CN87104828A - 用作疫苗和诊断标记的淋病奈瑟氏菌植物凝血素及其制备方法 - Google Patents

用作疫苗和诊断标记的淋病奈瑟氏菌植物凝血素及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了可从淋病奈瑟菌中分离出细菌植物凝血素。此植物凝血素可与诸如神经节丁糖基神经酰胺的淋球菌碳水化合物结合。其相对分子量约为22400道尔顿，等电点pH值约为6.1至6.4。该凝血素可用作抗淋病疫苗的组分并可作为诊断淋病的方法。本发明还揭示了分离和产生这种植物凝血素的方法。

Description

本发明有关一种适用于抗淋病奈瑟氏菌（Neisseria    gonorrhoeae）的接种物或疫苗的植物凝血素，有关一种含有植物凝血素的疫苗，及有关诊断淋病的方法。具体地说，本发明有关可从淋球菌得到的淋病奈瑟氏菌植物凝血素，并有关分离凝血素的方法，有关从它们制备的一种接种物和/或疫苗;以及有关生产上述凝血素的方法。
据报导因淋病奈瑟氏菌（N.g）感染，年发病率估计有200万例。人体中淋球菌感染通常导致相对未并发的泌尿生殖系统的感染。又报导了在淋病方面，因淋病菌传播感染发病率达1-3%，但是这类疾病症状用现行的治疗方法效果很差。
另一方面，在妇女中因淋病感染，输卵管炎的发病率占10-20%，甚至在适当治疗后，可能产生输卵管炎复发、子宫外孕和不育症。估计在美国每年因输卵管炎导致有180万职员请私人医生治疗，有22万人住院治疗。
依靠公共卫生措施控制淋病至今还是困难的。Greenburg等在“世界卫生组织通报”45：531页1971年发表文章“开展淋球菌疫苗的初步研究”报导了由全部杀死的淋球菌制成的疫苗毫无疗效。
抗淋球菌的青霉素和四环素菌株也已问世。
淋球菌感染包括由细菌粘膜的移生，一种依靠移生细胞粘合力传递至膜表面的过程。术语“粘合力”意指细菌附着于表面比较稳定。有如此粘附活性任何可靠结构都称做粘接物。
淋球菌伞毛是一种具有由相同重复亚单元）伞毛蛋白-pilin）组成的丝状结构的粘着物。在N.g的MS11菌株中，每个伞毛蛋白的分子量约18，000道尔顿，淋球菌与上皮表面结合可能被抗伞毛抗体封阻。除封阻细胞的结合外，对伞毛蛋白产生的抗体也就是调理素，即它们通过血液中的各噬细胞，杀死侵入细菌。然而，由于缺乏通过不同N.g菌株形成的伞毛的血清交叉反应，因而提出使用伞毛免疫剂作为疫苗是不实际的。
我们发现，真核生物细胞表面糖〔神经〕鞘脂类，如：乳糖基神经酰胺，异球丙糖基神经酰胺（isoglobotri    sylcetamide），神经节丙糖基神经酰胺（gangliotriocylcoramide）和神经节丁糖基神经酰胺（gangliotetraosylceramide），均包括在N.g.的识别和粘合力之中，此外，还发现糖脂的直接识别可借助于至今未报导过的细菌植物凝血素，一种具有能识别特殊糖类系列（碳水化合物结构）并与之结合的细菌蛋白。这种细菌植物凝血素，当用于接种物、疫苗的组成，或用于诊断鉴定时，没有上述提到的伞毛免疫剂的缺点。
本发明企图分离名为GCL-1的细菌植物凝血素。这种植物凝血素可从淋球菌中得到，并与真核生物糖类相结合，相对分子量约为22400道尔顿。该植物凝血素的等电点pH值约6.1-6.4，它具有与神经节丁糖基神绿酰胺特殊结合的能力，并用作为抗淋病的接种物和疫苗的组成。这种植物凝血素也用于淋病的诊断方法。这种植物凝血素可以其分离形式或其在药物上可接受的盐的形式使用。
另外，本发明旨在由上述提到的分离的植物凝血素或其在药物上可接受的盐及其在药物上可接受的载体组成的接种物和疫苗。还提出一种抗淋球菌感染的免疫方法，即通过给病人施用有效量的、在药物上可接受的载体或稀释剂中含有上述分离的植物凝血素或其盐。
本发明进一步提出了分离GCL-1植物凝血素的DNA片段及存在于生物宿主和培养物中同样的DNA片段，在该培养物中上述生物宿主同适宜于表达GCL-1编码基因的该GCL-1编码基因存在于表达载体中，同时包含在合适的表达介质中。
附图系本发明的公开部分：
图1是涂银的具有标记蛋白质分子量位置的12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的（SDS-PAGE）凝胶照片，并以其各自的相对分子量以1千道尔顿为单位表示在图的右面。
带A含具有相对分子量约18000道尔顿的纯伞毛蛋白。
带B含有本发明从实例1得到的粗品GCL-1提取物中亲合吸收后剩余的蛋白质样品。在检测方法的范围水平内没有证明GCL-1的存在。然而，在18000分子量的位置上可以看到伞毛蛋白。
带C含有存在于22400道尔顿位置上亲合分离的GCL-1。不存在大量伞毛蛋白或与其相结合的蛋白。
带D含有按实例1叙述的须经红细胞糖苷脂亲合分离的粗品GCL-1萃取溶液洗脱液。该溶液用作对照检测与糖脂亲合基质的非特异结合。在该带中不存在显著量的GCL-1，表明GCL-1与神经节丁糖基神经酰胺亲合基质的结合是一种特殊的植物凝血素-配位体相互体作用。
带E含有下列分子量标记的蛋白质：α-乳白蛋白14;大豆胰蛋白酶抑制剂20;胰蛋白酶原24;碳酸酐酶29;甘油醛-3-磷酸（酯）脱氢酶36;卵白蛋白45;和牛蛋白66，以上都以1千道尔顿单位计。
图2是GCL-1的Western印迹分析照片，含有用免抗GCL-1抗体增加亲合分离GCL-1的溶液。印迹的左面指的是具有相对分子量以数千道尔顿计的蛋白质的期望位置。
带A含有按实例1产生的粗品GCL-1提取物的样品。GCL-1是具有相对分子量约为22，400道尔顿的蛋白质主带。两个蛋白质次带是与伞毛蛋白结合的植物凝血素，分别出现在约29000道尔顿位置和36000道尔顿的位置上。
带B含有按实例1制成的含伞毛蛋白丸的样品。其中GCL-1大量存在，还大量存在其它伞毛蛋白和与伞毛蛋白相结合的蛋白。
带C含有亲合分离的GCL-1基本不含与伞毛蛋白相结合的其他蛋白。
图3是Western印迹照片。表示免抗GCL-1抗体与由Morexella牛产生的蛋白质交叉反应，该种蛋白质具有由N.g.（箭头）产生的GCL-1相同的相对分子量。带A含有按实施1N.g.菌株MS11无伞毛变异体B2制备的粗品GCL-1提取物。带B含有从Morexella牛中用类似方法制备的提取物。
图4是实例1粗品GCL-1提取物，通过从单P聚焦层析柱洗脱纯化的表图，用PH梯度表示。洗脱液通过在吸光率为280毫微米（O.D.280.）处测定光密度以检测其所含蛋白质，洗脱馏分的PH梯度线性增加。含GCL-1峰值部份是从PH值略高于约6.1至6.4处的聚焦层析柱洗脱得到的，用箭头表示。
图5是Western印迹分析GCL的照片，含有通过聚焦层析分离的用兔抗GCL-1抗体增加的GCL-1溶液。印迹左边表示具有相对分子量蛋白质期望的位置，用千道尔顿表示。
带A含有按实例5叙述的质粒PHSS6，但是没有任何淋球菌DNA插入的大肠杆菌（Escherichia    coli）培养物的样品。该样品是溶解在SDS-PAGE样品缓冲剂中，通过电泳以及Western印迹法进行如分离实例5叙述。
带B含有按实例1产生的粗品GCL-1提取物样品，如带A叙述的分析。GCL-1是具有相对分子量约22400道尔顿的蛋白质主带。
带C含有如下分子量标记的蛋白质（美国马里兰州盖瑟堡贝塞斯达研究室）;肌凝蛋白200;磷酸化酶b97.4;牛血清白蛋白68;卵白蛋白43;糜蛋白酶原25.7;β-乳球蛋白18.4;和溶菌酶14.3，以上均以1千道尔顿单位表示。
带D到0含有从大肠杆菌的多个培养物得到一试样，而该大肠杆菌含有用淋球菌DNA插入的质粒pHdd6，如实例5所述，并按带A所述进行分析。
术语定义：
本文所用的术语“抗体”，其各种字面上的含义都涉及免疫球蛋白或含有生物活性抗体结合部位的免疫球蛋白片段，而该结合部位实际上是与抗原结合。
在本文中所用的“复合物”涉及植物凝血素具体与配位体结合时所形成的产品。
在本文中所用的“免疫反应物”涉及免疫反应的产物，例如抗原由抗体免疫结合时所产生的实体。
本文所用的涉及植物凝血素“分离的”一词是指一种实际上不含其他淋球菌蛋白的植物凝血素。当用该术语描述本发明的抗体制剂时，是指抗GCL-1抗体，而它实际上是不含其他抗淋球菌蛋白的抗体。
术语“配位体”涉及具有糖类结构的分子，而实际上被植物凝血素结合。
本文所用的术语“药物上可接受的盐”是指分离植物凝血素的无毒性的碱金属盐，碱土金属盐或铵盐。这样的盐通常用于制药业中，包括钠盐，钾盐，锂盐，钙盐，镁盐和铵盐等，这些盐类物是用本领域中众所周知的方法制备的。该术语还包括无毒性的酸加成盐，通常是将本发明的植物凝血素与适当的有机酸或无机酸反应取。具有代表性的盐包括氯化氢、溴化氢、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、棕檬酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、琥珀酸盐、洒石酸盐等。
由本发明期望制得的分离的淋球菌糖结合蛋白或植物凝血素，具有其相对分子量约为22，400道尔顿，其测定方法是采用SDS-PAGE，并采用α-乳清蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶原、碳酸酐酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、卵清蛋白和小牛清蛋白作为对比分子量的标准物。即本发明的植物凝血素（GCL-1）的电泳迁移率是介乎大豆胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶原的迁移率之间。该领域用SDS-PAGE测定分子量的技术和可靠性业已众所周知。韦伯等人，《生物化学杂志》第244卷，第4406～4412页上（1969年），茨瓦安，《生物化学分析杂志》，第21卷，155～168页（1967年）。
GCL-1的进一步特征在于其等电点pH值约为6.1～6.4。蛋白质的等电pH值或等电点（pI）是蛋白质的不再具有净放电时的pH值。而在该等电点时，蛋白质不再在电场中发生移动。用聚丙烯酰胺凝胶测定蛋白质的等电点pH值的方法也是现有技术中熟知的方法。艾伦RC和莫勒，H.R，《聚丙烯酰胺凝胶的电泳法和等电聚焦法》瓦尔特，格里特，纽约（1984年）;阿巴思诺特，J.P.和比利，J.A.《等电聚焦法》，Butter    worths出版，伦敦（1975年）。
GCL-1也具体地与糖〔神经〕鞘脂类，乳糖基神经酰胺、异球丙糖基神经酰胺、神经节丙糖基神经酰胺和神经节丁糖基神经酰胺相结合。
测定植物凝血素具体与糖配位体结合的能力的方法在现有技术中也是公知的。这些方法包括通过涉及的植物凝血素，对红血细胞凝集作用或多糖沉淀作用进行结合抑制性研究的方法。用植物凝血素或用糖配位体作为亲合吸收剂进行亲合色谱法，也能用于本发明。
一般是将GCL-1的已知用量与（糖〔神经〕鞘脂类）的预测用量混合。在生物测定条件下，保持该混合物在数分钟到数小时的预定时间内，例如大约10分钟到大约16～20小时，即用足够的时间使GCL-1与（糖〔神经〕鞘脂类）配位体形成复合物。
生物测定条件是指保持本发明的分离植物凝血素和其标记的配位体的生物活性。这样的测定条件包括温度约为4℃到45℃，pH值大约为5到9，离子浓度的变化范围约从蒸馏水的离子浓度至大约1摩尔氯化钠的离子浓度。优选这些条件的方法在现有技术中也是公知的。
于是，测定含有形成复合物的GCL-1的存在，也能直接或间接地采用在现有技术中公知的测定技术。
将GCL-1具体结合到糖〔神经〕鞘脂类上的方法，也是在现有技术中所公知的。请参阅：例如，汉斯生等人的“FEBS”第170期，第15-18页，（1984年）;布赖姆等人，在《生物化学杂志》上发表的文章，第90期，第589～609页（1981年）;卡尔生和拉生的，《生物化学杂志》第257期，第557-568页，（1982年）;布赖姆等人的，《生物医学质谱法》，第6期，第231-241页（1979年）;汉斯生等人的，《生物化学和生物物理学学报》第750期，第214～216页，（1983年）。
本发明的另一方面属于分离GCL-1的方法。这种方法要求利用该植物凝血素的上述各项性质，将含有植物凝血素的溶液进行分离。
尤其是通过从N.g.的表层蛋白萃取，首先得到含有GCL-1的溶液。为此，要从N.g.中切断表层蛋白，典型地是用等渗的、非变性的缓冲溶液涡动N.g.。再通过离心分离将残余细胞和碎片从得到的溶液中分离。得到的上清液含有GCL-1蛋白，然后对其进行回收。
各种方法像凝胶过滤、凝胶色谱、色谱聚焦法、超滤法、电泳迁移法、离子交换法等，这些都是蛋白质分离的公知方法，于是能用上述特征的方法将某一蛋白质与现有其他蛋白质进行分离。
例如，在现有技术中已有涉及两种不同电泳分离技术的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2D-PAGE），能从复合生物源中重复分离蛋白质。在第一向根据蛋白质各自的等电点，通过等电聚焦法（IEF），然后在第二向根据其分子量通过SDS-PAGE，来分离溶液中的蛋白质。由于蛋白质离析是根据各向特征，所以得到穿过双向凝胶，基本上均匀分布的蛋白质离散斑点。具有上述等电点和分子量的相关蛋白质的离散斑点，分离植物凝血素GCL-1，然后再通过常规技术从该凝胶中进行回收。
另一方面，用液相色谱聚焦层析法从存在于上述上清液的其他蛋白质中分离出GCL-1。这种方法是根据蛋白的质等电点的差别来分离蛋白质。根据流过层析柱的pH梯度，聚焦蛋白质，再按其等电点大小的顺序进行洗脱。收集相应于上述等电点的各部份，并从所收集的各部份中用常规技术回收GCL-1。
通过用含有该蛋白质的液体进行一种或多种分离具有实际结合配位体能力的蛋白质的公知方法，也能分离GCL-1，其中公知的方法有亲合色谱法，亲合吸附法以及类似的方法。当采用这种可行的分离方法时，一般将含有GCL-1的液体与像神经节丁糖基神经酰胺的固体加基体的配位体混合。将得到的该混合物保持在生物测定的条件下，以足够的时间使GCL-1实际结合到固体加基体的配位体上，以形成固相复合物。然而将从该固相复合物中非具体结合的蛋白质，通常用缓冲液洗涤或漂清。因此，从固相附加的配位体中分离GCL-1，并洗脱成分离的形式。
另外，也能采用免疫化方法，从含有植物凝血素的液体中，用下文所述的抗体分离出GCL-1。这些方法，例如免疫亲合法。免疫吸附法以及类似的方法均能采用，按类似于上述的方法，将糖脂配位体基进行亲合提纯。
用公知的重组体DNA技术也能产生分离形式的GCL-1。主要地是，将N.g.中的DNA分离，并通过切断或通过核酸内切限制酶消化将其分裂。将这些片段插入质粒载体中，例如pHSS6或入一噬菌体载体。将会有载体的插入物导入相容的宿主中进行繁殖。再接着将含有载体的宿主克隆，测光该克隆中含有GCL-1基团因的质粒的存在。
于是，含有GCL-1基因的克隆载体，可以用作表达载体，以直接表达GCL-1基因产物。在有些情况下，期望用不同的载体或不同的生物宿主，以操作GCL-1基因进一步调节其表达。
于是，从含有该基因的质粒中分离GCL-1基因，并用适当的核苷酸序列重组，以生成一种转录转译表达载体。然后，将GCL-1基因表达载体导入适当的转录转译原核生物的表达介质，例如细菌宿主，其核生物表达例如酵母或哺乳类动物宿主〔例如中国老鼠卵巢细胞〕，或例如由戴维斯和朱伯所介绍的离体介质（美国国家科学院会议录，第57卷，第267页，1967年）。
本发明的另一方面，是将本发明的植物凝血素或其盐用于药物上可接受的稀释液或载体，以形成接种物或疫苗，并以有效量给病人用药后，这些物质能与GCL-1在N.g.表面发生免疫反应，产生的抗体由此消除粘接到表面膜的粘接物。
在本文中以各种字面形式所用的术语“接种物”，是描述含有本发明植物凝血素作为诱导对GCL-1产生抗体的活性成分的组合物。
接种物能用在哺乳动物内产生抗体，所述哺乳动物例如有小鼠、白兔、山羊、马等，以用来诊断测定，鉴别用GCL-1表达的N.g.细胞。接种物也能用作含有本发明有效量的植物凝血素的疫苗，可保护接种的单体免受淋球菌感染，从而防止淋病感染。必要时也可以采用激发注射或各种注射。
本文采用的术语“疫苗”是指保护人体的疫苗。本文采用的术语“接种物”是指含有本发明的蛋白质作为活性成分的组合物，用来产生致免疫地结合到淋球菌GCL-1上的抗体。疫苗和接种物可含有相同的成分。然而预期使用的目的是不同的。
单位剂量的分离GCL-1有效量还取决于接种动物的种类，动物的体重以及所选用现有技术中公知的接种方法。每次接种（剂量）的GCL-1浓度一般约为10微克到大约500毫克，每次接种的优选浓度约为100微克到100毫克。
术语“单位剂量”指适宜于作为动物单一剂量的躯体的独立单位，计算每个单位含有活性物质的预定量。其产生的令人满意的疗效与所要求的稀释剂如载体或赋形剂有关。对于本发明采用的新的单位剂量的规格取决于并且直接取决于（1）活性物质的单一特征以及得到特殊的免疫作用;和（2）限制化合这种用于产生人体内免疫的活性物固有性质，正如说明书中详细公开的，这些均是本发明的特征。
一般通过将植物凝血素悬浮在生理上能忍受的稀释液中从本发明的分离细菌植物凝血素中制备接种物，其中所述的稀释液为水，生理盐水或缓冲磷酸盐生理盐水（PBS）。如果需要，通常也可将添加物用于疫苗或接种物中。这种添加物的例子是稳定剂和佐剂，稳定剂例如乳糖或山梨糖醇，佐剂例如氢氧化铝，硫酸盐或磷酸盐，明矾，或藻酸盐。沉淀的磷酸铝（AlPO4）是一特别适用于疫苗的佐剂，而弗兰德（Freund）完全佐剂（CFA）和弗兰德不完全佐剂（IFA）则更适用于接种物。
本发明的疫苗和接种物可以用针剂，通常用肌肉注射或皮下注射，口服肠道吸收胶囊或片剂，像栓剂，鼻吸喷雾剂，和其它适合的用药方式。
由本发明分离形式的细菌植物凝血素引起的抗体还构成本发明的另一个实施例。本发明分离抗体的制剂仅仅基本上显示对GCL-1的抗淋病球菌的活性。
利用前述接种物，通过免疫方法，可在哺乳动物，例如在兔子、山羊、马等体内产生分离形式的抗GCL-1抗体，分离的抗体制剂也能够利用本发明分离的细菌植物凝血素和先有技术中公知的方法通过免疫亲合纯化来制取。
分离的抗GCL-1抗体制剂也可以利用在奈门等在1985年美国国家科学院会议录等82卷7924-7928页中所介绍的杂种瘤技术制备，该文已列为本文参考文献。
为了从所产生的单克隆抗体中生成杂种瘤，将骨髓瘤或其它自体恶变细胞系与从用GCL-1超免疫的哺乳动物脾脏获得的淋巴细胞进行融合。
骨髓瘤细胞系最好来自与淋巴细胞同类的细胞。129G1X+品系的小鼠是一类最佳的哺乳动物。用于本发明的合适的小鼠骨髓瘤包括对次黄嘌呤-氨基蝶蛉-胸苷敏感的（HAT）细胞系P3X63-Ag8.653（ATCC CRL15080），和Sp2/O-Ag14（ATCC CRL 1581）。
一般用聚乙烯二醇（PEG）1500，将肤脏细胞与骨髓瘤细胞融合。以对HAT的敏感度挑选出融合的杂种。产生本发明抗体的杂种瘤，可通过采用本文所述连接抗GCL-1酶的免疫吸收剂（ELISA）测定方法进行鉴定。
单克隆抗体不仅能够从杂种瘤培养物的上清液里获得，而且一般也可以从已经引入需杂种瘤的哺乳动物腹水液体里获得较高浓度的形式。采用腹水液体产生单克隆抗体是公知的技术，这里无需赘述。
本发明分离的细菌植物凝血素是专门用于测定机体样品例如血液、血清或血浆中抗GCL-1抗体的存在和含量。
在一个实施例中，本发明还提出一种测定机体样品中存在抗GCL-1抗体的方法，包括以下步骤：
（a）提供一被分析的机体样品。这种典型样品是一已知量的血液，最好是血清或血浆。提供血液、血清或血浆样品的方法是先有技术所熟知的。
（b）接着，提供一预估量的本发明的分离细菌植物凝血素。
（c）接着，将抗体样品与分离细菌植物凝血素混合形成免疫反应混合物，
（d）将获得的混合物保持在生物测定条件下从几分钟到几小时的这样一段预定时间。通常大约10分钟到大约16～20个小时的一段时间，足以使存在于样品中的任何抗GCL-1抗体免疫地结合到植物凝血素，以形成免疫反应物。
免疫反应的生物测定条件类似于所描述的用于植物凝血素配位体结合测定的条件。
（e）在生物试验条件下保存的混合物则用于测定在前述的保存期间所生成的任何免疫反应物的存在。免疫反应物的存在表示，样品中存在着抗GCL-1抗体。
用于测定含有免疫反应物的抗GCL-1抗体的存在，无论是直接的还是间接的，都能被公知的先有技术中的测定技术所完成。例如，可以采用均一测定系统，如同在美国专利号4536479;4233401，4233402和3996345中所述。
在最佳实施例中，测定与植物凝血素结合的抗GCL-1抗体的存在的步骤如下：
（ⅰ）一机体样品与标记有生物活性的结合任何人体免疫球蛋白的抗体连结在一起，此免疫球蛋白可能在机体样品中存在以生成免疫反应物。标记抗体能够提供免疫反应物中存在抗体的信号。
（ⅱ）如此生成的标记抗/内液样品混合物在生物测定条件下保持预定的充分时间，使该抗体与作为第一免疫反应物存在的任何抗GCL-1抗体生成免疫反应物。免疫反应也能以上述的步骤（d）中所介绍的类似方法来实现。
在特别优择的测定中，本发明的植物凝血素和标记抗体即免疫地结合在存在于体液试样中的任何抗GCL-1抗体上，从而形成一种含有结合成为其组成部分的标记的三明治式（Sandwich）免疫反应剂。也就是说，当抗GCL-1抗体的一个分子1）作为一种抗体与本发明的植物凝血素进行免疫反应时;和2）作为一种抗原与一种标记抗体进行免疫反应时，即形成一种含有标记的三明治式（Sandwich）免疫反应剂。在优择的实施方案中，在测定是否有标记抗体存在之前，可将任何不能成为免疫反应剂的一部分的标记抗体（即，不能免疫地结合在GCL-1抗体上的标记抗体），最好是用洗涤的方法，从免疫反应剂中分离出来。
（ⅲ）然后测定是否有结合成为含有抗GCL-1抗体免疫反应剂的组成部分的标记抗体的存在。此法可测定体液试样中是否有抗GCL-1抗体存在。测出结合成为免疫反应剂的组成部分的标记抗体的数量。此法可用来定量测定试样中抗GCL-1抗体的数量。当然，该数量可以是零，亦即表示在可测知的范围内，体液试样中无抗GCL-1抗体存在。检验是否有第二种标记抗体的存在及其数量的方法，取决于所用的标记，此类标记和测定方法在本技术领域中是众所周知的。
将蛋白抗体进行标记也是一种众所周知的方法。例如，通过代谢参入用作组织培养基组分的含有同位素的氨基酸，可将杂交瘤产生的抗体进行标记。见，例如，Galfre，G.和Milstein，C.Meth.Euzymel.73：3-46（1981年）。通过活化官能团将蛋白结合或偶联的技术是特别适用的。见，例如，Aurameas等人，Scand.J.Immunol.8，Snppl，7：7-23（1978年）和美国专利第4，493，795号，这两份资料均已列入本发明的参考文献。此外，可进行位取向偶联反应，使标记实际上不会干扰第二种抗体与其靶抗原的免疫反应。见，例如，Rodwell等人，Biotech.3：889-894（1985年）。
标记剂可以是一种以化学作用与抗体或抗原结合的但了不会使它们变性的荧光标记剂，以形成一种有用的免疫荧光示踪剂的荧光染料。适用的荧光标记剂是诸如荧光素异氰酸酯（FIC）、荧光素异硫代氰酸酯（FITC）、5-二甲胺-1-萘次甲基磺酰氯（DANSC）、四甲基若丹明异硫代氰酸酯（TRITC）、丽丝胺、若丹明8200磺酰氯（RB200SC）等一类的荧光染料。在Wiley    &    Sons有限公司纽约N.Y.（1982年）出版的由Marchalonis等人编辑的The    Antibody    as    a    Tool书中第189-231页，由“免疫荧光分析（Immunogluorescence    Analysis）”一书中，对免疫荧光分析技术进行了详细的阐述。该书已列入本文的参考文献。
在优择的实施方案中，指示基因是诸如辣木过氧化物酶（HRP）、葡糖氧化酶等一类的酶。在主要指示基因是诸如辣木过氧化物酶（HRP）或葡糖氧化酶一类的酶时，还需要附加的试剂来观测一种抗体配位体配合物（免疫反应剂）已经形成的实际情况。此种在观察HRP时所用的附加试剂包括，过氧化氢和一种氧化染料前体，例如二氨基联苯胺。观测葡糖氧化酶对适用的附加试剂是2，2′-连氮基-二-（3-乙基-苯基噻唑啉-G-磺酸（ABTS）。
放射性元素也是有用的标记剂。
一种有代表性的放射性标记剂是可产生γ射线的放射性元素。象124Ⅰ、125Ⅰ、128Ⅰ、131Ⅰ、132Ⅰ和51Cr一类本身能发射γ射线的元素，代表了一类可产生γ射线的指示基团放射性元素。特别优择的是125Ⅰ。另一组有用的指示基团是基本身可发射正电了的元素，例如11C、18F、15O和13N。所发射出来的正电子在与动物体内的电子碰撞时即产生γ射线。可发射β射线的元素也是适用的发射性元素标记剂，例如111In。
本发明的测定方法和系统能使用添加于固体基质而形成载体的本发明植物凝血素或抗植物凝血素抗体。
通过由一种含水介质的吸附，把植物凝血素或抗植物凝血素抗体典型地添加于固体基质上，虽然这也可使用本领域技术人员熟知的一些吸附方法以及其它添加方法。这类方法的例子为植物凝血素或抗植物凝血素抗体同羧基官能度反应，羧基官能度由溴化氰同含葡萄糖基质例如交联右旋糖或纤维素反应制得。下文将连同胶乳粒了等一起对作为连接的戊二醛进行讨论。
对本领域技术人员所知的有效固体基质包括现有的交联的右旋糖酐（Pharmacia    Fine    Chemicals，Piscataway，NJ所提供为SEPHADEX商标）;直径约1微米至约5毫米的聚苯乙烯粒珠（由北芝加哥AL    Abbott实验室提供），聚氯乙烯;聚苯乙烯;交联聚丙烯酰胺;硝化纤维素，锦纶基质织物如片，条或叶;管，板或微量滴定板的井例如那些由聚苯乙烯或聚氯乙烯所制备的，以及等等。
用于凝集型测定的乳胶粒子也能用作为固体基质，这类物质由日本东京，日本合成橡胶公司商业性提供，并且是作为分散于阴离子肥皂的羰酸官能团粒子来加以描述。具有代表性的这种粒子的直径为0.308微米，每羧基平均羧基官能团分布约为15至30平方埃。
在使用前，粒了先用二胺如1，3-二氨基-2-丙醇处理，使得维持处于游离胺基团下，同粒子羧基相连形成多重酰胺键。然后游离胺同二醛如戊二醛和抗体或抗原反应得到席夫硷反应产物。接着，用水溶性还原剂如氢硼化钠还原席夫硷反应产物得到有效的载体。
本领域技术人员知道数目众多的固相免疫测定的方法可以采用。例如，有效固相测定包括增殖酶免疫测定技术（EMIT）和荧光免疫测定（FIA），以及将具体讨论的ELISA。然而，事实上由抗GCL-1抗体同本发明的植物凝血素反应而传递所产生信号的任何方法都是适合的。那些测定方法中的每一个都能采用单或双抗体技术，该技术中使用指示装置给出免疫反应信号，从而测定出抗体同本发明植物凝血素的结合。Maggio《酶免疫测定》，CRC    Press，Cheueland，OH（1981）描述了该实验技术，Goldman《荧光抗体方法》，Academic    Press，纽约（1980）上也有描述。
测定用于抗GCL-1抗体的体液样品的方法的一个具体实施例是非竞争性ELISA，其中是顺序地进行免疫反应的。在这样的测定中，等分量的本发明植物凝血素（例如通常为约1至约500微克）被添加在微量滴定井的内壁上，形成一个载体。
然后，存在于所提供的体样上的抗GCL-1抗体同固相植物凝血素起免疫反应。用等分量（如约10至约200毫升样品）（可预稀释）如血浆血清在微量滴定井里同吸附于植物凝血素的固相相混，从而完成得到一个固/液相混合物。维持混合物足够的预定时间，使存在于样品里的任何抗GCL-1抗体能同植物凝血素分子进行免疫原学地结合，并且形成一个固相免疫反应物。接着，分离固相和液相，固相进行典型地漂洗来保证除去非特种的结合物质。
然后以固相免疫反应物形式存在的抗GCL-1抗体（也就是结合于固相吸附植物凝血素上的抗GCL-1抗体）同标有酶的第二抗体进行免疫反应。在含水缓冲溶液中，通过混合分量（例如约0.1至约10微克）的标记酶的第二抗体，较好为HRP一标记山羊抗人体Ig抗体，得到第二个固/液混合物。如同上述维持第二混合物，从而形成由植物凝血素、抗GCL-1抗体和标记酶的抗体所组成“三明治式”的固相免疫反应物。
经如前所述步骤，从固相中分离液相后，在用于HRP的过氧化氢存在下，分量的色原作用物如邻苯二胺（OPD）在含有固相免疫反应物的滴定井中混合，形成第三固/液混合物。维持该混合物足够的预定时间，使以免疫反应物形式存在的任何酶能够转化比例量的作用物成产品。然后测定所得有色溶液的克密度，并使用含有已知量反应试剂的溶液进行比较所得的结果。
有效用于实施本发明抗GCL-1抗体方法的诊断系统（优先用于药囊形式）包括：（是以合并但分离包装形式）（a）本发明分离植物凝血素，和（b）用于给出抗GCL-1-抗体同植物凝血素免疫反应信号的标记抗体。标记抗体最好为连接酶的全抗体。
在较佳实例中。该系统还进一步包括一个能添加植物凝血素来形成的固体基质。前面已经描述过有效的固体基质。但是，优先的固体基质是微量滴定板的井。
在进一步较佳的实施例中，该系统还包括使本发明植物凝血素呈E控制的抗体。
提供已知量的植物凝血素和标记抗体，其量至少能进行一次测定。提供植物凝血素和标记抗体的典型形式和配方用量，正如本领域专业人员所知，用水，盐水或缓冲剂可稀释至配方体积。
在该系统中也可以包括另外的包装。这类包装可以含有（ⅰ）干或液体形式的缓冲盐，（ⅱ）酶作用物如邻苯二胺等。
本文还涉及测定体样中GCL-1存在的方法，通常所用的提供体样如需测定的颈或泌尿生殖器的涂片，并且同含有由本发明植物凝血素诱导的抗体结合部位的抗体混合。在生物测定条件下，维持混合物足够的预定时间，使抗体分子同存在于体样里的GCL-1起免疫反应。然后测量该免疫反应量以确定所测体样中是否存在GCL-1分子。
实例之一是免萤光测定，其中颈或泌尿生殖器的涂片用内酮固定于载物平片上。按照本发明所取等分量抗体（例如取自兔子）通常约10微克至约5000微克，采用已知技术在载物上进行培养。
移去任何未起免疫反应的抗体并在载物片上，用牛血清蛋白封阻非特种结合部位后，如有需要可在试验载片上培养。第二抗体如山羊抗兔抗体。再用连接萤光染料如异硫氰酸（FITC）来标记第二抗体。
第二抗体经培养后，去除任何过量的第二抗体，留下FITC标记的山羊抗兔抗体，使其同试验载片上的第一抗体结合。使用莹光显微镜检查可检测出FITC-标记抗体的存在，因此给出存在淋病奈瑟氏菌感染的信号。
当指示物不是直接连于本发明抗体时，该指示物与抗体分别包装。当混合体样如丙酮固定的颈或泌尿生殖器的涂片时，抗体部同GCL-1进行免疫反应形成免疫反应物，指示物便给出免疫反应产物形成的信号。
下面实施例将进一步描述本发明。
实施例1
GCL-1的制备和分离
N.g菌株Ms11以及N.g.C9菌株的带纤毛透明变异体和无纤透明变异体在GCB板〔29克GC培养基，Difco，1克Bacto-agar，Difto，8毫升添加物A（400克葡萄糖，10克L-谷氨酰胺，20毫克辅羧酶/升），0.8毫升添加物B（每800毫升总体积为12.5克Fe（NO/250毫升）〕上生长。纤毛和透明表型可用James等人在《传染免疫学》（Infect.Immun）19：332-340（1978），和Swanson，J.在《传染免疫学》19：320-331（1978）上描述的系统进行辨别。
在5%CO2气氛和35℃下于板上接种并保温18小时。首先用1.25毫升50毫摩尔三羟甲基氨基甲烷缓冲液〔Sigma化学公司，St，Louis，MO（pH9.5）〕混合到每个板上，采集所得菌苔。然后取出所得菌苔中的细胞，用巴斯德吸管把其移至50毫升的聚碳酸酯离心管中，在0℃下贮藏。
接着，旋转该贮藏细胞3分钟，切变/细菌表面蛋白。然后用贝克曼JA-20转子在40℃和/10000rpm离心所得悬液，得到小片伞毛蛋白和含有GCL-1的上清液。保留上层液并且使用6000至8000分子量的渗析切断膜（dialysis    Cutoff    memfrance）（spectropor，Fischer科学公司Springfield，NJ），在4℃用抗纤毛缓冲液（150毫摩尔三羟甲基氨基甲烷，150毫摩尔Nacl，pH7.5）参析24小时，以便使蛋白质聚集和沉淀。经如前所述离心后，收集沉淀的小片蛋白再悬浮于10毫升的毫麾尔的三羟甲基氨基甲烷（pH9.5）中，从而形成GCL-1提取物粗制品。在-20℃贮藏该粗提取物。
用神经节丁糖基神经酰胺添加至固体基质来制备用于纯化GCL-1亲合吸收剂。在聚氯乙烯96井微量滴定板的每个井中，加入含有200毫克微克神经节四丁糖基神经酰胺（Supelco公司，Bellefonte，PA）的50微升甲醇。然后蒸发甲醇，在每个井中余下沉淀神经节丁糖基神经酰胺，在每个井中加入50微升含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS来封阻井中的非特种结合部位，在室温下维持所形成的混合物4小时，然后通过转化井和震摇移去过量封阻溶液。
其首先引入50微升粗提取物到微量滴定井中，井中含有吸附其上的神经节丁糖基神经酰胺，从上面所得的粗提取物通过亲合吸附分离GCL-1。维持所得制品约8小时，因而使粗提取物中的GCL-1结合到神经节丁糖基神经酰胺上。接着通过转化井和震摇除去非结合蛋白。再用来微升整份部分的PBS漂洗井5次。
在每个井中加入50微升含有十二烷基磺酸钠（SDS）的PBS，来洗脱特别结合的GCL-1。室温再维持按此法所得制品30分钟，使GCL-1溶解存在其中。然后从井中移去所得含有GCL-1的溶液并在-20℃贮藏。从每微量滴定井中得到分离于GCL-1的亲合物近1微克。
此外，也可用蛋白质快速液相色谱法（FPLC）色谱聚速，从上面所得粗提取物中分离出GCL-1。为了制备用于色谱聚焦的GCL-1提取物，使用前面提取的渗析膜。经FPLC饱和缓冲液（25毫摩尔咪唑，PH7.4）渗析由无纤毛N.g.菌珠MS11异变体B2产生的粗GCL-1提取物。然后把渗析的GCL-1提取物注入一个单P色谱聚焦柱（FPLC系统，药物公司，Piscatarway，NJ），用FPLC饱和缓冲液预饱和，再用聚缓冲液74（Sigma化学公司，St.Louis，MO）洗脱，该缓冲液是用无菌水1∶8稀释和调节PH至4.0。
图4中显示了在类色谱聚焦柱上，粗GCL-1提取物典型流动的洗脱分布情况。通过在280毫微米（O.D    280）测量洗脱剂的光密度来控制蛋白质的洗脱部分，并且测定其PH。含有蛋白质的部分用约PH6.1至6.4的洗脱，回收并在-20℃贮藏。
实施例2
由SDS-PAGE测定分离细菌的植物凝血素的分子量
按Laemmli，U.K.，Nature    227：680-684（1970）的方法，用SDS-PAGE测定实施例1中所得经纯化细菌的植物凝血素的相对分子量。为此目的，12%和15%聚丙烯酰胺凝胶呈管状并每个区带用约25至200微克总量蛋白质流过。以下为在对照区带或标准区带内的分子量标记蛋白质及其近似分子量（以道尔顿为单位）：α-乳白蛋白14，200;大豆胰蛋白酶抑制剂20，100，胰蛋白酶原24，000;碳酸酐酶29，000;3-磷酸甘油醛脱氢酶36，000;卵白蛋白45，000;牛白蛋白66，000;这些蛋白质金系从Sigma化学公司，St.Louis，MO获得。
经电泳后，用考马斯亮兰（Sigma）着色，或者按Merril等人在生物化学分析105：361（1980）一文中介绍的银着色技术，使用由Bio-Rad。得到的银着色剂（Richmond，CA）检查蛋白质区带。
凝胶分析揭示了样品区带里的一个主带，其相对电泳迁移率高于胰蛋白酶原但低于大豆胰蛋白酶抑制剂，相对分子量约为22，400道尔顿。图1所示该主带为亲合纯化的细菌植物凝血素GCL-1。
在一些例子中，蛋白质区带在着色前，经电泳吸附到硝化纤维素（Schleicher和Shuell，Keene，NH，产品目录号：BA85）上形成Western印迹，为Towbin等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA    76：4350-4354（1979）一文中所述。首先通过印迹同兔抗GCL-1抗体免疫反应测定吸附于硝化纤维素的GCL-1蛋白质，其中免疫GCL-1抗体的制备是按实施例1所述用粗GCL-1提取物使兔产生免疫得到的。然后将通过免疫方法结合到吸附着硝化纤维素的GCF-1上的兔抗GCL-1抗体，同硷性磷酸酶标记山羊抗兔免疫球蛋白进行免疫反应。使用原印迹免疫印迹系统〔Promega    Biotech，Madison）WI（产品目录号：P3930）〕观测标记的，由此观测GCL-1的存在。
图2给出由实例1所述的亲合方法中各种分离步骤获得的产物的Western印迹。对那些印迹分析，揭示出新合分离的GCL-基本上不含有同蛋白质结合的其它淋球菌纤毛。
图3显示了牛（Morexella    bovis）粗蛋白质提取物的Western印迹，该提取物是用类似于实施例1所述制备N.g.粗提取物的方法制备的。对印迹分析显示出，Morexellla    bovis产生一种蛋白质，该种蛋白质同抗GCL-1抗体起免疫反应，其表观相对分子量约为22，400道尔顿。
实施例3：分离及双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）的特征
进一步分离含有由例1制成的GCL-1非亲和纯化的细菌表面蛋白粗提取物，其特征是采用双向凝胶系统的2D-PAGE，该系统是由Hoefer    Scientific    Instruments，Sem    Francisco，CA获得。等电聚焦（IEF）凝胶包括6.5%的聚丙烯酰胺和两组二性电解质（LKB    Instruments，Inc，Gaithersburg    MD），其中一组可以产生梯度为3～10的pH值，另一组是可以产生梯度为4～6.5的pH值，凝胶在130×3毫米经酸洗过的玻璃管中制备。该凝胶或涂以含约25微克蛋白溶液的GCL-1或涂以含例2所述分子量标记蛋白的对照溶液。然后将样品涂复溶液〔9摩尔尿素、上述两组二性电能质各2%和10%聚乙烯（9）辛基苯基醚（Nonidet    p40）〕涂敷在该凝胶上。使蛋白质先后在400伏3恒压下电泳12小时及在800伏恒压下电泳1小时。
由玻璃管中去除聚焦凝胶，用处理缓冲剂（0.0625摩尔tris，HCI，pH6.8;2%SDS;10%甘油;5%2-巯基乙醇）冲洗两次约30分钟，从而产生含按其等电点pH值分离的蛋白质的IEF凝胶。
然后通过SDS-PAGE将等电聚焦蛋白按其相对分子量进行分离。IEF凝胶固定于15%SDS-PAGE凝胶的顶部，并用0.1%的醛红作为径迹染料在约30毫安恒定电流下移动。当径迹染料达到凝胶底部时，则电泳终止。随后，凝胶用考马斯亮兰或银着色剂着色，如例2所述;或者将蛋白质由凝胶转移到硝化纤维素上，如Towbin等人在以上文献中所述。
对凝胶的分析揭示了单个蛋白质斑点相当于具有约22400道尔顿相对分子量的蛋白质即GCL-1的相对分子量。该22400道尔顿蛋白质的等电点pH值约为6.1～约6.4。
实施例4由老鼠小肠制备纯神经节丁糖基神经酰胺
为了从老鼠小肠制备纯神经节丁糖基神经酰胺采用如下一系列萃取和色谱分离方法。所用溶剂在使用前先经脱水和重蒸馏。
萃取
从老鼠腹中手术取出小肠，切成碎片，冰冻干燥。然后用本领域熟知的索格利特抽提器分两步将约130克的冰冻材料进行萃取。首先，将约1000毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比2∶1）在一个2000毫升的圆底烧瓶中与冰冻材料混合，并在石棉绝热的电加热装置中在70℃下加热约24小时。在去溶剂以后，采用1500毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比1∶9），用相同方法第二次萃取该材料，然后去溶剂，将其加入第一溶剂中。将合并的溶剂提取物在氮气流下蒸发干燥。
碱解
将干燥的小肠提取物溶解在500毫升的0.2M    KOH的甲醇溶液中进行碱解，溶解的提取物的在玻璃瓶中和室温下保持3小时，该玻璃瓶中有5个玻璃珠，通过间隙摇动分碎干燥提取物。所得的混合物与10毫升冰醋酸中和，再与1000毫升的三氯甲烷/水（体积比3∶2）混合，流水透析4天。首先将碱解提取物与大约500毫升的甲苯混合，然后用旋转蒸发器干燥所得混合物，在70℃下蒸发碱解提取物再将干样品重新溶解在大约500毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比2∶1）中，滤去不溶物质。用大约500毫升甲醇冲洗过滤装置，检查残留的提取物。然后将滤液合并，在氮气流下蒸发，再溶于大约50毫升的三氯甲烷中。
硅酸层析
将碱解小肠提取物在硅酸柱上进行层析，以从糖脂及稳定碱磷酯中去除胆甾醇及脂肪酸甲基脂。
100目试剂的硅酸（Malinckrodt化工厂，St.Louis，MO）筛分成三个粒度：小于约44um约44-74um，以及约大于76um。小于约44um的部分用甲醇（3升1公斤）悬浮液冲洗，30分钟后抽去甲醇层，以去除通过下述方法所用的在层析柱底部的烧结玻璃过滤器的极小颗粒。
分馏成大约44～74um大小的硅酸颗粒，用三氯甲烷装填成50克的柱子，再将预先已溶于三氯甲烷中的碱解提取物装在层析柱1上。相继将500毫升三氯甲烷，和500毫升三氯甲烷/甲醇（体积比98∶2）加入层析柱并让其流过。再先后加入500毫升三氯甲烷/甲醇（体积比1∶3）和500毫升甲醇，收集并合并这两种洗脱液，然后将洗脱液及其液体部分在氮气流下蒸发，产生干提取物。
离子交换层析
将硅酸柱中的干提取物再溶于大约10毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比2∶1），并装载到20克采用三氯甲烷/甲醇装成乙酸盐形式的二乙氨乙基纤维素（DE-23，Whatrovn    Inc，Clifton，NJ）的层析柱上。室温下，经在层析柱上的平衡约1～2天后，样品先后用400毫升三氯甲烷/甲醇（体积比2∶1）和400毫升甲醇洗脱。合并两种洗脱液，其液体部分在氮气流下蒸发，得到干提取物。
乙酰化
进行乙酰化是将二乙氨乙基纤维素层析柱上洗脱及干燥的提取物溶于10毫升三氯甲烷，再与10毫升的吡啶及10毫升的醋酸酐混合，该混合物在室温下保持在黑暗中约12～18小时。在乙酰化反应之后，将25毫升的甲醇及25毫升的甲苯混合，样品先在氮气流下蒸发，同时保持在大约60℃。接着用旋转蒸发器蒸发干燥，得到乙酰化肠萃取液。
乙酰化萃取物的硅酸层析
将乙酰化肠的萃取物溶解在大约50毫升的三氯甲烷并装到含50克硅酸粒子的层析柱上，该硅酸粒子约小于44um，并装在三氯甲烷/甲醇内（体积比98∶2）。相继将500毫升三氯甲烷/甲醇（体积比90∶10）加到层析柱中，收集洗脱液并将其合并，其液体部分在氮气流下蒸发，得到乙酰化干萃取物。
脱乙酰化
经硅酸层析和乙酰化的萃取物溶解于大约20毫升的甲苯/甲醇0.2M    KOH（体积比为1∶1∶2）的甲醇溶液，在室温下间隙摇动30分钟进行脱乙酰化。反应后，与2毫升冰醋酸混合，把生成的混合物移入80毫升的三氯甲烷/水中（体积比为1∶1）并用流水渗析4天。该脱乙酰化萃取物的蒸发是在70℃的温度下，先与约100毫升甲苯混合，然后再用旋转蒸发器蒸发干燥，得到脱乙酰化干萃取物。
二乙氨乙基纤维素柱层析
将脱乙酰化干萃取物溶解在大约10毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比为2∶1）中并装载到10克的二乙氨乙基纤维素层析柱上，达到如上所述的平衡。再先后把250毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比为2∶1）和250毫升甲醇加入层析柱中，合并得洗脱液，其液体部分在氮气流下蒸发，得到含有残余物的糖脂。
硅酸层析
将上述所得残余物的整部分溶于500毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比为98∶2）并装载到颗粒约小于44um的25克硅酸层析柱上，该硅酸颗粒用适当溶剂包装。将500毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比为98∶2）加到该层析柱上使其流过。然后相继将250毫升的三氯甲烷/甲醇（体积比为1∶3）和250毫升甲醇加到层析柱上，收集这两部分洗脱液体并将其合并，其液体部分在氮气流下蒸发。得到的干燥物质基本上是纯神经节丁糖基神经酰胺。[Hansson    et    al.，FEBS    Letter，139：291（1982）]。
例5：通过克隆编码GCL-1基因制取分离GCL-1及在重组DNA载体中的表达。
采用本技术领域中熟知的以及在Maniatis等人的著作（《分子克隆：I.实验室手册》，冷泉港实验室，1982年）中较详细地介绍过的方法对包含在由N.g.MS11菌珠无纤毛变异体B2的淋球菌DNA中的GCL-1编码基因进行克隆并操作使其进入表达载体。
为此从上述N.g异体分离出DNA用酶MboⅠ限制性地进行部分消化并插入到Seifert等人所描述的克隆载体pHSS6（Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：735（1986））的BamHⅠ限制部位中所得的重组质粒在作为生物宿主的大肠杆菌（E.coli）菌珠HB101（Bethesda    Research    Laboratories，Gaithersberg，MD）中进行繁殖。然后将含有大量不同质粒的大肠杆菌进行筛选作为含有插入GCL-1基因的质粒的那些细菌的基因库。
鉴定含有插入GCL-1基因的质粒的细菌筛选试验是通过利用GCL-1基因产物可借助GCL-1基因本身自然产生的表达启动子在大肠杆菌内表达的能力来完成的。表达的GCL-1是在含有插入GCL-1基因的质粒的那些细菌菌落中进行检查的，检查的方法是用兔子中产生抗GCL-1的抗血清对细菌菌落的基因库进行免疫筛选，该GCL-1是按实施例1所述的色谱聚焦法分离得到的。
为制取这种抗血清，可将大约10至20微克分离的GCL-1通过皮下注射接种入兔子的颈部。第一次接种是在弗氏完全佐剂中进行接着每隔两周在弗氏不完全佐剂中进行一次接种，共同接种两次。阳性反应的抗血清可凭借其识别例2中所述的Western印刷迹的粗提取物中的GCL-1的能力来鉴定。
鉴定基因库中表达GCL-1的那些大肠杆菌的免疫筛选方法可按照Helfman等人在Focus    6∶1-5（1984）一文中所述的方法进行。该文已经列为本文的参考文献，但下列几点除外，即：用脱脂奶粉代替牛血清白蛋白（BSA）作为封阻剂，如Johnson等人在Gene    Anal.Techn.1∶3-8（1984）文字中的所述，该文也列为本文的参考文献。这些例外还包括用标记山羊抗兔子免疫球蛋白的碱性磷酸酶代替125I标记第二抗体作为指示物。利用Promega Biotech，Madison，WI（Catalog No.P3930）中原印迹免疫印迹（Protoblot Immunoblotling）系统可观察到标记的存在，亦即说明GCL-1的存在。
分别回收按前述免疫筛选方法测定的含有GCL-1的各个阳性反应细菌菌落，并至少对按各菌落进行一次纯化，以确保其均匀性。接着采用例1中所述的Westen印迹法进一步分析各分离菌的GCL-1表达。为此将各细菌分离物的最小培养物直接溶解于SDS-PAGE缓冲液中，然后再溶解在Western印迹上，用前述产生的由色谱聚焦分离得到的抗GCL-1抗血清进行显色。这样分析得到的并表达GCL-1的典型细菌培养物如图5所示。
表达在大肠杆菌中的GCL-1明显的活动力与略大于直接由N.g.培养物的提取物中分离得到的植物凝血素的相对分子量一致。可以认为在大肠杆菌宿主内的表达介质并不是从表达蛋白质中产生和分裂出主序列的，因此产生相当大的蛋白产物，如同在原始宿主，即N.g.中所发现的蛋白质产物。
对这些典型的培养物用已知方法作进一步分析，以测定残留质粒载体中所含的GCL-1表达DNA插入物的近似大小，其方法包括用酶NotI.进行限制酶的消化作用。已经检测到插入物的大小约为2.8至约4.0仟碱基。
从所观察到的数据看，可以推断所制得的非染色体，质粒载体存在多种结构序列特征，这是因为这种结构序列的通性在本技术领域中是众所周知的例如，可以参阅Lewin的Genes，John    Wiley&Sons有限公司，纽约，N.Y.（1983）。更具体地说，原核细菌蛋白质与其同源核苷酸序列是线性对应的，而在真核生物中，例如插入的非编码序列（即基因内区-intioks）中没有发现任何中断现象。因此，采用的每个氨基酸残基110道尔顿和每个氨基残基3个核苷酸碱基对的转换因子，可直接从用SDS-PAGE溶解的植物凝血素的表观分子量中粗略估算编码GCL-1的核苷酸碱基对的数量。通过这种转换，具有约22，400道尔顿的GCL-1含有约204个氨基酸，并约有612个核苷酸碱基可用来编码。
细菌中基因的表达取决于转录转译的起始信号和终止信号。这些信号也称为表达调节信号，因为他们是包含在调节蛋白质编码序列表达的序列中的信号。由于这些信号不出现在质粒载体pHSS6的BamHⅠ克隆部位的周围，所以这些序列是由GCL-1编码部分的两端或两端附近的通常位置中的DNA插入物提供的。于是，插入的DNA片段包括编码区及与适宜于细菌植物凝血素表达编码区的上游和下游（侧面）操纵连接的表达调节信号主对DNA插入物的生物宿主来说是异体的。
通常用于与膜联系的或待分泌的蛋白质的主肽的存在可由表观分子量稍大的GCL-1得到证实，只是在大肠杆菌中的表达，而不是其天然生物宿主。
此外，表达调节信号的特殊组分是需要使GCL-1基因开始转录的启动子。这个启动子序列通常位于相当于编码序列起始端的5′端上。因为启动子序列的特征用其它细菌基因的特征表示，所以GCL-1启动子也被认为是与从编码的序列的5′端上的前导序列（leades    Aequence）所得到的100个核苷酸碱基于紧密相关并位于其中。
因此，具有上述典型的GCL-1基因插入物含有大约2.8至4.0仟碱基对，并且包含有一个编码约22，400道尔顿植物凝血素蛋白质的编码序列时，这种插入物就可以更大些，例如达到约10仟碱基对量级，较好为6仟碱基对。前导系列适合的起始和终止信号包括启动子以及位于基因任一端或两端的附加多余的侧序列数量的改变除了可以出现在GCL-1基因本身外，也可以出现在其本发明所期望的克隆并分离的DNA片段中。
典型的大肠杆菌分离物含有作为表达载体，并在其中插入了GCL-1基因的pHSS6质粒，这种表达GCL-1在图5所示，为参考起见，给这种大肠杆菌标记为PGCL-1。这种细菌培养已保存在美国标准菌库（ATCC），地址在马里兰州，Rockville市登记号为ATCC67，198。
保藏符合布佩斯条约要求，保存期从保存日算起30年或最后请求在保藏中心保存或美国专利可实施期限之后5年，从本申请获准专利起，无论那个保存期都是比较长的。如果含有重组质粒的细胞在保藏室失话，就要重新保存。
因此本发明一方面期望DNA片段，不管是分离还是在异体生物宿主中复制的都能为细菌植物凝血素编码，其特征如上所述。这种DNA片段可包括调节信号CV用以表达所期望的细菌植物凝血素，通过操作连接到存在于DNA片段中那种植物凝血素的编码区。当表达调节信号与生物宿主来说是异体时，这些信号由宿主识别。本发明之一特殊方面的较好例子中，编码区是存在于植物凝血素的N.g.中天然产生的这种植物凝血素的编码区。更好的是，表达调节信号或存在于DNA片段中的信号碱基对序列是天然产生的N.g.表达调节信号，这种信号与植物凝血素N.g.编码区有关。
这里所期望的细菌植物凝血素的编码含有不大于约650碱基对并且在两端与之连接的两侧区有关。两侧区连同编码区共含不多于约10仟碱基对，较好的是不多于约6仟碱基对。
本发明另一个方法是在适合的条件下利用培养方法的各个步骤来制取细菌植物凝血素，这种细菌培养物包括含有非染色体质粒载体的细菌，这种质粒载体如上所述用来遗传转录转译介质中的DNA并在其后采用熟知的蛋白质收获技术从培养物中收获表达的细菌植物凝血素。
以上说明书，包括具体的实施例用来说明本发明而不是限制本发明。其它各种改变与改进可以实现，而不偏离本发明的真实精神与范围。

Claims (8)

1、一种可从淋球菌中获得的离体细菌植物凝血素，经十二烷基磺酸钠和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其相对分子量约为22400道尔顿，等电点pH值约为6.1～6.4，该植物凝血素具有与神经节丁糖基神经酰胺特殊的结合能力。
2、按权利要求1所述的细菌植物凝血素是以药物上可接受盐的形式存在。
3、一种接种物，包括按权利要求1所述分离细菌植物凝血素与其在药物上可接受的载体。
4、按权利要求3所述的接种物，其单位剂量中，植物凝血素的含量约为10微克至500毫克。
5、按权利要求3所述接种物，其单位剂量中植物凝血素的含量约为100微克至500毫克。
6、一种使人对淋球菌感染产生免疫的方法，其中包括给人施用在按权利要求1所述的植物凝血素的有效剂量。
7、按权利要求6所述方法，其中人用植物凝血素的有效剂量约为100微克至100毫克。
8、一种测定人体样品中存在植物凝血素GCL-1的方法，包括如下步骤：
（a）人体采样品;
（b）将取得的人体样品与抗GCL-1抗体相结合，形成免疫反应混合物;
（c）将形成的免疫反应混合物在生物测定条件下，保持充分的时间，使抗GCL-1抗体与存在于所述人体样品中的所有GCL-1结合，从而形成免疫反应物;以及
（d）测定保存的混合物中免疫反应物的存在。
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