisation de plusieurs amorces nucléiques choisis à partir d'une séquence connue en tant que sonde dans l'identification de M. tuberculosis. Cependant, la longueur des fragments obtenue en utilisant ces amorces était différente dc la longueur théorique attendue et plusieurs fragments de taille variable étaient obtenus. De plus, les auteurs ont observé l'absence d'hybridation des produits amplifiés avec le plasmide ayant servi à déterminer les amorces. Ces résultats indiquent que ces amorces ne seraient pas appropriées dans la détection de la présence de M tuberculosis dans un échantillon biologique et confirment la nature critique du choix des amorces. La même année,
J.L. Guesdon et D. Thierry ont décrit une méthode de détection dc M. Iziherculosis, de grande sensibilité, par amplification d'un fragment d'ADN de M tuberculosis localisc au sein de la séquence 1S6110 (Brevet européen EP 461 045) à l'aide d'amorces générant des fragments d'ADN amplifié de longueur constante, même lorsque le choix des amorces conduisait à l'amplification de fragments longs (de l'ordre de 1000 à 1500 bases) où le risque d'interruption de la polymérisation est élevée en raison des effets de la structure secondaire de la séquence. D'autres amorces spécifiques de la séquence IS6110 sont décrites dans le brevet européen N EP-0490 951.

Les inventeurs ont montré que certains isolats cliniques de Mycobacterium tuberculosis étaient exempts de la séquence d'insertion IS6110 et ne pouvaient donc être détectés à l'aide des oligonucléotides spécifiques de cette séquence. L'absence de la séquence
IS6110 chez certaines souches de M tuberculosis peut conduire ainsi à des résultats de diagnostic faussement négatifs. Parmi les isolats ne contenant pas la séquence IS6110, peuvent être cités les souches 729, 761, 808, 327 et 50, de M. tuberculosis, qui constituent des isolats cliniques plus partiuclièrement décrits ci-après dans les exemples. Ces résultats confirment une observation similaire faite par Yuen et al. en 1993. L'impossibilité de détecter ces souches pathogènes potentiellement présentes dans un échantillon biologique prélevé sur tin patient est ainsi susceptible de conduire à des difficultés de diagnostic et à la sélection de souches exemptes de la séquence IS6110..

En conséquence, les inventeurs se sont attachés à rechercher des séquences communes aux différentes souches de mycobactéries appartenant au complexe de AJycobacterizrn tuberculosis et qui ne comportent pas les inconvénients des séquences de l'art antérieur. En particulier, les inventeurs ont recherché des séquences qui peuvent être retrouvées dans toutes les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis, y compris chez les souches qui ne contiennent pas la séquence IS 6110.

Les inventeurs ont ainsi caractérisé un polynucléotide constitué par une séquence de nuclotides présente chez toutes les souches testées de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tzzherczxlosi.vs y compris chez les souches qui ne contiennent pas la séquence IS6110. Cette séquence de nucléotides contient un cadre ouvert dc lecture (ORF) codant pour un polypeptide de 27 kD. De plus, des signaux de régulation de l'expression de la séquence codante ont été identifiés en amont et en aval de cette dernière.

Ainsi, I'invention concerne un polynucléotide de 2805 paires de bases, spécifique du complexe de tuberculosis. Ce polynucléotide inclut la séquence correspondant à un gène de structure appelé p27, qui code pour une protéine de poids moléculaire d'environ 27 kDa, apprécié avec une marge d'erreur de 10%.

Par gène de structure aux fins de la présente invention, on entend un polynucléotide codant pour une protéine, un polypeptide ou encore un fragment de ces derniers, ledit polynucléotide ne comprenant que la séquence correspondant au cadre ouvert de lecture (ORF), ce qui exclut les séquences du côté 5' du cadre ouvert de lecture (ORF) qui dirigent l'initiation de la transcription.

Plus particulièrement, I'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ ID N 1):
TTGGGCCGCCGTAAGGAATGCGTCATGAGCGACTTCGCATCACGGGCGACCAATCATTAATTT
GTCAAACCCTTTGAGATGCACTACTTGTCCACATTTTGTACACGAAATACCTAACACACTATG
GTGCACATCACGCACTTCCACGTTCCGTATTCGGTGTACGATTTGTCACGCAACTAAGCGTTC
AAGAGGGAGTACTATGACTCACCAAAAGTAAAAGATGACATAGAAATAGAAGAGTCGTGGTTC
CGGTGCGGGTAGCTCCCGATGGCTTGACTGTGGTAAGCACCAGTGGCGTGTTCCCCGTGGTTG
AGACCAGGAAGTTTTAAAGTCCTACAGCCCGCGGTATTCCGCAOAGCACATTGTGTGCATTTC
GCACCTTCGGGTGGGAGAAATCGGGATGATCTCACCACCGGCCACCGGGTGGCGCACTTTGTA
CCCTTCGATTCCGTTATTCGGCGGATTTAAGCAGTTCGCACCATTACCAAGCAGCCAATGAGG
AAGAGCGCAGGTGACTAGGTCGCTTGATCTTTCCCTGTGCAGTAGCTCGGGTTCTTTGAGTTT
CGAGGAGGAGAAACCACATGTCCTTTGTGAATGTAGACCCATTTGGATGTTGGCGGCCGTGCG
ACACTGGAGTCCCTTGGTTCCCACATGGCGGTAAGCAATGCCGCGGTGGCCTCGGTGACCACC
AAGGTTCCTCCCCCGGCCGCCGACTACGTATCAAAAAAGTTATCGCTGTTCTTTAGTAGCCAC
GGGCAGCAGTACCAGGTGCAAGCCGCTCGGGCACGGCCTTTCATCGAAATTGGTCCGGACCCT
GGGCCGAATTGCGCTTGCGTATGAGGAAGTCGAGAATCGCCAACAACGAAGGTTTCTAACGTG
TCGCCAGTTACGCACGAGTGGCTACCAGCGAGTACAAGGGAGTAACGAATTATGCCCAATTTC
TGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGTTCTGGCCCGATA
CTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACGAAGGTGGGGTTG
CAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCAGGCTTTGATACAG
CAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACGCCCATAAGACCGCGATC
CAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCGGCGATGGTGCCGCCGGCGATG
GTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCC
ACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATG
GAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCG GAGATGGCCGACGACTACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAG
AACGCAAAAGAGGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAA
CTCGTAACCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTT
TCATACAAGGAACATCCTAAGTTTTGATTCGGGAACATCCTAAGAAACGGGGGGCGTCGCCGT
TGGAGACGTCGCAACGTGTCCGCAGTCCCAAGGGCAACAGTGAAGGGCCCACGGTGCGATCCC
CAACACCCGGCTAGAGTGCGCATAATATTTTCCCGCCTCGGCTCAAGGCGTGCACCCCCATCA
CCGCTAACCATGCTGTGTATCAACAGATTTCATTGTCCCGGCCGTCGCGCGACCGACCAATAG
GGTGAGTTCCATGTGCGATATCGCCTAACAGCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGATGTGATT
ATTGATTACGTGGATCACCATGTGGGTGATCGCGGTCGACAGCTTTGGTACCGAGCACATCGC
CACAACGCGCGGTACGAATCTAGTACACAAATCCGCACCAGCCGCCATGCGACTTCGCAGGTC
ATAGCCCCGCAGAGTCGCCGAACCTGCCGCAGTGACAAAAGTCAGGACGGCCGGCGACGCGTC
GAGCCGGGGTTAGGCGCAGTTAACGTCGCAGCGGGGTCCCAGACACGCGTCGGACTTTCGGAC
TCAGCCCGACGATTCGCCGTCAGACTGCGGGCTTTCCTGGTCTACCAGCAACGCTTGCAGGGC
GGAGCCGGTGATGCGCCGGAACGCGCGCCGTGGCCGGTTGGCATCGAGAACGGCCACCTCTAA
GCTGGCCACGCCAAGGGTGGGTTGATCACCACCCGAGGTGTCGGCACTGCCGGCCCGCAATGC
AGCGACCGCGATACGCAGGGCGTCGGTCAGGCTGGCGTTCTCGGCATACGACTCTTTGAGCGC
GTTGGCGATCGGCTCCGTGGTGCCGCCCATCACCACGAAATGCGGCTCGTCGGCGATCGACCC
GTCGTAGGTAATACGATACAACTCAGGGCGTTTCGTCTCGCCGTAATGCGCCACCTCGGCCAC
ACACAACTCAACCTCGTAGGGCTTGGCCTGTTCGGTGAAGATGGTGCCTAGAGTCTGCGCGTA
GACATTGGCCAACTGCCGACCCGTGACGTCACGACGGTCATAGGCGTAACCGCGGGTGTCGGC
GAACTGGATCCCGCCGCGGCGCAAATTGTCGAACTCGTTGAACTTGCCCGCAGCCGCAAAACC
CACCCGATCGTAGAGCTCACTGATCTTCTGCAG b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a); c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).

On entend par polynucléotide ou acide nucléique, selon la présente invention, aussi bien Un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits
ADN.

Par polynucléotide de séquence complémentaire. on entend tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N l ou d'une partie de la SEQ ID Nol, et dont l'orientation est inversée.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien dc l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires.

A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes
l'hybridation est réalisée à une température préférentielle dc 65 C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5% SDS et 100 tig/ml d'ADN dc sperme de saumon.

1 x SSC correspond à 0,15 M NaCI et 0,05M citrate de Na et une solution de I x
Denhardt correspond à 0,02% Ficoll, 0,02% de polyvinylpyrrolidone et 0,02% de sérum albumine bovine.

Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes - deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 30 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon de 1 x SSC et 0,1% SDS.

L'invention concerne également un polynucléotide comprenant le cadre ouvert de lecture codant pour un polypeptide d'un poids moléculaire de l'ordre de 27 kD. Selon un mode de réalisation préféré dudit polynucléotide, il est constitué d'une séquence présentant un cadre de lecture ouvert (ORF) qui comporte à son extrémité 5' le codon ATG, et à son extrémité 3' le codon TGA.

Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit polynucléotide comprend les nucléotides 934-1665 du polynucléotide de séquence SEQ ID N l et les fragments de celui-ci, ainsi que les séquences qui présentent au moins 80 % d'homologie avec ledit polynucléotide ou lesdits fragments. Par pourcentage d'homologie au sens de la présente invention, on entend un pourcentage d'identité entre les bases des deux polynucléotides homologues, ce pourcentage étant purement statistique et les difïérences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur.

Le polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 a été dénommé p27 par les inventeurs et comprend notamment les sites de restriction suivants : Alul, BamHI, Bstl, EcoRII, HaeIII, Sali. SalI.

Tableau I : Sites de restriction de la SEQ ID N01

<tb> Enzyme <SEP> Positions <SEP> de <SEP> coupure <SEP> de <SEP> l'enzyme <SEP> de <SEP> restriction <SEP> sur <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N01
<tb> Alul <SEP> 265 <SEP> ; <SEP> 550 <SEP> 1048 <SEP> 1201 <SEP> 1996 <SEP> 2333 <SEP> | <SEP> 2788
<tb> BamHI <SEP> 1441 <SEP> 2716
<tb> Bstl <SEP> 1441 <SEP> 2716
<tb> Dral <SEP> 331
<tb> EcoRII <SEP> 319 <SEP> 768 <SEP> 817 <SEP> 1020 <SEP> 1325 <SEP> 1475 <SEP> 2241
<tb> EcoRV <SEP> 1910
<tb> HaeIII(l) <SEP> 6 <SEP> 420 <SEP> 624 <SEP> 680 <SEP> 710 <SEP> 793 <SEP> 823 <SEP> 990 <SEP> 1002 <SEP> 1013 <SEP> 1040
<tb> Haelll(2) <SEP> 1346 <SEP> 1457 <SEP> 1475 <SEP> 1567 <SEP> 1749 <SEP> 1869 <SEP> 1943 <SEP> 2130 <SEP> 2302 <SEP> 2322 <SEP> 2337
<tb> l-laeIIl(3) <SEP> 2385 <SEP> 2580 <SEP> 2610 <SEP> 2655
<tb> Kpnl <SEP> 2005
<tb> PstI <SEP> 2805
<tb> Pvul <SEP> 2467 <SEP> 2515 <SEP> 2781
<tb> Sacl <SEP> 2790
<tb> Sacll <SEP> 348 <SEP> 675 <SEP> 2700 <SEP> 2727
<tb> SalI <SEP> 1423 <SEP> 1989
<tb>
A titre illustratif, des fragments préférés du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 selon l'invention sont les fragments suivants
- le fragment obtenu en faisant agir les enzymes de restrictions Dral et EcoRV, coupant
respectivement aux nucléotides nt 331 et nt 1910 de la séquence SEQ ID N"1; - le fragment obtenu en faisant agir les enzymes de restriction Dral ct KpnI, coupant respectivement aux nucléotides nt 331 et nt 2005 de la séquence SEQ ID N0 1.

Les fragments ci-dessus comprennent tous les deux la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour la protéine P27.

Pour les conditions de mise en oeuvre des enzymes de restriction dans le but d'obtenir des fragments nucléotidiques des polynucléotides selon l'invention, on se référera avantageusement à l'ouvrage de Sambrook de 1989.

L'invention concerne ainsi un polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de 1 'enchaînement de nucléotides (SEQ ID N 2) suivant ATGCCCAATTTCTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGT
TCTGGCCCGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACG
AAGGTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCAG
GCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACGCCCAT
AAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCGGCGATGGTG
CCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTC
GGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGAC
GCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTT
GAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGACTACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGAC
TATCACAACGAGAACGCAAAAGAGGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGG
GGGCCCATCGAACTCGTAACCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGG
GAGCCCACGTTTTCATACAAGGAACATCCTAAGTTTTGA b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a); c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).

Le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 comprend les signaux de régulation et/ou d'expression du gène de structure p27, situés respectivement du côté 5' et 3' et à proximité de ce gène.

Par comparaison avec les séquences connues, et plus particulièrement avec les
séquences qui ont été déterminées chez les mycobactéries, les séquences des signaux de
transcription et de traduction du gène p27 ont été déterminés. IL s'agit des séquences suivantes
- une séquence de type Shine-Dalgarno de fixation au ribosome est la séquence suivante,
allant du nucléotide en position nt 919 au nucléotide en position nt 925 de la SEQ ID
N 1 : 5'-AGGGAGT-3'.

- la boîte -10 du promoteur du gène p27 est la séquence suivante, allant du nucléotide en position nt 802 au nucléotide en position nt 807 de la SEQ ID N l: : 5'-GAAATT-3'
- la boîte -35 du promoteur du gène p27 peut être constituée par l'une des séquneces suivantes
la séquence allant du nucléotide en position nt 776 au nucléotide en position nt
781 de la SEQ ID N 1 : 5'-AAGCCG-3'.
la séquence allant du nucléotide en position nt 783 au nucléotide en position nt
788 de la SEQ ID N 1 : 5'-TCGGGC-3'
- Une séquence terminateur de la transcription ayant une structure de type dyad
symetry est la séquence suivante, allant du nucléotide en position nt 1909 au
nucléotide en position nt 1959 de la SEQ ID N01
5' TATCGCCTAACACCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGATGTGATTATTGAT
La présente invention concerne ainsi un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend les signaux de régulation et/ou d'expression naturels de la protéine de 27 kD de M. tuberculosis, localisés à proximité de la SEQ ID N 2, du côté 5' et du côté 3' de la SEQ ID N 2.

Avantageusement, un tel polynucléotide contiendra au moins une séquence comprenant l'enchaînement de nucléotides allant du nucléotide en position nt 776 au nucléotide nt 1665 du polynucléotide de séquence SEQ ID N"1.

De manière générale, I'invention a également pour objet un fragment nucléotidique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence telle que définie ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un polypeptide issu d'une mycobactérie, caractérisé en ce qu'il est présent uniquement chez les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, qu'il possède un poids moléculaire d'environ 27 kilodaltons et un point isoélectrique situé dans l'intervalle pI= 4,5 +/- 1,5.

En outre, le polypeptide mycobactérien selon l'invention possède la composition suivante en acides aminés
Tableau Il : Composition

<tb> <SEP> S=Ser <SEP> 1 <SEP> I <SEP> <SEP> 4,527 <SEP> T=Thr <SEP> 17 <SEP> 6,996
<tb> <SEP> V=Val <SEP> 15 <SEP> 6,173 <SEP> W=Trp <SEP> 7 <SEP> 2,881
<tb> Y=Tyr <SEP> 10 <SEP> 4,115 <SEP> Z=Glx <SEP> o <SEP> 0
<tb>
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide dc 27 kD désigné P27, de M tuberculosis, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N 3 suivant
M PNFWALPPEWSTRIYLGPGSGPILAAAQGWNALASELEKTKVGLQSALDTLLES YR
GQSSQALIQQTLPYVQWLTTTAEHAHKTAIQLTAAANAYEQARAAMVPPAMVRAN
RVQTTVLKAINWFGQFSTRIADKEADYEQMWFQDALVMENYWEAVQEAIQSTSHFE
DPPEMADDYDEAWMLNTVFDYHNENAKEEVIHLVPDVNKERGPIELVIKVDKEGTI
RLVYDGEPTFSYKEHPKF b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27 KD. c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b) au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27 KD.

Un tel polypeptide, tel que défini précédemment, est susceptible d'être reconnu spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients infectés par des mycobactéries appartenant au complexe de Mycobcaterium tz(herculosix.

Font ainsi partie de l'invention les fragments du polypeptide P27 de séquence ID N 3, qui peuvent être obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, telle que la trypsine ou la chymotrypsine ou la collagénase, ou par un réactif chimique, tel que le bromure de cyanogène (CnBr) ou encore en plaçant le polypeptide P27 dans un environnement très acide, par exemple à pH 2,5. A ce titre des fragments peptidiques selon l'invention sont les fragments figurant à l'Annexe 2 de la description. Dans l'Annexe 2, figure une analyse, à l'aide du logiciel PepsortTM (commercialisé Par Genetics Computer Group,
Inc., 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 53711,USA), des fragments peptidiques obtenus après coupure enzymatique ou chimique respectivement par la trypsine (Tryp.), la chvmotrypsine (Chymo), la clostripaine (Clos.= Trypsine ayant une lysine bloquée). le bromure de cyanogène (CnBr), l'lodobenzoate (IBzo), la protéase de Myxobacter (Myxo.), un milieu à pH 2,5 (pH2.5), la Proline endopeptidase (Proen.), la Protéase de Staphylocoque (Staph.), la trypsine dont les résidus Lysine sont bloqués (TrypK.), la Trypsine dont les résidus Arginine sont bloqués (TrypR).et l'Endoprotéinase Asp-N (AspN). Pour chacun des réactifs de coupure, les fragments peptidiques générés sont classés, dans l'ordre croissant, en ponction de leur poids moléculaire (Mol. Wt.) et la séquence peptidiquc de chacun des fragments peut être déduite du fait de l'indication, pour chacun des fragments, des positions respectives de l'acide aminé N-terminal et de l'acide aminé C-terminal, la numérotation étant conforme à celle du polypeptide P27 de séquence SEQ ID N 3. La colonne Chg correspond à la charge nette du fragment peptidique considéré, la colonne Aro indique le nombre d'acides aminés de type aromatique contenus dans ce fragment peptidique, les colonnes Acid et Base indiquent respectivement le nombre d'acides aminés acides ou basiques contenus dans ledit fragment peptidique, la colonne SuIf indique le nombre de résidus Cystéine dans le fragment peptidique et les colonnes Phil et Phob indiquent le nombre de résidus hydrophiles ou hydrophobes présents dans le fragment peptidique considéré.

Des fragments peptidiques préférés selon l'invention, pour une utilisation en diagnostic ou en vaccination, sont les fragments contenus dans des régions du polypeptide
P27 susceptibles d'être naturellement exposées au solvant et de présenter ainsi des propriétés d'immunogénicité importante. De tels fragments peptidiques peuvent être préparés indifféremment par synthèse chimique, à partir d'hôtes transformés par un vecteur d'expression selon l'invention contenant un acide nucléique permettant l'expression desdits fragments. placé sous le contrôle des éléments de régulation et/ou d'expression appropriés ou encore par clivage chimique ou enzymatique, comme cela a été plus particulièrement décrit cidessus.

Une analyse de l'hydrophilicité du polypeptide P27 a été réalisée à l'aide du logiciel l)eptidestructureTM (commercialisé Par Genetics Computer Group, lnc., 575 Science Drive, lkfadison, Wisconsin, 53711,USA), sur la base d'un calcul du caractère hydrophile de chaque acide aminé (1 à 243) de la SEQ ID N 3, la fenêtre de calcul ayant été fixée à 7 acides aminés consécutifs de la SEQ ID N 3. Les résultats de cette analyse sont présentés à l'annexe 3, où sont détaillés, pour chacun des acides aminés (AA) de position définie dans la SEQ ID N 3 (Pos), I'indice d'hydrophilicité (HyPhil) et l'indice correspondant au degré d'antigénicité (AI lnl). l > lus l'indice d'hydrophilicité est élevé, plus l'acide aminé considéré est susceptible d'être exposé au solvant dans la molécule native, et est en conséquence susceptible de présenter un degré d'antigénicité élevé. Ainsi, un enchaînement d'au moins sept acides aminés possédant un indice élevé d'hydrophilicité ( > 0,3) peut constituer la base de la structure d'un peptide candidat immunogène selon la présente invention. Les résultats présentés à
I'Annexe 3, dans la colonne Glycos , ont permis d'identifier un site de glycosylation potentiel, indiqué G, au niveau de l'asparagine en position 12 sur la SEQ ID N" 3.

A partir des données de l'Annexe 3, on peut identifier huit régions du polypeptide P27 présentant un indice d'antigénicité élevé. Il s'agit des régions suivantes désignées par les positions des acides aminés N- et C-terminal, conformément à la numérotation de la SEQ ID N03, l'acide aminé en position 1 étant la méthionine codée par le codon ATG - Région 9-15 (7 acides aminés); - Région 54-62 (9 acides aminés); - Région 77-87 (11 acides aminés); - Région 95-101(7 acides aminés); - Région 111 - 116 (6 acides aminés); - Région 127-145 (19 acides aminés); - Régionl53-158 (6 acides aminés); - Région 164-183 (20 acides aminés); - Région 188-199(12 acides aminés); - Région 205-212 ( 8 acides aminés) et - Région 229-243 (15 acides aminés).

Les régions du polypeptide P27 détaillées ci-dessus constituent les régions préférentielles que devra contenir un fragment peptidique préféré selon l'invention. Un tel fragment peut avantageusement comprendre une ou plusieurs de ces régions potentiellement exposées au solvant et à forte capacité immunogène.

Font également partie de l'invention les polypeptides homologues au polypeptide de séquence SEQ ID N" 3 ainsi que les fragments de tels polypeptides homologues. Par polypeptide homologue aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide comprenant une ou plusieurs délétions et/ou substitutions d'acides aminés dans la séquence
SEQ ID N"3. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés -consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés par des acides aminés < ( équivalents . L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés immunogènes des peptides correspondants. En d'autrcs termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'un polypcptide de séquence modifiée qui permet l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaîtrc le polypeptide de séquence
SEQ ID N03 ou l'un de ses fragments ci-dessus définis.

Ces aminoacyles équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacyles auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'immunogénicité croisée auxquels les différents peptides sont susceptibles de donner lieu.

A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptible d'être cffectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie dc l'immunogènicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucinc par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique. de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.

L'invention concerne aussi un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de séquence SEQ ID N"3 ou un polypeptide homologue au polypeptide de séquence SEQ ID N" 3 ou encore un fragment de ces derniers, tel que définis ci-dessus.

La séquence de P27 présente des homologies de séquence avec une protéine de 408 acides aminés, riche en sérine (Serine- Rich Antigen), de M. Ieprae, désignée Sra (Vega
Lopez et al., 1993). Il a ainsi été déterminé, d'une part que l'homologie entre la séquence de
P27 et la séquence de Sra de Aq: leprae est restreinte aux 207 premiers acides aminés Nterminaux et d'autre part que le pourcentage d'homologie entre P27 et la protéine Sra (P.M. estimé : 42,5 KD) est de 34% sur ces 207 acides aminés (Fig. 4). La protéine Sra de M leprae présente elle-même un faible degré d'homologie avec un antigène hypothétique de 51 kD de M rlaberculosis décrit par Shinnick en 1987, en particulier dans la région N-terminale. Alors que la protéine Sra de Ad: leprae possède 30% de sérine dans une région centrale, la protéine
P27 ne possède que 5% de sérine mais possède en revanche 12% d'alanine. En conséquence, la protéine P27 selon l'invention ne peut être assimilée à un membre de la famille des protéines riches en sérine du type de la protéine Sra de AI. Ieprae.

Le point isoélectrique théorique de la protéine P27 a été déterminé grâce au logiciel Isoelectric (commercialisé Par Genetics Computer Group, Inc., 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, 53711,USA). Il est de 4,59 (Fig. 3), ce qui permet de classer P27 parmi les protéines acides.

L'invention vise aussi des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotide(s) dans un proportion d'environ 15% par rapport à la longueur des fragments cidessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dês lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de II. tuberculosis, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés, dans les conditions de stringence définies ci-dessus.

Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 8 nucléotides, de préférence au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides consécutifs de la SEQ ID N0 I.

Ces fragments peuvent être mis en oeuvre en tant in'amorces pour la réalisation de réactions d'amplification, ou en tant que sondes.

Les séquences SEQ ID N"1 et SEQ ID N"2 ou les fragments obtenus à partir de ces séquences peuvent ainsi être utilisés pour sélectionner des amorces nucléotidiques, notamment pour la technique PCR.

Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N" 4 683 202. Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont avantageusement une longueur d'au moins 8 nucléotides, de préférence d'au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides. On préférera en particulier des amorces d'une longueur comprise entre 8 et 30 et de préférence 12 et 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaires du brin (+) [amorce aller] de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-) [amorce retour].

II est important que les amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques provenant de mycobactéries n'appartenant pas au complexe de tuberculosis ni avec lADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer l'échantillon biologique.

Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une électrophorèse capillaire, ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les séquences nucléotidiqucs SEQ ID N I ou SEQ ID N"2, des fragments de celles-ci, des plasmides contenant ces séquences ou des fragments de celles-ci, des oligonucléotides complémentaires de ces séquences ou fragments de séquences ou des produits d'amplification.

Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.

Ainsi, font également partie de l'invention les fragments nucléotidiques amplifiés ( amplicons ) définis ci-dessus.

Ces sondes et amplicons peuvent être marqués ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives, telles que des enzymes ou des éléments fluorescents..

Des amorces particulièrement intéressantes répondent aux séquences suivantes , les positions de nucléotides indiquées correspondant à la numérotation du gène p27 de la SEQ ID
N02 - Amorce n"l : nt 547 à nt 564 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 2 : nt 669 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 3 : nt 554 à nt 571 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n04 : nt 668 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 5 : nt 564 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n06 : nt 667 à nt 650 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n07 : nt 454 à nt 471 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 8 : nt 600 à nt 583 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n09 : nt 571 à nt 589 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n"10 : nt 686 à nt 667 de la SEQ ID N02(amorce retour); - Amorce n l 1 nt 572 à nt 589 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 12 : nt 686 à nt 668 de la SEQ ID N02 (amorce retour); - Amorce n"13 : nt 574 à nt 591 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n"14 : nt 573 à nt 591 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n"15 : nt 566 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n"16 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n"17 : nt 567 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 18 : nt 666 à nt 646 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce ne 19 : nt 564 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller) - Amorce n 20 : nt 575 à nt 592 de la SEQ ID N 2 (amorce aller): - Amorce n021 : nt 352 à nt 369 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n022 : nt 594 à nt 577 de la SEQ ID N 2 (amorce retour): - Amorce n023 : nt 687 à nt 668 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 24 : nt 424 à nt 441 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n025 : nt 600 à nt 583 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 26 : nt 414 à nt 431 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 27 : nt 668 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n028 : nt 422 à nt 439 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n029 : nt 584 à nt 567 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 30 : nt 419 à nt 436 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n03 1 nt 577 à nt 595 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n032 : nt 601 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 33 : nt 451 à nt 470 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 34 : nt 670 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 35 : nt 447 à nt 466 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n036 : nt 713 à nt 696 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n037 : nt 563 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n038 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n039 : nt 577 à nt 594 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); Amorce n040 : nt 689 à nt 671 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 41 : nt 422 à nt 439 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n042 : nt 601 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce retour);
De telles amorces nucléotidiques peuvent être utilisées deux à deux afin d'amplifier des régions spécifiques de la SEQ ID N 1 ou de la SEQ ID N 2 A titre d'exemple, on pourra, dans une réaction d'amplification de l'ADN, mettre en oeuvre l'un des couples d'amorces suivants - Couple P1 : Amorce n 1 et Amorce n02; - Couple P2 : Amorce n03 et Amorce n04; - Couple P3 : Amorce n05 et Amorce n 6; - Couple P4 : Amorce n 7 et Amorce n 8; - Couple PS : Amorce n 9 et Amorce n 10; - Couple P6 : Amorce n0l 1 et Amorce n 12; - Couple P7 : Amorce n 13 et Amorce n 12; - Couple P8 : Amorce n014 et Amorce n 10; - Couple P9 ; Amorce n 15 et Amorce n016; - Couple P10 : Amorce n017 et Amorce n 18; - Couple P11 : Amorce n 19 et Amorce n 18; - Couple P 12 : Amorce n 20 et Amorce n 10; - Couple P13 : Amorce n 21 et Amorce n 22; - Couple P14 : Amorce n 20 et Amorce n 23; - Couple PIS : Amorce n 24 et Amorce n 25; - Couple P16 Amorce n026 et Amorce n 27; - Couple P 17 : Amorce n 28 et Amorce n 29; - Couple P18 : Amorce n 30 et Amorce n 22; - Couple P 19 : Amorce n"31 et Amorce n 10; - Couple P20 : Amorce n 7 et Amorce n032; - Couple P21 : Amorce n 33 et Amorce n 34; - Couple P22 : Amorce n 35 et Amorce n 36; - Couple P23 : Amorce n 37 et Amorce n 38; - Couple P24 : Amorce n 39 et Amorce n040; - Couple P25 : Amorce n 41 et Amorce n 42;
Les amorces figurent en détail dans l'annexe 1 avec leurs caractéristiques notamment les Tm de l'amorce.

L'invention vise également les fragments nucléotidiques obtenus par amplification du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention, plus particulièrement à l'aide de l'un quelconque des couples d'amorces P1 à P25 selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternatives à la PCR.

La technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) est une technique d'amplification isotherme dont le principe est fondé sur la capacité d'une enzyme de restriction de couper l'un des deux brins de son site de reconnaissance qui se trouve sous une forme hemiphosphorothioate et sur la propriété d'une ADN polymérase d'initier la synthèse d'un nouveau brin d'ADN à partir de l'extrémité 3'OH créée par l'enzyme de restriction et de déplacer le brin préalablement synthétisé qui se trouve en aval. La méthode comprend deux étapes principales a). Synthèse, en présence de dCTP-alpha-S, de molécules d'ADN flanquées par des sites de restriction qui peuvent etre coupés par une enzyme appropriée. b). Amplification exponentielle de ces molécules d'ADN ainsi modifiées, par coupure enzymatique, déplacement de brin et copiage des brins déplacés. Les étapes de coupure, de déplacement et de copiage sont répétées un nombre suffisant de fois afin d'obtenir une bonne sensibilité.

Ainsi, le protocole de la technique SDA est simple l'ADN cible présent dans l'échantillon à analyser est dénaturé par la chaleur en présence de tous les réactifs exceptées les enzymes (enzyme de restriction et polymérase) qui sont ajoutées au milieu réactionnel après l'étape de dénaturation.

Initialement réalisée avec l'enzyme de restriction HincII (Walker et al., 1992), cette technique est désormais mise en oeuvre avec une endonucléase de restriction isolée à partir de
Bacillus stearothermophilus (BsoBl). et un fragment sans activité exonucléase 5 # 3' d'lune
ADN polymérase isolée de Bacillus cladotenax (exo~Bcrr) [= cxo-moins-Bz]. Ces deux enzymes peuvent opérer à 600C et le système est désormais optimisé pour permettre l'utilisation de dUTP et la décontamination par l'UDG.

Lors de la mise en oeuvre de cette technique, comme décrit par Spargo et al. en 1996, le temps de doublement de l'ADN cible est de 26 secondes et son taux d'amplification atteint 1010 après 15 minutes d'incubation à 60 C.

La technique SDA est plus simple à réaliser que la PCR (un bain marie est suffisant) et elle est plus rapide que les autres techniques d'amplification. La SDA a été appliquée essentiellement à la détection de Mycobacterium tuberculosis. Son seuil de détection est équivalent à un génome mycobactérien contenant 10 copies de la séquence IS61110.

Un autre objet de la présente invention est donc la mise en oeuvre des amorces oligonucléotidiques selon l'invention dans un procédé d'amplification d'ADN ou d'ARN selon la technique SDA ci-dessus. Pour la mise en oeuvre de la technique SDA, deux couples d'amorces sont utilisées : un couple d'amorces externes (Bl, B2) constituées d'une séquence spécifique de la SEQ ID N 1 ou de la SEQ ID N 2 ou de leur séquence complémentaire, et un couple d'amorces internes (S1, S2) constituées d'un oligonucléotide de fusion entre une séquence spécifique de la SEQ ID N l ou de la SEQ ID N 2 ou de leur séquence complémentaire fusionnée à une séquence nucléotidique contenant un site reconnu par une endonucléase de restriction, par exemple l'enzyme BsoBI.

A titre d'exemple de la mise en oeuvre des amorces selon l'invention dans un procédé d'amplification de type SDA, on peut, pour réaliser une amorce utilisable dans une réaction
SDA, ajouter, à l'extrémité 5' de la région de l'amorce spécifique de SEQ ID N l ou SEQ ID
N 2 selon l'invention, une séquence non spécifique de SEQ ID N l ou SEQ ID N 2 contenant un site de restriction, et plus particulièrement un site de restriction reconnu par l'cndonucléase i lincll ou BsoBI.

Une telle séquence additionnelle contenant le site de restriction reconnu par l'endonucléase B.soBI est avantageusement la séquence de nucléotides
GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBI.

A titre illustratif, une amorce selon l'invention utilisable dans le cadre d'une amplification de type SDA peut être réalisée à partir de la séquence de l'amorce n 1 et sera constituée de la séquence GCATCGAATGCATGTCTCGGGTATGCTCAACACCGTGTTC, dans laquelle les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme AsoBI et les nucléotides soulignés correspondent à la séquence spécifique de l'ADN cible, en l'occurrence la séquence constituée des nucléotides nt547 à nt564 inclus de la SEQ
ID N 2 Dans ce cas précis, la seconde amorce utilisée sera l'amorce n 2 modifiée comme décrit ci-dessus. Un second jeu d'amorces, amplifiant l'autre extrémité de l'acide nucléique cible, sera réalisé comme décrit ci-dessus.

La sonde de détection sera choisie de telle manière à ce qu'elle hybride avec l'amplicon généré. Une telle sonde de détection aura avantageusement pour séquence une séquence d'au moins 12 nucléotides, et en particulier 15 nucléotides, comme par exemple la séquence comprise entre les nucléotides aux positions nt565 et nt650 de la SEQ ID N"2 ou de la séquence complémentaire de la séquence comprise entre les nucléotides nt565 et nt650 de la SEQ ID N 2. Une sonde de détection spécifique répondant à la définition ci-dessus sera avantageusement constituée de la séquence comprise entre les nucléotides 580 et 598 de la
SEQ ID N"2 ou de la séquence complémentaire de la séquence comprise entre les nucléotides ntS80 et ntS98 de la SEQ ID N 2.

D'autres amorces préférées selon l'invention utilisables pour une réaction d'amplification de type SDA sont, par exemple, les suivantes
Position sur la SEO ID N 2 B la GAGATGGCCGACGAC 517-531 B2a CCCATCGTAGACGAG 693-679 S la ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCTCAACACCGTGTTC 550 t64
S2a CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTCTTTGTCTACCTTG 665-651 132b CCCCCTCTCCTTGTT 633-619
S2b CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGATGGATGACCTCC 605591r
Les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gènep27 de M. titherculosis, les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso BI utilisée dans la technique SDA (Spargo et al, 1996).

Des amorces similaires, utilisables dans une technique d'amplification de type SDA peuvent être réalisées à partir de l'une quelconque des amorces selon l'invention et plus particulièrement avec l'une quelconque des amorces n"l à 42 selon l'invention.

L'invention a donc également pour objet des amorces nucléotidiques conformes aux amorces décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une technique d'amplication d'ADN par déplacement de brin (SDA).

De manière préférentielle, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase HincII, les réactions SDA HincII/exo-Klenow [= HincII/exo-moins
Klenow] sont réalisées dans un volume de 50ptl en présence de concentrations finales de 7,7 mM MgCl2, 0,2 mM de chaque dGTP, dCTP, dATP-alpha-S, 0,5 mM dUTP, 100 g/ml de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/l d'ADN de placenta humain, 50 mM K2HPO4, pH 7,6, 10% (v/v) diméthylsulfoxyde, 5% (v/v) glycerol, 0,5 M de chacune des deux amorces
S1, S2, 0,05 M de chacune des amorces B1, B2, 3 unités/ l de Hincll, 0,04 U/ptl de exo
Klenow et des quantités variées de l'ADN cible de M. tuberculosis. Prélablement à l'addition de HincII, de exo-Klenow et de MgCl2, les réactions incomplètes (40 l) sont chauffées à 95 C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible, puis sont placées à la température de 40 C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 l du mélange d'enzymes constitué de 5 l de MgCl2 à 77 mM, 0,2 l de exo-Klenow (10 U/tiI), 2 Cil HincII (75 U/ptl) et de 2,8 l de glycérol à 50%, le mélange réactionnel est incubé à 40 C pendant 2 h. Des fractions aliquotes de chaque échantillon sont ajoutées directement à 5 l de tampon nondénaturant (20% Ficoll, 0,25% de bleu de bromophénol). L'analyse est ensuite effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% non dénaturant suivie d'une coloration au bromure d'éthidium et d'une visualisation des bandes par illumination du gel d'électrophorèse aux rayons ultra-violet.

De manière avantageuse, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase BsoBI, les réactions SDA BsoBI/exo-Bca [= BsoBI/exo-moins-Bca] sont réalisées dans un volume de 50 Cil en présence de concentrations finales de 6mM MgCl2, 0,2mM de chacun des dGTP, dATP, 0,5 mM dUTP, 1,4 mM dCTP-alpha-S, 100 ng/l de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/ l d'ADN de placenta humain, 35 mM K2HPO4 pH 7,6, 10% (v/v) de glycérol, 0,5 M de chacune des amorces SI et S2,0,0S M de chacune des amorces B1 et B2, 3,2 U/ptl BsoBI, 0,16 U/til de exo-Bca et des quantités variées d'ADN cible de M tuberculosis. Préalablement à l'addition de BsoBI, de exo-Bca et de MgCl2, les réactions incomplètes (40 l) sont chauffées à 95 C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible puis sont placées à 56 C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 l du mélange enzymatique constitué de 5 l de MgCl2 60 mM, 0,8 l exo-Bca (10 U/ l), 1 l BsoBI (160 U/ l) et 3,2 l de tampon de dilution (10 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCI, 1 mM DTT), les réactions sont incubées à 56 C pendant 20 min. Des fractions aliquotes de 10 Ctl de chacun des échantillons sont ajoutées directement à 5 tii de tampon non dénaturant et analysé comme décrit ci-dessus,
Les polynucléotides de séquences SEQ ID N"1 et SEQ ID N"2 et leurs fragments nucléotidiques ci-dessus décrits, en particulier les amorces selon l'invention, peuvent également être mis en oeuvre dans d'autres procédés d'amplification d'un acide nucléique cible, tels que - la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989; - la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990; - la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991; - la technique TMA (Transcription Mediated Amplification).

Les polynucléotides de séquences SEQ ID N"1 et SEQ ID N"2 ainsi que leurs fragments oligonucléotidiques peuvent aussi être employés dans des techniques d 'amplification ou de modification de l'acide nucléique servant de sonde, telles que - la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable; - la technique de RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992; - la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990; - la technique d'amplification à la Q-beta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996.

Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplfication à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un
ADNc à partir de l'ARN contenu dans l'échanillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.

Des sondes nucléotidiques selon l'invention sont spécifiques pour détecter les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobactewrium tutercl(losis, plus précisément du fait que ces mycobactéries possèdent dans leur génome au moins une copie de la SEQ ID N I ou de la SEQ ID N"2 ou un fragment de celles-ci.

Par les sondes spécifiques selon l'invention, on entend tout oligonucléotide hybridant avec la séquence nucléotidique SEQ ID N l, et plus particulièrement tout oligonucléotide hybridant avec la séquence SEQ ID N02 codant pour un polypeptide de 27 kD chez M. ruhevrcz xis, et ne présentant pas de réaction d'hybridation croisée ou d'amplification (PCR) avec des séquences présentes chez des mycobactéries n'appartenant pas au complexe dc tuberculosis. Des sondes nucléotidiques préférées selon l'invention ont avantageusement une longueur d'au moins 8 nucléotides, plus particulièrement une longueur comprise entre 8 et 200 nucléotides.

Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN comprenant tout ou partie de la SEQ ID N 1 ou de la SEQ ID
N 2 dans des conditions d'hybridation de forte stringence.

A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de détecter spécifiquement un ADN cible d'une mycobactérie appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, peuvent avantageusement être les suivantes
l'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5% SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon.

1 x SSC correspond à 0,15 M NaCI et 0,05M citrate de Na et une solution de 1 x
Denhardt correspond à 0,02% Ficoll, 0,02% de plyvinylpyrrolidone et 0,02% de sérum albumine bovine.

Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes - deux lavages de 5 min, préférentiellement à 650C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 30 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon de 0,1 x SSC et 0,1% SDS.

Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (32P, 35S, 3H, 125I) ou OU par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5- bromo-désoxyuridine, fluorescéine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications.

Des exemples de marquages non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français N 78. 10975 ou par Urdea et al. ou par Sanchez-Pescador et al. en 1988.

Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée dc manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de mycobactéries sur un support (nitrocellulose, nylon, polystyrène, ...) et à incuber, dans des conditions bien définies, I'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent possible une amplification du signal radioactif ou nonradioactif. Un système d'amplification répondant à la définition ci-dessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché ( branched DNA ) telles que celles décrites par Urdea et al. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou l ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN branché > > présentant une structure ramifiée. L'ADN branché, à son tour, est capable de fixer des sondes oligonucléotidiques qui sont elles-mêmes couplées à des molécules de phosphatase alcaline. Puis l'activité de cette enzyme est mise en évidence grâce à un substrat chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-phosphate.

Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon
I'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite < ( sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable.

Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon
I'invention. par coupure avec des enzymes de restriction, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen NO EP 0305929 (Millipore Corporation) ou encore par d'autres procédés.

Un mode de préparation approprié des acides nucléiques de l'invention comportant au maximum 200 nucléotides (ou 200 pb s'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des béta-cyanethylphosphoramidite décrite en 1986, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée.

Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques selon l'invention de longueur supérieure à 200 nucléotides (ou 200 pb lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes - I'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leur extrémité de sites de restrictions différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit en 1983, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée.

Les sondes nucléotidiques utilisées pour la récupération de l'acide nucléique recherché dans les procédés sus-mentionnés, sont constituées généralement de 8 à 200 nucléotides de la séquence SEQ ID N l ou SEQ ID N"2 ou des séquences complémentaires des SEQ ID N l ou SEQ ID N"2 et sont susceptibles de s'hybrider avec l'acide nucléique recherché dans les conditions d'hybridation définies précédemment. La synthèse de ces sondes peut être effectuée selon la méthode automatisée des béta cyanethylphosphoramidites décrite en 1986.

Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être mises en oeuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonuléotides sondes fixés sur un support, la séquence de chaque sonde d'une longueur donnée étant située en décalage d'une ou plusieurs bases par rapport à la sonde précédente, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle-ci forme des hybrides avec les sondes de séquences complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquence cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires.

Du fait de la connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la séquence nucléotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible. Cette technique est particulièrement efficace lorsque sont utilisées des matrices de sondes oligonucléotidiques de grande taille.

Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l utilisation d'un support permettant une détection bioélectronique > > de l'hybndation de la séquence cible sur les sondes du support matrice, lorsque que ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électron est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucléotidique de l'ADN ou ARN cible est alors déterminée par un dispositif électronique.

Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini ci-dessus, est décrit dans la demande de brevet européen N EP-0721 016 au nom de AQymax technologies N.V. ou encore dans le brevet américain N US 5.202.231 au nom de Drmanac.

L'invention a aussi pour objet les polynucléotides hybrides résultant - soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou
ADNc) provenant d'un échantillon biologique avec une sonde ou une amorce selon I' invention.

- soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou
ADNc) provenant d'un échantillon biologique avec un fragment nucléotidique amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention.

Par ADNc au sens de la présente invention, on entend une molécule d'ADN obtenue en faisant agir une enzyme de type transcriptase inverse sur une molécule d'ARN, en particulier une molécule d'ARN messager (ARNm), selon les techniques décites dans
Sambrook et al. en 1989.

La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N"1 ou un fragment de celle-ci, par exemple le fragment de séquence
SEQ ID N"2. Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC. Un plasmide recombiné particulier, répondant à la définition ci-dessus, a été dénommé pMTOS par les inventeurs.

Un autre objet de la présente invention est un vecteur approprié pour le clonage et/ou
I'expression et/ou l'insertion d'une séquence, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ci-dessus décrite en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression du polypeptide de 27 kD, chez un hôte déterminé.

Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides des phages, des cosmides, des phagemides, des YAC.

Un vecteur préféré est le plasmide pMTOS transfecté dans la souche TG1 de E. coli, la souche transfectée étant désignée sous le nom TGMTOS ayant été déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786 Ce plasmide possède un insert de 6 kb comprenant notamment la SEQ ID N l et la SEQ ID N 2, ainsi qu'une séquence du génome de M. titherculosis présente naturellement en amont de l'extrémité S' de la SEQ ID N"1.

I,e vecteur pMTOS ci-dessus a été construit à partir du vecteur pUC18 et de I'insert d'ADN de 6kb de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Ces vecteurs sont utiles pour transformer ou transfecter des hôtes cellulaires afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention.

Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence nucléotidique ou un vecteur ci-dessus décrits.

De préférence, I'hôte cellulaire est modifié par cette séquence dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide p27 fonctionnel, s'agissant de sa reconnaissance par des anticorps le reconnaissant spécifiquement.

Un hôte cellulaire préféré selon l'invention est la souche de E. coli TGMTOS, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro I-1786.

Il est aujourd'hui facile de produire des protéines en quantité relativement importante par génie génétique en utilisant comme vecteurs d'expression des plasmides, des phages, des phagemides. Le gène p27 peut être inséré dans un vecteur d'expression approprié pour produire in vitro le polypeptide P27. Celle-ci pourra être fixée sur une microplaque pour développer un test sérologique destiné à rechercher, dans un but de diagnostic, les anticorps spécifiques chez les patients atteints de tuberculose.

Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention comprenant les étapes suivantes: - le cas échéant, I'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide de deux amorces d'ADN choisies de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique. suivie de l'introduction desdites séquences ainsi amplifiées dans un vecteur approprié, - la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transtormé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'invention comprenant la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, et - la séparation, à partir du susdit milieu de culture, dudit polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.

Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.

Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par Houbenweyl en 1974.

Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments. à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-éthyl-3-(3 d i méthyl-aminopropyl)-carbodiimide.

Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par des groupes t-butylester.

Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal.

Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par
Merrifield.

Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et se fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.

Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.

Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe tbutyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trilluoroacétique.

On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le tbutyloxycarbonyle.

On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acides aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans des conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé Cterminal.

On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.

Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine, par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique.

L'invention a aussi pour objet un polypeptide de 27 kD, le polypeptide P27, tel qu'obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant selon la définition précédente, le polypeptide P27 étant caractérisé en ce que son ossature peptidique comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID N"3.

L'invention vise aussi une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés modifiée par rapport à la SEQ ID N 3, par délétion, insertion ou remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que la protéine ainsi modifiée est reconnue par des anticorps spécifiques du polypeptide P27.

Entre également dans le cadre de l'invention, tout fragment peptidique du polypeptide
P27 caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés SEQ ID N"3 ou à toute partie de cette séquence. Avantageusement, des fragments peptidiques de l'invention présentent des propriétés antigéniques et sont donc reconnus par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27.

De manière préférentielle, un tel fragment peptidique du polypeptide P27 comprendra une région de P27 exposée au solvant et aura une longueur d'au moins 20 acides amines.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ces antigènes sont spécifiques du polypeptide P27 et ne sont donc pas reconnus par des anticorps spécifiques d'autres protéines de mycobactéries.

L'invention est en outre relative à des protéines hybrides présentant au moins une partie de la SEQ ID N"3 et une séquence d'un peptide ou d'une protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal.

Avantageusement, le déterminant antigénique est tel qu'il est susceptible d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire.

Un tel déterminant peut être de diverses natures et notamment être un fragment d'antigène protéique, avantageusement glycoprotéique, utilisé en vue d'obtenir des compositions immunogènes susceptibles d'induire la synthèse d'anticorps dirigés contre des épitopes multiples.

Ces molécules hybrides peuvent être constituées en partie d'une molécule porteuse de séquence SEQ ID N"3 ou de séquence comprise dans la SEQ ID N"3 associée à une partie, en particulier un épitope de la toxine diphtérique, la toxine tétanique, un antigène de surface du virus de l'hépatite B (brevet FR 79 21811), I'antigène VPI du virus de la poliomyélite ou toute autre toxine ou antigène viral ou bactérien.

Avantageusement, un antigène bactérien tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de la protéine immunogène de 45/47 kD de M: tuberculosis (demande internationale PCT/FR 96/0166).

Un antigène viral, tel que défini ci-dessus, sera préférentiellement une protéine de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite, par exemple la protéine de surface de l'hépatite B sous l'une de ses formes S, S-préS1, S-préS2 ou S-préS2-préS1 ou encore une protéine d'un virus de l'hépatite A, ou d'une hépatite non-A, non-B, tel qu'un virus de l'hépatite C, E ou delta.

Plus particulièrement, un antigène viral tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de l'une des glycoprotéines codées par le génome du virus HIV-1 (brevets GB 8324800, EP 84401834 ou EP 85905513) ou du virus HIV-2 (EP 87400151), et en particulier tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi gag, pol, nef ou env de HIV-1 ou de HIV-2.

Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des ADN hybrides codant pour les séquences protéiques ou peptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par Minton en 1984

De préférence, I'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum humain ou animal.

Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, ou immunofluorescents, ou radio immunologiques (RIA) ou équivalent.

Ainsi, l'invention concerne également le polypeptide P27 ou tout fragment de celui-ci, marqué à l'aide d'un marqueur adéquat du type enzymatique, fluorescent, radioactif etc.

De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes - dépôt de quantités déterminées d'une composition polypeptidique selon l'invention dans les puits d'une plaque de microtitration, - introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être analysé, - incubation de la microplaque, - introduction dans les puits de la plaque de microtitration d'anticorps marqués dirigés contre des immunoglobulines humaines ou animales, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, par exemple à 550 nm, -détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolysé.

L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par une mycobactérie appartenant au complexe de tuberculosis, comprenant: - le polypeptide P27 ou un fragment antigénique de celui-ci, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, -les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ces réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide p27, ou le fragment antigénique de ce dernier, n'est pas marqué, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par le polypeptide P27 ou le fragment antigénique de celui-ci, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticorps reconnus par le polypeptide P27 ou le fragment antigénique de celui-ci .

Le polypeptide P27 selon l'invention permet de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement le polypeptide P27 ou un fragment peptidique de P27. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement etre préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation dun animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé le polypeptide P27 ou un fragment de celui-ci, des anticorps contenus dans le sérum de patients infectés par une mycobactérie appartenant au complexe de tuberculosis.

L'invention vise en conséquence un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycohrrcterium tuberculosis dans un Schantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) Mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) prélevé chez
un individu avec un anticorps dirigé contre le polypeptide P27, dans des conditions
permettant une réaction immunologique in vitro entre lesdits anticorps et les
polypeptides spécifiques des mycobactéries du complexe de tuberculosis éventuellement
présents dans l'échantillon biologique,
b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps forme.

Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de souches de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, par exemple M lulierculosis, caractérisé en ce qu'il comprend - un anticorps polyclonal ou monoclonal ci-dessus décrit, le cas échéant marqué; - le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique; - un réactif permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'anticorps monoclonal ou polyclonal sus-mentionné n'est pas marqué.

- le cas échéant, des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé.

Un autre objet de la présente invention concerne une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend le polypeptide P27 ou encore un ou plusieurs fragments antigéniques de celui-ci.

Une autre composition immunogène selon l'invention est caractérisé en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'invention et/ou une ou plusieurs protéines hybrides conformes à l'invention.

Selon un mode de réalisation avantageux, la composition immunogène ci-dessus définie est constitutive d'un vaccin, lorsqu'elle est présentée en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants de l'immunité tels que l'alun ou un représentant de la famille des muramyl peptides ou encore l'adjuvant incomplet de Freund.

Aujourd'hui, divers types vaccins sont disponibles pour protéger l'homme contre des maladies infectieuses : micro-organismes vivants atténués (M. bovis - BCG pour la tuberculose), micro-organismes inactivés (virus de la grippe), des extraits acellulaires (Bordetella pertussis pour la coqueluche), protéines recombinées (antigène de surface du virus de l'hépatite B), des polyosides (pneumocoques). Des vaccins préparés à partir de peptides de synthèse ou de micro-organismes génétiquement modifiés exprimant des antigènes hétérologues sont en cours d'expérimentation. Plus récemment encore, des ADN plasmidiques recombinés portant des gènes codant pour des antigènes protecteurs ont été proposés comme stratégie vaccinale alternative. Ce type de vaccination est réalisé avec un plasmide particulier dérivant d'un plasmide de E. coli qui ne se réplique pas in vivo et qui code uniquement pour la protéine vaccinante. Les principaux composants fonctionnels de ce plasmide sont: un promoteur fort (par exemple celui du CMV), un site de clonage approprié pour insérer le gène d'intérêt, une séquence de terminaison-polyadénylation, une origine de réplication procaryote pour produire le plasmide recombiné in vitro et un marqueur de sélection (par exemple le gène de résistance à l'ampicilline) pour faciliter la sélection des bactéries qui contiennent le plasmide. Des animaux ont été immunisés en injectant simplement l'ADN plasmidique nu dans le muscle. Cette technique conduit à l'expression de la protéine vaccinale in situ et à une réponse immunitaire de type cellulaire (CTL) et de type humoral (anticorps). Cette double induction de la réponse immunitaire est l'un des principaux avantages de la technique de vaccination avec de l'ADN nu. Huygen et al. (1996) et Tascon et ai. (1996) ont réussi a obtenir une certaine protection contre M tuberculosis en injectant des plasmides recombinés contenant des gènes de M. Icprae (hsp65. 36kDa pria) comme inserts.

V leprae est l'agent responsable de la lèpre. L'utilisation d'un insert spécifique de M.

Ilrhcrculosis (comme par exemple le gène p27, objet de la présente invention) conduirait probablement à une meilleure protection contre la tuberculose. Le gène p27 peut être
Facilement inséré dans les plasmides vecteurs V1J (Montgomery et al, 1993), pcDNA3 (Invitrogen, R & D Systems) ou pcDNA1/Neo (Invitrogen) qui possèdent les caractéristiques nécessaires pour une utilisation vaccinale.

L'invention vise ainsi une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels que précédemment définis en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité.

L'invention vise aussi une composition vaccinale destinée à l'immunisation de l'homme ou l'animal à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou l'hépatite, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels que précédemment définis en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité.

Avantageusement, dans le cas d'une protéine hybride entre P27 et l'antigène de surface de l'hépatite B, la composition vaccinale sera administrée, chez l'homme, à raison de 0,1 à 1 tig de protéine hybride purifiée par kilogramme du poids du patient, de préférence 0,2 à 0,5 llg/kg de poids du patient, pour une dose destinée à une administration donnée. Dans le cas de patients atteints de troubles du système immunitaire, en particulier les patients immunodéprimés, chaque dose injectée contiendra préférentiellement la moitié de la quantité pondérale de la protéine hybride contenue dans une dose destinée à un patient n'étant pas affecté de troubles du système immunitaire.

De préférence, la composition vaccinale sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps, par voie intradermique ou sous-cutanée. A titre d'exemple, trois doses telles que définies ci-dessus seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au temps tO + 1 an.

Alternativement, trois doses seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au temps tO + 6 mois.

Chez la souris, chez laquelle une dose pondérale de la composition vaccinale comparable à la dose utilisée chez l'homme est administrée, la réaction anticorps est testée par prélèvement du sérum suivi d'une étude de la formation d'un complexe entre les anticorps présents dans le sérum et l'antigène de la composition vaccinale, selon les techniques usuelles.

L'invention concerne également une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide ou un vecteur d'expression selon l'invention, en association avec un véhicule permettant son administration à l'homme ou l'animal.

L'invention a encore pour objet un vaccin destiné à l'immunisation à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide ou un vecteur d'expression selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions immunogènes ou vaccinales sont notamment décrites dans la demande internationale N" WO 90/11092 (Vical Inc.) et également dans la demande internationale N" WO 95/11307 (Institut Pasteur).

Le polynucléotide constitutif de la composition immunogène ou de la composition vaccinale selon l'invention peut être injecté à l'hôte après avoir été couplé à des composés qui favorisent la pénétration de ce polynucléotide à l'intérieur de la cellule ou son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules polymères, comme décrit dans la demande internationale N" WO 94/27238 (medisorb Technologies International).

Selon un autre mode de réalisation de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide, de préférence un ADN, est complexé avec du DEAEdextran (Pagano et al., 1967) ou avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., 1989), avec des lipides (Felgner et al., 1987) ou encore encapsulés dans des liposomes (Fraley et al., 1980).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide selon l'invention peut être introduit sous la forme d'un gel facilitant sa transfection dans les cellules. Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-L-lysine et de lactose, comme décrit par Midoux en 1993, ou encore le Poloxamer 407tu, comme décrit par Pastore en 1994. Le polynucléotide ou le vecteur selon l'invention peuvent aussi être en suspension dans une solution tampon ou être associés à des liposomes.

Avantageusement, un tel vaccin sera préparé conformément à la technique décrite par
Tacson et al. ou Huygen et al. en 1996 ou encore conformément à la technique décrite par
Davis et al. dans la demande internationale N" WO 95/11307 (Whalen et al.).

Un tel vaccin sera avantageusement préparé sous la forme d'une composition contenant un vecteur selon l'invention, comprenant tout ou partie de la SEQ ID N"2 placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression chez l'homme ou I 'animal .

* Pour réaliser un tel vaccin, le fragment d'ADN correspondant au gène p27 (SEQ ID NU2) du plasmide pMT0S est tout d'abord sous-cloné dans un vecteur d'expression approprié, plus particulièrement un vecteur d'expression contenant des signaux de régulation et d'expression reconnus par les enzymes des cellules eucaryotes et contenant également une origine de réplication active chez les procaryotes, par exemple chez L. coli qui permet son amplification préalable. Puis le plasmide recombinant purifié obtenu est injecté à l'hôte, par exemple par voie intramusculaire.

On pourra par exemple utiliser, en tant que vecteur d'expression in vivo de l'antigène d'intérêt, le plasmide pcDNA3 ou le plasmide pcDNAl/neo, tous les deux commercialisés par
Invitrogen (R & D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). On peut aussi utiliser le plasmide V 1 Jns.tPA, décrit par Shiver et al. en 1995.

Un tel vaccin comprendra avantageusement, outre le vecteur recombinant, une solution saline, par exemple une solution de chlorure de sodium.

Une composition vaccinale telle que définie ci-dessus sera par exemple administrée par voie parentérale ou par voie intramusculaire.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes
- 1 - Isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique.

- 2 - Amplification spécifique de l'ADN des mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis.

- 3 - Analyse des produits d'amplification. Ceux-ci peuvent être analysés par différentes méthodes. Deux méthodes sont données à titre d'exemple ci-dessous.

- 3a - Analyse électrophorétique en gel d'agarose des produits d'amplification. Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l?ADN de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis.

- 3b - Analyse par la technique d'hybridation moléculaire en utilisant une sonde nucléique dont la séquence est déduite de la séquence spécifique. Cette sonde sera avantageusement marquée par un élément non radioactif(sonde froide) ou radioactif.

Aux fins de la présente invention, on entendra par ( < ADN de l'échantillon biologique ou ADN contenu dans l'échantillon biologique , soit l'ADN présent dans
I échantillon biologique considéré, soit l'ADNc obtenu après l'action d'une enzyme de type transcriptase inverse sur l'ARN présent dans ledit échantillon biologique.

Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycohcrcrerilrrn tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 5 ou 6
avec un échantillon biologique, I'ADN contenu dans l'échantillon biologique, ou
I'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, ayant, le
cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions
permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN ou l'ADNc d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis;
b) Détection de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de
I'échantillon biologique.

L'invention vise également un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support selon la
revendication 7 avec un échantillon biologique, I'ADN de l'échantillon biologique
ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des
conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis;
b) Mise en contact de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique immobilisée sur
un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après
élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde,
avec une sonde oligonucléotidique marquée telle que définie précédemment.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de détection défini précédemment, celui-ci est caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces tel que précédemment décrit.

Une autre forme de mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple de fragments d'acide
nucléique amorces, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant,
préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une
hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycohacterium tuherculosis;
b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;
c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment
encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une
sonde oligonucléotidique selon invention.

L'invention a aussi pour objet un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tubercl(losis dans un échantillon biologique par déplacement de brin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec deux couples d'amorces
spécifiquement destinées à l'amplification de type SDA décrites ci-dessus, I'ADN
contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à
l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN
d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;
b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;
c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment
encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une
sonde oligonucléotidique selon l'invention.

L'invention concerne aussi un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, destiné à la détection de la présence d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants
a) Une sonde oligonucléotidique selon l'invention;
b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation;
c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs
nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN (ADN génomique, ADN
plasmidique ou ADNc) d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.

L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants
a) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention;
b) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, telle que décrite
précédemment.
c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs
nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe
Mycobacterium tuberculosis.

L'invention concerne encore un kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants
a) Un couple de fragments d'acide nucléique amorces selon l'invention;
b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN;
c) Eventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment
amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique telle que décrite
précédemment.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants
FIGURES
Figure 1: Carte du cosmide pHC 79, construit à partir du plasmide pBR322. II possède les séquences cos du phage lambda, permettant l'empaquetage d'un insert d'ADN d'une taille de 30 à 40 kb. Il possède deux gènes de résistance aux antibiotiques : un gène de résistance à l'ampicilline et un gène de résistance à la tétracycline, porteur d'un site de restriction unique pour l'endonucléase SalI.

Figure 2 : Carte du plasmide pMT05 contenant la SEQ ID N0 1 et la SEQ ID N 2. L'extrémité 5' de la SEQ ID N 1 est localisée au nucléotide suivant immédiatement le dernier nucléotide de la séquence IS6110, représentée par la boîte IS6110 sur cette figure, et l'extrémité 3' de la
SEQ ID N 1 est localisée en aval de la séquence de p27 représentée par la boîte p27 sur cette figure. La SEQ ID N 2 correspond à la boîte désignée p27 sur la figure.

Figure 3 : Comparaison des séquences en acides aminés de la protéine Sra de M. leprae et de la protéine P27 de M. tuberculosis.

EXEMPLES
Exemple 1: Construction de la banque génomique M. tuberculosis
L'ADN génomique de M. tuberculosis H37rv est digéré partiellement par l'cndonucléase de restriction SalI en faisant agir 0,03 U d'enzyme par tig d'ADN pendant
I heure à 37 C dans le tampon composé de 100 mM de NaCI 50 mM de MgC12, 1 mM de dithiothréitol. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par electrophorèse sur gel d'agarose à 0.6%. les fragments entre 30 et 40 kb electroélués et précipités en éthanol après extraction au phénol/chloroforme (1/1).

Le vecteur est le cosmide pHC79. Il est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation.

La ligation s'effectue en mélangeant 1,5 g de vecteur et 3 g de fragments d'ADN 30/40 kb (soit un rapport molaire vecteur/insert de 1/2), la réaction est laissée à 140C pendant 18h après avoir ajouté 5 U de T4 DNA ligase dans un tampon composé de 0,066 mM de TRIS-HCI pH 7,5, 5 mM de MgC12, 1 mM de dithiothréitol et 1 mM d'ATP.

Les cosmides recombinés sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries (HB101). Les bactéries transformées sont incubées 1h à 37 C en milieu LB puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 50 llg/ml d'Ampicilline. Les colonies résistantes à l'Ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la Tétracycline, en effet le fragment d'ADN 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tetracycline (Tet) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp).

Exemple 2 : Criblage de la banque et détermination de la séquence
Il est effectué une mini préparation d'ADN sur les 455 premières colonies de bactéries transformées résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tetracycline (tets) selon la technique de lyse alcaline. Ces ADN sont testés par PCR en utilisant les amorces SRAI: GCC
CGA GAT CAA CTC CAC CC et SRA2: ACA TCT G CGT AGT CGG CC dont les séquences avaient été déterminées préalablement dans le laboratoire. Six clones cosmidiques présentent un fragment d'amplification en quantité importante et dont la taille est celle attendue (410 pb). Chacun de ces clones est repiqué sur milieu solide LB + ampicilline 50 ptg/ml et les colonies bien individualisées sont repiquées sur une boîte ordonnée. Il est effectué une mini-préparation des 4 premières colonies recombinantes de chacun des clones.

Les ADN de ces mini-préparations sont soumis à une PCR avec les amorces SRAI/SRA2 et testés en gel d'agarose. Six sous-clones sont sélectionnés et conservés en glycérol à -80 C.

L'ADN de chacun des 6 sous-clones sélectionnés est hydrolysé individuellement par 7 enzymes de restriction, soumis à une électrophorèse et transféré selon la méthode de Southern puis hybridé avec le fragment de PCR SRAI/SRA2. Ce fragment a été préalablement purifié par une chromatographie (FPLC) suivie d'une électrophorèse, d'une électruélution et d'un marquage au 32P par multipriming.

C'est l'enzyme de restriction Pst I qui est retenue car une seule bande dont la taille est estimée à environ 7-7,4 kb hybride avec la sonde SRAI/SRA2.

Le clone J411 est sélectionné, une maxi-préparation est réalisée suivie d'une hydrolyse préparative de J41 i par Pst I, le produit digéré est mis à migrer dans un gel d'agarose à 1,2%, la bande dont la taille est alors estimée à 7-7,4 kb est découpée puis électroéluée, le fragment électroélué est contrôlé sur gel d'agarose à 0,8%, la taille de ce fragment est estimée à environ 6 kb.

Ce fragment a été cloné dans un vecteur pUC18, le plasmide recombiné est utilisé pour transformer des bactéries E. coli TGI. Les colonies des bactéries TG1 transformées ont été ordonnées sur boîte LB + ampicilline et 24 mini-préparations ont été réalisées pour contrôler la présence de l'insert. Le clone J411/Pst I/8 est retenu et cultivé pour préparer une grande quantité de plasmide recombiné, celui-ci est dénommé pMT0S. La souche contenant le plasmide pMTOS est dénommée TGMTOS et déposée à la C. N. C. M. le 19 novembre 1996 sous le numéro I-1786.

La séquence d'une partie du fragment (2805 paires de bases) a été réalisée par la méthode de Sanger. La partie en amont de cette séquence contient une séquence IS 6110 et le fragment MT308.

Des couples d'amorces issues du fragment MT308 (MT26/MT27 et MT5/MT6), de <RTI I
Exemple 4 Isolement de l'ADN mycobactérien
Les suspensions de mycobactéries sont centrifugées à 12 000 x g pendant 15 minutes.

L'ADN est extrait par remise en suspension du culot avec 50 l de NaOH 0,1 M contenant du
NaCI 2 M et du SDS 0,5%. Le mélange est incubé à 95 C pendant 15 minutes, au mélange réactionnel on ajoute 400 l de Tris-HCl 0,1M pH 7. L'ADN est extrait 3 fois au phénol/chloroforme, précipité à méthanol et repris dans 50 l de Tris lOmM, EDTA 0,lmM pH 8.

Exemple 5 Amplification de l'ADN mycobactérien avec les couples d'amorces 3-4 et 7-8 issues de la séquence (SEQ ID N 24 donnant respectivement les produits n 13 et n 1
L'analyse de la spécificité des couples 3-4 et 7-8 sur les ADN mycobactériens suivants a été réalisée
M. kansasii, M. intracellulare, M. avium, M. paratuberculosis, M ho vis, M. chelonae,
M. gordonae, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. simiae, M. tuberculosis (souche H37Rv), M. tuberculosis (souche 729), M. tuberculosis (souche 761), M tuberculosis (souche 808), M tuberculosis souche 327), M. tuberculosis (souche 14).

La souche 50, mentionnée en préambule de la description, correspond à un isolat clinique disponible à l'Institut de la tuberculose, Hanoï, Vietnam
Les souches 729, 761, 808 et 327 correspondent à des isolats cliniques provenant respectivement de - Hôpital Pham Ngoc Thach, Ho Chi Min Ville, Vietman (souches 729, 761, 808); - Centre Muraz, Bobo-Dioulasso, Burkina-Fasso (souche 327).

L'amplification est réalisée par la technique d'amplification in vitro selon Saiki et al (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 12,5 pmoles de chacune des amorces oligonucléotidiques et 50 ng d'ADN de différentes souches de mycobactéries avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon contenant 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgC12, 200 ptM de désoxyribonucléotides et 100 ptg/ml de gélatine. Le volume final de la réaction étant de 100 l. Les paramètres des étapes de PCR ont été choisis dc la façon suivante : 1 mn à 94 C, 1 mn à 55 C, 1 mn à 72 C. Trente cycles sont réalisés en utilisant un thermocycleur.

Après le dernier cycle les échantillons sont maintenus à 72 C 10 mn puis stockés à 4 C.

Les résultats de l'amplification sont analysés par électrophorèse. Dix l des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2% dans un tampon TAE (0,04M
Tris -acétate, 0,001M EDTA) et 1 Mg/ml EtBr. Les fragments amplifiées sont visualisées sous JV.

Un fragment d'ADN correspondant à la taille attendue est observé avec les ADN des mycobactéries suivantes : M. tuberculosis (souche H37Rv), Ai tuberculosis (souche 729),
M. tuberculosis (souche 761), M. tuberculosis (souche 808), M. tuberculosis souche (327), ÀÏ tuberculosis (souche 14), M. bovis ; le couple 3-4 donne un fragment compris entre 234 et 281 pb et le couple 7-8 un fragment dont la taille est comprise entre 118 et 194 pb. Par contre ce fragment n'est pas visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes
M. kansasii, M intracellulare, M. avium, M. paratuberculosis, M. chelonae, M gordonae, M xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. simiae.

Les résultats obtenus montrent que le gène p27 n'est présent que chez les bactéries appartenant au complexe tuberculosis. D'autre part, ce gène est présent chez les souches n 729, 761, 808, 327 de Mycobacterium tuberculosis non détectables par les amorces issues de la séquence IS6110 (brevet EP 0 490 951 B1). En effet, la PCR réalisée sur ces quatre souches avec le couple 3-4 ou le couple 7-8 donne le fragment d'ADN attendu, aucun fragment de PCR n'est observé avec les amorces MT7 et MT3 issues de l'IS6110.

Exemple 6: Amplification de l'ADN mycobactérien avec différents couples d'amorces issues de la séquence SEO ID N 1 et de l'1S6110.

Deux paires d'amorces ont été sélectionnées (cf.tableau ci-dessous) dans la séquence (SEQ ID N l) et utilisées comparativement avec les amorces MT7 et MT3 issues de 1'IS6110 dans un test PCR réalisé avec l'ADN des souches suivantes : M. tuberculosis (souche
H37Rv), M. tuberculosis (souche 729), M. tuberculosis (souche 761), M tuberculosis (souche 808), M. tuberculosis (souche 327).

Tableau VI: Couples d'amorces spécifiques de la séquence SEQ ID N0 1

<tb> Numéro <SEP> Localisation <SEP> sur <SEP> la <SEP> Séquences <SEP> (5'#3') <SEP> <SEP> Longueur <SEP> attendue
<tb> <SEP> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N l <SEP>
<tb> SERAI <SEP> 957-976(20-mer) <SEP> GCCCGAGATCAACTCCACC <SEP> 410 <SEP> pb
<tb> <SEP> C
<tb> SRA2 <SEP> 1363-1344(20-mer) <SEP> ACATCTGTTCGTAGTCGGCC <SEP>
<tb>

<tb> X11 <SEP> 1434-1453 <SEP> (20-mer) <SEP> TTTTGAGGATCCACCGGAGA <SEP> 527 <SEP> pb
<tb> B <SEP> 1961 <SEP> - <SEP> 1942(20-mer) <SEP> TAATCAATAATCACATCGGC
<tb>
L'amplification est réalisée en utilisant 12,5 pmoles de chacune des amorces oligonucléotidiques et 50 ng d'ADN de différentes souches de Ai. tuberculosis avec 2 U de
Taq polymérase dans un tampon contenant 50 mM KCI, 10 mM Tris-I-ICI pH 8,3, 1,5 mM
MgCl2 200 pM de désoxyribonucléotides et 100 g/ml de gélatine. Le volume final de la réaction étant de 100 p1. Les paramètres des étapes de PCR ont été choisis de la façon suivante : 1 mn à 940C, 1 mn à 60 C, I mn à 72 C, Quarante cycles sont réalisés en utilisant un thermocycleur. Après le dernier cycle les échantillons sont maintenus à 72 C 10 mn puis stockés à 4 C.

Les résultats de l'amplification sont analysés par électrophorèse. Dix ptl des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2% dans un tampon TAE (0,04M
Tris -acétate, 0,001 M EDTA) et 1 Hg/ml EtBr. Les fragments amplifiées sont visualisées sous
UV.

Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous
Tableau V : Résultats de l'amplification par PCR de l'ADN de plusieurs souches de M. tuberculosis à l'aide des couples d'amorces respectivement spécifiques de IS6110 (M7/MT3) ou de la séquence SEQ ID N 1 (SRAI/SRA2 et Xl l/b).

<tb>

<SEP> Souches <SEP> Résultats <SEP> de <SEP> la <SEP> PCR <SEP> avec <SEP> les <SEP> couple <SEP> d'amorces
<tb> <SEP> MT7/MT3 <SEP> SRA1/SRA2 <SEP> X11/B
<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37Rv <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> n 729 <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> n 761 <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> M. <SEP> tuterculosis <SEP> n0808 <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> n0327 <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb>
Ces résultats montrent clairement que les amorces issues dc la séquence SEQ ID N 1 permettent de détecter et/ou d'identifier les souches de Mycobacterium tuberculosis non détectables par les amorces issues de la séquence IS6110 (brevet EP 0 490 951 Bl). En effet, les PCR réalisées sur les quatre souches M. tuberculosis n 729, 761, 808 et 327 avec les couples SRAI/SRA2 et Xl 1/B donnent les fragments d'ADN attendus, aucun fragment de
PCR n'est observé avec les amorces MT7 et MT3 issues de l'IS6110.

Exemple 7 Amplification par déplacement de chaîne (Strand Displacement
Amplification)
II existe aujourd'hui plusieurs méthodes d'amplification génique utilisable pour le diagnostic de maladies infectieuses, parmi celles-ci la SDA oftre certains avantages : un taux d'amplification de 1010 est atteint en 15 minutes seulement, la réaction est isotherme. Nous avons donc défini, à partir du gènep27 (SEQ ID N 2), des amorces pour réaliser la technique
SDA.

Tableau VI. : Exemples d'amorces utilisables dans une réaction d'amplification par déplacement de chaîne (SDA).

<tb>

Amorces <SEP> Séquences <SEP> (5' <SEP> <SEP> 3') <SEP> | <SEP> Position <SEP> sur <SEP> le <SEP> gène
<tb> B <SEP> la <SEP> GAGATGGCCGACGAC <SEP> 517-531
<tb> B2a <SEP> CCCATCGTAGACGAG <SEP> 693-679
<tb> S <SEP> la <SEP> ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCTCAACACCG <SEP> 550-564
<tb> <SEP> TGTTC
<tb> S2a <SEP> C <SEP> GATTCCGCTCCAGACTTCTCG <SEP> GGTCTTTGTCTAC <SEP> 665-651
<tb> <SEP> CTTG
<tb> B2b <SEP> CCCCCTCTCCTTGTT <SEP> 633-619
<tb> S2b <SEP> CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAOATGGATOA <SEP> 605-591
<tb> <SEP> CCTCC
<tb>
Les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gènep27 de Ad: tuberculosis, les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso BI utilisée dans la technique SDA (Spargo et al., Molecular and
Cellular Probes, August 1996, 10, 247-256).

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses mode de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

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Annexe 1 : Amorces sélectionnées
Produit: P1
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 547 ATGCTCAACACCGTGTTC 564 Amorce retour (19-mer): : 669 CCCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
EGC de l'amorce: 50.0 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 55.3 54.8
Produit
Longueur: 123
ZGC: 53.7
Tm: 76.9 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.4 degrés Celsius
Produit: P2
Amorces
5' 3
Amorce aller (18-mer): 554 ACACCGTGTTCGACTATC 571
Amorce retour (18-mer): : 668 CCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.3 50.4
Produit
Longueur: 115
%GC: 53.9
Tm: 77.0 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.1 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 1)
Produit: P3
Amorces 5' 3'
Amorce aller (19-mer) : 564 CGACTATCACAACGAGAAC 582
Amorce retour (18-mer) : 667 CCTCTTTGTCTACCTTGG 650
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.4 50.4
Produit
Longueur: 104
%GC: 53.8
Tm: 76.0 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 53.4 degrés Celsius
Produit: P4
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 454 GAGAACTATTGGGAAGCC 471
Amorce retour (18-mer): 600 GATGACCTCCTCTTTTGC 583
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 50.0
Trn de l'amorce (degrés Celsius): 52.1 52.9
Produit
Longueur: 147
%GC: 54.4
Tm: 78.2 degrés Celsius
différence entre les '::m des amorces: 0.9 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.5 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 2)
Produit: P5
Amorces
5' 3
Amorce aller (19-mer): : 571 CACAACGAGAACGCAAAAG 589
Amorce retour (20-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 58.0 57.6
Produit
Longueur: 116
ZGC: 54 3
Tm: 77.2 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.4 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.4 degrés Celsius
Produit: P6
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 572 ACAACGAGAACGCAAAAG 589
Amorce retour (19-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
ZGC de l'amorce: 44.4 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 54.9 53.3
Produit
Longueur: 115
%GC: 53.9
T=n: 77.0 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.6 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.0 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 3)
Produit: P7
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 574 AACGAGAACGCAAAAGAG 591
Amorce retour (19-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 52.6
Tm de 1',Lorce (degrés Celsius): 54.1 53.3
Produit
Longueur: 113
%GC: 54.0
Tm: 77.0 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.7 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.0 degrés Celsius ------------------------------------------------------
Produit: P8
Amorces
S' 3'
Amorce aller (19-mer): 573 CAACGAGAACGCAAAAGAG 591
Amorce retour (20-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 57.2 57.6
Produit
Longueur: 114
GGC: 54.4
Tm: 77.2 degrés Celsius
différence entre les Trn des amorces: 0.4 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.3 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 4)
Produit: p9 Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer): 566 ACTATCACAACGAGAACGC 584
Amorce retour (19-mer): 673 TGGTCCCCTCTTTGTCTAC 655
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 53.7 55.0
Produit
Longueur: 108
ZGC: 53.7
Tm: 75.9 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.4 degrés Celsius
Produit: P10
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 567 CTATCACAACGAGAACGC 584
Amorce retour (21-mer) : 666 CTCTTTGTCTACCTTGGTTAC 646
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 42.9
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 52.5 50.9 Produit
Longueur: 100
%GC: 53.0
Tm: 75.6 degrés Celsius
différence entre les Ta des amorces: 1.6 degrés Celsius tampérature optimale d'hybridation: 53.3 degrés Celsius Annexe i (suite 5)
Produit: Pli Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer): 564 CGACTATCACAACGAGAAC 582
Amorce retour (21-mer): 666 CTCTTTGTCTACCTTGGTTAC 646
aller retour
%GC de l'amorce: 47.4 42.9
Tm de l'amorce (degrés Ceîsius) : 51.4 50.9
Produit
Longueur: 103
ZGC: 53.4
Tm: 75.8 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 53.4 degrés Celsius
Produit: P12
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): : 575 ACGAGAACGCAAAAGAGG 592
Amorce retour (20-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 56.5 57.6
Produit
Longueur: 112
%GC: 54.5
Tm: 76.2 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.1 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.4 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 6)
Produit: P13
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 352 ACAGTGTTGAAGGCAATC 369
Amorce retour (18-mer) : 594 CTCCTCTTTTGCGTTCTC 577
aller retour
EGC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.5 53.4
Produit
Longueur: 243
ZGC: 54.3
Tm: 80.2 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 2.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.7 degrés Celsius
Produit: P14
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 575 ACGAGAACGCAAAAGAGG 592
Amorce retour (20-mer): 687 GTAGACGAGTCTGATGGTCC 668
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 56.5 54.5
Produit
Longueur: 113 EGC: 54.9
Tm: 77.4 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 2.0 degrés Celsius terpérature optimale d'hybridation: 55.6 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 7)
Produit: P15
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 424 CAGATGTGGTTCCAAGAC 441
Amorce retour (18-mer): 600 GATGACCTCCTCTTTTGC 583
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.7 52.9
Produit
Longueur: 177
%GC: 54.2
Tm: 79.1 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.0 degrés Celsius
Produit: P16
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 414 CGACTACGAACAGATGTG 431
Amorce retour (18-mer): 668 CCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
EGC de l'amorce: 50.0 50.0
T:n de l'amorce (degrés Celsius): 50.3 50.4
Produit
Longueur 255
%GC: 54.9
Tm: 80.4 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.1 degrés Celsius tenpérature optimale d'hybridation: 56.5 degrés Celsius Annexe i (suite 8)
Produit: P17 Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer) : 422 AACAGATGTGGTTCCAAG 439
Amorce retour (18-mer): : 584 GCGTTCTCGTTGTGATAG 567
aller retour
ZGC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 51.3 52.5
Produit
Longueur: 163
ZGC: 54.6
Tm: 78.3 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.2 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.3 degrés Celsius
Produit: P18
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): : 419 ACGAACAGATGTGGTTCC 436
Amorce retour (18-mer): : 594 CTCCTCTTTTGCGTTCTC 577
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 54.0 53.4
Produit
Longueur: 176
ZGC: 54.0
Tm: 79.0 degrés Celsius
différence entre les T:n des amorces: 0.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 56.5 degrés Celsius Annexe i (suite 9)
Produit: P19
Amorces
5' 3'
Amorce aller (19-mer) : 577 GAGAACGCAAAAGAGGAGG 595
Amorce retour (20-mer): 686 TAGACGAGTCTGATGGTCCC 667
aller retour
ZGC de l'amorce: 52.6 55.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 57.6 57.6
Produit
Longueur: 110
%GC: 54.5
Tm: 76.3 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.1 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.8 degrés Celsius
Produit: P20
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 454 GAGAACTATTGGGAAGCC 471
Amorce retour (18-mer): 601 GGATGACCTCCTCTTTTG 584
aller retour
ZGC de l'amorce: 50.0 50.0
de l'amorce (degrés Celsius): 52.1 52.8
Produit
Longueur: 148
EGC: 54.7
Tm: 78.3 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 0.7 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.6 degrés Celsius
Annexe 1 (suite 10)
Produit: P2l amorces
5' 3'
Amorce aller (20-mer): : 451 ATGGAGAACTATTGGGAAGC 470
Amorce retour (20-mer): : 670 TCCCCTCTTTGTCTACCTTG 651
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 55.8 56.8
Produit
Longueur: 220
%GC: 55.0
Tm: 79.5 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.0 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 57.5 degrés Celsius
Produit: P22
Amorces
5' 3'
Amorce aller (20-mer): 447 AGTGATGGAGAACTATTGGG 466
Amorce retour (18-mer): : 713 TTGTATGAAAACGTGGGC 696
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 44.4
Trn de l'amorce (degrés Celsius): : 54.1 55.4
Produit
Longueur: 267
%GC: i4.3
Tm: 80.2 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 57.4 degrés Celsius
Annexe I (suite 11)
Produit: P23 Amorces
5' 3'
amorce aller (20-mer): : 563 TCGACTATCACAACGAGAAC 582
Amorce retour (19-mer): 673 TGGTCCCCTCTTTGTCTAC 655
aller retour
%GC de l'amorce: 45.0 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 53.7 55.0
Produit
Longueur: 111
%GC: 54.1
Tm: 76.1 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.3 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 54.5 degrés Celsius
Produit: P24
Amorces
5' 3'
Amorce aller (18-mer): 577 GAGAACGCAAAAGAGGAG 594
Anorce retour (19-mer): 689 TCGTAGACGAGTCTGATGG 671
aller retour
%GC de l'amorce: 50.0 52.6
Tm de l'amorce (degrés Celsius): 53.4 54.6
Produit
Longueur: 113
%GC: 54.9
Tm: 77.4 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.2 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.3 degrés Celsius
Annexe i (suite 12)
Produit: P25 Amorces
5' 3
Amorce aller (18-mer): 422 AACAGATGTGGTTCCAAG 439
Amorce retour (18-mer) : 601 GGATGACCTCCTCTTTTG 584
aller retour
%GC de l'amorce: 44.4 50.0
Tm de l'amorce (degrés Celsius): : 51.3 52.8
Produit
Longueur: 180
%GC: 53.9
Tm: 79.0 degrés Celsius
différence entre les Tm des amorces: 1.5 degrés Celsius température optimale d'hybridation: 55.8 degrés Celsius
Annexe 2
Carte peptidique de la proteine p27KD
Digest with: Tryp.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
20 243 - 244 147.2 0.0 1 0 0 0 0 1
3 42 - 43 247.3 1.0 0 0 1 0 2 0
14 209 - 210 303.3 0.0 0 1 1 0 2 0
8 112 - 114 359.4 1.0 0 0 1 0 2 1
16 219 - 221 360.4 0.0 0 1 1 0 2 1
il 133 - 136 445.5 0.0 0 1 1 0 2 2
19 239 - 242 509.6 0.0 0 1 1 0 4 0
17 222 - 226 574.6 0.0 0 1 1 0 3 2
9 115 - 121 788.0 1.0 0 0 1 O 4 3
15 211 - 218 856.0 0;0 0 1 1 Q 4 4
7 102 - 111 1042.3 1.0 o 0 1 2 3 7
10 122 - 132 1326.5 1.0 3 0 1 0 S 6
13 197 - 208 1391.6 -2.0 0 3 1 0 7 5
18 227 - 238 1418.6 -1.0 3 2 1 0 6 6
4 44 - 58 1664.9 -1.0 1 2 1 0 7 8
6 86 - 101 1691.8 0.0 1 1 1 9 7 9
1 1 - 15 1773.0 0.0 2 1 1 1 9 6
2 16 - 41 2627.0 -1.0 2 2 1 0 9 17
S 59 - 85 3037.4 0.0 2 1 1 0 16 11
12 137 - 196 7239.7 -15.0 10 16 1 4 33 27
Digest with: Chymo.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
26 244 - 244 0.0 0.0 0 0 0 0 0 0
10 126 - 126 165.2 0.0 1 0 0 0 O 1
14 145 - 145 165.2 0.0 1 0 0 0 0 1
2 5 - S 204.2 0.0 1 O 0 0 0 1
16 155 - 155 204.2 0.0 1 0 0 0 0 1
24 236 - 237 268.3 0.0 1 0 O 0 1 1
21 189 - 190 296.3 -1.0 1 1 0 0 1 1
11 127 - 129 350.4 0.0 1 0 0 0 1 2
7 73 - 75 431.5 0.0 1 0 0 0 1 2
1 1 - 4 507.6 0.0 1 0 0 1 2 2
19 179 - 182 519.5 -2.0 1 2 0 0 2 2
13 141 - 144 592.7 -1.0 1 1 0 1 2 2
23 230 - 235 664.7 -2.0 1 2 0 0 4 2
20 183 - 188 723.9 0.0 1 0 0 1 2 4
25 238 - 243 764.9 1.0 1 1 2 0 5 1
15 146 - 154 1082.2 -2.0 1 2 0 1 4 5
18 169 - 178 1181.2 -5.0 1 i 0 1 7 3
12 130 - 140 1268.3 -1.0 1 3 2 0 7 4
3 6 - 17 1373.5 0.0 1 1 1 0 7 5
4 18 - 32 1394.6 0.0 1 C O 0 4 11
17 156 - 168 1446.5 -2.0 1 2 Q 0 S 5
6 58 - 72 1669.9 1.0 1 0 1 @ 9 6
8 76 - 97 2297.5 0.0 1 1 1 0 11 11
5 33 - 57 2694.0 -2.0 1 4 2 0 13 12
9 98 - 125 3122.7 3.0 1 1 4 2 13 15
22 191 - 229 4483.; -2.0 1 9 6 0 23 15
Annexe 2(suite 1)
Digest with: Clos.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
S 112 - 114 359.4 1.0 0 0 1 0 2 1
4 102 - 111 1042.3 1.0 0 0 1 2 3 7
8 211 - 225 1755.0 0.0 0 3 3 0 9 7
1 1 - 15 1773.0 0.0 2 1 1 1 9 6
9 227 - 244 2039.3 -1.0 4 3 2 0 10 7
6 115 - !32 2096.4 2.0 3 0 2 0 9 9
2 16 - 59 4503.1 -1.0 3 4 3 0 la 25
3 59 - 101 4711.2 0.0 3 2 2 0 23 20
7 133 - 210 9326.1 -17.0 10 21 4 4 44 34
Digest with: CnBr.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
1 1 - 1 149.2 0.0 0 0 0 1 0 1
3 105 - 109 513.7 0.0 0 0 0 1 2 3
5 144 - 151 1009.2 -1.0 2 1 0 1 2 6
7 175 - 183 1115.1 -4.0 2 4 0 1 4 5
6 152 - 174 2737.9 -6.0 3 6 0 1 15 8
4 110 - 143 3987.5 1.0 4 4 5 1 18 16
8 184 - 244 6981.8 -4.0 6 12 8 0 36 24
2 2 - 104 11093.4 -1.0 8 7 6 1 50 53
Digest with: IBzO.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
1 1 - 5 693.6 0.0 2 0 0 1 2 3
6 145 - 155 1415.6 -2.0 3 2 0 1 4 7
5 126 - 144 2322.5 -2.0 4 4 2 1 10 9
2 6 - 32 2750.1 0.0 2 1 1 0 11 16
7 156 - 182 3111.2 -9.0 3 9 0 1 17 10
3 33 - 75 4779.3 -1.0 3 4 3 0 23 20
4 76 - 125 5402.2 3.0 2 2 5 2 24 26
8 183 - 244 7113.0 -4.0 6 12 8 1 36 25
Digest with: Myxo.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
12 243 - 244 147.2 0.0 1 O 0 0 0 1
2 42 - 43 247.3 1.0 0 0 1 0 2 O
9 219 - 221 360.4 0.0 Q 1 1 0 2 1
@@ 239 - 242 509.6 o.a o 1 1 c 4 0
8 209 - 219 1141.3 0.0 0 2 2 0 6 4
7 197 - 208 1391.6 -2.0 0 3 1 0 7 5
5 122 - 136 1754.0 1.0 3 1 @ @ 7 6
10 222 - 238 1975.2 -1.0 3 3 2 0 9 8
4 66 - 121 3827.4 3.0 1 1 4 2 15 20
1 1 - 41 4382.0 -1.0 4 3 2 l 19 23
3 44 - 85 4684.2 -1.0 3 3 2 0 23 19
6 137 - 199 7239.7 -15.0 10 16 1 4 33 27
Annexe2 (suite 2)
Digest with: pH2,5.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
2 171 - 244 8533.5 -9.0 8 17 a 2 43 30
1 1 - 170 18946.2 -6.0 17 17 11 5 84 86
Digest with: ProEn.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
3 9 - 9 115.1 0.0 0 0 0 0 1 0
8 107 - 107 115.1 0.0 0 0 0 0 1 0
10 172 - 172 115.1 0.0 0 0 0 0 1 0
1 I - 2 246.3 0.0 0 0 0 1 1 1
15 242 - 244 275.4 1:0 1 0 1 0 1 1
5 21 - 24 316.3 0.0 0 0 0 0 2 2
2 3 - 8 746.9 0.0 2 0 0 0 2 4
12 205 - 2:2 914.0 0.0 0 2 2 0 6 2
14 234 - 241 1008.1 0.0 2 1 1 0 6 2
4 10 - 20 1262.4 0.0 1 1 1 0 6 5
13 213 - 233 2374.7 -2.0 1 5 3 0 11 10
7 72 - 106 3828.3 0.0 3 2 2 1 16 19
11 173 - 204 3839.2 -8.0 4 9 1 2 17 15
6 25 - 71 5013.6 -1.0 2 4 3 0 23 24
9 108 - 171 7543.4 -5.0 9 10 5 3 33 31
Digest with: Staph.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
17 196 - 196 147.1 -1.0 0 1 0 O 1 0
3 39 - 40 260.3 -1.0 0 1 0 0 1 1
11 157 - 160 445.5 -1.0 0 1 0 0 2 2
13 170 - 173 456.4 -2.0 0 2 0 0 4 0
16 194 - 197 460.5 0.0 0 1 1 0 3 1
8 138 - 141 496.5 -2.0 1 2 0 0 2 2
23 240 - 244 509.6 1.0 1 0 1 0 3 1
19 210 - 214 570.6 0.0 O 1 1 0 3 2
10 153 - 156 610.6 -1.0 2 1 0 0 2 2
14 174 - 180 857.8 -4.0 1 4 0 1 4 3
22 233 - 239 870.9 0.0 2 1 1 0 5 2
20 215 - 222 931.1 0.0 0 2 2 0 5 3
'2 161 - 169 1019.1 -1.0 1 1 0 0 6 3
21 223 - 232 1122.2 -1.0 1 2 1 0 4 6
1 1 - 10 1201.4 -1.0 2 1 0 1 5 5
18 199 - 209 1262.5 -1.0 0 2 1 0 6 5
9 142 - 152 1397.6 -2.0 2 2 0 2 4 7
4 41 - S: 1515.9 0.0 0 2 2 C 8 7
15 181 - 193 1639.8 -2.0 3 2 0 1 6 7
5 62 - 93 1810.0 0.0 1 1 1 0 6 9
2 11 - 33 2828.1 0.0 2 1 1 0 11 17
5 56 - @1 2970.3 0.G 3 1 1 0 15 11
7 99 - 137 4374.1 4.0 3 2 6 2 19 20
Annexe2 (suite 3)
Digest with: TrypK.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acd Base Sul Phil Phob
12 243 - 244 147.2 0.0 1 C O 0 0 1
2 42 - 43 247.3 1.0 0 0 1 0 2 0
9 219 - 221 360.4 0.0 O 1 1 O 2 1
11 239 - 242 509.6 0.0 0 1 I O 4 O
8 209 - 218 1141.3 0 0 0 2 2 0 6 4
7 197 - 208 1391.6 -2.0 0 3 1 0 7 5
5 122 - 136 1754.0 1.0 0 3 1 2 0 7 8
10 222 - 238 1975.2 -1.0 3 3 2 0 9 8
4 86 - 121 3827.4 3.0 1 1 4 2 16 20
1 1 - 41 4382.0 -1.0 4 3 2 1 18 23
3 44 - 85 4684.2 -1.0 3 3 2 0 23 19
6 137 - 196 7239.7 -15.0 10 16 1 4 33 27
Digest with: TrypR.

Pos From To Mol Wt Chg Aro Acid Base Sulf Phil Phob
5 112 - 114 359.4 1.0 0 0 1 0 2 1
4 102 - 111 1042.3 1.0 0 0 1 2 3 7
8 211 - 226 1755.0 0.0 0 3 3 0 9 7
1 I - 15 1773.0 0.0 2 1 1 1 9 6
9 227 - 244 2039.3 -1.0 4 3 2 0 10 7
6 115 - 132 2096.4 2.0 3 0 2 0 9 9
2 16 - 58 4503.1 -1.0 3 4 3 0 18 25
3 59 - 101 4711.2 0.0 3 2 2 0 23 20
7 133 - 210 9326.1 @17.0 10 21 4 4 44 34
Digest with: AspN.

Pos From To Mol Wt @ Cho Aro Acid Base Sul Phil Phob
7 176 - 176 133.1 -1.0 0 1 0 0 1 0
8 177 - 178 296.3 -1.0 1 1 0 0 1 1
3 135 - 138 461.5 -1.0 0 2 1 o 3 1
6 170 - 175 658.7 -2.0 0 2 0 1 4 2
4 139 - 146 1146.2 -2.0 3 2 O 1 4 4
12 220 - 229 1193.4 0.0 1 2 2 0 5 5
9 179 - 188 1225.4 -2.0 2 2 0 1 4 6
13 230 - 244 1663.8 -1.0 3 3 2 0 10 4
11 205 - 219 1697.0 0.0 0 3 3 o 9 6
10 189 - 204 1907.1 -3.0 1 4 1 C 10 6
5 147 - 169 2697.9 -5.0 3 S 0 1 12 11
1 1 - 50 5230.0 0.0 4 3 3 1 22 28
2 51 - 134 9317.5 3.0 7 7 42 42
Annexe 3
Pos AA GlycoS HyPhil AI-Ind 1 M 0.100 0.450 2 P . 0.260 0.450 3 N . -0.083 0.250 4 F . -0.614 -0.050 5 W . -0.114 0.100 6 A . -0.114 -0.300 7 L . -0.114 -0.300 8 P . -0.357 -0.150 9 P 0.014 0.650 10 E 0.386 1.200 il I . 1.029 1.300 12 N G 1.443 1.300 13 S . 0.571 1.150 14 T . 0.257 0.600 15 R . 0.357 0.300 16 I . -o.oa6 -0.300 17 Y . 0.029 0.300 18 L . -0.014 -0.300 19 G . -0.543 -0.450 20 P . 0.157 1.250 21 C . 0.200 1.250 22 S . 0.100 0.850 23 C . -0.500 -0.050 24 P . -0.986 -0.450 25 I . -1.300 -0.600 26 L . -1.671 -0.600 27 A . -1.229 -0.600 28 A . -1.400 -0.600 29 A . -0.629 -0.600 30 Q . 0.414 0.300 31 G . 0.414 0.300 32 W . 0.129 0.300 33 N . 0.129 0.300 34 A . -0.257 -0.300 35 L . 0.186 0.300 36 A -0.486 -0.600 37 S . -0.486 -0.600 38 E . 0.329 0.600 39 L . 0.971 0.900 40 E 1.786 0.900 41 K . 1.071 0.900 42 T . 0.629 0.900 43 K 0.629 0.750 44 V 0.629 0.750 45 G 0.186 0.300 46 L -0.171 -0.300 47 Q -1.271 -0.600 48 S -0.171 -0.300 49 A -0.129 0.000 50 L -0.129 -0.150 51 D -1.171 -0.450
Annexe 3(suite 1) 52 T -0.786 -0.450 53 L -0.414 -0.450 54 @ 0.314 0.450 55 E 0.457 1.000 56 S 0.414 1.200 57 Y 1.457 1.500 58 R 2.114 1.700 59 G 1.729 1.700 60 Q 2.114 1.500 61 S . 1.671 1.100 62 S . 0.486 0.800 63 Q . -0.214 -0.150 64 A -0.214 -0.300 65 L 0.171 0.300 66 I . 0.157 0.300 67 Q . -0.886 -0.450 68 q . -0.400 -0.450 69 T . 0.329 0.600 70 L 0.37l 0.300 71 P 0.371 0.300 72 Y . 0.000 0.300 73 V -0.643 -0.600 74 Q 0.000 0.300 75 W . -0.129 -0.300 76 L . -0.214 -0.150 77 T . 0.129 0.450 78 T 0.129 0.450 79 T 0.457 0.600 80 A 0.743 0.900 81 E . 1.100 0.750 82 H 1.557 0.750 83 A . 1.557 0.750 84 H . 1.557 0.750 85 X . 0.414 0.300 86 T . 0.457 0.450 87 A . 0.171 0.300 88 I . -0.186 -0.300 89 Q . -1.000 -0.600 90 L . -1.357 -0.600 91 T . -1.357 -0.600 92 A . -0.214 -0.300 93 A . -0.971 -0.600 94 A . -0.243 -0.300 95 N . 0.157 0.450 96 A 0.914 0.750 97 Y . 0.914 0.750 98 E . 1.814 0.750 99 Q @ 1.057 0.750 100 A . 1.057 0.750 101 R . 0.600 0.600 102 A @ -0.500 -0.600 103 A -0.771 -0.600 104 M . -0.286 -0.300 105 V -1.186 -0.600 106 P -1.200 -0.600 107 P -1.543 -0.600 108 A -0.629 -0.600 109 M -0.286 -0.300 110 V -0.014 -0.300 111 R 0.400 0.450 112 A 0.057 0.300 113 N 0.829 0.750 114 R 1.529 0.900 115 V 0.985 0.900 116 Q 0.643 0.750 117 T -0.400 -0.450
Annexe 3 (suite 2) 118 T -0.486 -0.300 119 V -0.143 -0.300 120 L -1.286 -0.600 121 X -0.886 -0.600 122 A -0.857 -0.600 123 I -0.657 -0.600 124 N -0.057 0.100 125 w . -0.114 0.100 126 F . -0.257 -0.300 127 G 0.500 0.700 128 Q 0.100 0.700 129 F 0.614 0.900 130 S 0.371 0.450 131 T 0.057 0.450 132 R 0.057 0.600 133 I 1.014 0.750 134 A 1.400 0.900 135 D 1.043 0.750 136 K . 0.900 0.900 137 E 1.729 0.900 138 A . 2.486 0.900 139 D 2.486 0.750 140 Y 1.657 0.750 141 E 1.286 0.750 142 Q 1.143 0.600 143 M . 1.143 0.750 144 W . 1.457 0.750 145 F . 0.700 0.600 146 Q . -0,343 -0.300 147 D . -0.671 -0.600 148 A . -1.071 -0.600 149 L . -0.171 -0.300 150 V . -0.171 -0.300 151 M . -0.486 -0.600 152 E @ -0.100 -0.300 153 N . 0.943 0.950 154 Y . 1.286 0.950 155 W . 0.957 0.600 156 E . 0.957 0.600 157 A . 0.957 0.600 158 V . 0.514 0.600 159 Q . -0.257 -0.300 160 E . -0.257 -0.300 161 A . 0.114 0.450 162 I . 0.814 0.750 163 Q . 0.429 0.450 164 S . 0.386 0.450 165 T . 0.243 0.800 166 S . 1.386 1.100 167 H . 1.386 0.900 168 F . 1.500 0.750 l69 E 1.629 0.900 170 D 2.014 0.900 171 P 1.286 1.100 172 P 1.429 1.100 173 E 1.429 0.900 174 M . 1.429 0.750 175 A . 1.386 0.750 176 D 1.657 0.900 177 D 1.657 0.900 178 Y 1.671 0.900 179 D 2.057 0.900 180 E 1.286 0.750 181 A 0.243 0.330 182 W 0.557 0.600 183 M 0.157 0.300
Annexe 3 (suite 3) 184 L -0.943 -0.600 185 N -1.086 -0.600 186 T -0.714 -0.600 187 V -0.257 -0.300 188 F 0.743 0.600 189 D 0.743 0.600 190 Y 1.143 0.950 191 H 2.243 0.950 192 N 2.386 0.900 193 . E 2.443 0.900 194 N . 2.757 0.900 195 A . 2.800 0.900 196 K 1.700 0.900 197 E 0.557 0.750 198 E . 0.514 0.750 199 V . 0.229 0.300 200 I . -0.929 -0.600 201 H . -1.200 -0.600 202 L -1.200 -0.600 203 V -1.200 -0.600 204 P . -0.057 -0.150 205 D 0.043 0.600 206 V @ 1.086 0.900 207 N @ 2.329 0.900 208 K @ 2.157 0.900 209 E @ 1.886 0.900 210 R 1.843 0.900 211 G 1.843 0.900 212 P @ 0.743 0.750 213 I @ -0.357 -0.150 214 E -0.900 -0.600 215 L . -0.400 -0.300 216 V . -1.229 -0.600 217 T . -0.086 -0.150 218 K . -0.029 0.000 219 V @ 1.014 0.900 220 D @ 1.671 0.900 221 K @ 1.671 0.900 222 E @ 0.471 0.600 223 G @ 1.714 0.900 224 T 0.671 0.750 225 I -0.486 -0.450 226 R -0.800 -0.600 227 L . -0.357 -0.300 228 V . -0.400 -0.300 229 Y @ 0.743 0.600 230 D @ 0.329 0.800 231 G @ 0.971 1.100 232 E 1.171 0.900 233 P 1.100 0.900 234 T 0.786 1.100 235 F . 1.286 0.950 236 S 1.286 0.750 237 Y 1.514 0.750 238 K 1.643 0.900 239 E 2.600 0.500 240 H 2.086 0.900 241 P 2.217 1.700 242 K 1.880 1.700 243 F 1.475 1 300
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(1) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR
(B) RUE: 28 RUE DU DOCTEUR ROUX
(C) VILLE: PARIS CEDEX 15
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75724
(ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE
DE 27KD DE MYCOBACTERIES APPARTENANT AU COMPLEXE DE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. APPLICATION AU DIAGNOSTIC ET A
LA PREVENTION DE LA TUBERCULOSE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C! SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
)D) LOGICIEL: PatentIn Release 1.0, Version &num;1.30 (OEB)
2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2805 aires ce jase
B) TYPE: nucl otide
NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TTGGGCCGCC GTAAGGAATG CGTCATGAGC GACTTCGCAT CACGGGCGAC CAATCATTAA 60
TTTGTCAAAC CCTTTGAGAT GCACTACTTG TCCACATTTT GTACACGAAA TACCTAACAC 120
ACTATGGTGC ACATCACGCA CTTCCACGTT CCGTATTCGG TGTACGATTT GTCACGCAAC 180
TAAGCGTTCA AGAGGGAGTA CTATGACTCA CCAAAAGTAA AAGATGACAT AGAAATAGAA 240 GAGTCGTGGT TCCGGTGCGG GTAGCTCCCG ATGGCTTGAC TGTGGTAAGC ACCAGTGGCG 300
TGTTCCCCGT GGTTGAGACC AGGAAGTTTT AAAGTCCTAC AGCCCGCGGT ATTCCGCAGA 360
GGACATTGTG TGCATTTCGC ACCTTCGGGT GGGAGAAATC GGGATGATCT CACCACCGGC 420
CACCGGGTGG CGCACTTTGT ACCCTTCGAT TCCGTTATTC GGCGGATTTA AGCAGTTCGC 480
ACCATTACCA AGCAGCCAAT GAGGAAGAGC GCAGGTGACT AGGTCGCTTG ATCTTTCCCT 540
CTGCAGTAGC TCGGGTTCTT TGAGTTTCGA GGAGGAGAAA CCACATGTCC TTTGTGAATG 600 TA--ACCCATT TGGATGTTGG CGGCCGTGCG ACACTGGAGT CCCTTCGTTC CCACATGGCG 660
@TAAGCAATG CCGCGGTGGC CTCGGTGACC ACCAAGGTTC CTCCCCCGGC CGCCGACTAC @@@TCAAAAA AGTTATCGCT GTTCTTTAGT AGCCACGGGC AGCAGTACCA @@TGCAAGCC
@@TCGGGCAC GGCCTTTCAT CGAAATTGGT CCGGACCCTG GGCCGAATTG CGCTTGCGTA
TGAGGAAGTC GAGAATCGCC AACAACGAAG GTTTCTAACG TGTCGCCAGT TACGCACGAG 900
TGGCTACCAG CGAGTACAAG GGAGTAACGA ATTATGCCCA ATTTCTGGGC GTTGCCGCCC 960
GAGATCAACT CCACCCGGAT ATATCTCGGC CCGGGTTCTG GCCCGATACT GGCCGCCGCC 1020 CAGOGATOGA ACGCTCTGGC CAGTGAGCTG GAAAAGACGA AGGTGGGGTT GCAGTCAGCG 1080 CTCGACACGT TGCTGGAGTC GTATAGGGGT CAGTCGTCGC AGGCTTTGAT ACAGCAGACC 1140
TTGCCGTATG TGCAGTGGCT GACCACGACC GCCGAGCACG CCCATAAGAC CGCGATCCAG 1200
CTCACGGCAG CGGCGAACGC CTACGAGCAG GCTAGAGCGG CGATGGTGCC GCCGGCGATG 1260
GTGCGCGCGA ACCGCGTGCA GACCACAGTG TTGAAGGCAA TCAACTGGTT CGGGCAATTC 1320
TCCACCAGGA TCGCCGACAA GGAGGCCGAC TACGAACAGA TGTGGTTCCA AGACGCGCTA 1380
GTGATGGAGA ACTATTGGGA AGCCGTGCAA GAGGCGATAC AGTCGACGTC GCATTTTGAG 1440
GATCCACCGG AGATGGCCGA CGACTACGAC GAGGCCTGGA TGCTCAACAC CGTGTTCGAC 1500
TATCACAACG AGAACGCAAA AGAGGAGGTC ATCCATCTCG TGCCCGACGT GAACAAGGAG 1560
AGGGGGCCCA TCGAACTCGT AACCAAGGTA GACAAAGAGG GGACCATCAG ACTCGTCTAC 1620
GATGGGGAGC CCACGTTTTC ATACAAGGAA CATCCTAAGT TTTGATTCGG GAACATCCTA 1680
@@AAACGGGG GGCGTCGCCG TTGGAGACGT CGCAACGTGT CCGCAGTCCC AAGGGCAACA 1740
@@@AAGGGCC CACGGTGCGA TCCCCAACAC CCGGCTAGAG TGCGCATAAT ATTTTCCCGC 1800
@@@@GCTCAA GGCGTGCACC CCCATCACCG CTAACCATGC TGTGTATCAA CAGATTTCAT 1860
TGTCCCGGCC GTCGCGCGAC CGACCAATAG GGTGAGTTCC ATGTGCGATA TCGCCTAACA 1920 GCCGGCTC@C GTACTCCCGT GGCCGATGTG ATTATTGATT ACGTGGATCA CCATGTGGGT 1980
GATCGCGGTC GACAGCTTTG GTACCGAGCA CATCGCCACA ACGCGCGGTA CGAATCTAGT 2040
ACACAAATCC GCACCAGCCG CCATGCGACT TCGCAGGTCA TAGCCCCGCA GAGTCGCCGA 2100
ACCTGCCGCA GTGACAAAAG TCAGGACGGC CGGCGACGCG TCGAGCCGGG GTTAGGCGCA 2160
GTTAACGTCG CAGCGGGGTC CCAGACACGC GTCGGACTTT CGGACTCAGC CCGACGATTC 2220
GCCGTCAGAC TGCGGGCTTT CCTGGTCTAC CAGCAACGCT TGCAGGGCGG AGCCGGTGAT 2280
GCGCCGGAAC GCGCGCCGTG GCCGGTTGGC ATCGAGAACG GCCACCTCTA AGCTGGCCAC 2340
GCCAAGGGTG GGTTGATCAC CACCCGAGGT GTCGGCACTG CCGGCCCGCA ATGCAGCGAC 2400
CGCGATACGC AGGGCGTCGG TCAGGCTGGC GTTCTCGGCA TACGACTCTT TGAGCGCGTT 2460
GGCGATCGGC TCCGTGGTGC CGCCCATCAC CACGAAATGC GGCTCGTCGG CGATCGACCC 2520
GTCGTAGGTA ATACGATACA ACTCAGGGCG TTTCGTCTCG CCGTAATGCG CCACCTCGGC 2580
CACACACAAC TCAACCTCGT AGGGCTTGGC CTGTTCGGTG AAGATGGTGC CTAGAGTCTG 2640
CGCGTAGACA TTGGCCAACT GCCGACCCGT GACGTCACGA CGGTCATAGG CGTAACCGCG 2700
CGTGTCGGCG AACTGGATCC CGCCGCGGCG CAAATTGTCG AACTCGTTGA ACTTGCCCGC 2760 @@@@GCAAAA CCCACCCGAT CGTAGAGCTC ACTGATCTTC TG@@ 2805
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:
@ CARACTERISTIQUES DE LA SEOJENCE:
(A LONGUEUR: @32 paires de bases
(B) TYPE: nucl otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGCCCAATT TCTGGGCGTT GCCGCCCGAG ATCAACTCCA CCCGGATATA TCTCGGCCCG 60
GGTTCTGGCC CGATACTGGC CGCCGCCCAG GGATGGAACG CTCTGGCCAG TGAGCTGGAA 120 AAGACGAAGG TGGGGTTGCA GTCAGCGCTC GACACGTTGC TGGAGTCGTA TAGGGGTCAG 180
TCGTCGCAGG CTTTGATACA GCAGACCTTG CCGTATGTGC AGTGGCTGAC CACGACCGCC 240
GAGCACGCCC ATAAGACCGC GATCCAGCTC ACGGCAGCGG CGAACGCCTA CGAGCAGGCT 300 ACAGCGGCGA TGGTGCCGCC GGCGATGGTG CGCGCGAACC GCGTGCAGAC CACAGTGTTG 360
AAGGCAATCA ACTGGTTCGG GCAATTCTCC ACCAGGATCG CCGACAAGGA GGCCGACTAC 420
GAACAGATGT GGTTCCAAGA CGCGCTAGTG ATGGAGAACT ATTGGGAAGC CGTGCAAGAG 480
GCGATACAGT CGACGTCGCA TTTTGAGGAT CCACCGGAGA TGGCCGACGA CTACGACGAG 540
GCCTGGATGC TCAACACCGT GTTCGACTAT CACAACGAGA ACGCAAAAGA GGAGGTCATC 600 @@T@@@GTGT CCGACGTGAA CAAGGAGAGG GGGCCCATCG AA@T@@@AA@ TAAGGTAGA@ 66@
AAAGAGGGGA CCATCAGACT CGTCTACGAT GGGGAGCCCA CGTTTTCATA CAAGGAACAT @20
CCTAAGTTTT GA 732 !2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 243 acides amin s
(B) TYPE: acide amin
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Pro Asn Phe Trp Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Thr Arg Ile
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Pro Gly Ser Gly Pro Ile Leu Ala Ala Ala Gin Gly Trp
20 25 30
Asn Ala Leu Ala Ser Glu Leu Glu Lys Thr Lys Val Gly Leu Gln Ser
35 40 45
Ala eu Asp Thr Leu Leu Glu Ser Tyr Arg Gly Gln Ser Ser Gln Ala
50 55 oO
Leu Ile Gln Gln Thr Leu Pro Tyr Val Gln Trp @@@ @@@ Thr Thr Ala
65 70 75 80
@@@ His Ala His Lys Thr Ala Ile Gln Leu Thr Ala Ala Ala Asn Ala
85 90
Tyr lu Gln Ala Arg Ala Ala Met Val Pro Pro Ala Met Val Arg Ala
100 105 110
Asn Arg Val Gln Thr Thr Val Leu Lys Ala Ile Asn Trp Phe Gly Gln
115 120 125
Phe Ser Thr Arg Ile Ala Asp Lys Glu Ala Asp Tyr Glu Gln Met Trp
130 135 140
Phe Gln Asp Ala Leu Val Met Glu Asn Tyr Trp Glu Ala Val Gln Glu 145 150 155 160
Ala Ile Gln Ser Thr Ser His Phe Glu Asp Pro Pro Glu Met Ala Asp
165 170 175
Asp Tyr Asp Glu Ala Trp Met Leu Asn Thr Val Phe Asp Tyr His Asn
180 185 190
Glu Asn Ala Lys Glu Glu Val Ile His Leu Val Pro Asp Val Asn Lys
195 200 205
Glu Arg Gly Pro Ile Glu Leu Val Thr Lys Val Asp Lys Glu Gly Thr
210 215 220
Ile Arg Leu Val Tyr Asp Gly Glu Pro Thr Phe Ser Tyr Lys Glu His 225 230 235 240
Pro Lys Phe

Claims

Revendications 1) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides conscutiís dc l'enchaînement dc nuciéntides suivant (SEQ ID N 1): TTGGGCCGCCGTAAGGAATGCGTCATGAGCGACTTCGCATCACGGGCGACCAATCATTAATTT GTCAAACCCTTTGAGATGCACTACTTGTCCACATTTTGTACACGAAATACCTAACACACTATG GTGCACATCACGCACTTCCACGTTCCGTATTCGGTGTACGATTTGTCACGCAACTAAGCGTTC AAGAGGGAGTACTATGACTCACCAAAAGTAAAAGATGACATAGAAATAGAAGAGTCGTGGTTC CGGTGCGGGTAGCTCCCGATGGCTTGACTGTGGTAAGCACCAGTGGCGTGTTCCCCGTGGTTG AGACCAGGAAGTTTTAAAGTCCTACAGCCCGCGGTATTCCGCAGAGGACATTGTGTGCATTTC GCACCTTCGGGTGGGAGAAATCGGGATGATCTCACCACCGGCCACCGGGTGGCGCACTTTGTA CCCTTCGATTCCGTTATTCGGCGGATTTAAGCAGTTCGCACCATTACCAAGCAGCCAATGAGG AAGAGCGCAGGTGACTAGGTCGCTTGATCTTTCCCTGTGCAGTAGCTCGGGTTCTTTGAGTTT CGAGGAGGAGAAACCACATGTCCTTTGTGAATGTAGACCCATTTGGATGTTGGCGGCCGTGCG ACACTGGAGTCCCTTGGTTCCCACATGGCGGTAAGCAATGCCGCGGTGGCCTCGGTGACCACC AAGGTTCCTCCCCCGGCCGCCGACTACGTATCAAAAAAGTTATCGCTGTTCTTTAGTAGCCAC GGGCAGCAGTACCAGGTGCAAGCCGCTCGGGCACGGCCTTTCATCGAAATTGGTCCGGACCCT GGGCCGAATTGCGCTTGCGTATGAGGAAGTCGAGAATCGCCAACAACGAAGGTTTCTAACGTG TCGCCAGTTACGCACGAGTGGCTACCAGCGAGTACAAGGGAGTAACGAATTATGCCCAATTTC TGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGTTCTGGCCCGATA CTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACGAAGGTGGGGTTG CAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCAGGCTTTGATACAG CAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACGCCCATAAGACCGCGATC CAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCGGCGATGGTGCCGCCGGCGATG GTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTCGGGCAATTCTCC ACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGACGCGCTAGTGATG GAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTTGAGGATCCACCG GAGATGGCCGACGACTACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGACTATCACAACGAG AACGCAAAAGAGGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGGGGGCCCATCGAA CTCGTAACCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGGGAGCCCACGTTT TCATACAAGGAACATCCTAAGTTTTGATTCGGGAACATCCTAAGAAACGGGGGGCGTCGCCGT TGGAGACGTCGCAACGTGTCCGCAGTCCCAAGGGCAACAGTGAAGGGCCCACGGTGCGATCCC CAACACCCGGCTAGAGTGCGCATAATATTTTCCCGCCTCGGCTCAAGGCGTGCACCCCCATCA CCGCTAACCATGCTGTGTATCAACAGATTTCATTGTCCCGGCCGTCGCGCGACCGACCAATAG GGTGAGTTCCATGTGCGATATCGCCTAACAGCCGGCTCCCGTACTCCCGTGGCCGATGTGATT ATTGATTACGTGGATCACCATGTGGGTGATCGCGGTCGACAGCTTTGGTACCGAGCACATCGC CACAACGCGCGGTACGAATCTAGTACACAAATCCGCACCAGCCGCCATGCGACTTCGCAGGTC ATAGCCCCGCAGAGTCGCCGAACCTGCCGCAGTGACAAAAGTCAGGACGGCCGGCGACGCGTC GAGCCGGGGTTAGGCGCAGTTAACGTCGCAGCGGGGTCCCAGACACGCGTCGGACTTTCGGAC TCAGCCCGACGATTCGCCGTCACACTGCGGGCTTTCCTGCTCTACCAGCAACCCTTGCAOGGC GGAGCCGGTGATGCGCCGGAACGCGCGCCGTGGCCGGTTGGCATCGAGAACGGCCACCTCTAA GCTGGCCACGCCAAGGGTGGGTTGATCACCACCCGAGGTGTCGGCACTGCCGGCCCGCAATGC AGCGACCGCGATACGCAGGGCGTCGGTCAGCCTCGCGTTCTCGGCATACGACTCTTTGAGCCC GTTGGCGATCGGCTCCGTGGTGCCGCCCATCACCACGAAATGCGGCTCGTCGGCGATCGACCC GTCGTAGGTAATACGATACAACTCAGGGCGTTTCGTCTCGCCGTAATGCGCCACCTCGGCCAC ACACAACTCAACCTCGTAGGGCTTGGCCTGTTCGGTGAAGATGGTGCCTAGAGTCTGCGCGTA GACATTGGCCAACTGCCGACCCGTGACGTCACGACGGTCATAGGCGTAACCGCGGGTGTCGGC GAACTGGATCCCGCCGCGGCGCAAATTGTCGAACTCGTTGAACTTGCCCGCAGCCGCAAAACC CACCCGATCGTAGAGCTCACTGATCTTCTGCAG b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a); c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b).

2) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polynucléotide comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de l'enchainement de nucléotides suivant (SEQ ID N 2):

ATGCCCAATTTCTGGGCGTTGCCGCCCGAGATCAACTCCACCCGGATATATCTCGGCCCGGGT

TCTGGCCCGATACTGGCCGCCGCCCAGGGATGGAACGCTCTGGCCAGTGAGCTGGAAAAGACG

AAGGTGGGGTTGCAGTCAGCGCTCGACACGTTGCTGGAGTCGTATAGGGGTCAGTCGTCGCAG

GCTTTGATACAGCAGACCTTGCCGTATGTGCAGTGGCTGACCACGACCGCCGAGCACGCCCAT

AAGACCGCGATCCAGCTCACGGCAGCGGCGAACGCCTACGAGCAGGCTAGAGCGGCGATGGTG

CCGCCGGCGATGGTGCGCGCGAACCGCGTGCAGACCACAGTGTTGAAGGCAATCAACTGGTTC

GGGCAATTCTCCACCAGGATCGCCGACAAGGAGGCCGACTACGAACAGATGTGGTTCCAAGAC

GCGCTAGTGATGGAGAACTATTGGGAAGCCGTGCAAGAGGCGATACAGTCGACGTCGCATTTT

GAGGATCCACCGGAGATGGCCGACGACTACGACGAGGCCTGGATGCTCAACACCGTGTTCGAC

TATCACAACGAGAACGCAAAAGAGGAGGTCATCCATCTCGTGCCCGACGTGAACAAGGAGAGG GGGCCCATCGAACTCGTAACCAAGGTAGACAAAGAGGGGACCATCAGACTCGTCTACGATGGG

GAGCCCACGTTTTCATACAAGGAACATCCTAAGTTTTGA b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini cn a); C) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini cn a) ou avec le polynucléotide défini en b).

3) Polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide P27 d'une mycobactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis.
4) Polynucléotide selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en cc qu'il comprend les signaux pour la régulation et/ou pour l'expression du polypeptide P27 de Mycobacterium tuberculosis.
5) Sonde oligonucléotidique pour la détection spécifique d'un microorganisme appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 8 bases consécutives d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
6) Sonde oligonucléotidique selon la revendication 5, caractérisée en qu'elle comprend un cnclaîncment d'au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon l'une des revendications I à 4.
7) Sonde oligonuléotidique selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que celleci est marquée par un composé radioactif ou par un composé non radioactif.
8) Sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 5 ou 6. caractérisée en ce que celle-ci est immobilisée sur un support, de manière covalente ou noll-covalentc.
9) Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4. î( > ) Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'une séquence du génome et/ou d'une séquence d'ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un microorganisme appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 8 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'au moins 20 bases consécutives d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.
11) Amorce nucléotidique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'une des amorces suivantes - Amorce n0 1: nt 547 à nt 564 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n02 : nt 669 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 3 : nt 554 à nt 571 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n04 : nt 668 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 5 : nt 564 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 6 : nt 667 à nt 650 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 7 : nt 454 à nt 471 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 8 : nt 600 à nt 583 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 9 : nt 571 à nt 589 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 10 : nt 686 à nt 667 de la SEQ ID N 2(amorce retour); - Amorce n Il: nt 572 à nt 589 de la SEQ ID N02 (amorce aller); - Amorce n 12 : nt 686 à nt 668 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 13 : nt 574 à nt 591 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 14 : nt 573 à nt 591 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 15 : nt 566 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 16 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 17 : nt 567 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 18 : nt 666 à nt 646 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 19 : nt 564 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n020 : nt 575 à nt 592 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n021 : nt 352 à nt 369 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 22 : nt 594 à nt 577 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n023 : nt 687 à nt 668 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 24 : nt 424 à nt 441 de la SEQ ID N 2 (amorce aller): - Amorce n 25 : nt 600 à nt 583 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n026 : nt 414 à nt 431 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n027 : nt 668 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n028 : nt 422 à nt 439 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 29 : nt 584 à nt 567 de la SEQ ID N 2 (amorce retour): - Amorce n 30 : nt 419 à nt 436 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n03 1 nt 577 à nt 595 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n032 : nt 601 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 33 : nt 451 à nt 470 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 34 : nt 670 à nt 651 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 35 : nt 447 à nt 466 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 36 : nt 713 à nt 696 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 37 : nt 563 à nt 582 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 38 : nt 673 à nt 655 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n039 : nt 577 à nt 594 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n 40 : nt 689 à nt 671 de la SEQ ID N 2 (amorce retour); - Amorce n 41: nt 422 à nt 439 de la SEQ ID N 2 (amorce aller); - Amorce n042 : nt 601 à nt 584 de la SEQ ID N 2 (amorce retour);
12) Couple d'amorces nueléotidiques, caractérisé en ce qu'il est constitué de deux amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 9 à 11.
13) Couple d'amorces selon la revendication 12, caractérisé en ce quil s'agit des couples suivants - Couple P1 : Amorce n 1 et Amorce n 2; - Couple P2 : Amorce n 3 et Amorce n 4; - Couple P3 : Amorce n 5 et Amorce n 6 - Couple P4 : Amorce n 7 et Amorce n 8; - Couple P5 ; Amorce n09 et Amorce n 10; - Couple P6 : Amorce n 11 et Amorce n 12; - Couple P7 : Amorce n013 et Amorce n 12; - Couple P8 : Amorce n 14 et Amorce n 10; - Couple P9 : Amorce n 15 et Amorce n 16; - Couple P10 : Amorce n 17 et Amorce n 18; - Couple PI 1 Amorce n019 et Amorce n 18; - Couple P12 : Amorce n 20 et Amorce n 10; - Couple Pl 3 Amorce n021 et Amorce n 22; - Couple P14 : Amorce n 20 et Amorce n 23; - Couple P15 : Amorce n 24 et Amorce n 25; - Couple P16 : Amorce n 26 et Amorce n027; - Couple P 1 7 : Amorce n 28 et Amorce n 29; - Couple P18 : Amorce n 30 et Amorce n 22; - Couple P19 : Amorce n 31 et Amorce n 10; - Couple P20 : Amorce n 7 et Amorce n 32; - Couple 1'91 : Amorce n 33 et Amorce n 34; - Couple P22 : Amorce n035 et Amorce n 36; - Couple P23 : Amorce n 37 et Amorce n038; - Couple P24 : Amorce n039 et Amorce n040; - Couple P25 : Amorce n041 et Amorce n 42; 14). Amorce nucléotidique pour la mise en oeuvre d'une amplification d'ADN par déplacement de chaîne, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une amorce selon l'une des revendications 9 à 13, couplée, le cas échéant, à un oligonucléotide contenant un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction.

15). Amorce nucléotidique selon la revendication 14, caractérisée en ce que le site de reconaissance pour une endonucléase de restriction est un site de reconnaissance pour l'enzyme Hindi.

1 6). Amorce nucléotidique selon la revendication 14, caractérisé en ce que le site de reconaissance pour une endonucléase de restriction est un site de reconnaissance pour l'enzyme Bso BI.

17). Amorce nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14 et 16,caractérisée en cc qu'elle est sélectionnée parmi les oligonucléotides suivants B 1 a: GAGATGGCCGACGAC 139a CCCATCGTAGACGAG

S1a: ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCTCAACACCGTGTTC

S2a: CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTCTTTGTCTACCTTG 132h: CCCCCTCTCCTTGTT

S2b: CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGATGGATGACCTCC d:ïns lesquels les séquences soulignées correspondent aux séquences spécifiques du gêne p27 de M. tuberculosis et les séquences en caractères gras correspondent aux sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction Bso BI.

18). Polypeptide de mycobactérie, caractérisé en ce qu'il est présent chez les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuherculosis et en ce qu'il posséde un poids moléculaire de 27 kilodaltons +/- 10% et un point isoélectrique de 4,5 +/- 1,5 19) Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N 3 suivante

MPNFWALPPEINSTRIYLGPGSGPILAAAQGWNALASELEKTKVGLQSALDTLLESYR

GQS SQALIQQTLPWQWLTTTAEHAHKTAIQLTAAANAYEQARAAMVPPAMVRAN R

VQTTVLKAINWFGQFSTRIADKEADYEQMWFQDALVMENYWEAVQEAIQSTSHFED

PPEMADDYDEAWMLNTVFDYHNENAKEEVIHLVPDVNKERGPIELVTKVDKEGTIRL

VYDGEPTFSYKEHPKF b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27. c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b) au moins une mofidication par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide P27.
20) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'un des revendiactions 18 ou 19.
21) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression et/ou d'insertion caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'acide nucléique ou un ADN selon l'une des revendications 1 à 4 et 20.
22) Vecteur recombinant selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pMTOS contenu dans la souche de E. coli TGMTOS, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1-1786.
23) Hôte recombinant, caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une des revendications I à 4 et 20 ou un vecteur selon l'une des revendications 21 et 22 24) Hote recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche de

E coli TGMT05, déposée à la CNCM le 19 novembre 1996 sous le numéro 1- 1786.
25) Polypeptide recombinant selon l'une des revendications 18 et 19, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte recombinant selon l'une des revendications 23 ou 24.
26) Protéine hybride, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins la séquence d'un polypeptide selon l'une des revendications 18 et 19 et une séquence d'un peptide ou d'une protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal.
27) Protéine hybride selon la revendication 26, caractérisée en ce que le peptide ou la protéine susceptible d'induire une réponse immunitaire contient au moins un déterminant antigénique capable d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire.
28) Protéine hybride selon la revendication 27, caractérisée en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de la protéine de 45/47 kD de

Mycobacterium tuberculosis.
29) Protéine hybride selon la revendication 27, caractérisée en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de l'antigène de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite ou de l'antigène VPl du virus de la poliomyélite.
30) Protéine hybride selon la revendication 27, caractérisée en ce que le déterminant antigénique est constitué de tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi les protéines gag, pol, nef ou env de HIV-I ou HIV-2.
31) Polynucléotide codant pour une protéine hybride selon l'une des revendications 26 à 30.
32) Protéine hybride selon l'une des revendications 26 à 30 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine recombinante obtenue par l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 3 1.
33) Anticorps polyclonal ou monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 18,19 et 25 à 30.
34) Anticorps selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps marqué.
35) Composition immunogéne caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon la revendication 18 et/ou une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 25 à 30.
36) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon I'une des revendications 18 ou 19 et/ou une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 25 à 30, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant un adjuvant de l'immunité approprié.
37) Vaccin destiné à l'immunisation à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou l'hépatite, comprenant un vecteur contenant un polynucléotide selon la revendication 20 ou un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 31, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.
38) Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe

Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 5 à 7

avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le

cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions

permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe

tfycobacterium tuberculosis;

b) Détection de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de

l'échantillon biologique.

9) Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe

Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique. caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) Nolise en contact d'une sonde olieonucléotidique immobilisée sur un support selon la

revendication 8 avec un échantillon biologique. l'ADN dc l'échantillon, ayant. Ic cas

ecl0éant. été préalablement rendu accessible a l'hybridation. dans des conditions

permettant l'hybridation de la sonde à @@ADN d'une bactérie du complexe

Mycobacterium tuberculosis;

b) Mise en contact de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique immobilisée sur

un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique. le cas échéant après

élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde,

avec une sonde oligonucléotidique marquée selon la revendication 7.
40) Procédé de détection selon la revendication 39, caractérisé cn ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'une des revendications 12 ou 13.
41) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon l'une des

revendications 12 ou 13, I'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant,

préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une

hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium

tuberculosis;

b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;

c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment

encadré par les arnorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une

sonde oligonucléotidique marquée selon l'une des revendications S à 7.
42) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuherculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec deux couples d'amorces selon l'une

quelconque des revendications 14 à 16, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le

cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions

permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe

Mycobacterium tuberculosis;

b) amplitication de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuhercl(lo.si.s;

c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment

encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une

sonde oligonucléotidique marquée selon l'une des revendications 5 à 7.
43) Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique. caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des

revendications 33 ou 34;

b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.

A4) Procédé d'expression d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 19 ou 32, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

a) insertion d'un polynucléotide selon l'une des revendications I à 4, 20 ou 31 dans un

vecteur d'expression, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle de signaux de

régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote;

b) transformation de l'hôte cellulaire par le vecteur d'expression obtenu à l'étape a);

c) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à

l'étape b);

d) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire

transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucléotide porté par le

vecteur recombinant.
45) Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe

Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants

a) Une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 5 à 7;

b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation;

c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des revendications 12 ou 13 ainsi

que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN (ADN génomique,

plasmidique ou ADNc) d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.

46 Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d UllC bactérie du complexe

Mycobacterium tuberculo.si.s dans un échantillon biologique. caractérisé en cc qu'il comprend les éléments suivants

a) Une sonde oligonucléotidique. dite sonde de capture, selon la revendication 8;

b) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, selon l'une des

revendications 5 à 7.

c) Lc cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des revendications 12 ou 13 ainsi

que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification dc 'ADN d'une bactérie du

complexe Mycobacterium tuberculosis.
47) Kit ou nécessaire pour l'amplification de I'ADN d'une bactérie du complexe ,Itycohactcrium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants

a) Un couple de fragments d'acide nucléique selon l'une des revendications 12 ou 13;

b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN;

c) Eventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment

amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon l'une des

revendications 5 à 8.
48) Kit ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'une des revendications 33 ou 34; b) Le ces échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps formé.
49) Kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe

Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants

a) Deux couples d'amorces selon l'une des revendications 14 à 17;

b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN;

c) Eventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment

amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon l'une des

revendications 5 à 8.