DK172329B1

DK172329B1 - Polydisperse, native Pseudomonas-flagella(H)-antigener (FAg) i polymer form og fremgangsmåde til deres udvinding

Info

Publication number: DK172329B1
Application number: DK421486A
Authority: DK
Inventors: Thomas C Montie; Friedrich Dorner; James L Mcdonel; Artur Mitterer
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-09-03
Publication date: 1998-03-23
Also published as: ES8800275A1; AT384032B; JPS62501363A; ATE81471T1; US4831121A; JPH085801B2; DE3686961D1; FI863677A0; CA1263307A; ES550831A0; EP0208743A1; CA1263307C; EP0208743B1; DK421486A; FI863677A; ATA7285A; FI85221C; WO1986003974A1; FI85221B; DK421486D0

Description

DK 172329 B1 #

Den foreliggende opfindelse angår polydisperse native Pseudomonas-flagella (H)-antigener (FAg) og en fremgangsmåde deres udvinding af Pseudomonas aeruginosa bakteriekulturer.

5 Bakterien Pseudomonas aeruginosa er en opportunistisk pathogen kim, der hyppigt optræder ved hospitalsinfektioner, hovedsagelig hos patienter med svækket immunforsvar, såsom hos forbrændingspatienter, hos patienter der lider af cystisk fibrose eller udviser organiske fejlfunktioner og hos tumor-10 patienter. Antibiotika er kun begrænset virksomme over for Pseudomonasinfektioner som følge af forekomst af resistenser, hvorfor man er nødt til at anvende immunologiske metoder til bekæmpelse af infektioner med Pseudomonas aeruginosa.

Infektioner kan udløses af mange stammer, som producerer 0-15 gruppeantigener og H-antigener. Ifølge H-antigenskemaet ifølge Ansorg (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228-238 (1978) skelnes der under anvendelse af indirekte immunfluo-rescensteknik på Pseudomonas aeruginosa mellem et komplekst flagella(H)-antigen a med partialantigenerne aQ, alr a2, a3, 20 a4 og et uniformt flagella(H)-antigen b. Partialfaktorerne aQ-a4 er uafhængige determinanter, således at der fremkommer et flagellart antigenskema med flere H-typer. O-grupper og H-typen viser frie kombinationer.

25 Stammer, der er anvendelige til tilberedning af Pseudomonas aeruginosabakteriekulturer og de producerede antigener, anføres i følgende tabel.

Stamme H-tvoe 30 1 170001 - b M-2 - b

2 5142 - aQ

3 5940 - aQ, a2 4 5939 - aQ, a3 35 5 5933 - aQ, al7 a2 . 1210 — 3q, 3^, a2 DK 172329 B1 2 16990 - 3q , al' a2 6 170018 — aQ, a3» a4

Isolerede filamenter af flagel-antigenerne, der kan udvindes ved rystning, homogenisering og påfølgende centrifugering 5 (R. Ansorg, W. Schmitt, Med. Microbiol. Immunol. (1980) 168: 217-226) består af flageller og flagelbrudstykker forenet i et kompleks bestående af lipopolysakkarider (LPS) og forureninger fra næringsmediet. Sådanne præparater er ifølge deres natur pyrogene og uegnede til anvendelse på mennesker.

10

Det er kendt til bekæmpelse af Pseudomonasinfektioner at fremstille Pseudomonasvacciner, idet der som udgangsmaterialer anvendes Pseudomonas aeruginosa-bakteriemasser og/eller kulturfiltrater, som blev udvundet under dyrkning af mikro-15 organismerne på overfladekulturer eller neddykket i komplekse næringsmedier. Til disse komplekse næringsmedier blev der ved siden af en carbon- og energikilde (for det meste kulhydrater) og essentielle næringssalte anvendt de mest forskelligartede ekstrakter og/eller hydrolysater af animalske, mikro-20 bielle eller vegetabilske proteiner (såkaldte peptoner). Sådanne næringsopløsningssupplementer er ikke definerede i deres nøjagtige sammensætning og desuden variable fra charge til charge. De indeholder ved siden af aminosyrer også ufuldstændigt nedbrudte proteinbrudstykker og udefinerede 25 komplekser af disse og tjener i det væsentlige til dækning af aminosyre- behovet og vækststofbehovet. Kulturvæsker er derfor altid rige på stoffer af ikke-bakteriel oprindelse, hvilket har den ulempe, at der til tilberedning af et flagella(H)-antigen af 30 Pseudomonas aeruginosa altid kræves flere adskillelsestrin efter kultiveringstrinnet, for så vidt muligt at befri flagella(H)-antigenet for de fra næringsmediet stammende forureninger .

Den nærmestliggende kendte teknik fremgår af Infection and 35 Immunity, bind 35, nr. 1, januar 1982, T.C. Montie et al.: DK 172329 B1 3 "Flagellar Preparations from Pseudomonas aeruginosa: Isola tion and Characterization", side 281-288, hvor der dels omtales meget rent flagellin med en molekylvægt på 53.000 og bestående af 16 aminosyrer, dels hvorfra flagellinet stammer, 5 fremstillingen af flagellinet, hvilket aminosyrer, som findes deri, at molekylvægten kan variere samt den biologiske effekt af flagelinet.

Fraskillelsen af det rå flagellare materiale fra bakteriesuspensionen blev foretaget ved såkaldt "Shearing", dvs. ind-10 virkning af forskydningskræfter på bakteriesuspensionen i et blandeapparat. Derefter centrifugeres ved 15.000 x g - 18.000 x g, pillen kasseres og den ovenstående væske, som indeholder det rå flagelpræparat, underkastes en centrifugalacceleration på mindst 40.000 x g i 1 time eller 100.000 x g i 20 minut-15 ter. Derved fremkommer det rå antigen i form af piller. Det indeholder som allerede tidligere nævnt blandt andet lipopo-lysakkarider (LPS), nucleinsyrer, forskellige salte, polysakkarider og ikke-flagellare proteiner, som ugunstigt påvirker effektiviteten og tåleligheden af en deraf fremstillet 20 vaccine. Flagella(H)-antigen har ikke hidtil kunnet isoleres ren (T.L. Pitt, J. Med. Microbiol. (1981), 14: 251-260).

Opfindelsen tilsigter at undgå de beskrevne ulemper og vanskeligheder og har den opgave, at fremstille polydisperse native flagella(H)-antigener (FAg) med høj renhed og fri for 25 pyrogene stoffer.

Disse meget rene FAg-antigener ifølge opfindelsen foreligger i polymer form med (i) en diffusionskoefficient D = 8,5 · 10”^ (cm2/s), 30 (ii) en hydrodynamisk radius R = 2,5 · 10-5 cm, (iii) en vægtfylde d = 1,28 g/cm3, og (iv) en vidtgående frihed for LPS, dvs. en mængde på mindre end 1% DK 172329 B1 4 og består af monomere bestanddele, hvor hver monomer bestanddel a) indeholder følgende aminosyrer: asparaginsyre (Asp), threonin (Thr), serin (Ser), glutaminsyre (Glu), glycin 5 (Gly), alanin (Ala), valin (Val), isoleucin (Ile), leucin (Leu), tyrosin (Tyr), phenylalanin (Phe), lysin (Lys), arginin (Arg) og eventuelt tryptophan (Trp), b) har den N-terminale aminsyresekvens alanin (Ala) - leucin (Leu) - threonin (Thr) - valin (Val) - asparagin (Asn) - 10 threonin (Thr) - asparagin (Asn) - isoleucin (Ile) alanin (Ala), c) har en molekylvægt mellem 43.500 og 53.050 dalton, og d) er fri for prolin, methionin, halv-cystin og histidin.

I enkeltheder karakteriseres ifølge opfindelsen seks speci-15 fikke H-serotyper, nemlig flagella (H) -antigen af H-serotype aQ, a3, a4, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og 20 arginin i forholdet 64: 33: 35: 42: 44: 68: 29: 20: 37: 3: 10: 19: 15 og har en molekylvægt på 43.500, flagella(H)-antigen af H-serotype aø, a3, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, 25 leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i for holdet 69: 35: 38: 44: 47: 73: 30: 30: 60: 3: 12: 21: 16 og har en molekylvægt på 46.700, flagella(H)-antigen af H-serotype aQ, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, DK 172329 B1 5 glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 74: 50: 49: 49: 49: 89: 37: 29: 44: 5: 14: 17: 16 og har en molekylvægt på 52.720, 5 - flagella(H)-antigen af H-serotype b, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 74: 48: 48: 49: 51: 91: 38: 30: 43: 4: 13: 18: 18 og har en 10 molekylvægt på 53.050, flagella (H)-antigen af H-serotype a0, a·^ a2, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i 15 forholdet 76: 44: 40: 52: 50: 81: 32: 32: 41: 4: 12: 20: 18 og har en molekylvægt på 51.250, flagella(H)-antigen af H-serotype aQ, a2, hvis monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, 20 leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i for holdet 68: 41: 37: 46: 44: 73: 29: 20: 37: 3: 10: 16: 16 og har en molekylvægt på 45.900.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til udvinding af de betegnede polydisperse, native Pseudomonas flagella(Η)-25 antigener af Pseudomonas aeruginosa-bakteriekulturer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at bakteriekulturen desintegreres, fortrinsvis underkastes en "Shearing"-proces og fraktioneres, efter tilsætning af et detergens underkastes en kromatografisk behandling eller rensning, hvor der til den 30 kromatografiske behandling især anvendes en molekylsigte, som er bragt i ligevægt med detergenset, og at de kromatografisk behandlede og rensede flagellare antigener underkastes en yderligere kromatografisk rensning til fjernelse af tilstede- DK 172329 B1 6 værende detergens, hvorved der fås flagella-antigener med en renhed på mere end 98% og et indhold af pyrogene substanser (LPS) på mindre end 1%.

Ved tilsætning af detergenset bevirkes, at antigenet kan 5 skilles fra bakteriemassen, og de derefter i opløsning værende antigener fraskilles. Som detergens egner sig med fordel et salt af galdesyre især deoxycholat.

Ved den kromatografiske behandling eller rensning tilbageholdes de som forureninger værende makromolekyler især lipo-10 polysakkariderne, nucleinsyrerne, salte, polysakkarider og andet.

En fordelagtig modifikation af fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at den desintegrerede bakteriekultur, før den kromatografiske behandling, underkastes en forrensning, 15 hvorved bakterier og mikroskopisk synlige bakteriepartikler fjernes fra kulturen. Denne forrensning kan foretages ved centrifugering med en centrifugalacceleration på indtil 5.000 x g. Det udskilte sediment kasseres, og den overstående væske forarbejdes videre.

20 En yderligere fordelagtig modifikation af fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at også den anden kromatografiske rensning udføres med en molekylsigte, såsom Sephadex™, eller med en ikke-polær polystyrenadsorptionsgel, såsom BIO-BEADS SM-4™.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere af følgende eksempel:

En bakteriekultur af Pseudomonas aeruginosa M-2 (udvalgt blandt de i indledningen anførte bakteriestammer) blev udviklet i en næringsopløsning af følgende sammensætning: DK 172329 B1 7 dinatriumsuccinat 4,05 g/1, dikaliummonohydrogenphosphat 7 g/1, kaliuradihydrogenphosphat 3 g/1, ammoniumhydrogenphosphat 1 g/1/ 5 magniumsulfat, 7 H2O 0,05 g/1, jern(III)chlorid 0,0025 g/1, indtil celletætheden var 2 - 3 x 10^ celler/ml og holdt konstant ved en fortyndingsgrad på 0,2 μ i en forgæringstid på 96 timer ved et oxygenpartialtryk på 10% (pC^) og under 10 omrøring.

Den fra forgæringsbeholderen kontinuerligt udtagne bakteriekultur blev oparbejdet i en med forgæringsbeholderen samvirkende ultracentrifuge med en rotoroptagelseskapacitet på 660 ml (0,45 kg fugtig masse) ved en centrifugalacceleration på 15 18.000 x g, hvorved der ved anvendelse af en fortyndingsgrad på 0,2 μ efter 96 timer blev samlet så meget biomasse, at der deraf efter indvirkning af forskydningskræfter i blanderen, fraskillelse af celler og cellebrudstykker ved 15.000 x - 18.000 x g af pillen fra ultracentrifugen fremkom 149 mg 20 råt, flagellart antigen. 1 mg af det fremkomne rå, flagellare antigen blev opløst i 12 ml af en 30 mM tris-HCl-stødpudeopløsning med en pH-værdi på 7,0, hvortil der var sat 20 mg/ml deoxycholat og overført til en 16 x 16 cm søjle, der var fyldt med Sephacryl S-1000, 25 og som var bragt i ligevægt med den 30 mM tris-HCl-stødpude pH 7,0, hvortil der var sat 2 mg/ml deoxycholat. Derefter blev der opsamlet fraktioner på 2 ml, og elueringsdiagrammet blev optaget ved at følge extinktionen ved 280 og 254 nm. Kolonnegennemløbet er anskueliggjort i diagrammet på fig. 1.

3 0 Den med A betegnede kurve er optaget ved en extinkt ion ved 254 nm og med en kyvette på 1 mm. Den med B betegnede kurve er optaget ved en extinktion ved 280 nm og med en kyvette med en diameter på 20 mm. I absorptionskurven ved 280 nm kan tydeligt ses antigentoppen.

DK 172329 B1 8

Opløsningen indeholdende det rensede flagella(H)-antigen blev så underkastet et andet rensningstrin for at fjerne det de-oxycholat, som blev tilbage efter det første rensningstrin, til hvilket formål der anvendes enten en molekylsigte med 5 mindre tværbindingsgrad, f.eks. Sephadex G-25™, eller en adsorptionsgel såsom BIO-BEADS SM-4™. Ved denne behandling blev DOC fraskilt, og det flagellare antigen fremkom i en renhed på mere 98% og en mængde pyrogene stoffer (LPS) på mindre end 1%.

10 På samme måde' kan udvikles bakteriekulturer af de øvrige i indledningen anførte stammer, og deraf kan på analog måde fås de enkelte H-type-antigener i ren form. Herved har det vist sig, at udbyttet af FAg afhænger af valget af stamme. Visse stammer, såsom 5933 (aQ, a^, a2) og 1210 (aQ, a^, a2) giver 15 større celleudbytter end 170001 (b) og M-2 (b).

Kendingsværdierne for de enkelte ifølge opfindelsen karakteriserede flagella(H)-antigener, der er polymere forbindelser og består af monomere bestanddele, blev bestemt på følgende måde: 20 A) Aminosyreanalyse.

Til analysen af den samlede aminosyresammensætning af flagella (H) -antigenerne blev prøver hydrolyseret for at bryde peptidbindingerne. Hertil blev anvendt standardmetoden til proteinhydrolyse (6 N HCl, 110°C, 22 timer) (C. H. W. Hirs, 25 Methods in Enzymology, S. P. Colowick, N. 0. Kaplan, Editors-in-chief, bind XI, Enzyme Structure, side 59-62, C. H. W. Hirs, ed. 1967, Academic Press).

Undersøgelserne blev udført i en Beckman System 6300 amino-syreanalysator. På grundlag af resultaterne af aminosyresam-30 mensætningen blev molekylvægten af de monomere underenheder beregnet.

DK 172329 B1 9 B) Renhed og molekylvægt.

Renheden henholdsvis friheden for forureninger af antigenerne ifølge opfindelsen blev prøvet ved hjælp af polyacrylamidgel-elektroforese i natriumdodecylsulfat (A. L. Shapiro, E.

5 Vinuela, J. Maizel, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1967) 28: 815) .

Elektroferogrammet blev farvet ved sølvfarvningsmetoden (C.

R. Merril, D. Goldman, S. A. Sedman og Μ. H. Ebert, Science (1981), 211: 1437). Der viste sig for alle undersøgte flagel-10 la-antigener et enkelt bånd, som ifølge den i det følgende anførte metode havde tilbagelagt en bestemt vandringsstrækning på grund af deres molekylvægte. Der kunne ikke konstateres nogen henvisninger til LPS.

Polyacrylamidgelelektroforese i natriumdodecylsulfat efter 15 modifikationen ifølge Osborn og Weber (K. Weber og M. Osborn (1969), J. Biol. Chem. 244: 4406) blev anvendt til at op- spalte de rensede flagella-antigener i deres monomere underenheder og til at bestemme deres molekylvægte. 1 følgende tabel er opført de til de enkelte stammer til-20 ordnede flagella(H)-antigener af den pågældende H-serotype med den tilsvarende sammensætning af deres aminosyrer og deres molekylvægt. Eventuelt tilstedeværende tryptofan er ikke anført i tabellen, fordi det ødelægges helt eller delvis under hydrolysen.

DK 172329 B1 10

O CN

«tf m

σ\ «· oo,—ir^cD«tfmcr\cr\r^moiDvooooo<riO

LnovD«tfcn«tf«tft'~fNCNm i—t i—i .—i «tf o (0 tf σ' in «tf

CN

o m

r-H

CN r-l

r-l (C VD«tfOCNOr-ICN(Nr-l«tfCNOOOOOOOCNO

<U v r-«tf«tfmmcocnm«tf i—i cn <-i om Οι o m cn >ι m

-P >—I

O m

P

ω _ c w ............

-ri I CN

r-ι ffi 1X3 «tfoooocrl.-ii-iooocn«tfcnoooooooomo <U 2 r^^,'tf«J,mcricnm«r ·—i <—i ·—i cnu~i tji tu m o O' m3 CO C cn r-ι V m

fe P

S ___ (1) JC --—-—--------- -P i—i

Cn -H CN

fB +j «r > r-ι o «tfo<Ticno'i<yir-~a'>«tfm«tfr-cooooocNo

r-l Ό miO nifltftftftSMNtf r—I i—I i—i CNCN

>-, qj m r-~

Λί E

(U CN

r-ι (U m O § -----------

E E

\ <0 cn cη -p σ> to < cn m cn «» omæ'tfr'cnooocncNi—icdooooooo r-ι moocnm«tf«tfr^mmio —i cn i—i r-~ o r0 (0 «tf C'

-P

C CD

< 'tf «tf 00 (0 r-l - o m 'tftnmcN«j,ooo<yir'mocnmoooooo o to vocn(n«tf«tfiocNCNcn <—i ·—i —i mo r~ ·. «tf m

r-l O

(0 <n __ «tf

II II

d) vJ o p tu c ^ s >i p -H d

p in >i d -H

0 c tn cm c -p P -H C C -H r-l -H tn c >, cn ·η -η υ dm d d >» -h tn m d _ £ d d dd-Pr-i -p d o υ ms O p o p m -η -p d <u ή tn >i d d -π ή i -π d m<UT1-Puc-p'-'POd-p-Hr-i£>4-i •h Oip^ d>imr-(0PP<uwtJ'04-ir-im

B tnx:<UrHr-irHmtn<i)>ix:>iPP(i)m-H

< <&Η^ηοϋι<>ΜΡΐΕΗΛΡΐ<:ΡΜ2κκ DK 172329 B1 11 C) N-terminalaminosyresekvens.

Med et Beckman-System 890 protein/peptid sekvensbestemmelses-apparat blev der ved fast fasemetoden (P. Edman, G. Begg, 1967, A protein sequanator, Eur. J. Biochem. 1:80-91) bestemt 5 sekvensen af de første ni aminosyrer fra den N-terminale ende af de rensede flagella(H)-antigener. Hos alle typer kunne konstateres samme sekvens.

M-2 5142 10 5939 Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Thr-Asn-Ile-Ala- 1210 170018 5940 15 D) Partikeltæthed af flagella(H)-antigener.

Partikeltætheden af flagella(H)-antigenerne ifølge opfindelsen blev i hvert enkelt tilfælde bestemt ved, at en ml af en prøvevæske (flagella(H)-antigen i destilleret vand) blev 20 hældt over en CsCl-gradient med d = 1,5 - 1,45 g/cm3.

Efter centrifugering ved 50.000 omdrejninger pr. minut i en Beckman 70 Ti-Rotor i 16 timer blev der udtaget fraktioner fra bunden af centrifugeglassene, og fraktionerne blev analyseret ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese i 25 natriumdodecylsulfat.

Alle undersøgte flagella(H)-antigenpræparater viser en vægtfylde på d = 1,28 g/cm3.

E) Quasielastisk lysspredning.

Bestemmelsen beror på, at ved indvirkning af laserlys på en 30 makromolekylær opløsning spredes lyset af molekylerne. Molekylerne bevarer i opløsningsmidlet aldrig deres momentane standpunkt, men bevæger sig på grund af den Brownske molekyl-bevægelse. Hvis molekylerne f.eks. bevæger sig væk fra lase- DK 172329 B1 12 ren, vil det spredte lys (ifølge Dopplereffekten) være noget nedsat i sin frekvens. Af disse frekvensskifter kan udledes oplysninger om molekylernes diffusion, og deraf kan beregnes den "hydrodynamiske radius" (Photon correlation spectroscopy 5 and velocimetry, Η. Z. Cummins og E. R. Pike, Plenum Press,

New York, London, 1977).

Hvor det drejer sig om flagella(H)-antigener repræsenterer den hydrodynamiske radius ikke molekylets radius men en gennemsnitlig størrelsesparameter. Denne udviser dog tydeligt 10 en afhængighed af prøvens alder.

Som undersøgelsesbetingelser blev anvendt: spredningsvinkel: 60°, bølgelængde: 632,8 nm, temperatur: 20°C. Som resultat fremkom fra alle flagella-antigener: M-2, 5142, 5940, 5939, 1210, 170018 en diffusionskoefficient på D = 8,5 x 10"^ 15 (cm^/sek.) og en hydrodynamisk radius på R = 2,5 x 10-5 cm.

F) Immunologiske analyser.

Fremstilling af immunsera: Rå og højt rensede flagella-antigenpræparater blev anvendt til immunisering af hvide New Zealand kaniner. Immuniserings-20 skemaet svarede til den af Lagenaur og Agabian (J. Bacteriol.

128: 435-444, 1976) beskrevne metode. Ved denne metode bliver 1 ml bestående af en 1:1 blanding af flagelle-antigen-præpa-rat (500 μg/ml) og fuldstændig Freunds adjuvans injiceret intramuskulært. 20 dage efter den første injektion injiceres 25 i 3 dages intervaller 4 i.v. injektioner med 50 μg, 100 μg, 150 μg og 250 μg af proteinpræparaterne i 0,5 ml uden ad-juvans. En uge efter den sidste immunisering blev der udtaget blod fra ørevenen, som blev henstillet ved 4°C. Serumet blev udvundet ved centrifugering ved 4.000 x g 15 minutter og ind-30 frosset i 0,5 ml portioner ved -70°C.

DK 172329 B1 13

Immundi f fusion:

Immundiffusionsundersøgelser blev med undtagelse af den i det følgende beskrevne modifikation udført efter metoden ifølge Quchterlony (0. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand.

5 (1949) 26 : 507-515) .

Immundiffusionen blev udført på glasplader, der var overhældt med 1% agarose, som indeholdt 1% Triton X-100 i kogsaltopløsning med phosphatstødpude.

Fordybningerne til antistoffet indeholdt sædvanligvis 20 μΐ 10 serum, og antigenfordybningerne 1-5 μΐ af de pågældende prøver. Det højt rensede flagella-antigenpræparater blev desintegreret i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS).

Intakte flageller kan kun vanskeligt trænge ind i agarosen, og ved behandlingen med detergenset blev der skabt sikkerhed 15 for, at antistofferne reagerer med de monomere antigener. Triton X-100 forhindrer i immundiffusionspladerne udfyldning af antiserumet med SDS. Immundiffusionsplader inkuberes i fugtigt kammer ved 30°C i 24 timer.

Immunelektroforese: 20 Immunelektroforesen blev udført efter forskrifterne af B. Weeke (A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Application, Axelsen, Kroll, Weeke, eds. , Universitetsforlaget, Oslo, 1973, side 15 - 37).

I princippet består denne fremgangsmåde i først at foretage 25 den elektroforetiske adskillelse af en proteinblanding (i det foreliggende tilfælde højt renset flagella-antigen) i en pufferindstillet agarosegel ved hjælp af SDS-gelelektrofore-se, og efter adskillelsen at indføre et udfældende immunserum (i det foreliggende tilfælde kaninantiserum mod rå og højt 30 renset flagella(H)-antigen) parallelt med vandringsretningen DK 172329 B1 14 af de adskilte proteiner i et trug.

Antigen og antiserum diffunderer gennem agarosegelen, som indeholder 1% Triton X-100, derefter mod hinanden og på deres berøringssteder opstår bueformede udfældningslinier, hvis 5 antal, stilling og form giver et indblik i sammensætningen af antigenblandingen.

Resultater af immundiffusionen:

De højt rensede flagelliner udviste ved Ouchterlony-prøven hver især et enkelt præcipitatbånd mod deres homologe anti-10 serum, ligegyldigt om dette antiserum var rettet mod et råt flagella-antigenpræparat eller mod det meget rene flagellin.

Resultater af immunelektroforesen:

Immunelektroforese med de højt rensede flagelliner af Pseudomonas aeruginosastammerne M-2, 1210, 5939, 5940, 5142, 170018 15 viste under anvendelse af homologe antisera både mod det tilsvarende rene flagella-antigen og mod et råt flagella-antigenpræparat et enkelt præcipitatbånd.

På fig. 2 er vist præcipitatbåndene fra den endimensionale immunelektroforese ifølge Weeke, og på fig. 3 præcipitat-20 båndene ved immundiffusionen ifølge Ouchterlony.

Som det vil ses af fig. 2, blev f lagel linprøven 1 svarende til stammen M-2, 2 svarende til stammen 170018, 3 svarende til stammen 1210, 4 svarende til stammen 5142, 5 svarende til stammen 5940 og 6 svarende til stammen 5939, hver især påført 25 i hullet X på gelstrimlen, og efter elektroforesen blev de tilsvarende antisera (a-f) pipetteret i spalten. Der opstod i alle tilfælde som vist et enkelt udfældningsbånd, hvilket beviser renheden af alle seks flagellinprøver.

Claims

1. Polydisperse, native Pseudomonas-flagella(H)-antigener i polymer form med (i) en diffusionskoefficient D = 8,5 ♦ 10-9 (cm2/s), (ii) en hydrodynamisk radius R = 2,5 · 10"5 cm, (iii) en vægtfylde d = 1,28 g/cm3, og 15 (iv) en vidtgående frihed for LPS, dvs. en mængde på mindre end 1% hvilke antigener består af monomere bestanddele, idet hver monomer bestanddel a) indeholder følgende aminosyrer: asparaginsyre (Asp), 20 threonin (Thr), serin (Ser), glutaminsyre (Glu), glycin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), isoleucin (Ile), leucin (Leu), tyrosin (Tyr), phenylalanin (Phe), lysin (Lys), arginin (Arg) og eventuelt tryptofan (Trp), b) udviser den N-terminale aminosyresekvens alanin (Ala) - 25 leucin (Leu) - threonin (Thr) - valin (Val) - asparagin (Asn) - threonin (Thr) - asparagin (Asn) - isoleucin (Ile) - alanin (Ala), c) har en molekylvægt mellem 43.500 og 53.050, og DK 172329 B1 d) er fri for prolin, methionin, halv-cystin og histidin.

2. Flagella(H)-antigen af H-serotype aQ, a3, a4 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, gluta- 5 minsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 64: 33: 35: 42: 44: 68: 29: 29: 37: 3: 10: 19: 15 og har en molekylvægt på 43.500.

3. Flagella (H)-antigen af H-serotype aQ, a3 ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 69: 35: 38: 44: 47: 73: 30: 30: 60: 3: 12: 21: 16 og har en molekylvægt på 46.700.

4. Flagella (H)-antigen af H-serotype aQ ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 74: 50: 49: 49: 49: 89: 20 37: 29: 44: 5: 14: 17: 16 og har en molekylvægt på 52.720.

5. Flagella(H)-antigen af H-serotype b ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenyl- 25 alanin, lysin og arginin i forholdet 74: 48: 48: 49: 51: 91: 38: 30: 43: 4: 13: 18: 18 og har en molekylvægt på 53.050. 1 Flagella(H)-antigen af H-serotype aQ, a2 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutamin- 30 syre, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin og arginin i forholdet 76: 44: 40: 52: 50: 81: 32: 32: 41: 4: 12: 20: 18 og har en molekylvægt på DK 172329 B1 51.250.

7. Flagella(H)-antigen af H-serotype aø, &2 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den monomere form indeholder aminosyrerne: asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, 5 glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenyl-alanin, lysin og arginin i forholdet 68: 41: 37: 46: 44: 73: 29: 29: 37: 3: 10: 16: 16 og har en molekylvægt på 45.900.

8. Flagella(H)-antigener ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at de ved immuniseringsskemaet ifølge

10 Lagenaur og Agabian inducerer polyvalente eller mono valente antistoffer i kanin.

9. Flagella(H)-antigener ifølge krav 1-8, kendetegnet ved, at de over for polyvalente og/eller monovalente antistoffer ved immundiffusionsprøven ifølge Ouchterlony 15 eller immunelektroforeseprøven ifølge Weeke danner et enkelt udfældningsbånd.

10. Fremgangsmåde til udvinding af polydisperse native Pseudomonas aeruginosa flagella(H)-antigener ifølge krav 1-7 af Pseudomonas aeruginosabakteriekulturer, kendetegnet 20 ved, at bakteriekulturen desintegreres, fortrinsvis underkastes en "Shearing"-proces og fraktioneres, efter tilsætning af et detergens underkastes en kromatografisk behandling eller rensning, hvor der til den kromatografiske behandling især anvendes en molekylsigte, som er bragt i ligevægt med 25 detergenset, og at de kromatografisk behandlede og rensede flagellare antigener underkastes en yderligere kromatografisk rensning til fjernelse af tilstedeværende detergens, hvorved der fås flagella-antigener med en renhed på mere end 98% og et indhold af pyrogene substanser (LPS) på mindre end 1%.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at bakteriekulturen før den kromatografiske behandling underkastes en forrensning ved fraskillelse af bakterier og mikro- DK 172329 B1 skopisk synlige bakteriepartikler.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at forrensningen foretages ved centrifugering med en centrifugalacceleration på indtil 5000 x g, og det udskilte 5 sediment kasseres.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der som detergens anvendes et salt af galdesyre især deoxycholat.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, 10 at også den anden kromatografiske behandling udføres med en molekylsigte såsom Sephadex eller en adsorptionsgel såsom BIO-BEADS SM 4. 15