JPS62501363A

JPS62501363A - 多分散系の天然緑膿菌のべん毛（Ｈ）抗原（ＦＡ▲下ｇ▼）および、それらを製造する方法

Info

Publication number: JPS62501363A
Application number: JP61500683A
Authority: JP
Inventors: モンテイ，トーマス・シイ; ドルネル，フリードリツヒ; マクドネル，ジエームズ・エル; ミツターラー，アーテユアー
Original assignee: イムノ・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-01-13
Publication date: 1987-06-04
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: ES8800275A1; AT384032B; ATE81471T1; US4831121A; JPH085801B2; DE3686961D1; FI863677A0; CA1263307A; ES550831A0; EP0208743A1; CA1263307C; EP0208743B1; DK421486A; FI863677A; ATA7285A; FI85221C; WO1986003974A1; DK172329B1; FI85221B; DK421486D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】多分散系の天然緑膿菌のべん毛（１−１）抗原（１’Ａｇ　）および、それらを製造する方法本発明は、多分散系の天然緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　のへん毛（ＩＩ）抗原（ＦＡｇ）および、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）の細菌培養物から、それらを製造する方法に関するものである。

シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　３ｅｒｕｇｉｒ）ｏｓａ）細菌はＪ主に免疫防衛能が低下している患者（例えば、火傷を負っている患者、のう飽性線維症の患者、または欠損性器官機能患者、および癌患者）において院内感染を引き起こすことの多い、条件的病原菌である。

耐性が生じるために、緑膿菌感染に対して抗生物質は、限られた範囲でしか活性を持たず、それ故、シュードモナス・アエルギノサに起因する感染症に対抗するには、免疫学的方法による試みがなされてきた。

感染は、〇一群抗原、およびＨ−抗原を生産する種々の株によって引き起こされつる。間接的免疫螢光法を用いた７　７７　／Ｌ／グ（Ａｎｓｏｒｇ）　（Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ、　Ｉ、　Ａｂｔ。

Ｏｒｉｇ、　Ａ２４２，２２８−２３８（１９７８））　ニよルＩ−Ｉ抗原ツバターンによると、シュードモナス　アエルギノサに関しては、部分抗原（ａｏ、Ｘ１１、Ａ２、Ａ３、Ａ４）を有する、複合的なべん毛（Ｈ）抗原−と、均一的べん毛（ｔｉ　）抗原シが識別される。部分因子であるａ。−Ａ４は、独立した抗原決定基であり、それゆえ、いくつかのＨ−型を有するべん毛抗原のパターンが生じる。〇一群とＩｔ−型とは自由に組み合せをつくる。

シュードモナス・アエルギノサの細菌培養物を調製するために使用しうる株、およびその株が産生ずる抗原を、以下の表に示す。

株　ＩＩ　−型１　１７０００１　−　ｂ３　５９４０　−　ａｏ、Ａ２４　５９３９　ａ　ｏ　、ａ　３５　５９３３　−　２ｏ、ａｌ、ａ□ １２１０　−　ａｏｒ　ａｔ、Ａ２１６９９０　−　ａｏ、ａｌ、ａ□ ６　１７００１８　−　ａｏＩ　ａ３Ｉ　Ａ４振とうし、ホモジナイズした後、遠心分離して得ることのできるべん毛抗原の単離された繊維（Ｒ，アンンルグ（Ａ、ｎｓｏｒｇ　）、Ｗ、シュミット（ＳｃｈｍｉＬｔ　）、（メト−フィクロバイオｏ−イムノｏ　）　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

（１９８０）１６８：２１７−２２６　）は、リボ多糖類（ＬＰＳ）と栄養培地由来の不純物とから成る複合物と一体化しているべん毛およびべん毛画分とを含む。そのような調製物は、本質的に発熱性であり、ヒトに対して利用するのに適さない。

緑Ｉ濃菌感染に対する予防用の緑膿菌ワクチンの製造は既知であり、シュードモナス・アエルギノサを、表面培養または混合栄養培地溶液中での液中培養により増殖させて得た該微生物の細菌塊および／または、培養濾過物を出発原料として使用する。これらの混合栄養培地に関しては、炭素源およびエネルギー源（土に炭水化物）および必須栄養塩類の他に、種々の抽出物および／または、動物性たんばく質、微生物たんばく質、または植物性たん白質の氷解物（いわゆるペプトン）を用いた。このような栄養溶液補充物の組成は厳密に定められておらず、ロフト（ｌｏｉ）ごとに変えることができる。栄養溶液補充物は、アミノ酸の他に、不完全に分解されたたん白質フラグメントおよびその不確定な混合物をも含み、実質上、アミノ酸および成長促進物質に対する需要を償うことができる。それ故、培養上清は常に、非微生物起源の物質に富んでいるが、このことは、培養段階の後、べん毛（■り抗原から、栄養培地に由来する不純物をできる限り除くために、いくつかの分離工程を常に必要とするので、シュードモナス・アエルギノサのべん毛（Ｉり抗原の調製には不利である。

粗製のべん尼原料を、細菌懸濁物から分離するには、いわゆる「せん断」、即ち、ミキサー内で、細菌懸副液にせん断力をかけた後、１５，０ＯＯＸ、ｐ−１８，０ＯＯＸ、ｐにて遠心分離する方法を用いる。その後、ベレットヲ捨て、粗製のべん毛調製物を含む上清を、少なくとも４０，０００ｘｇにて、１時間、または、Ｚｏｏ、０ＯＯＸ、９にて２０分間、遠心加速処理する。こうして、粗製の抗原をペレットの形で得る。すでに言及したように、それは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、核酸、種々の塩類、多糖類、および、そこから生成するワクチンの有効性および適合性に不利な影響を与える非べん氾たん白質を含んでいる。

従来は、純粋なべん毛（■り抗原を分離することは不可能であった（Ｔ、Ｌ、ピット（Ｐｉｔｔ）　、’（ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジイ）Ｊ、λ（ｅｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、　（１９８１）　、１４　：２５１−２６０）。

本発明は、前記の不利益および困難を避けることを目的とし、多分散系の天然べん毛（Ｈ）抗原（ＦＡｇ）を、高純度で、発熱性物質を含まずに得ることを目的とする。

これらの本発明に係る高純度のＦＡｇ抗原は、単量体成分から成り、各単量体成分は、ａ）　アミノ酸：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、インロイシフ（ｌｌｅ）、ロイ’／　７　（Ｌｅｕ　）、チロシフ　（Ｔｙｒ　）、フェニルアラ＝　７　（Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびおそらくトリプトファン（Ｔｒｐ　）を含み、酸ｂ）　Ｎ−末端アミノ配列：アラニン（Ａｈａ）−ロイシ△ ン（Ｌｅｕ）　−）レオ＝　７　（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ　）−アスパラギン（Ａｓｎ）　−）レオ＝　７　（Ｔｈｒ）−アスパラギア（Ａｓｎ）−イソロイシン（１１ｅ）−アラニン（Ａｌａ）を有し、Ｃ）　４３，５００〜５３，０５０ダルトンの分子量を有し、さらに、ｄ）　プロリン、メチオニン、セミ−シスチンおよびヒスチジンを含まないものである。

さらに詳細に述べると、本発明に従って、以下に示す６つの特異なＩ（−血清型が特徴づけられる。

１］−血清型（ａｏ、３３、ａ４）のべん毛（Ｉり抗原、その単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、インロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、°リジン、およびアルギニンを、６４：３３：３５：４２：４４：６８：２９：２９：３７：３：１０：１９：１５の割合で含み、分子量は４３，５００である。

１１−血清型（ａｏ、２３）のべん毛（ｌり抗原、その単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン１、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、およびアルギニンを６９：３５：３８：４４：４７：７３：３０：３０：６０：３：１２：２１：１６の割合で含み、分子量は４６．７００である。

Ｈ−血清型（ａｏ）のべん毛（Ｉ］）抗原、その単量形アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、およびアルギニンを、７４：５０：４９：４９：４９：８９：３７：２９：４４：５：１４：１７：１６の割合で含み、分子量は５２，７２０である。

Ｉ（−血清型（ｂ）のべん毛（Ｈ）抗原、その単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、インロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、およびアルギニンを、７４：４８：４８：４９：５１：９１：３８：３０：４３：４：１３：１８：１８の割合で含み、分子量は５３，０５０である。

■−血清型（ａｏ、ａｌ、ａ□）　（７）へん毛（Ｈ）抗原、その単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、およびアルギニンを、７６：４４：４０：５２：５０：８１：３２：３２：４１：４：１２：２０　：１８の割合で含み、分子量は５１，２５０である。

■（−血清型（”０ｑａ２）のべん毛（Ｈ）抗原、ソノ単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、およびアルギニンを、６８：４１：３７：４６：４４ニア３：２９：２９：３７：３：１０：１６：１６の割合で含み、分子量は４５，９００である。

本発明は、さらに、シュードモナス・アエルギノサ細菌培養物から、列挙した多分散系の天然緑膿菌べん毛（Ｈ）抗原を製造する方法であって、該細菌培養物を洗剤で処理し、培養物から、多分散系の天然べん毛抗原を分離することを特徴とする。

洗剤を加えることにより、抗原を細菌塊から分離し、次に、溶液中の抗原を分離することができる。洗剤としては、胆汁酸塩が都合がよく、特にデオキシコレートが適している。

この際、洗剤で処理する前に、好ましくは「せん断」方法により、細菌培養物を分解しておいてもよく、または、洗剤の存在下にせん断力をかけてもよい。

好ましい実施態様では、細菌培養物からの多分散系の天然べん毛（１−１）抗原の分離を、クロマトグラフィー処理または、精製により行なうが、不純物として存在している高分子、特にリポ多糖類、核酸、塩類、多糖類、およびその他のものは保持されている。

本発明に係る方法の勧められる改良法は、分解した微生物培養物を、クロマトグラフィー処理に先立って予備精製し、細菌および顕微鏡的に観察可能な微生物粒子を培養物から除去しておく方法である。この予備精製は、遠心加速度５，０ＯＯＸ、ｙの遠心分離により行ないつる。分離した沈殿物を捨て、その上清をさらに処理する。

クロマトグラフィー処理を都合よく行なうためには、洗剤で平衡化したモレキュラー・シーブを使用する。

適切なモレキュラー−シーブはセファクリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ　）である。

本発明方法のさらに好都合な改良法は、クロマトグラフィー処理により精製したべん毛抗原をカラムクロマトグラフィーにかけてさらに精製し、存在している洗剤を除き、純度９０％以上のべん毛（Ｈ）抗原を得ることを特徴とする。同様に、２回目のクロマトグラフィーによる処理をモレキュラー・シーブ（例えば、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　）、または非極性ポリスチレン吸着ゲル（例えば、ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ　５Ｍ−４）を用いて行なう。

本発明に係る方法を、以下に具体例を示して、より詳しく説明する。

シュードモナス・アエルギノサＭ−２（序文において例示した細菌株から選択した株）を以下に示す組成：コハク酸２ナトリウム　４．０５　ｉ／ｌ。

リン酸１水素２カリウム　７　ｇ／ｉ。

リン酸２水素カリウム　３　７！／ｅ。

リン酸水素アンモニウム　１　ｇ／ｅ、硫酸マグネシウム・７ｌ−Ｉ２０　０．０５　ｇ／ｌ。

塩化第２鉄　０．００２５　ｇ／ｌ。

の栄養液中にて、細胞密度が２〜３Ｘ１０９細胞／ｒｎＱに達するまで培養し、９６時間の発酵期間中撹拌下、酸素分圧（ｐＨ２）　１０　％において希釈率を一定（０，２μ）に保った。

連続的に発酵器から引き出した細菌培養物を、６６０ｍＱ　（０，４５ｋｑ湿重量）のローター保持容量の発酵器と協同させた超遠心分離機内で、遠心加速度ｉｓ、ｏｏｏｘｙにて処理することにより、仕上げる。ここで、希釈率０．２μを用いると、９６時間後に非常に多量の生物量が集められるので、これをミキサー中にてせん断力をかけ、超遠心して得たベレットを遠心分離（１５，０００ｘｇ −ｘｓ、ｏｏｏｘ、ｐ）Ｌ、細胞と細胞フラグメントとを分離すると、粗製のべん毛抗原１４９ダが得られた。

得られた粗製のべん毛抗原（１８ｆｆｉ＆）を、ｐＨ７、０のトリス−ＨＣ１緩衝液（３０ｍＭ、１２ｄ）中に溶解し、デオキシコレート（２０ＭＱ／ｍＱ　）を加えたトリス−ＨＣｄ緩衝液（３０ｍＭ　、　ｐＨ７、０）で平衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ　−１０００を充填したカラム（１６Ｘ１６ｆｆ）に適用し、デオキシコレート（２１１ｇ／ｍ（す　ヲ加えた。即座に両分（２ｄ）を集め、２８０ｎｍおよび２５４ｎｍＲ：おける吸光度を観測して、溶出図を作製した。カラムから流出（ｒｕｎ）を添付図面に示す（第１図）。

Ａと表示した曲線は、光路長Ｉ　ｍｌのキュベツト（・セル）を用いた２　５４０ｍにおける吸光度に基づいて作成し、Ｂと表示した曲線は、光路長２０１１！ｌのキュベツト（セル）を用いた２　８０　ｎｍにおける吸光度に基づいて作成した。

この吸収曲線において、抗原のピークは、２８０　ｎｍに明瞭に認められる。

次に、純化べん毛（Ｈ）抗原を含む溶液を、第１回目の精製段階から残存しているデオキシコレートを除くために、第２回目の精製工程に付した。この目的のためには、架橋結合（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ　）の程度がより少ないモレキュラー・シーブ、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　”　２５を用いるか、または、ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳＳＭ−４のような吸着ゲルを用いる。この処理によって、ＤＯＣが分離され、べん毛抗原が、９８％以上の純度で、少量の発熱性物質（ＬＰＳ）（１％以下）を伴なって得られた。

同じ方法で、序文で例示した他の株の細菌培養物を培養し、類似の方法を用いて、個々の１−１−型抗原を、それから純粋な型で得るこ吉ができる。ＦＡｇの収量は株の選択に左右されることが示された。ある特定の株、例えば５９３３（ａｏ、ａ、　、３２）および１２１０　（ａｏ％ａ１゜３°）を用いると、１７０００１　（ｂ）およびＭ−２（ｂ）　を用いるよりも、細胞を高収量で得ることができる。

本発明により特徴づけられた個々のべん毛（■り抗原は、単量体化合物から成る重合体化合物であり、その特性データーを以下に示す方法を用いて決定した。

Ａ）アミノ酸分析べん毛（Ｉり抗原の全アミノ酸組成を分析するために、標品を加水分解してペプチド結合を切断した。これには、標阜的なたん白質加水分解法（ｆｉＮＨ（Ｊ、１１０℃、２２時間）を用いた（Ｃ，Ｈ，Ｗ　ヒルス（Ｈｉｒｓ　）　メツ−グー４フーエフザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）、Ｓ、Ｐ、コｏウィック（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　）、Ｎ、０．カブラン（Ｋａｐｌａｎ　）　、編集長、Ｘ巻、エンザイム・ストラフチャー（Ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　）　、ｐｐ、　５　ｇ　−６２、Ｃ１Ｈ，〜Ｖ、ヒルス（Ｈｉｒｓ　）編集、１９６７アカデミツク・プンス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）　）。

試験はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）・システム６３００−アミノ酸分析器内にて行なった。アミノ酸組成の結果に基づいて、単量体サブユニットの分子量を計算した。

Ｂ）精製および分子量本発明に係る抗原の純度または不純物の不在性を、ドデシル硫酸ナトリウム中における、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた（Ａ、Ｌ、シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ　）　、　Ｅ、ビヌエラ（Ｖｉｎｕｅｌａ　）、Ｊ、？イゼ／Ｌｌ　（Ｍａｉｚｅｌ　）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミユニケージａ　７　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　）　（１９’　６７　）、２８：８１５）。

「銀染色」法（メリル（Ｍｅｒｒｉｌ　）、Ｃ０Ｒ，、ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ　）、Ｄｌ、セドマ７　（Ｓｅｄｍａｎ　）　、Ｓ、Ａ、およびエベルト（Ｅｂｅｒｔ　）、Ｍ＋Ｈ，、サイエフ　ス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　（１９８１）、２１１：１４３７　）を用いて、電気泳動図を染色した。試験を行なったすべてのべん毛抗原に関して、以下に記載した方法に従って、べん毛抗原の分子量に基づき、ある一定の距離を移動する単１のバンドが認められた。ＬＰＳに関しては、かすかな徴候も見出されなかった。

オスポーン（０ｓｂｏｒｎ　）およびウェーバ−いＶｅｂｅｒ　）　（ウェーバ −（Ｗｅｈｅｒ　）　、Ｋ、およびオスポーン（０ｓｈｏｒｎ　）　、八ｆ。

（１９６９）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス）　リイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　２２４　：４４０６）の改良法に従って゛、ドデシル硫酸ナトリウム中におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、精製したべん毛抗原を、その単量体サブユニットに分割し、それらの分子量を決定した。

以下に示す表中に、個々の株と関連したそれぞれのＨ−血清型のべん毛（Ｈ）抗原を、対応するそれらのアミノ酸組成およびそれらの分子量と共に例示した。ト的に分解するので、存在している場合でも表中には示されていない。

べん毛抗原分子のアミノ酸番号Ｃ）　Ｎ−末端アミノ酸配列ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）−システム８９０たん白質／ペプチド配列決定器を用いて、精製した（純化）べん毛（Ｈ）抗原のＮ−末端から最初の９アミノ酸の配列を、「固相」法（Ｐ、ｚドマン（Ｅｄｍａｎ　）、Ｇ、ベツグ（Ｂｅｇｇ　）、１９６７、たん白質シークエネーター（Ａ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ　）、ヨーロピアン・ジャーナルーオブ・バイオケミストリイ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１　：８Ｏ−９１））を用いて決定した。

すべての型に関して、同じ配列が見出された。

５９３９Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　−Ｖａｌ　−Ａｓｎ　−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−１１ｅ　−Ａｌａ　−Ｄ）べん毛（Ｈ）抗原の粒子密度本発明に係るべん毛（Ｈ）抗原の粒子密度を、標品液体（蒸留水中のべん毛（Ｈ）抗原）（ｌｄ）をＣｓＣ１−グラジｘ　７　）　（ｇｒａｄｉｅｎｔ）　（ｄ＝１．１５−１．４５．ｌｉｌ／３３）に重層することにより、決定した。

”’ニア　リフ　：／７　Ｑ　Ｔ　ｉ　−ｏ−ター（Ｒｏｔｏｒ　）中で、１６時間、遠心分１ｉｉＫ　（５０，０００ｒｐｏｉ　）　Ｌ　タｐ、遠心管（７Ｔ）　ｒｉＥ　カら画分を取り、ドデシル硫酸すトリウム中にて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうことにより分析した。

試験を行なったへん毛（Ｉ（）抗原調製物のすべてにおいて、ソノ密度はｄ＝１．２８ｐ／（Ｍ　Ｔあった。

Ｅ）擬−弾性光散乱この測定は、レーザー光線を高分子溶液に作用させると、高分子によってレーザー光線が散乱されるという事実に基づく。高分子は溶媒中にて決して瞬間的な位置に停止せず、ブラウンの分子運動によって移動する。例えば、高分子がレーザーから離れていく場合には、（ドツプラー効果に従って）、散乱光の振動数は幾分低下するである−う。このような振動数の変化から、高分子の拡散に関する情報を導くことができ、それから１−流体力学的半径」を計算することができる（光子相関性分光学および速度測定法（１’ｈｏｔｏ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｐｅｃ＋ｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　ｖｅｌｏｃｉｍｅｔｒｙ　）、Ｉ（、Ｚ、クミンズ（Ｃｕｍｍｉｎｓ）およびＥ、Ｒ，ピッチ（１’１ｋｅ）、プレナム（Ｐ　Ｉｅｎｔｒｎ　）　プレス、Ｎ、Ｙ、、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ　）、１９７７）。

−２ん下、（１１”）抗ｆ、’ｌの場合に（オ、ダの流体学゛Ｉ′−径はその分子の′−ｔ′径・２表わし、（−いるのではなく、干均の大きさのパラメーリ− ÷゛・表わＩ〜でいる５、し、か１７、後名は、標品の年齢に依存するこ占が大変は一゛−）きり（，５ている。

適用した試験条（４は以下の通り７５あ１）た：散乱角：６０°、波長：　６３２，８１１＋１１　、温度：２０’Ｃｏすべこのべん尼抗原に対して、以下に示す結甲、を得た：ＮＮ２２５１４２．５９４０、５９３９．１２１０．１７００１８、拡散係数、１）　＝　８．５　’ｘ　ｌ　Ｑ−９（ｒｙｎ２／秒）、流体学半径、Ｉ（−２°５Ｘ１０　”備。

Ｆ）免疫学的分析免疫血清の調製：高度に精製されたへん毛抗原調製物、並び（ご粗製のべん毛抗原調製物を、二ｊ −−−−−−シーラント（ＮｅＮｖＺｅａｌａｎｄ　）白うさぎを免疫するのに用いた。この免疫パターンはラゲナウル（Ｌａｇｃｎａｕｒ　）およびγガビアン（Ａｇａｂｉａｎ　）が記載した方法ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２８：４３５−４４４、１９７６）に対応していた。べん毛抗原調製物（５００μｇ／ｍＱ　）と完全フ０１＋７トーＴシュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｓ　）との混合物（１８１）を含む１　ｍＱを筋肉内注射する。最初の注射の２０日後に、静脈内注射（０，５ｍＱ中にアジュバントは含まずに、たん白質調製物を５０μ、ｐ、１００μｙ１１５０ μｙ１および２５０μｙ含んでいる）を４回、３日間隔で注射した。最後の免疫の一週間後に、耳の静脈から血液を採り、４℃で放置した。４，０ＯＯＸ、９にて１５分間遠心分離して血清を得、それを０．５　ｍＱ、づつ−７０℃にて、凍結した。

免疫拡散：免疫拡散試験を以下に示した改良点以外はオウクターロニイ（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）の方法（０，オウクターロニイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎγ）、アクターバンロ働マイクロバイオロやスカンド（Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　）　（１９４９）　２６：５０７−５１５）を用いて行なった。

免疫拡散は、リン酸緩衝化生理食塩水中にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　− １００（１％）を含んでいる寒天（１％）で被覆したガラス板上で行なった。

抗体用のウェルい■ｅｌｌｓ）には、通常、血清を２０μｅ入れ、抗原用ウェルには各々の標品を１−５μｅ入れた。

高度に精製したべん毛抗原調製物をドデシル硫酸すトリウム（ＳＤＳ）（０，１％）中にて分解した。

完全な（無傷の）べん毛が寒天中に入り込むのは困難であり、洗剤を用い゛Ｃ処理することにより、抗体と単量体抗原吉の反応を硅実にした３、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）Ｘ−１００は、免疫拡散プし・−ト中で、Ｓ　Ｉ）　Ｓによって抗原血清が沈殿するのを防ぐ。免疫拡散プレートを湿度相中で、３０℃において２４時間、インキュベーションする。。

免疫電気泳動：免疫電気泳動は、Ｂ、ウイーケ（Ｗｅｅｋｅ　）による指針（定量的免疫電気泳動のマニュアル、方法および応用（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｒｅｓｉｓ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）、アクセルゼン（Ａｘｅｌｓｅｎ　）　、クロール（Ｋｒｏｉｌ）、ウイーケ（Ｗｅｅｋｅ　）　、編、ユニバーサイテットスフオルラゲット（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｆｏｒｌａｇｅｔ　）　、オス口（Ｏｓｌｏ　）、１９７３、ｐｐ、１５−３７）に従って行なった。

原則として、本方法は、最初に、たん白質混合物（上記の場合には、高度に精製したべん毛抗原）を緩衝化し、たアガロースゲル中で、Ｓ　ｌ）　Ｓゲル電気泳動にかけて電気泳動的に分離し、この分離操作の後、沈殿している免疫血清（この場合においては、粗製の、および高度Ｉご精製し、７たべん毛（ｘ−ｉ　）抗原に対するうさぎの抗血清）を１つの槽内にて、分離したたん白質の移動方向と並行に導入することを特徴としている。

続いて、抗原および抗血清がトリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ　）　Ｘ　−１００（１饅）　を含むアガロースゲル中で、相関的に拡散すると、それらが接触した位置でアーチ形の沈降帯が生成するので、その沈降帯の数、位置、および形により、抗原混合物の組成を考察する。

免疫拡散の結果；オウクターロニイ（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）試験においては、高度に精製したべん毛は各々、それらのホモローガス（均質）な抗血清に関しては、この抗血清が粗製のべん毛抗原調製物に対するものであるか、高度に精製したべん毛抗原調製物に対するものであるかには関係なく、１本の沈降帯を示した。

免疫電気泳動の結果：シュードモナス・アエルギノサ株（Ｍ−２，１２１０゜５９３９，５９４’Ｏ１５１４２，１７００１８）の高度に精製したべん毛抗原調製物に関する免疫電気泳動は、粗製のべん毛抗原調製物に対するホモローガスな抗血清を用いた場合と同様に、それぞれの高度に精製したべん毛抗原調製物に対するホモローガスな抗血清を用いた場合にも、１本の沈降帯を示した。

第２図は、ウイーケの１次元免疫電気泳動による沈降帯を示し、第３図は、オウクターロニイの免疫拡散による沈降帯を示している。

第２図かられかるように、Ｎ１−２株に対応するべん毛標品１．１７００１８株に対応するべん毛標品２．１２１０株に対応するべん毛標品３．５１４２株に対応するべん毛標品４．５９４０株に対応するべん毛標品５、および５９３９株に対応するべん毛標品６を、各々、ゲルストリ゛／プの穴（Ｘ）に適用し、電気泳動を行なった後、各々の抗血清ａ−ｆを溝（スロット）の中にピペットで移した。図示したように、ただ１本の沈降帯のみが生成し、従って、６つのべん毛標品５はすべて純品であることがわかった。

第３図には、Ｍ−２，１７００１８，１２１０，５１４２，５９４０および５９３９の各べん毛型について、関連の抗血清を用いた１試験を行った結果が示されている。寒天平板の穴Ｘの各々にべん毛標品を適用し、穴Ｚにそれぞれの抗血清を適用した。この場合にも、単一の強い沈降帯のみが生じており、このことは、全ての６ベん毛標品が純粋であることを証明するものである。

ＦＩＧ、　１国際調え報告 ′＋ｌ＋″′−八″″′Ｌ管へ−ＰＣＴ７ＡＴ　Ｂ６ｆ■司ご

Claims

【特許請求の範囲】

１．単量体成分からなる多分散系の天然緑膿菌べん毛（Ｈ）抗原であつて、各単量体成分が、ａ）アミノ酸：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（ＧＩｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フエニルアラニン（Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）を含むと共に、トリプトフアン（Ｔｒｐ）を含むこともあり、ｂ）式：アラニン（Ａｌａ）−ロイシン（Ｌｅｕ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−イソロイシン（Ｉｌｅ）−アラニン（Ａｌａ）で示されるＮ末端アミノ酸配列を有し、ｃ）分子量が４３，５００〜５３，０５０であり、ｄ）プロリン、メチオニン、セミーシスチンおよびヒスチジンを含まないことを特徴とするべん毛（Ｈ）抗原。
２．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、およびアルギニンを６４：３３：３５：４２：４４：６８：２９：２９：３７：３：１０：１９：１５の割合で含み、分子量が４３，５００であることを特徴とするＨ−血清型がａ０、ａ３、ａ４である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。
３．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジンおよびアルギニンを６９：３５：３８：４４：４７：７３：３０：３０：６０：３：１２：２１：１６の割合で含み、分子量が４６，７００であることを特徴とするＨ−血清型がａ０、ａ３である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。
４．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジンおよびアルギニンを７４：５０：４９：４９：４９：８９：３７：２９：４４：５：１４１７：１６の割合で含み、分子量が５２，７２０であることを特徴とするＨ−血清型がａ０である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。
５．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニンバリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジンおよびアルギニンを７４：４８：４８：４９：５１：９１：３８：３０：４３：４：１３１８：１８の割合で含み、分子量が５３，０５０であることを特徴とするＨ−血清型がｂである第１項に記載のべん毛（Ｈ）抗原。
６．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジンおよびアルギニンを７６：４４：４０：５２：５０：８１：３２：３２：４１：４：１２２０：１８の割合で含み、分子量が５１，２５０であることを特徴とするＨ−血清型がａ０、ａ１、ａ２である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。
７．単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジンおよびアルギニンを６８：４１：３７：４６：４４：７３：２９：２９：３７：３：１０１６：１６の割合で含み、分子量が４５，９００であることを特徴とするＨ−血清型がａ０、ａ２である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。
８．ラゲナーおよびアガビアンによる免疫パターンに従い、多価の、または単価の抗体をウサギ内で誘導するものであることを特徴とする第１項〜第７項のいずれかに記載のべん毛（Ｈ）抗原。
９．オウクターロニイによる免疫拡散試験またはウイ一ケによる免疫電気泳動試験において、多価および／または単価の抗体に関して単一の沈降帯を形成するものであることを特徴とする第１項〜第８項のいずれかに記載のべん毛（Ｈ）抗原。
１０．シユードモナス・アエルギノサ細菌培養物から第１項〜第７項のいずれかに記載の多分散系の天然緑膿菌べん毛（Ｈ）抗原を回収する方法であつて、該細菌培養物またはその画分を洗剤で処理し、多分散系天然べん毛抗原を、該細菌培養物から分離することを特徴とする方法。
１１．洗剤として胆汁酸塩、特にデオキシコレートを使用することを特徴とする第１０項に記載の方法。
１２．該細胞培養物を洗剤で処理する前に、該細菌培養物を、好ましくは、せん断力処理により分解し、画分に分けることを特徴とする第１０項に記載の方法。
１３．該細菌培養物に洗剤を加えた後、該細菌培養物をクロマトグラフイー処理、または精製処理に付すことを特徴とする第１０項に記載の方法。
１４．該細菌培養物を該クロマトグラフイー処理に付す前に予備精製し、該細菌培養物から、細菌および、顕微鏡的に観察可能な細菌粒子を分離しておくことを特徴とする第１３項に記載の方法。
１５．遠心加速度５，０００ｘｇで遠心分離し、分離した沈殿物を捨てることにより予備精製することを特徴とする第１４項に記載の方法。
１６．洗剤で平衡化したモレキユラー・シーブをクロマトグラフイー処理に使用することを特徴とする第１３項に記載の方法。
１７．クロマトグラフイー処理し、精製したべん毛抗原をさらにカラムクロマトグラフイーにかけて精製し、存在の可能性のある洗剤を除去して純度９０％以上のべん毛抗原を得ることを特徴とする第１３項〜第１６項のいずれかに記載の方法。
１８．第２のクロマトグラフイー処理をも、セフアデツクスまたはＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ　ＳＭ４などの吸着ゲルを用いて行なうことを特徴とする第１７項に記載の方法。