FI85221B - Foerfarande foer framstaellning av nya nativa pseudomonas-flagella(h)-antigener. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av nya nativa pseudomonas-flagella(h)-antigener. Download PDFInfo
- Publication number
- FI85221B FI85221B FI863677A FI863677A FI85221B FI 85221 B FI85221 B FI 85221B FI 863677 A FI863677 A FI 863677A FI 863677 A FI863677 A FI 863677A FI 85221 B FI85221 B FI 85221B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antigens
- flagella
- threonine
- alanine
- amino acids
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
5 85221
Menetelmä uusien, natiivisten Pseudomonas-flagella(H)-antigeenien valmistamiseksi
Keksintö liittyy uusiin polydispersiin natiivisiin Pseudomonas-flagella (H)-antigeeneihin (FAg). Etenkin keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista menetelmää niiden valmistamiseksiPseudomonas aeruginosa-bakteeriviljelmistä.
10
Pseudomonas aeruginosa-bakteeri on opportunistinen, patogeeninen taudinaiheuttaja, jota esiintyy usein sairaalainfektioissa, pääasiassa potilaissa, joilla on heikentynyt vastustuskyky, kuten palovammoista kärsivissä potilaissa, hen-15 kilöissä, jotka sairastavat systistä fibroosia tai joilla on orgaanisia virhetoimintoja, ja syöpäpotilaissa. Antibiootit tehoavat vain rajoitetusti Pseudomonas-infektioihin resistenssin esiintymisen johdosta, mistä syystä pyritään käyttämään immunologisia menetelmiä Pseudomonas aeruginosan ai-20 heuttamien infektioiden torjuntaan.
Infektioita voivat laukaista useat kannat, jotka tuottavat O-ryhmäantigeenejä ja H-antigeenejä. Ansorgin H-antigeeni-kaavion mukaisesti (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228 25 - 238 (1978) käytettäessä immunofluoresenssitekniikkaa dif- ferentioidaan Pseudomonas aeruginosan kohdalla kompleksinen flagella (H)-antigeeni, jossa on osa-antigeenit a0, a,, a 2, a3, a4, ja yhtenäinen flagella (H)-antigeeni b. Osatekijät a0 - a4 ovat itsenäisiä determinantteja, niin että tuloksena 30 syntyy useita H-tyyppejä sisältävä flagellaarinen antigeeni- kaavio. O-ryhmillä ja H-tyypillä on vapaita yhdistelmiä.
Pseudomonas aeruginosa-bakteeriviljelmien valmistukseen käytettävät kannat ja tuotetut antigeenit esitetään seuraavassa • 35 taulukossa.
2 85221
Kanta H-tyyppi 1 170001 - b M-2 - b 5 2 5142 - a0 3 5940 - a0, a2 4 5939 - a0, a3 5 5933 a0, aj , a2 1210 - a0, a,, a2 10 6 170018 “ a3, a^
Yllä mainitut Pseudomonas-bakteerikannat ovat saatavissa seuraavasti: 15 Julkaisussa Acta Microbio. Acad. Sei. Hung. 23 (1976) 337 on kuvattu bakteerikannat 170001 ja 170018. Julkaisussa J. Infect. Diseases 131 (1975) on puolestaan esitetty 1210-kanta ja julkaisussa Infection and Immunity 35 (1982) 281 Pseudomonas M-2-kanta. Bakteerikanta 5142 on talletettu Pariisissa 20 sijaitsevaan talletuslaitokseen, Collection de 1'Institute
Pasteur, josta näytteitä on saatavissa. Kannat 5933, 5939 ja 5940 on talletettu American Type Culture Collection (ATCC) -nimiseen talletuslaitokseen ja niiden talletusnumerot ovat seuraavaat: - 25 5933 ATCC 33348 5939 ATCC 33354 5940 ATCC 33355 30 Kaikki yllä mainitut bakteerikannat olivat yleisesti saata vissa tämän hakemuksen tekemisajankohtana.
Flagelliantigeenien eristetyt säikeet, jotka voidaan ottaa talteen ravistelemalla, homogenoimalla ja tämän jälkeen suo-.-:35 ritettavalla linkouksella (R. Ansorg, W. Schmitt, Med. mic- robiol. Immunol. (1980) 168: 217-226), koostuvat flagelleis- ta ja flagelliosista yhdistettynä kompleksiin, joka koostuu 3 85221 lipopolysakkarideista (LPS) ja ravintoväliaineesta peräisin olevista epäpuhtauksista; tällaiset valmisteet ovat luonnostaan pyrogeenisia eikä niitä voida käyttää ihmisissä.
5 On tunnettua valmistaa Pseudomonas-rokotteita Pseudomonas- infektioiden torjumiseksi, jolloin lähtöaineina käytetään Pseudomonas aeruginosa-bakteerimassoja ja/tai viljelysuodok-sia, joita saadaan viljelemällä mikro-organismeja pintavil-jelmissä tai pinnanalaisesti kompleksisissa ravintoväliai-10 neissa. Näissä kompleksisissa ravintoväliaineissa on käytet ty hiili- ja energialähteen (useimmiten hiilihydraattien) ja olennaisten ravintosuolojen lisäksi mitä erilaisimpia uutteita ja/tai eläin-, mikrobi- tai kasviproteiinien hydroly-saatteja (niin kutsuttuja peptoneja). Tällaisten ravinto-15 liuoksen täydennysaineiden tarkkaa koostumusta ei ole määri telty ja ne saattavat lisäksi vaihdella erästä toiseen. Ne sisältävät aminohappojen lisäksi myös epätäydellisesti hajaantuneita proteiiniosia ja niiden määrittelemättömiä komplekseja ja niiden oleellinen tehtävä on aminohappo- ja 20 kasvuainetarpeen kattaminen. Viljelmän emäliuokset sisältä vät tästä syystä aina runsaasti aineita, jotka eivät ole peräisin bakteereistä, mikä on haitallista siksi, että Pseudomonas aeruginosan flagella(H)-antigeenin valmistamiseksi tarvitaan yhä useampia viljelyasteen mukaisesti . . 25 säädettäviä erotusasteita, jotta flagella(H)-antigeeni voi daan vapauttaa mahdollisimman pitkälti ravintoväliaineesta peräisin olevista epäpuhtauksista.
Raa'an flagellaarisen materiaalin erotus bakteerisuspensios-io ta on suoritettu sekoittimessa niin kutsutun "shearing"-me- netelmän avulla, s.o. antamalla leikkuuvoimien vaikuttaa bakteerisuspensioon. Tämän jälkeen lingotaan 15.000 x g:ssä - 18.000 x g:ssä, pelletti heitetään pois ja emäliuos, joka sisältää raa'an flagellivalmisteen, alistetaan keskipakois-35 kiihdytykseen, joka on vähintään 40.000 x g, 1 tunti, tai 100.000 x g, 20 min. Tällöin saadaan raaka antigeeni pellettien muodossa. Se sisältää, kuten edellä jo mainittiin, mm.
4 85221 lipopolysakkarideja (LPS), nukleiinihappoja, erilaisia suoloja, polysakkarideja ja ei-flagellaarisia proteiineja, jotka vaikuttavat epäsuotuisasti siitä valmistettujen rokotteiden tehokkuuteen ja siedettävyyteen. Flagella(H)-5 antigeeniä ei ole vielä tähän mennessä voitu eristää puhtaa na (T.L. Pitt, J. Med. Microbiol. (1981), 14: 251 - 260).
Keksinnön tarkoituksena on välttää esitetyt haitat ja vaikeudet ja keksinnön tehtävänä on valmistaa polydisperssejä 10 natiivisia flagella(H)-antigeenejä (FAg), jotka ovat erit täin puhtaita ja vapaita pyrogeenisistä aineista.
Nämä keksinnön mukaan aikaansaatavat erittäin puhtaat FAg-antigeenit koostuvat monomeerisistä osista, jolloin jokainen 15 osa a) sisältää seuraavat aminohapot: asparagiinihappo (Asp), treoniini (Thr), seriini (Ser), glutamiinihappo (Glu), gly-siini (Gly), alaniini (Ala), väliini (Vai), isoleusiini (Ile), leusiini (Leu), tyrosiini (Tyr), fenyylialaniini 20 (Phe), lysiini (Lys), arginiini (Arg) ja mahdollisesti tryp- tofaani (Trp), b) sisältää N-terminaalisen aminohapposekvenssin alaniini (Ala) - leusiini (Leu) - treoniini (Thr) - väliini (Vai) -asparagiini (Asn) - treoniini (Thr) - asparagiini (Asn) - 25 isoleusiini (Ile) - alaniini (Ala), c) sen molekyylipaino on 43.500 - 53.050 daltonia ja d) se on vapaa proliinista, metioniinistä, puolikysteiinistä ja histidiinistä.
30 Ykstyiskohtaisesti keksinnön mukaisesti luonnehditaan kuusi spesifistä H-serotyyppiä, nimittäin - H-serotyypin a0, a3, a4 flagella (H)-antigeeni, jonka mono-meerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, /..35 väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialanii ni, lysiini ja arginiini suhteessa 64 : 33 : 35 : 42 : 44 : 68 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 19 : 15 ja jonka mole- 5 85221 kyylipaino on 43.500, - H-serotyypin a0, a3 flagella(H)-antigeeni, jonka monomee-rinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treo-niini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, 5 väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialanii- ni, lysiini ja arginiini suhteessa 69 : 35 : 38 : 44 : 47 : 73 : 30 : 30 : 60 : 3 : 12 : 21 : 16 ja sen mole-kyylipaino on 46.700, - H-serotyypin a0 flagella(H)-antigeeni, jonka monomeerinen 10 muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 74 : 50 : 49 : 49 : 49 : 89 : 37 : 29 : 44 : 5 : 14 : 17 : 16 ja jonka molekyylipaino on 15 52.720, - H-serotyypin b flagella(H)-antigeeni, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini 20 ja arginiini suhteessa 74 : 48 : 48 : 49 : 51 : 91 : 38 : 30 : 43 : 4 : 13 : 18 : 18 ja jonka molekyylipaino on 53.050, - H-serotyypin a0, a,, a2 flagella (H)-antigeeni, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, 25 treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 76 : 44 : 40 : 52 : 50 : 81 : 32 : 32 : 41 : 4 : 12 : 20 : 18 ja jonka molekyylipaino on 51.250, 30 - H-serotyypin a0, a2 flagella(H)-antigeeni, jonka monomee rinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 68 : 41 : 37 : 46 : 44 : .;.35 73 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 16 : 16 ja jonka molekyyli- paino on 45.900.
6 85221
Keksinnön kohteena on etenkin menetelmä esitettyjen polydis-perssien natiivisten Pseudomonas flagella(H)-antigeenien valmistamiseksi Pseudomonas aeruginosa-bakteeriviljelmistä, jonka menetelmän mukaan bakteeriviljelmät käsitellään deter-5 gentillä ja polydisperssit natiiviset flagella-antigeenit erotetaan kromatograafisesti viljelmistä.
Lisäämällä detergenttiä saadaan aikaan antigeenin erottuminen bakteerimassasta ja erotetaan tällöin liuoksessa olevat 10 antigeenit. Detergenttinä käytetään edullisesti sappihapon suolaa, etenkin deoksikolaattia.
Tällöin bakteeriviljelmä voidaan hajottaa joko ennen deter-gentillä suoritettavaa käsittelyä, alistaa etenkin "shea-15 ring"-menetelmään tai alistaa detergentin läsnäollessa leik- kuuvoimille.
Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti tapahtuu polydis-perssien natiivisten flagella(H)-antigeenien eristäminen 20 bakteeriviljelmästä kromatograafisen käsittelyn tai vastaa vasti puhdistuksen avulla, jolloin pidätetään epäpuhtauksina esiintyvät makromolekyylit, etenkin lipopolysakkaridit, nukleiinihapot, suolat, polysakkaridit jne.
25 Eräässä suositeltavassa keksinnön mukaisen menetelmän muun nelmassa hajotettu bakteeriviljelmä esipuhdistetaan ennen kromatograafista käsittelyä, jolloin viljelmästä poistetaan bakteerit ja mikroskoopilla nähtävät bakteeriosat. Tämä esi-puhdistus voidaan suorittaa linkoamalla keskipakoiskiihdy-30 tyksellä, joka on korkeintaan 5.000 x g, eronnut sedimentti heitetään pois ja emäliuosta käsitellään edelleen.
Kromatograafiseen käsittelyyn käytetään etenkin molekyyliseu-laa, joka on tasapainotettu detergentin kanssa. Eräs sopiva ..35 molekyyliseula on Sephacryl.
Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä toisessa edullisessa 7 85221 muunnelmassa kromatograafisesti käsitelty ja siten puhdistettu flagellaarinen antigeeni puhdistetaan edelleen pylväskro-matografisesti mahdollisesti esiintyvän detergentin poistamiseksi, jolloin saadaan flagella(H)-antigeeni, jonka puh-5 taus on > 90 %. Tällöin myös toinen kromatograafinen käsitte ly suoritetaan molekyyliseulalla, kuten Sephadexilla, tai ei-polaarisella polystyreeniadsorptiogeelillä, kuten BIO-BEADS SM-4:llä.
10 Keksinnön mukaista menetelmää selitetään nyt lähemmin seu- raavan suoritusesimerkin avulla:
Kasvatettiin Pseudomonas aeruginosa M-2:n bakteeriviljelmä (valittu alussa esitetyistä bakteerikannoista) seuraavan 15 koostumuksen omaavassa ravintoliuoksessa: dinatriumsukkinaattia 4,05 g/1 dikaliummonovetyfosfaattia 7 g/1 kaliumdivetyfosfaattia 3 g/1 20 ammoniumvetyfosfaattia 1 g/1 magnesiumsulfaattia . 7 H20 0,05 g/1 rauta(III)kloridia 0,0025 g/1 kunnes solutiheys oli 2 - 3 x 109 solua/ml, ja pidettiin - 25 käyttämällä 0,2 μ:n laimennusmäärää 96 tuntia kestävässä fermentoinnissa vakiona 10 %:n happiosapaineessa (p02) ja sekoittaen.
Fermentointilaitteesta jatkuvasti poistettu bakteeriviljelmä 30 käsiteltiin fermentointilaitteen kanssa yhdessä toimivassa ultrasentrifugissa, jonka roottorin vastaanottokyky oli 660 ml (0,45 kg kosteaa massaa) ja keskipakoiskiihdytys oli 18.000 x g, jolloin käytettäessä 0,2 μ:η laimennusmäärää 96 tunnin kuluttua voitiin kerätä niin paljon biomassaa, että . 35 siitä saatiin 149 mg raakaa flagellaarista antigeeniä sen jälkeen, kun se oli alistettu leikkuuvoimien vaikutukseen sekoittimessa ja solut ja soluosat oli poistettu 15.000 x 8 85221 g:ssä - 18.000 x g:ssä ultrasentrifugin pelletistä.
18 mg saatua raakaa flagellaarista antigeeniä liuotettiin 12 ml:aan 30 nM tris-HCl-puskuriliuosta, jonka pH-arvo oli 5 7,0 ja johon oli lisätty 20 mg/ml deoksikolaattia, ja levi tettiin pylväälle (16 x 16 cm), joka oli täytetty Sephacryl S-1000:lla ja tasapainotettu 30 nM tris-HCl-puskurilla, pH, 7,0, johon oli lisätty 2 mg/ml deoksikolaattia. Tämän jälkeen kerättiin 2 ml:n fraktioita ja rekisteröitiin eluointi-10 kaavio seuraamalla ekstinktiota 280 ja 254 nm:ssä. Kolonnin ajo on havainnollistettu oheisessa kaaviossa (kuvio 1). Kirjaimella A merkitty käyrä on rekisteröity käyttämällä ekstinktiota 254 nm:ssä ja kyvettiä, jonka läpimitta oli 1 mm; kirjaimella B merkitty käyrä on rekisteröity käyttämällä 15 ekstinktiota 280 nm:ssa ja kyvettiä, jonka läpimitta oli 20 mm. Absorptiokäyrässä, joka on kohdassa 280 nm, voidaan nähdä selvästi antigeeni-piikki.
Puhdistetun flagella(H)-antigeenin sisältävä liuos puhdis-20 tettiin sitten toistamiseen ensimmäisestä puhdistusvaiheesta jäljelle jääneen deoksikolaatin poistamiseksi, jolloin käytettiin joko pienen silloitusasteen omaavaa molekyyliseulaa, esim. Sephadex G-25:tä, tai adsorptioainetta, esim. BIO-BEADS SM-4:ää. Tässä käsittelyssä erotettiin DOC ja saatiin 25 flagellaarinen antigeeni, jonka puhtaus oli yli 98 % ja jossa oli pyrogeenisiä aineita (LPS) alle 1 %.
Samalla tavalla voidaan kehittää muiden alussa esitettyjen kantojen bakteeriviljelmiä ja näistä saada vastaavalla ta-30 valla yksittäiset H-tyyppiantigeenit puhtaassa muodossa.
Tällöin on osoittautunut, että FAg:n saanto riippuu kannan valinnasta. Määrätyt kannat, kuten 5933 (a0, a,, a2) ja 1210 (a0, a,, a2) tuottavat suurempia solusaantoja kuin 170001 (b) ja M-2 (b).
Yksittäisten keksinnön mukaisesti luonnehdittujen flagella (H) -antigeenien ominaisarvot, jotka ovat polymeerisiä .35 9 85221 yhdisteitä ja koostuvat monomeerisistä osista, määritettiin seuraavalla tavalla: A) Aminohappoanalyysi 5
Flagella(H)-antigeenien koko aminohappokoostumuksen analysoimiseksi hydrolysoitiin näytteitä peptidisidosten katkaisemiseksi. Tällöin käytettiin proteiinihydrolyysin standardimenetelmää (6 N HC1, 110°C, 22 tuntia) (C.H.W. Hirs, Met-10 hods in Enzymology, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, Editors-in- chief, Volume XI, Enzyme Structure, p. 59-62, C.H.W. Hirs; ed. 1967, Academic Press).
Tutkimukset suoritettiin Beckman System 6300-aminohappo-15 analysaattorissa. Aminohappokoostumuksen tulosten perusteel la laskettiin monomeeristen alayksikköjen molekyylipaino.
B) Puhtaus ja molekyylipaino 20 Keksinnön mukaisten antigeenien puhtaus tai vastaavasti vapaus epäpuhtauksista tarkastettiin polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa (A.L. Shapiro, E. Vinuela, J. Maizel, Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1967), 28, 815).
25
Elektroferogrammi värjättiin "silver-staining"-menetelmällä (Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A. and Ebert, M.H., Science (1981), 211: 1437). Sillä oli kaikkien niiden tutkittujen flagella(H)-antigeenien kohdella yksi ainoa kaista, 30 jotka olivat kulkeneet seuraavassa esitetyn menetelmän mu kaisesti molekyylipainojensa johdosta määrätyn vaellusvälin. Mitään viitteitä LPS:stä ei voitu todeta.
Käytettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesia natriumdode-35 kyylisulfaatissa Osbornin ja Weberin muunnelman mukaisesti (Weber, K. ja Osborn, M. (1969) J. Biol. Chem. 244: 4406) puhdistettujen flagella(H)-antigeenien lohkaisemiseksi nii- ίο 8 5221 den monomeerisiksi alayksiköiksi ja niiden molekyylipainon määrittämiseksi.
Seuraavassa taulukossa on esitetty kulloinkin kyseessä ole-5 van H-serotyypin yksittäisille kannoille järjestetyt flagel la (H) -antigeenit niiden aminohappojen vastaavan koostumuksen ja niiden molekyylipainon kanssa. Mahdollisesti esiintyvää tryptofaania ei ole taulukossa esitetty, koska se hajoaa kokonaan tai osittain hydrolyysissä.
10 11 85221 O (N o
*3· (O O
tn oi-ir'-iDN'rointnr^rooiDiooooo <n <n m m soN'roN'N't^-CNcNro ,—t .—t ·—t n· · 4-i o n· in .C nJ n· O j* c ' :rd (1> cn
H a) O (0 O
rH C r—I » LO
>1 -H (N i—I ID^OCNOrHCNCNi—INiCNOOOOOOO CN<N
>i 0) i—4 3 h^^uiinoanM·'» h o· M Λ m h 0) CU o in rH >, 3 0 >1__ S -fc> 1 o C 1-1 o •h a; (n m i-ι to I Xl TfooootnHrHooornTrmoooooooo m o ι-t l S r-^Tr^incyimm^r rHi-tr-t cn QJK in ro
Cji in
(0 (U
i-h C- C3 -Ή ""^^~~ >
:3 3 cn O
>~l r-l TT CN
:3 3 γηο ^3·οσι<τΐ(ΤΐσιΓ^σι·«ί·ιητ9<Γ^ιοοοοο cn r-~ :nj 3 in m r^in^^rroorocN·"» rHi-tr-t cn· §M in cn in
ϋ C
3 <D ____ r-l K -
--H
C —t σι ro o <u to ro (0 σ •n tn tnmoooir^roooorocNrHiooooo αο r» O (0 in» vororON'N'r'-POroiO rl (N H r* ·
CU -U o N ID
CU C 3 N· 3 3 K «__ o c n· •h oo 3 o E f—4 » o < o ro N'roincN^rootntnr^roocninoooo o in 03 mroro-NNiocNCNro r-irHrH in· r» » Tf ro i-H O Ν' 3
O II
Oi 0 Ή a cu c cu 3 CU ί-ι-ηϊ
-C 3 -h C
H £ -H C -H
-3 C -H C 3 Ή -H -H
0 Ή -H C -H -ι-l r-4 -H C 4-4 C
CU -H C "H -H -H -H -H C 3 C -H --4 tfl -H
3 tJl -r4 -H -M C C Ή tO C -H -H -H -rl C -H >4 -H
K 3 -H C 6 -H -H C 3 -H -H rH C -H -H C J* Ό
O 3 C -3 3 -3 -r4 -H 3 -3 to >4 -H c -H O *3 -H
C 3 O -H 4-> to G "4 H 0} O >1 ή -H 4-1 -H rH 4J
-3 CUO)33>i3i-l033Clfla40-30iO
g M 3 0)4—li—Ιι—I 3lfl 3 >itU >i33 0)3 "rl
< Ct4WOC5rt:>iHiJE-ipL43)i<<(USCUK
: o m o
in r- 4- CN
12 85221 C) N-terminaalinen aminohapposekvenssi
Beckman-System 890 Protein/Peptide Sequencer-laitteella määritettiin "solid phase"-menetelmällä (P. Edman, G. Begg, 5 1967, A protein sequenator, Eur. J. Biochem. 1:80-91) puh distettujen flagella(H)-antigeenien N-terminaalisen pään ensimmäisen yhdeksän aminohapon sekvenssi. Kaikissa tyypeissä voitiin todeta sama sekvenssi.
10 M-2 λ 5142 5939 Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Thr-Asn-Ile-Ala- 1210 170018
15 5940 J
D) Flagella(H)-antigeenien hiukkastiheys
Keksinnön mukaisten flagella(H)-antigeenien hiukkastiheys 20 määritettiin siten, että l ml näytenestettä (flagella(H)-an tigeeni tislatussa vedessä) päällystettiin CsCl-gradientilla (d = 1,15 - 1,45 g/cm3) .
Linkous suoritettiin 50.000 rpm:ssä Beckman 70 Ti-Rotor-25 laitteessa 16 tunnin kuluessa, minkä jälkeen fraktiot pois tettiin sentrifugiputkien pohjasta ja analysoitiin poly-akryyliamidigeelielektroforeesin avulla natriumdodekyyli-sulfaatissa.
30 Kaikkien flagella(H)-antigeeni-valmisteiden tiheys oli d = 1,28 g/cm3.
E) Kvasielastinen valonhajonta '35 Määritys perustuu siihen, että laservalon vaikuttaessa mak- romolekyyliseen liuokseen valo hajaantuu molekyyleistä. Molekyylit eivät koskaan säilytä liuottimessa senhetkistä i3 85221 paikkaansa, vaan ne liikkuvat Brownin molekyyliliikkeen johdosta. Jos molekyylit liikkuvat esim. laserista poispäin, niin hajaantunut valo pienenee hieman taajuudeltaan (Dopp-lerin ilmiön mukaisesti). Tästä taajuuden siirrosta voidaan 5 johtaa informaatioita molekyylien diffuusiosta ja laskea tästä "hydrodynaaminen säde" (Photon correlation spectroscopy and velocimetry, H.Z. Cummins and E.R. Pike, Plenum Press, N.Y., London, 1977).
10 Flagella(H)-antigeenin ollessa kyseessä hydrodynaaminen säde ei merkitse molekyylin sädettä, vaan keskimääräistä suurepa-rametriä. Tämä riippuu kuitenkin selvästi näytteen iästä.
Tutkimusolosuhteet olivat seuraavat: hajontakulma: 60°, aal-15 lonpituus: 632,8 nm, lämpötila: 20°C. Tuloksena saatiin kai kille flagella-antigeeneille: M-2, 5142, 5940, 5939, 1210, 170018 diffuusiokertoimeksi D = 8,5 x 10'9 (cm2/sek.) ja hydrodynaamiseksi säteeksi R = 2,5 x 10'5 cm.
20 F) Immunologiset analyysit
Immuuniseerumin valmistus:
Raakoja, sekä erittäin puhtaita flagella-antigeeni-valmis-teita käytettiin valkoisten New Zealand-kanien immunisoin-25 tiin. Immunisointikaavio vastasi Lagenauerin ja Agabianin esittämää menetelmää (J. Bacteriol. 128: 435-444, 1976). Tällöin injektoitiin intramuskuläärisesti 1 ml, joka koostui flagella-antigeeni-valmisteen (500 μg/ml) 1:1-seoksesta ja komplettista Freundin adjuvantista. 20 päivän kuluttua en-30 simmäisestä injektiosta injektoidaan 3 päivän jaksoin 4 i.v.-injektiota, jotka sisälsivät 50, 100, 150 ja 250 pq proteiinivalmisteita 0,5 ml:ssa ilman adjuvanttia. Viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista otettiin verta korva-laskimosta ja annettiin seistä 4°C:ssa. Seerumi otettiin 35 talteen linkoamalla 4.000 x g, 15 min. ja jäädytettiin 0,5 ml:n annoksina -70°C:ssa.
i4 85221
Immunodiffuusio:
Immunodiffuusiotutkimukset suoritettiin lukuunottamatta seu-raavassa esitettyä muunnelmaa Ouchterlonyn menetelmän mukai-5 sesti (0. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand. (1949) 26: 507-515).
Immunodiffuusio suoritettiin lasilevyillä, jotka oli päällystetty 1 % agaroosilla, joka sisälsi 1 % Triton X-100:aa 10 fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa.
Vasta-aineiden syvennykset sisälsivät tavanomaisesti 20 μΐ seerumia, antigeenisyvennykset sisälsivät 1 - 5 μΐ vastaavia näytteitä. Erittäin puhtaat flagella-antigeeni-valmisteet 15 hajotettiin 0,1 %:sessa natriumdodekyylisulfaatissa (SDS).
Intaktit flagellit pystyivät vain vaivoin tunkeutumaan aga-roosiin ja käsittelemällä detergenssillä varmistettiin, että vasta-aineet reagoivat monomeeristen antigeenien kanssa.
20 Triton X-100 estää immunodiffuusiolevyillä antiseerumin SDS:n aiheuttaman presipitoitumisen. Immunodiffuusiolevyjä inkuboidaan kosteuskaapissa 30°C:ssa 24 tunnin ajan.
Immunoelektroforeesi: : 25
Immunoelektroforeesi suoritettiin B. Weekin ohjeiden mukaisesti (A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Application, Axelsen, Kroll, Week, eds., Universi-tetsforlaget, Oslo, 1973, p. 15 - 37).
30
Periaatteessa tässä menetelmässä suoritetaan ensin proteii-niseoksen (tässä erittäin puhtaan flagella-antigeenin) elek-troforeettinen erotus puskuroidussa agaroosigeelissä SDS-geelielektroforeesilla ja erottamisen jälkeen presipitoitu-35 nut immuuniseerumi (tässä kanin antiseerumi raakaa ja erit täin puhdasta flagella(H)-antigeeniä vastaan) sijoitetaan yhdensuuntaisesti erotettujen proteiinien kulkusuunnan suh- is 85221 teen kaukaloon.
Antigeeni ja antiseerumi diffusoituvat agaroosigeelin läpi, joka sisälsi 1 % Triton X-100:aa, tämän jälkeen toisiinsa 5 päin ja niiden kohtaamiskohdissa muodostuu kaarevia saostus- viiruja, joiden määrä, asema ja muoto antavat kuvan antigee-niseoksen koostumuksesta.
Immunodiffuusion tulokset: 10
Erittäin puhtailla flagelliineillä oli Ouchterlony-testissä kulloinkin yksi ainoa presipitaattikaista niiden homologisen antiseerumin suhteen, samantekevää, oliko tämä antiseerumi suunnattu flagella-antigeeni-valmistetta vastaan tai erit-15 täin puhdasta flagelliiniä vastaan.
Immunoelektroforeesin tulokset:
Immunoelektroforeesissa Pseudomonas aeruginosa-kannoilla 20 M-2, 1210, 5939, 5940, 5142, 170018 oli yksi ainoa presipi taattikaista käytettäessä homologisia antiseerumeita suunnattuna vastaavaa puhdasta flagella-antigeeniä sekä myös raakaa flagella-antigeeni-valmistetta vastaan.
•25 Kuviossa 2 on esitetty Weeken mukaisen yksidimensionaalisen immunoelektroforeesin presipitaattikaistat ja kuviossa 3 on esitetty Ouchterlonyn mukaisen immunodiffuusion presipitaattikaistat.
.30 Kuten kuviosta 2 nähdään, flagelliininäytteet 1 levitettiin kannan M-2 mukaisesti, näytteet 2 levitettiin kannan 170018 mukaisesti, näytteet 3 levitettiin kannan 1210 mukaisesti, näytteet 4 levitettiin kannan 5142 mukaisesti, näytteet 5 levitettiin kannan 5940 mukaisesti ja näytteet 6 kannan 5939 ;..3 5 mukaisesti geelikaistan reikään X ja elektroforeesin jälkeen vastaavat antiseerumit (a - f) pipetoitiin rakoon. Kaikissa tapauksissa muodostui, kuten on esitetty, yksi ainoa presi- ie 85221 pitaatiokaista, mikä osoittaa kaikkien kuuden flagelliini-näytteen puhtauden.
Kuvion 3 mukaisesti jokaiselle flagellityypille M-2, 170018, 5 1210, 5142, 5940 ja 5939 suoritettiin testi kulloinkin ky seessä olevan antiseerumin kanssa. Flagelliininäyte levitettiin agarlevyn reikään X ja vastaava antiseerumi reikään Z. Myös tässä esiintyi kulloinkin vain yksi ainoa voimakas pre-sipitaatiokaista, mikä osoittaa kaikkien kuuden flagelliini-10 näytteen puhtauden.
Claims (8)
1. Menetelmä uusien, natiivisten Pseudomonas-flagella(H)-5 antigeenien valmistamiseksi, jotka antigeenit koostuvat monomeerisistä osista, jolloin jokainen monomeerinen osa a) sisältää seuraavat aminohapot: asparagiinihappo (Asp), treeniini (Thr), seriini (Ser), glutamiinihappo (Glu), glysiini (Gly), alaniini (Ala), väliini (Vai), iso- 10 leusiini (Ile), leusiini (Leu), tyrosiini (Tyr), fenyyli- alaniini (Phe), lysiini (Lys), arginiini (Arg) ja mahdollisesti tryptofaani (Trp), b) sisältää N-terminaalisen aminohapposekvenssin alaniini (Ala) - leusiini (Leu) - treoniini (Thr) - väliini (Vai) - 15 asparagiini (Asn) - treoniini (Thr) - asparagiini (Asn) - isoleusiini (Ile) - alaniini (Ala), c) sen molekyylipaino on 43.500 - 53.050 daltonia ja d) se on vapaa proliinista, metioniinistä, puolikystiinistä ja histidiinistä, 20 etenkin menetelmä uuden H-serotyypin a0, a3, a4 flagella (H)-antigeenin valmistamiseksi, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, ; 25 tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 64 : 33 : 35 : 42 : 44 : 68 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 19 : 15 ja sen molekyylipaino on 43.500, uuden H-serotyypin a0, a3 flagella(H)-antigeenin valmistami-30 seksi, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: aspara giinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 69 : 35 : 38 : 44 : 47 : 73 : 30 : 30 : 60 : 3 : 12 : 21 : 35 16 ja sen molekyylipaino on 46.700, uuden H-serotyypin a0 flagella(H)-antigeenin valmistamisek- is 85221 si, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagii-nihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, ala-niini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyyli-alaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 5 74 : 50 : 49 : 49 : 49 : 89 : 37 : 29 : 44 : 5 : 14 : 17 : 16 ja sen molekyylipaino on 52.720, uuden H-serotyypin b flagella(H)-antigeenin valmistamiseksi, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiini-10 happo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, ala- niini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyyli-alaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 74 : 48 : 48 : 49 : 51 : 91 : 38 : 30 : 43 : 4 : 13 : 18 : 18 ja sen molekyylipaino on 53.050, 15 uuden H-serotyypin a0, a,, a2 flagella (H)-antigeenin valmistamiseksi, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: asparagiinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, 20 fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 76 : 44 : 40 : 52 : 50 : 81 : 32 : 32 : 41 : 4 : 12 : 20 : 18 ja sen molekyylipaino on 51.250, tai uuden H-serotyypin a0, a2 flagella(H)-antigeenin valmistami-25 seksi, jonka monomeerinen muoto sisältää aminohapot: aspara giinihappo, treoniini, seriini, glutamiinihappo, glysiini, alaniini, väliini, isoleusiini, leusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, lysiini ja arginiini suhteessa 68 : 41 : 37 : 46 : 44 : 73 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 16 : 30 16 ja sen molekyylipaino on 45.900, jolloin flagella(H)-antigeenit indusoivat Lagenauerin ja Agabian immunisointikaavion mukaisesti kaneissa polyvalent-teja ja monovalentteja vasta-aineita, ja - 35 muodostavat polyvalenttien ja/tai monovalenttien vasta-aineiden suhteen Ouchterlonyn mukaisessa immunodiffuusio- i9 85221 testissä tai Weeken mukaisessa immunoelektroforeesitestissä yhden ainoan presipitaattikaistan, tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruginosa-5 bakteeriviljelmiä tai niiden fraktioita käsitellään detergentillä ja polydisperssit natiiviset flagella-antigeenit erotetaan kromatograafisesti viljelmistä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että detergenttinä käytetään sappihapon suolaa, eten kin deoksikolaattia.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeriviljelmä hajotetaan ennen detergenttikä- 15 sittelyä, käsitellään etenkin "shearing"-menetelmällä ja fraktioidaan.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeriviljelmä käsitellään tai vastaavasti 20 puhdistetaan kromatograafisesti detergentin lisäyksen jäl keen.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeriviljelmä esipuhdistetaan ennen kroma- 25 tografista käsittelyä erottamalla bakteerit ja mikroskoopil la nähtävät bakteerihiukkaset.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatograafiseen käsittelyyn käytetään molekyy- 30 liseulaa, joka on tasapainotettu detergentin kanssa.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatograafisesti käsitelty ja puhdistettu flagellaarinen antigeeni puhdistetaan edelleen :.35 pylväskromatograafisesti mahdollisesti esiintyvän detergentin poistamiseksi, jolloin saadaan flagella-antigeeni, jonka puhtaus on > 90 %. 20 85221
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen kromatograafinen käsittely suoritetaan molekyyliseulalla, kuten Sephadexilla, tai adsorptioaineel-la, kuten BIO-BEADS SM 4:llä. 5 2' 85221
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0007285A AT384032B (de) | 1985-01-14 | 1985-01-14 | Verfahren zur herstellung von polydispersen nativen pseudomonas-flagella(h)-antigenen (fag) |
| AT7285 | 1985-01-14 | ||
| PCT/AT1986/000002 WO1986003974A1 (en) | 1985-01-14 | 1986-01-13 | POLYDISPERSED NATIVE PSEUDOMONAS-FLAGELLA (H)-ANTIGENS (FAg) AND METHODS FOR THEIR PREPARATION |
| AT8600002 | 1986-01-13 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863677A FI863677A (fi) | 1986-09-11 |
| FI863677A0 FI863677A0 (fi) | 1986-09-11 |
| FI85221B true FI85221B (fi) | 1991-12-13 |
| FI85221C FI85221C (fi) | 1992-03-25 |
Family
ID=3480790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863677A FI85221C (fi) | 1985-01-14 | 1986-09-11 | Foerfarande foer framstaellning av nya nativa pseudomonas-flagella(h)-antigener. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4831121A (fi) |
| EP (1) | EP0208743B1 (fi) |
| JP (1) | JPH085801B2 (fi) |
| AT (2) | AT384032B (fi) |
| CA (1) | CA1263307C (fi) |
| DE (1) | DE3686961D1 (fi) |
| DK (1) | DK172329B1 (fi) |
| ES (1) | ES8800275A1 (fi) |
| FI (1) | FI85221C (fi) |
| WO (1) | WO1986003974A1 (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5237053A (en) * | 1986-06-24 | 1993-08-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Preparation active against Pseudomonas aeruginosa infections and methods of producing them |
| AT391080B (de) * | 1986-06-24 | 1990-08-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von gegen pseudomonas aeruginosa infektionen wirksamen praeparationen |
| AT390192B (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-26 | Immuno Ag | Gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen wirksame praeparationen sowie immunglobuling-h|ltige, gegen bakterium pseudomonas aeruginosa wirksame praeparationen |
| US4994161A (en) * | 1989-02-02 | 1991-02-19 | University Of New Hampshire | Apparatus and method for macromolecular charge determination |
| CA2560923A1 (en) * | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Quark Biotech, Inc. | Annexin ii and uses thereof |
| WO2009033009A2 (en) * | 2007-09-05 | 2009-03-12 | Inotek Pharmaceuticals Corporation | Antibodies against flagellin and uses thereof |
| US20100239583A1 (en) * | 2009-03-04 | 2010-09-23 | Inotek Pharmaceuticals Corporation | Antibodies against flagellin and uses thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3928565A (en) * | 1971-10-19 | 1975-12-23 | Yuzuru Homma | Pharmaceutical preparation of pseudomonas aeruginosa bacterial component possessing anti-tumor and anti-infection properties |
| JPS51133489A (en) * | 1975-05-14 | 1976-11-19 | Tokyo Daigaku | Process for producing microbial components of pseudomonas aeruginosa h aving antimicrobial and antitumor activities |
| FR2460139A1 (fr) * | 1979-06-29 | 1981-01-23 | Pasteur Institut | Fraction antigenique glycopeptidique vaccinante a tres grande immunogenicite isolee de cultures de germes pathogenes, procedes d'isolement de cette fraction et vaccins contenant ladite fraction |
| US4271147A (en) * | 1980-01-10 | 1981-06-02 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same |
| EP0048422A3 (en) * | 1980-09-15 | 1983-08-24 | Bactex Incorporated | Pili of pseudomonas aeruginosa and utilization of same as vaccines against infectionary p.aeruginosa |
| US4470924A (en) * | 1981-12-30 | 1984-09-11 | Iglewski Barbara M | Nontoxic, immunologically crossreactive toxin A protein from Pseudomonas aeruginosa |
| US4578458A (en) * | 1983-03-23 | 1986-03-25 | Brigham And Women's Hospital | Mucoid exopolysaccharide vaccine against Pseudomonas aeruginosa |
-
1985
- 1985-01-14 AT AT0007285A patent/AT384032B/de not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-13 EP EP86900707A patent/EP0208743B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-13 US US06/912,242 patent/US4831121A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-13 AT AT86900707T patent/ATE81471T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-01-13 WO PCT/AT1986/000002 patent/WO1986003974A1/de active IP Right Grant
- 1986-01-13 CA CA499444A patent/CA1263307C/en not_active Expired
- 1986-01-13 ES ES550831A patent/ES8800275A1/es not_active Expired
- 1986-01-13 JP JP61500683A patent/JPH085801B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-01-13 DE DE8686900707T patent/DE3686961D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-03 DK DK421486A patent/DK172329B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-09-11 FI FI863677A patent/FI85221C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1263307A (en) | 1989-11-28 |
| JPH085801B2 (ja) | 1996-01-24 |
| WO1986003974A1 (en) | 1986-07-17 |
| EP0208743A1 (de) | 1987-01-21 |
| ES8800275A1 (es) | 1987-11-01 |
| DE3686961D1 (de) | 1992-11-19 |
| AT384032B (de) | 1987-09-25 |
| DK421486D0 (da) | 1986-09-03 |
| EP0208743B1 (de) | 1992-10-14 |
| JPS62501363A (ja) | 1987-06-04 |
| DK421486A (da) | 1986-09-03 |
| ATE81471T1 (de) | 1992-10-15 |
| ATA7285A (de) | 1987-02-15 |
| FI85221C (fi) | 1992-03-25 |
| ES550831A0 (es) | 1987-11-01 |
| FI863677A (fi) | 1986-09-11 |
| CA1263307C (en) | 1989-11-28 |
| DK172329B1 (da) | 1998-03-23 |
| FI863677A0 (fi) | 1986-09-11 |
| US4831121A (en) | 1989-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Amano et al. | Chemical and immunological characterization of lipopolysaccharides from phase I and phase II Coxiella burnetii | |
| Fisher et al. | Proteoglycans of developing bone. | |
| Bridgen et al. | Photoreceptor protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Molecular weight and retinal binding site | |
| Kawamoto et al. | Isolation, characterization, and localization of the spanning protein from skeletal muscle triads. | |
| Bulinski et al. | Peptide antibody specific for the amino terminus of skeletal muscle alpha-actin. | |
| Irons et al. | Isolation of the lymphocytosis promoting factor-haemagglutinin of Bordetella pertussis by affinity chromatography | |
| Fraker et al. | Isolation and characterization of a bacteriochlorophyll-containing protein from Rhodopseudomonas spheroides | |
| Kelley et al. | Identification and preliminary characterization of Vibrio cholerae outer membrane proteins | |
| US4681761A (en) | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine | |
| AU614718B2 (en) | A neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin | |
| Bessler et al. | A bacteriophage-induced depolymerase active on Klebsiella K11 capsular polysaccharide | |
| FI85221B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya nativa pseudomonas-flagella(h)-antigener. | |
| Krantz et al. | Analysis of Halobacterium halobium gas vesicles | |
| EP0132125B1 (en) | A protein having antitumor activity | |
| Weckesser et al. | Porin from Rhodopseudomonas sphaeroides | |
| Wahlström | Purification and characterization of phospholipase A from the venom of Naja nigricollis | |
| Everett et al. | Characterization of lipoprotein EnvA in Chlamydia psittaci 6BC | |
| Sachdev et al. | Isolation and characterization of glycoproteins from canine tracheal mucus | |
| Six et al. | Purification and properties of two forms of staphylococcal α-toxin | |
| Marsh | Histidinoalanine, a naturally occurring cross-link derived from phosphoserine and histidine residues in mineral-binding phosphoproteins | |
| AU613932B2 (en) | Immunosuppressive polypeptides | |
| Goel | New method for the isolation of membranes from Mycoplasma gallisepticum | |
| Ceriani et al. | Characterization of differentiation antigens of the mouse mammary epithelial cell (MME antigens) carried on the mouse milk fat globule | |
| Hong et al. | Isolation and characterization of a soluble, immunoactive peptide of glial fibrillary acidic protein | |
| Furukawa et al. | Isolation and characterization of nerve growth factor from the venom of Naja naja atra |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: IMMUNO AKTIENGESELLSCHAFT |