JPH10506521A

JPH10506521A - ヘリコバクターピロリニッケル結合タンパク質

Info

Publication number: JPH10506521A
Application number: JP8500888A
Authority: JP
Inventors: アンドリュージー．プロート; ジョアンヌブイ．ギルバート−ロステイン; アンドリューライト
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-05-09
Publication date: 1998-06-30
Also published as: US5780040A; EP0770092A4; CA2192312A1; US5972348A; EP0770092A1; WO1995033767A1

Abstract

(57)【要約】本願は、ヘリコバクターピロリから単離されたニッケル結合タンパク質及びそれをコードするDNAに関する。該生物は、慢性胃炎およびそれに続く消化性潰瘍の第一原因であり、胃癌に関与している。ニッケル結合タンパク質は、細菌の病原性に関与する酵素である活性型ウレアーゼの組立を阻害するのに有用である。可能な用途としては、ワクチンとして、診断薬として、薬物標的として、および治療薬としての用途が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクターピロリニッケル結合タンパク質発明の背景本発明の領域は、胃疾患及びニッケル関連疾患の診断、予防、および治療、ならびに非臨床的なニッケルの無毒化である。本発明はまた、細菌ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）にも関する。細菌ヘリコバクターピロリは、1983年にヒト胃粘膜から最初に単離され、キャンピロバクター（Campylobacter）属に属すると同定された（C.ピロリ（C.pylor i）またはC.ピロリディス（C.Pyloridis）のいずれか; Warren and Marshall,La ncet I:1273,1983; Marshall and Goodwin,Int.J.Syst.Bacteriol.37:68,1987）。H.ピロリは、病原体として認識されており、慢性胃炎、胃粘膜の炎症、および消化性潰瘍の第一原因である。それはまた、癌の発現の原因ともなる（総説について、シッポネン（Sipponen）ら、”ヘリコバクターピロリ感染の歴史及び超微細構造：胃炎、十二指腸炎、および消化性潰瘍、ならびにそれらに関連する前癌性の状態（Histology and Ultrastructure of Helicobacter pylori Infections : Gastritis,Duodenitis,and Peptic Ulceration，and Their Relevant Precanc erous Conditions）”、ヘリコバクターピロリ：生物学および臨床の実際（Heli cobacter pylori: Biology and Clinical Practice 37）、グッドウィン（Goodw in）およびワースレイ（Worsley）編、1993年を参照）。 H.ピロリは、胃の高度に酸性の環境で生存することができるが、その少なくとも一部の理由は、内因性の尿素をアンモニアおよび二酸化炭素に加水分解することによって局所的な環境のpHを高めることができる高いウレアーゼ活性である。アンモニア成分はpHに影響を与え、その局所における蓄積が周辺の粘膜に直接毒性の効果を及ぼすと考えられる。ウレアーゼ活性は、細菌の主要な性質の一つである。H.ピロリのウレアーゼの特徴はよく同定されており、高分子量（550kDa）の多量体酵素である。二つの基本的なサブユニット、UreA（66kDa）およびUreB（29.5kDa）が存在し、これらが結合してより大きいサブユニットを形成し、最終的にはそれが6個結合して完全なタンパク質が形成される。H.ピロリのウレアーゼ酵素は、その他の細菌種のウレアーゼ、および植物（例えばタチナタマメ）のウレアーゼと相同性がある。現在までに研究されたウレアーゼには全てニッケルが含まれており、H.ピロリウレアーゼは、一分子当たり5.21個のニッケル原子を含むことが示されている。 H.ピロリのウレアーゼ活性は、酵素の活性部位におけるニッケルイオンの利用可能性に左右される。高レベルのタンパク質を産生する大腸菌でクローニングされた酵素は、大腸菌の培養培地にニッケルイオン源（典型的にはNiCl₂の形態で）を供給した場合にのみ、ウレアーゼ活性を発揮する。このニッケルは、酵素合成の間に存在する必要があり、タンパク質が完全に合成された後には取り込まれない。また、活発にニッケルイオンとキレートを形成するアミノ酸、ヒスチジンまたはシステインは、大腸菌で発現されるクローニングウレアーゼタンパク質へのニッケルの取り込み又は進入を阻害する。したがって、細胞をヒスチジン及びシステインが多く含まれる栄養培地中で培養した場合には、組換えウレアーゼの活性は低くなる。H.ピロリによる、または構造上のウレアーゼサブユニットによるニッケル取り込みの機構はまだ解明されていない。アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のUreD補助遺伝子産物、またはクレブシエラ・エアロゲネス（Klebsiella aerogenes）およびP.ミラビリス（P．mirabilis）のヒスチジンを多く含むUreE遺伝子産物のように、数種の微生物において、ウレアーゼ構造遺伝子付近の補助遺伝子がニッケル取り込みに関与していると推定されているが、これらのいずれもまだ証明はされていない。生物のニッケル取り込み及びウレアーゼのニッケル取り込みの別の機構が存在する可能性もある。発明の概要一般的に、本発明は、配列番号：1のアミノ酸配列を含み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）に基づき約14kDaのモノマーの分子量を有する、実質的に純粋なヘリコバクターのニッケル結合タンパク質を特徴とする。該タンパク質はさらに、4.5および8の間のpH値で、最適にはpH6〜8で、ニッケルと非共有結合により結合することを特徴とする。もう一つの面において、本発明は、ニッケル結合タンパク質の生物学的に活性な断片を特徴とする。「生物学的に活性な断片」とは、全長の天然のタンパク質の生理学的な効果（例えば、生物学的基質への結合、抗原反応の惹起など）を発揮することができる断片を意味する。また、配列番号：1と実質的に同一なポリペプチドも特徴とする。「実質的に同一な」とは、保存的なアミノ酸置換、または一つ又は複数の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。保存的なアミノ酸置換とは、例えば、同じクラスの一アミノ酸と別のアミノ酸との置換（例えば、バリンとグリシンとの置換、アルギニンとリジンとの置換など）であり、非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入とは、ポリペプチドの生物学的な機能を損なうことのないアミノ酸配列部位に位置するものである。またこれには、ポリペプチド中の共有ペプチド結合の代替的な結合への置換も含まれる。「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば糖付加またはリン酸化）に無関係に、全てのアミノ酸鎖を意味し、「タンパク質」という用語と交換可能に用いることができる。本発明はまた、抗原性を有するニッケル結合タンパク質の断片を特徴とする。本明細書で用いられるように「抗原性」という用語は、特異的な免疫原性の反応、例えばニッケル結合タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、または細胞傷害性リンパ球を誘導する免疫原性の反応を引き起こすことができるタンパク質の断片をさす。断片は、好ましくは少なくとも8アミノ酸の長さである。好ましい態様において、断片は、ニッケル結合タンパク質のニッケル結合ドメインを含む。「ドメイン」とは、ニッケルイオンの結合に直接関与するタンパク質中のアミノ酸領域を意味する。本発明のニッケル結合タンパク質の由来は、天然であっても、組換えであってもよい。もう一つの面において、本発明は、ニッケル結合タンパク質をコードする核酸配列（配列番号：2および3）、その縮重変異体、または24個の連続ヌクレオチド以上の長さのそれらの一部を特徴とする。「縮重変異体」とは、遺伝コードの縮重のために天然の配列とは異なるが、本発明のニッケル結合タンパク質、又は実質的に同一なポリペプチドをコードする全てのヌクレオチド配列を意味する。本発明は、本発明のタンパク質または断片に特異的に結合する抗体を特徴とする。本発明のもう一つの面は、患者から生物学的試料（例えば、血清、胃分泌物、または生検材料）を採取しヘリコバクターの存在を試験する、患者におけるヘリコバクター感染を検出する方法を特徴とする。好ましい態様において、ニッケル結合タンパク質またはその抗原性断片を基質として用いて（例えば、ウェスタンブロッティングにより）、H.ピロリニッケル結合タンパク質に結合する抗体が検出される。患者に該抗体が存在することは、ヘリコバクター感染の指標となる。もう一つの態様において、感染の検出を、ニッケル結合タンパク質それ自体の存在を検出することにより、または（例えば、 PCR増幅またはドットブロッティングにより）ニッケル結合タンパク質をコードするDNAの存在を検出することにより行うことができる。本発明はまた、本発明のニッケル結合タンパク質または該タンパク質のニッケル結合ドメインを、好ましくは経口投与または全身投与により患者に投与することにより、治療（例えば消化性潰瘍、胃炎、またはニッケル毒性の治療）、または予防（例えば消化性潰瘍または胃炎の予防）を目的として、患者体内の遊離のニッケルイオンを結合する方法を特徴とする。本発明はまた、ヘリコバクターのようなニッケルを必須とする病原性細菌が感染することから引き起こされる、患者における胃腸組織損傷の予防または改善する方法を特徴とする。本方法は、本発明のニッケル結合タンパク質に結合する特異的抗体を患者に投与し、それにより宿主における病原性細菌を結合し、中和することを含む。本発明はまた、本発明のタンパク質または可溶性断片に溶液を接触させて金属 −タンパク質複合体を形成させ、それからそれを溶液から除去することによる、水溶液からのニッケルイオンの除去を特徴とする。「水溶液」とは、pHを4〜8の範囲に滴定することができる水と混和性の全ての溶液を意味する。該溶液には、例えば⁶³Niのような放射性同位元素を含む、水溶性の実験廃棄物が含まれる。本発明のもう一つの面は、本発明のニッケル結合タンパク質または断片と相互作用する能力をアッセイすることにより、治療剤として使用できる可能性について化合物をスクリーニングする方法である。本方法は、被験化合物をタンパク質または断片と混合し、次に該タンパク質をニッケル結合樹脂に接触させ、該タンパク質がニッケルに結合するか否かを判定することにより、ニッケル結合能をアッセイすることを含む。本発明はまた、ヘリコバクターによる感染に対して患者を種痘する方法を特徴とする。本方法は、患者において免疫原性の反応（例えば、抗体の生成、細胞傷害性リンパ球の刺激）を発揮するための量で、適当な賦形剤中の配列番号：1のタンパク質または断片を患者に投与することを含む。本発明のもう一つの特徴は、本発明のニッケル結合タンパク質またはDNAの（転写または翻訳の機構による）合成を阻害することにより胃組織損傷を軽減するよう設計された治療方法である。本方法は、ヘリコバクターに感染した患者へ、本発明のDNAに対するアンチセンス分子を投与することを含む。「アンチセンス」とは、本発明の二本鎖DNAのコーディング鎖の一部の反対側の相補鎖である10 ヌクレオチドまたはそれ以上を含む分子を意味する。本発明は、従来の診断法および予防法より優れた利点を有し、様々なニッケル関連疾患、最も注目すべきはヘリコバクターピロリ感染およびニッケル毒性のための新規な治療薬および診断薬を開発する機会を提供する。例えば、H.ピロリ感染を診断することができる現在入手可能な試験法が存在する。これらは、ウレアーゼ活性のアッセイに基づいている。本発明の方法により試験するための血清試料を得ることは、使用可能な胃組織試料を得るよりも容易であるため、本発明はこれらの方法よりも優れている。本発明のニッケル結合タンパク質には、その他の使用法もある。例えば、H.ピロリ感染を予防するためのワクチンとして、又は粘膜における遊離のニッケルイオンの取り込みをH.ピロリウレアーゼと競合し、集合したウレアーゼの活性を減少させるための該感染症の治療剤として、使用することができる。また、ニッケル結合タンパク質に対する抗体は、ヘリコバクターのウレアーゼへのニッケル取り込みを阻害するために用いることができる。さらに、本ポリペプチドまたはニッケル結合断片は、（例えばニッケル中毒において）過剰のニッケルイオンを結合するための解毒剤として全身的に使用することができる。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求の範囲から明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図1：ニッケル結合タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列である。下線の領域は、配列決定されたトリプシンによる断片である。a)は消化されないニッケル結合ポリペプチドのＮ末端配列（AHHEE）であり、b)はトリプシンによるピーク37（ HHEEQHGGHHHHH ）であり、c)はトリプシンによるピーク14（T HHQEEG (S )HGHHE）である。図2：ヘリコバクターに感染した患者および感染していない患者からの血清のウェスタンブロットである。詳細な説明 H.ピロリは、活性な酵素を合成するために、ウレアーゼ合成の間にニッケルイオンを必要とする。既知のニッケル結合ウレアーゼ補助遺伝子と有意な相同性は示さない、ヘリコバクターの高度に発現したニッケル結合タンパク質が、本明細書に開示される。該タンパク質は、吸着樹脂の形態で固定化されたニッケルイオン（Ni-NTA樹脂；キアゲン社（Qiagen Inc.）、米国）へとヘリコバクタータンパク質を吸着させることにより、選択的に単離された。対応するDNAクローンが同定され、その配列が決定された。該DNAは、H.ピロリの培養試料において大量に転写され、おそらく局所的な環境から遊離のニッケルイオンを除去するために、または活性型ウレアーゼを組み立てる機能的な段階において、生物により利用される。それは、豊富に存在するため、ヒト患者におけるH.ピロリ感染の診断および抑制のための標的として好適である。本発明の製造法および使用法を以下に詳細に説明する。ヘリコバクターピロリの培養ヘリコバクターピロリ株は、以下の3つの方法のうちの一つにより培養した。 1）10％のヒツジ血液および抗生物質（バンコマイシン、ポリミキシン、およびトリメトプリム）を添加したヒツジ血液寒天プレート（キャンピアガー・スキロー（Caulpyagar Skirrow）、ディフコ社（Difco,Inc））上で、標準的な方法を用いて接種し、37℃でインキュベーションを行う。 2）キャンピアガー様プレートに、0.1〜0.2％のシクロデキストリンを添加した10mlの液体ブルセラブロス（Brucella broth）を重ねることを含む、二相培養法（biphasic culture method）。細胞をプレートに加え、キャンピパック（Cam py Pak）（Becton Dickinson Microbiology Systems）中で微好気性の条件下で37℃ で培養しながら穏和に攪拌する。 3）トーション容器（torsion jar）中で、同じく微好気性の条件下で、細胞を 0.1〜0.2％のシクロデキストリンおよび抗生物質を含むブルセラブロス中で培養する。いずれの培養法を用いても、ニッケル結合タンパク質が相当量で産生される。細胞の回収およびタンパク質の単離寒天プレート培地を削り、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で溶離することにより、細胞を得た。次に、細胞を遠心分離し（5,000RPM）、PBSで一回洗浄した。液体培地から細胞を遠心沈降させ、PBSで一回洗浄した。遠心分離したペレット中の細菌を緩衝液B（8M尿素、10mM Tris-HCl、100mMリン酸ナトリウム）に再懸濁させた。溶液は、細胞が溶解する、pH8.2に調整した。遠心分離により、細胞溶解物から不溶性の物質をペレットにし、上清（ヘリコバクタータンパク質およびDNAが含まれる）を再び遠心分離し、微粒子を完全に除去した。清澄な上清へ15μlのNi-NTA樹脂（キアゲン社、米国）を添加した。この樹脂は、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを行うためのもので、ニッケルイオン（Ni２＋）により荷電したニトリロートリ酢酸（nitrilo-tr iaceticacid）、従ってNi-NTAである。この系において、NTAは、Ni²⁺イオンの配位領域内の6個のリガンド結合部位のうち4個に結合し、2つの部位はニッケル結合タンパク質と相互作用できるように未結合の状態になっている。この吸着樹脂は、目的の組換えタンパク質に6×Hisテールを結合させ、キアゲン樹脂へのアフィニティ結合により単離することを含む、キアゲン系によりクローニングされたタンパク質の単離、という他の目的においても同様に使用されている。ニッケル結合タンパク質を樹脂に結合させるため、混合液を、室温で 30分間エンド・オーバー・エンド（end-over-end）攪拌（１分間に10振幅）によりゆっくり混合した。次に樹脂を遠心分離により安定させ、緩衝液C（上記の緩衝液B と同一、ただしpH6.3に調整した）で4回洗浄した。この処理により、樹脂に対する結合親和性の低いタンパク質が溶出する（クレブシエラ（Klebsiella）の補助ウレアーゼタンパク質ureEを精製するためにも同様の方法が試されたが、結果は得られなったことに注意せよ）。不要なタンパク質を含む上清は廃棄した。ほとんど乾燥した樹脂を0.1M EDTAを含む緩衝液C中に再懸濁させ、SDS-PAGE試料緩衝液を加えることにより、ニッケル結合タンパク質を放出させた。それから、この混合液を7分間加熱して、ニッケル結合タンパク質が除去された不溶性樹脂を遠心分離により除去した。ニッケル結合タンパク質を含む上清を、15％SDS-PAGEゲルで還元条件下で電気泳動させた。タンパク質を同定するために、クーマシーブルーでゲルを染色した。この時点におけるタンパク質は、高度に濃縮され、精製されているが、他の未同定のタンパク質を極微量含んでいる可能性がある。アミノ酸分析のためタンパク質を完全に単離するために、他の微量タンパク質を残して、それを未染色のゲルから切り出した。タンパク質は、指標として典型的な分子量マーカーを用いて位置を決定した。それから、それを電気穿孔法により溶出させた。ニッケル結合タンパク質を含む切り取ったゲルをトリス／グリシン緩衝液中に置き、3500kDa のカットオフ値を有する透析チューブに入れた。4℃、100ボルトで2時間、ゲルからタンパク質を電気溶出させた。この後、透析チューブの一端を開封し、ゲル片を取り出し、タンパク質を含む液を4℃で一晩、0.05％SDS/5.0mM炭酸水素(-HC O₃)アンモニウムに対して透析した。それから、内容物を透析チューブから取り出し、マイクロフュージ遠心チューブ中に入れ、各チューブ内の容量が50μlに減少するまで、スピードバック（Spe edVac）中でエバポレーションにより濃縮した。次に、タンパク質を沈殿させるため、50μlのタンパク質溶解液に450μlのアセトンを添加した。この沈殿物を、-20℃で一晩保存した。沈殿したタンパク質物質を遠心分離し、アセトンで洗浄し、再び遠心し、そして空気乾燥によりアセトンを除去した。それから、沈殿物を、8M尿素および0.4M炭酸水素アンモニウム、pH8.0を含む溶液50μl中に再懸濁させた。この溶液の5μlを、予めメタノール、次に水で湿らせたイモビロンP メンブレン（Immobilon P membrane）に載せた。タンパク質を吸着しているこのメンブレンを、水で5回洗浄し、アミノ酸分析に使用した。アミノ酸分析上記のようにしてH.ピロリから精製されたニッケル結合タンパク質のアミノ酸分析を、以下の表1に示す。ヒスチジン含量は30モル％であることが示された。標準の分子量マーカーと比較したSDS-PAGEゲル中の移動度による分子量は14kD aであった。この分子量は、一単位のポリペプチドのものであり、従って、ニッケル結合タンパク質がヘテロポリマーまたはホモポリマーであるなら、14kDaとはそのサブユニットの大きさである。精製の過程で示されたように、一つのサブユニットは単独でニッケルに結合する能力を有する。精製されたタンパク質についてアミノ末端分析を行ったが、保護されていることが明らかとなった。内部の残基を調べることができるように、タンパク質のトリプシン消化を利用した。還元され、アルキル化されたタンパク質を修飾トリプシン（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim））で消化し、断片をH PLCで分離した。ピークを同定し、3つの断片をエドマン型アミノ末端分析に供した。配列を決定した断片を図1に示す。このニッケル結合タンパク質は、米国および日本で異なる患者から単離された 10個のH.ピロリ株の全てに見出された。ケナガイタチ（ferret）から得られた二つのH.ムスタレ（H.mustalae）株では、ゲル上に、幾分幅広の、しかしほとんど同じ大きさのタンパク質が観察された。DNA クローンの単離プラスミドベクターでゲノムDNAライブラリーを構築した。大腸菌をDNA含有プラスミドに形質転換し、選択培養し、ポリペプチドを発現させた。一次抗体としてポリペプチドに特異的なヒト抗体を用いて、修飾ウェスタンプロトコルにより、ニッケル結合ポリペプチドを発現しているコロニーを検索した。コロニーをニトロセルロース上にブロットし、5％SDS中に浸したフィルター紙上で溶解させた。メンブレンを100℃で15分間加熱し、続いてDNAseおよびPMSFを含む5％BSA/PBS中で１時間インキュベーションを行った。メンブレンを洗浄し、トランスファーアセンブリ（transfer assembly）中に入れ、トリス／グリシン／メタノール緩衝液中で50Vで1時間電気泳動させた。その後、特異的抗体を用いてメンブレンを検索することができた。特異的抗体を調製するため、Ni-NTAを用いて精製したニッケル結合ポリペプチドを、15％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、イモビロンPメンブレンへとエレクトロブロットした。メンブレンをPBS/１％BSA溶液でブロックし、それからELISAアッセイによりヘリコバクター感染陽性と判定された患者からの血清とともにインキュベートした。室温で3時間インキュベーションを行った後、メンブレンをPBS/0.5％ツイーン20で十分に洗浄した。pH2.6の0.1Mグリシン緩衝液を用いてメンブレンから特異的抗体を溶出した。その後、その溶出液を1MトリスpH8を用いて中性pHに滴定した。シグマ抗ヒトIgGアルカリホスフアターゼ複合体を二次抗体として用い、ホスファターゼの発色基質でブロットを可視化した。約6000コロニーをスクリーニングし、10個のおそらく陽性のクローンを同定および単離した。2個のクローンをさらに精製した。クローン番号1は、ヘリコバクターDNAの710bp断片を有しており、当技術分野において既知のジデオキシチェーンターミネーション法（シーケナーゼ2（Sequenase 2）、USB）によりその配列を決定した。クローニングされたDNA（配列番号３）によりコードされるニッケル結合タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号1）を図1に示す。タンパク質発現クローニングされたDNAは、組換えニッケル結合タンパク質を合成するため、大腸菌のような宿主細胞を形質転換するために用いられる発現ベクターへ挿入することができる。発現法は、当業者に周知である。抗体の作製ニッケル結合タンパク質またはその抗原性断片を、従来の方法を用いて抗体を作製するために用いることができる。抗原性断片を用いる場合、それらは、（例えば、コンピテント細菌細胞の形質転換の前に）目的のアミノ酸をコードするDN A部分（24またはそれ以上のヌクレオチド）のみをベクターに導入することにより、上記と同様の組換え法を用いて作製することができる。また、組換え体であっても野生型であっても、完全なタンパク質を特異的なプロテアーゼで消化し、 8またはそれ以上のアミノ酸の抗原性断片を得ることができる。抗血清は、組換え体または野生型の精製されたタンパク質を免疫原として用いることにより、当業者に周知の方法により作製することができる。抗血清を採取し、既知の方法を用いて特異性についてスクリーニングする。天然の抗血清はH.ピロリに感染したヒト患者から採取され、本発明のニッケル結合タンパク質に対する抗体はホール（Hall）ら（Nature 311:379,1984）の方法に従い単離された。モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法を用いて（例えば、Coligan et a l.,eds.Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,1992; Kohler et al.,Nature 256:495,1975; Hammerling et al.,in Monoclonal Antibodies a nd T Cell Hybridomas,Elsevier,NY,1981）、免疫したマウスの脾臓からの免疫B 細胞を不死化細胞と融合させ、各抗体を特異的に分泌するハイブリドーマを作出することにより作製できる。発明の利用診断薬として本発明の適用の一つは、患者が免疫反応を起こすのに十分な程度にH.ピロリに侵されているか否かを確認するための、診断用手段としてのものである。現在の技術により、本発明のこの面を短期間のうちに臨床的に利用できるようにすることができ、それは患者から簡便に血液を採取するだけでよいという点で従来のH. ピロリ感染の試験法よりも利点を有している。実施例： H.ピロリに感染している患者および感染していない対照の患者から、血清を得た。H.ピロリから精製されたニッケル結合タンパク質を、ウェスタンブロット解析のためにメンブレン上に固定化した（Sambrook，et al．上記）。患者の血清を1:400に希釈して、ニッケル結合タンパク質のウェスタンブロットにおいて試験した。ウェスタンブロット解析により、H.ピロリ感染ヒト血清中にニッケル結合タンパク質に対する抗体が同定された。対照の血清については、反応するとしても、その反応は極めて微弱であった（図2）。ワクチンとして上記の実施例は、H.ピロリのニッケル結合タンパク質が、感染の間、抗原性を有するということを示しており、したがって、本発明における該タンパク質のもう一つの用途は、ヘリコバクター感染に対するワクチンとして、というものである。精製されたポリペプチドまたはその抗原エピトープは、（当業者に既知の方法を用いて）ワクチンに適当な組成物と混合し、患者に接種してH.ピロリ感染に対する防御を与える免疫原性の反応を誘導するために用いることができる。ポリペプチドのいかなる部分も有効であるが、特にタンパク質が4次または3次構造へと折り畳まれた際に表面に露出される領域、およびそれゆえにニッケル結合領域が、必ずしも、本発明の態様にとって最も重要な領域であるとは限らない。治療薬として本発明のタンパク質はまた、ニッケル中毒（しばしば工業地域でみられる）のような該イオンの過剰を治療するために、または胃粘膜において内因的に供給されるニッケルイオンとの結合をH.ピロリと競合するために、体内の遊離のニッケルイオンを捕捉する手段として機能することができる。全長タンパク質までを含む、より大きい断片も可能であるが、タンパク質のニッケル結合ドメインが、唯一の必須の成分である。経口投与されると、ニッケル結合ポリペプチドは、H.ピロリがコロニーを形成した胃内の環境まで到達し、生物が本来有するニッケル捕捉機構と無毒性に競合する。ニッケルはウレアーゼの活性にとって必要であり、ウレアーゼ活性（及びその結果生じるアンモニア産物）は胃炎および消化性潰瘍の原因となっているため、遊離のニッケルが不十分になれば、ウレアーゼの活性が失われるか、または微弱となる。これには、胃炎および消化性潰瘍を予防又は軽減する効果がある。胃内におけるタンパク質の消化を最小限にするために、一つ又は複数のペプチド結合を、胃に共通のペプチダーゼによる切断を受けにくい別の型の共有結合（「擬ペプチド(peptide mimetic)」）と置換した組換えペプチドを作製することができる。患者へ投与した後のペプチドのタンパク分解が問題となる場合には、特に切断されやすいペプチド結合を非分解性の擬ペプチドで置換することにより、ペプチドの安定性を増大させることができる。このような擬ペプチド、およびそれをポリペプチドに取り込ませる方法は、当技術分野において周知である。同様に、L-アミノ酸残基の置換は、ポリペプチドのタンパク分解に対する感受性を減ずるための標準的な方法である。また、t-ブチロキシカルボニル基、アセチル基、テイル基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、スベリル基、アジピル基、アゼライル基、ダンシル基、ベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、メトキシアゼライル基、メトキシアジピル基、メトキシスベリル基、および2,4-ジニトロフェニル基のようなアミノ末端保護基も有用である。後者の方法には、組換え技術ではなく、ポリペプチド合成が必要である。ニッケルのキレート化および除去は、さらに、粘膜に対して保護効果を有する可能性がある。タンパク質に結合したニッケルイオンは、細胞に対して周知の悪影響を及ぼし、核酸、タンパク質、および脂質に損傷を与える、フリーラジカル源となりうる（総説について、Sunderman（1987）Toxicological and Environmant al Chemistry,15:59を参照）。コーヒー、茶、およびチョコレートなどの通常の食事からのニッケル源は、消化された後にフリーラジカルを生じるために、潰瘍の患者に苦痛を与えると考えられる。したがって、アンモニア（活性型ウレアーゼ）源と同様に、組織損傷のフリーラジカル源を減少させることが有用であることは、容易に理解されるであろう。本発明の分子はさらに、アンチセンス療法として治療に使用することが可能である。アンチセンス分子は、本発明のDNAのいかなる部分に対しても標準的な合成法を用いてを作製することができ、ヘリコバクターのニッケル結合タンパク質の転写および／または翻訳を阻害することにより胃組織損傷を軽減するために患者に投与することができる。問題としているタンパク質が細菌のものであるため、アンチセンス分子にとって好適なベクターは、細菌に選択的に感染し、所望のアンチセンス分子を合成するバクテリオファージである。それら（例えば大腸菌）はニッケル結合タンパク質を産生しないため、この治療は正常な細菌叢には悪影響を与えない。さらに、ベクターは、より標準的なウイルスベクター系およびプラスミドベクター系から選択することができる。また、分子をベクターを用いずに、例えば経口投与により投与することも可能である。この場合、細菌は直接アンチセンス分子と接触し、それを正常な（例えばファゴサイトーシスによる）機構を介して取り込む。該分子は、当技術分野において知られている方法を用いて、適当な賦形剤に入れて投与される。ニッケル結合遺伝子の転写を阻害するために生物のDNAに結合するアンチセンス、またはタンパク質の翻訳を阻害するためにmRNAに結合するアンチセンスが選択される。ニッケル結合タンパク質は、H. ピロリ細胞を抑制する薬物を、同定および設計するためにも用いることができる。例えば、該タンパク質と相互作用する薬物は、ニッケルを結合させずに、代わりに選択的に該タンパク質に結合し、その結果活性型ウレアーゼの組立を抑制する。この機能に関する薬物のスクリーニングは、被験化合物とニッケルとの間の（当技術分野において標準的な）競合アッセイを確立し、結合基質として精製されたタンパク質またはニッケル結合断片を用いることにより、比較的容易なものとなった。例えば、Ni-NTAキアゲン樹脂をアッセイにおけるニッケル源として用い、被験化合物の存在下または非存在下で樹脂に吸着するタンパク質の量を薬物結合効率の指標とすることが可能である。環境への適用本発明のポリペプチド、またはその金属結合断片のさらにもう一つの用途は、水溶液を精製する試薬としてのものである。そのような汚染を除去する方法には、商業的および産業的適用の可能性が数多くある。例えば、本方法は、ニッケルの放射性同位元素を含む廃棄物の管理に好適である。可能であれば、液体放射性廃棄物の容量を減少させることは望ましいことであり、（廃棄物を適当なpHに滴定した後）ニッケル結合ポリペプチドの可溶性部分を水溶性廃棄物と混合し、放射性金属イオンを結合させ、それから結合したタンパク質―金属複合体を溶液から除去するという、ニッケル結合タンパク質の利用法が可能である。６３Niは、本方法により除去できる放射性核種の一例である。また、本発明のニッケル結合ポリペプチドを固相支持体（例えば、樹脂またはより大きな支持体）に結合させ、次に汚染を除去したい溶液に加え、それからニッケルがタンパク質へと接近できるように混合してもよい。遊離のニッケルが結合した後、低容量の固体廃棄物を得るために、大きな支持体を除去するか、または樹脂を遠心分離することは、簡単なことである。本方法はまた、非放射性の水溶液にも適用可能であり、いかなる容量の液体にも用いることができる。寄託特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest T reaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure）の要件の下で、ヘリコバクターピロリニッケル結合タンパク質の配列と共に3.5kbのゲノムクローンを含むプラスミドp SKHP2-17を、1994年7月7日に、米国、メリーランド州、ロックヴィルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託し、寄託番号（Accession Number ）75806を与えられた。出願人の譲渡人、ニューイングランドメディカルセンターホスピタル（New En gland Medical Center Hospital）およびタフツ医科大学（Tufts University Sc hool of Medicine）は、ATCCは、寄託物を永久に維持することができ、特許が付与された場合、公衆への利用可能性が準備されている寄託所であることを示している。このように寄託された該物質の公衆への利用可能性を制限するものは全て、特許が付与された際に変更不可能に取り除かれるであろう。特許出願の係属中、長官（Commissioner）により37CFR1.14および35U.S.C.§122の下で資格を与えられると決定された者は、寄託物を利用することが可能である。寄託物は、寄託されたプラスミドの最も最近の分譲請求から少なくとも5年間、そしていずれにしても寄託日から少なくとも30年間、または特許が有効である期間は、いずれの期間の方が長くとも、最大の注意を払って維持されるであろう。出願人の譲渡人は、寄託物の状態のために寄託所が請求時に試料を分譲できない場合には、寄託物を交換する義務を理解している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/566 33/566 (72)発明者ギルバート−ロステインジョアンヌブイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ州アーリントンロビンフッドロード 31 (72)発明者ライトアンドリューアメリカ合衆国マサチューセッツ州リンカーンオークメドウロード９

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）ヘリコバクター細菌に見出され、ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含み、ｃ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、約14kDaのモノマーの分子量を有する、ことを特徴とする実質的に純粋なタンパク質、およびその生物学的に活性な断片。２．配列番号１と実質的に同一なポリペプチド、またはその断片。３．ニッケル結合タンパク質に特異的に結合する抗体を生成することができる、請求の範囲1のタンパク質の断片。４．少なくとも8アミノ酸の長さである請求の範囲1の断片。５．タンパク質のニッケル結合ドメインを含む、請求の範囲4の断片。６．配列番号2を含むニッケル結合タンパク質をコードする実質的に純粋なDNAもしくはその縮重変異体、または少なくとも24個の連続ヌクレオチドを含む該DNA の一部。７．請求の範囲1のポリペプチドに特異的に結合する抗体。８．配列番号1のニッケル結合タンパク質に対する抗体の存在をアッセイすることによってヘリコバクター感染の徴候について試料を試験することを含む、試料中のヘリコバクター感染を検出する方法。９．検出が、配列番号1のニッケル結合タンパク質をコードするDNAの存在をアッセイすることによって行われる、請求の範囲8の方法。１０．検出が、配列番号1のニッケル結合タンパク質の存在をアッセイすることによって行われる、請求の範囲8の方法。１１．ａ）ニッケルイオンとタンパク質との間で複合体を形成させるために、請求の範囲1（配列番号1）のタンパク質またはそのニッケル結合断片を溶液に添加し、ｂ）該溶液から該複合体を除去することを含む、水溶液からニッケルイオンを除去する方法。１２．請求の範囲1のニッケル結合タンパク質又は断片と相互作用する能力について治療用候補化合物を試験する方法であって、ａ）該化合物をタンパク質又は断片と接触させ、ｂ）該化合物／タンパク質混合物をニッケル結合樹脂と接触させ、ｃ）該タンパク質が該ニッケル結合樹脂に結合するか否かを判定すること、を含む方法。