CN114277001B - 分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一株能分泌抗α‑芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株5E4及其应用。该杂交瘤细胞株分类命名为抗α‑芋螺毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年5月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC No.22347。该杂交瘤细胞株5E4分泌的抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体特异性强、亲和力大、效价高，可应用于芋螺毒素的检测技术领域。基于该杂交瘤细胞株5E4及其所分泌的单克隆抗体，本发明建立了一种免疫侧流层析检测卡，该检测卡可应用于芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX检测中，且具有灵敏度高、检测快速的优势。

Description

分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于抗体工程与免疫检测领域，具体涉及一株能分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株5E4及其应用。

背景技术

芋螺毒素（Conotoxin，CTX），由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺分泌，用于麻醉猎物的小肽类毒素。它们是由10~41个氨基酸残基组成的，是富含半胱氨酸的动物神经肽毒素。具有特异性结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。芋螺毒素种类繁多，结构新颖，选择性强，疗效确切，在成瘾、麻醉、镇痛和研究治疗精神疾病、癌症和心脏疾病等方面具有极好的应用前景，已成为神经科学研究和新药研发的新来源。

芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX是从菖蒲芋螺（Conus vexillum）中发现的新超家族芋螺毒素，属于B-基因超家族。芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX含有40个氮基酸，可特异性作用于乙酰胆碱受体。含有四个半胱氨酸模式，其中活性最强异构体的二硫键连接方式是Cysl-Cys2和Cys3-Cys4。

芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的获取主要有三大方法，分别是从螺肉中提取、人工合成以及基因工程方法。由于芋螺毒素特殊的翻译后修饰，目前毒素主要从螺肉中提取，但芋螺还未实现人工养殖，从芋螺中提取芋螺毒素难度较大，收获量低。对于芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的检测方法也未有报道，也未有关于芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体的应用，因此开展关于芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX免疫检测方法的研究具有重要意义。

酶联免疫吸附（ELISA）技术是建立在免疫学基础上发展起来的，是将具有免疫活性的抗原或者抗体与酶结合成具有免疫活性和酶活性的酶标抗原或者酶标抗体，使之能够与待测样品结合形成复合产物，最后通过测定而能够对待测样品实现定量分析，具有灵敏性高，特异性强且操作简便，成本低的特点，在现代医学研究，食品化学分析，生物学等各大领域得到广泛应用，如今已发展有夹心法、间接法、直接法、竞争法四种技术方法。

芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX是小分子多肽，但由于其难以提纯获得，因此还未有关于其基于单克隆抗体的ELISA免疫分析方法建立，因此，制备出能够稳定分泌抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为商品化开发生产高质量的酶联检测试剂盒奠定夯实基础。

免疫胶体金层析技术的实现还得益于其载体免疫胶体金层析试纸条（immunochromatograp hic test strips，ICTSs），一种通过硝酸纤维素膜将加入的待检测样品固定在能与样品发生特异性结合的受体处位置，随着复合物的随膜流的累积，胶体金在检测试纸条上显色，这个过程往往只需要几分钟时间，因此此技术大大降低了检测的时间成本，加之其操作简单，特异性强，灵敏度高，很快在科学研究中得到广泛应用。随着纳米材料技术的成熟，金属纳米粒子的使用也越来越广泛，金属纳米粒子具有有与纳米材料一样的光电性，以及其独特的生物相容性，自然而然受到免疫学的重视，在免疫学研究中的应用随着胶体金的广泛使用而更加深远。胶体金因为受离子层的静电作用在溶液中以胶体分散状态显现。胶体金纳米粒子作为标记材料，其制备工艺简单，稳定性强，粒子分散性好以及优质的光学特性，在免疫标记方法上具有独特的优势。金纳米花作为一种新型的高催化胶体金技术在近几年发展迅速，金纳米花是在胶体金基础上通过种子生长法放大胶体金粒子，行成的形似花状的纳米粒子，其具有更显著的光学消化系数和催化活性，一定程度上大大提高了标记检测的灵敏度。目前制备金纳米粒子的方法有物理合成法和化学合成法，但化学合成法中的液还原法也称为种子生长法因其操作简单而受到广大研究者的青睐。种子生长法是在胶体金颗粒的基础上利用还原氯金酸行成表面不规则的较大颗粒的金纳米花。实验中采用对苯二酚作还原剂，可以调控合成了不同粒径的纳米花。

发明内容

本发明目的在于提供一株能分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株5E4及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一株杂交瘤细胞株5E4，其分类命名为抗α-芋螺毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年05月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.22347。

本发明还提供了一种抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体，其亚型为IgG2b，其由保藏编号为CGMCC No. 22347的杂交瘤细胞株5E4分泌产生。

本发明还提供了一种芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的免疫侧流层析检测卡，所述检测卡包括样品垫、金标垫、检测膜、吸水垫和塑料卡壳；所述检测膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG2b抗体，所述检测线上包被有TRX-αB-CTX融合蛋白抗原；所述金标垫上含有胶体金或纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体。

本发明还提供了上述一种免疫侧流层析检测卡的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）抗体及抗原的制备

选用杂交瘤细胞株5E4分泌产生的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体作为标记抗体，选用TRX-αB- CTX融合蛋白抗原作为检测线包被抗原，选用羊抗小鼠IgG2b抗体作为质控线包被抗体；

（2）检测膜的制备

将1.6mg/mL的检测线包被抗原和1 mg/mL的质控线包被抗体用0.01M pH7.4的PBS缓冲液分别按1/0.5和1/1进行稀释，将二者以0.5cm的间隔在硝酸纤维膜上划线，划线量为2 μL/cm，得到检测线和质控线，干燥备用；

（3）样品垫的制备

将玻纤GL-b02样品垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；

（4）金标垫的制备

将聚酯MA0280金标垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥；将胶体金或纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液以4μL的量点涂于金标垫上，干燥备用；

（5）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；

（6）检测卡的组装

在DB-6卡式底板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm，得到试纸条；将组装好的试纸条裁切成宽0.3cm长6cm的小条，置于塑料卡壳的卡槽内，盖上上盖，压紧，即得到所述免疫侧流层析检测卡；

其中，所述封闭液配方按质量分数计为：0.01M pH7.4 PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.5% PEG20000+0.5%吐温20。

进一步的，上述一种免疫侧流层析检测卡的制备方法中，所述胶体金的制备方法为：将1g HAuCl₄溶于100mL ddH₂O中，得到1wt%的氯金酸水溶液，然后按1mL/管平均分装于1.5mL无菌的EP管中，用锡箔纸密封后置于-20℃冰箱中保存备用；取1mL 1wt%的氯金酸水溶液溶于100mL ddH₂O中，混匀后加热煮沸，随后向其中加入2mL 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7min，观察氯金酸水溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，将其放置室温冷却后，用无菌ddH₂O定容至100mL，即得到直径12.2nm的胶体金溶液。

进一步的，上述一种免疫侧流层析检测卡的制备方法中，所述纳米花的制备方法为：取100μL直径12.2nm胶体金溶液加入至100mL ddH₂O中，然后向其中加入750μL 1wt%的氯金酸水溶液混匀，再加入300μL 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，调节pH值至7.0，再向其中加入750μL 0.03 M的对苯二酚溶液，搅拌至溶液颜色变为蓝色即得到纳米花溶液。

进一步的，上述一种免疫侧流层析检测卡的制备方法中，所述胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液的制备方法为：取10mL直径12.2nm胶体金溶液置于冰水浴，在搅拌状态下向其中加入180μL 0.1M的K₂CO₃溶液，随后缓慢滴加120μL 2.41mg/mL的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆IgG2b抗体溶液，维持冰水浴搅拌1 h，随后加入终浓度1wt%的牛血清白蛋白，维持冰水浴搅拌30 min，再加入终浓度0.5wt%的PEG 20000，维持冰水浴继续搅拌30 min，4℃静置过夜后，在4℃、3000 r/min的条件下离心20 min，将离心得到的上清再次在4℃、12000 r/min的条件下离心20 min，将离心后的沉淀用20μL金标稀释液重悬，即得到所述胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液；其中，所述金标稀释液配方按质量分数计为：0.01M pH6.5 PB缓冲液+1%牛血清白蛋白+ 0.5%PEG20000。

进一步的，上述一种免疫侧流层析检测卡的制备方法中，所述纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液的制备方法为：取10mL纳米花溶液置于冰水浴，在搅拌状态下向其中加入180μL 0.1M的K₂CO₃溶液，随后缓慢滴加30μL 1.6mg/mL的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆IgG抗体溶液，维持冰水浴搅拌1 h，再加入终浓度1wt%的牛血清白蛋白，维持冰水浴搅拌30 min，再加入终浓度0.5wt%的PEG 20000，维持冰水浴继续搅拌30 min，4℃静置过夜后，在4℃、3000 r/min的条件下离心20 min，将离心得到的上清再次在4℃、12000 r/min的条件下离心20 min，将离心后的的沉淀用20μL金标稀释液重悬，即得到所述纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液；其中，所述金标稀释液配方按质量份数计为：0.01M pH7.0 PB缓冲液+1%牛血清白蛋白+ 0.5% PEG20000 。

本发明还提供了一种检测芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的方法，具体为：使用上述的免疫侧流层析检测卡进行芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的检测。

本发明还提供了上述一种免疫侧流层析检测卡在芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX检测中的应用。

本发明的显著优点在于：

目前还未有基于单克隆抗体（IgG2b）的芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的ELISA免疫分析的报道，更未见有关于芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX的免疫检测方法。本发明提供的αB-CTX竞争法免疫侧流层析检测卡，检测时间仅为10 min，检测阈值（消除T线）达到20μg/mL，检测限（vLOD）达到1.5ng/mL，相较于现有的检测方法来说，具有特异性好，灵敏度高，精确度强，操作简单，成本低等特点，适合大批量样品检测。

附图说明

图1是本发明重组抗原的表达与纯化电泳图。（A）泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-28a总蛋白；泳道2-3：pET-28a- αB-ctx ₄ 总蛋白。（B）泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-32a总蛋白；泳道2：pET-32a- αB-ctx ₄ 总蛋白；泳道3-5: 纯化的TRX-αB-CTX4融合蛋白。(C)泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-32a总蛋白；泳道2：pET-32a- αB-ctx总蛋白；泳道3：纯化的TRX-αB-CTX融合蛋白；泳道4：空载pGEX-6p-1总蛋白；泳道5：pGEX-6p-1- αB-ctx总蛋白；泳道6：纯化的GST-αB-CTX融合蛋白。

图2是本发明免疫小鼠血清效价测定。

图3是本发明细胞融合结果。

图4是本发明抗体纯化结果鉴定。泳道M：Maker；泳道1：腹水总蛋白；泳道2：纯化的抗蛇毒SN311单克隆抗体。

图5是本发明杂交瘤细胞株染色体分析。

图6是本发明单克隆抗体亲和力检测结果。

图7是本发明单克隆抗体间接iELISA特异性分析结果。

图8是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测曲线图。

图9是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测直线图。

图10是本发明胶体金胶体溶液数码照片图。

图11是本发明制备的胶体金溶液及胶体金免疫探针紫外可见全波长扫描图。

图12是本发明纳米花胶体溶液数码照片图。

图13是本发明制备的纳米花溶液及金纳米花免疫探针紫外可见全波长扫描图。

图14是本发明胶体金免疫侧流层析检测卡特异性分析。

图15是本发明胶体金免疫侧流层析检测卡灵敏度分析。

图16是本发明纳米花免疫侧流层析检测卡特异性分析。

图17是本发明纳米花免疫侧流层析检测卡灵敏度分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的杂交瘤细胞株5E4，其分类命名为抗α-芋螺毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年05月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北层西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCC No.22347。

实施例1单克隆抗体的制备与鉴定

1 抗原载体构建

1）芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX（以下统一表述为αB-CTX）蛋白质序列及基因序列的获得

在NCBI网站的GenBank数据库中查找到αB-CTX的氨基酸序列为：

VRCLEKSGAQPNKLFRPPCCQKGPSFARHSRCVYYTQSRE。

依据大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性，优化αB-CTX毒素的DNA序列 ，进行化学合成。优化后的 αB-ctx基因的核苷酸序列如下：

5’-GTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAA-3’（SEQ ID NO.1)。

2） αB-ctx基因的处理

以下两组PCR扩增共用一套引物，上下游引物序列如下：

αB- ctx（αB- ctx 4）-F- EcoR Ⅰ（SEQ ID NO.2): 5’-AGTGAATTCGTTCG-3’

αB- ctx（αB- ctx 4）-R- Hind Ⅲ（SEQ ID NO.3)。: 5’-GCAAAGCTTTTCACGAG-3’

组一：将优化后的 αB-ctx基因通过PCR扩增在两侧增加酶切位点 EcoR I(5’-GAATTC-3’)， Hind III(5’-AAGCTT-3’)，得到待克隆的 αB-ctx基因序列如下：

5’-GAATTCGTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAAAAGCTT-3’（SEQ IDNO.4)。

组二：将4个优化后的 αB-ctx基因使用5’-GGATCA-3’串联，通过PCR扩增在两侧增加酶切位点 EcoR I(5’-GAATTC-3’)， Hind III(5’-AAGCTT-3’)，得到待克隆的 αB-ctx4基因序列如下：

5’-GAATTCGTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAAGGATCAGTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAAGGATCAGTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAAGGATCAGTTCGTTGCCTGGAAAAATCTGGTGCTCAGCCGAACAAACTGTTCCGTCCGCCGTGCTGCCAGAAAGGTCCGTCTTTCGCTCGTCACTCTCGTTGCGTTTACTACACCCAGTCTCGTGAAAAGCTT-3’（SEQ IDNO.5)。

3）重组质粒pET-28a- αB-ctx4以及pET-32a- αB-ctx4的构建

将上述组二扩增得到的 αB-ctx4基因分别插入到同样经过 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切处理的pET-28a载体、pET-32a载体中，用T4-DNA连接酶连接过夜，得到了重组质粒pET-28a- αB-ctx4以及pET-32a- αB-ctx4。将上述重组质粒分别转入 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，再分别涂布于LB+Kana（终浓度50 μg/mL）平板和LB+ Ampicillin（终浓度100 μg/mL）平板上。

4）重组质粒pGEX-6p-1- αB-ctx以及pET-32a- αB-ctx的构建

将上述组一扩增得到的 αB-ctx基因分别插入到同样经过 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切处理的pGEX-6p载体、pET-32a载体中，用T4-DNA连接酶连接过夜，得到了重组质粒pGEX-6p-1- αB-ctx以及pET-32a- αB-ctx。将上述重组质粒分别转入 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，再分别涂布于LB+ Ampicillin（终浓度100 μg/mL）平板上。

5）重组质粒的筛选、检测

分别挑取上述平板上的单菌落， pET-28a- αB-ctx4BL21(DE3) 接种于LB+Kana（终浓度50 μg/mL）液体培养基，其余均接种于LB+ Ampicillin（终浓度100 μg/mL）液体培养基（以下实验均按此对应关系接种），于37℃、180 r/min摇床培养8 h后，将菌体送去测序鉴定。

2 重组抗原的表达与纯化

1）菌株pET-28a- αB-ctx4/BL21(DE3) 活化与αB-CTX4融合蛋白表达纯化

取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（50 μg/mL Kana），37℃、180 r/min摇床培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，向其中加入100 μL浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于25℃摇床中培养过夜。

将33 mL菌液收集至一个洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速8000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后向沉淀中加入330μL事先配置好的5×SDS-PAGE loading buffer（0.01g溴酚蓝+0.6mL 1M pH6.8 Tris-HCl+2.5mL甘油+2mL 10%SDS +0.5mL β-巯基乙醇+4.4 mL ddH2O），用移液枪充分吹打，沸水浴10min，随后在1000r/min的条件下离心5min，收集上清液，以30 μL/泳道的体积上样，进行SDS-PAGE电泳，每板点满10泳道，染色脱色后，割下目的条带集中在研钵中，液氮充分研磨，每板研磨粉末加500μL 0.01M pH7.4的PBS缓冲液(两只免疫的量)，放进-80℃冰箱待用。

2）pET-32a- αB-ctx4/BL21(DE3)活化、TRX-αB-CTX4融合蛋白表达纯化和pET-32a- αB-ctx /BL21(DE3)活化、TRX-αB-CTX融合蛋白表达纯化

取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Ampicillin），37℃、180 r/min摇床培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，向其中加入100 μL浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于25℃摇床中培养过夜。

将33 mL菌液收集至一个洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速8000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后向沉淀中加入7 mL事先配置好的Buffer A（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O+0.3 M NaCl+10 mM C₃H₄N₂，pH8.0）溶液将菌体重悬。用超声破碎仪破碎，工作5 s，暂停10 s，直至菌液由浑浊变澄清。将超声破碎后的菌液置于4℃冷冻离心机离心10 min，转速10000 r/min，离心之后收集上清液。将上清加入至事先用Buffer A溶液平衡过的Ni²⁺-NTA亲和层析柱中，反复上柱结合1 h左右（循环10次）。后穿流250 mL Buffer B（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O+0.3 M NaCl+50 mM C₃H₄N₂，pH8.0）除去杂蛋白分子，最后用Buffer C（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O+0.3 M NaCl+250 mM C₃H₄N₂，pH8.0）将目的蛋白洗脱并收集。

3）菌株pGEX-6p-1- αB-ctx /BL21(DE3)活化与GST-αB-CTX融合蛋白表达纯化

取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Ampicillin），37℃、180 r/min摇床培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，向其中加入100 μL浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），体系终浓度1mmol/L，置于20℃摇床中培养过夜。

将33 mL菌液收集至一个洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速8000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后向沉淀中加入7 mL0.01M pH7.4的PBS缓冲液将菌体重悬。用超声破碎仪破碎，工作5 s，暂停10 s，直至菌液由浑浊变澄清。将超声破碎后的菌液置于4℃冷冻离心机离心10 min，转速10000 r/min，离心之后收集上清液。将上清加入至事先用0.01M pH7.4的PBS缓冲液平衡的GST亲和层析柱中，反复上柱结合2 h左右，循环8次。后穿流200 mL 0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗去杂蛋白分子，最后用GSH溶液将目的蛋白洗脱并收集，其中，GSH溶液配方为：10mmol/mLGSH+50mmol/mLTris-HCl，pH8.0。

4）蛋白的验证

取20 μL纯化所得蛋白溶液，向其中加入10 μL 5×SDS-PAGE loading buffer，用移液枪充分混匀，沸水浴10min，离心后吸取10 μL上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示。

3 单克隆抗体的制备

1）小鼠免疫

以完全抗原αB-CTX4免疫6-8周龄雌性 Balb/c小鼠。

首次免疫为将Freund’s完全佐剂等体积与αB-CTX₄融合蛋白抗原（抗原浓度为100μg/200μL）混合进行，用乳化仪将混合物乳化至油包水状态，乳化的结果以滴到水中30 min之内不散开为判断标准，乳化后对Balb/c小鼠进行皮下多点注射，注射量为200μL/只。后续每间隔14天进行一次免疫，第一次免疫之后将Freund’s完全佐剂替换成Freund’s不完全佐剂，抗原浓度调整为50μg/200μL，其他步骤同首次免疫。免疫两次后尾部取血，以TRX-αB-CTX4融合蛋白抗原包被酶标条，iELISA检测血清效价。直至小鼠抗血清效价在1:8000稀释度下OD₄₅₀值超过1时达到细胞融合的条件，如图2所示为第四次免疫一周后的抗血清效价检测情况。若未达到效价，小鼠可继续按照常规方法免疫，直至效价达标为止。若当天选取的小鼠效价达标且有αB-CTX特异性，则改用与首次免疫相同剂量的αB-CTX4融合蛋白抗原，将其用生理盐水稀释成 30μg/100μL并过滤除菌，直接注射于小鼠腹腔进行末次加强免疫，注射量为100μL/只，为取小鼠脾脏进行细胞融合做准备。

2）免疫血清效价测定

在小鼠第二次免疫后的5~7 d内，用间接酶联免疫吸附测定法（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，iELISA）检测小鼠抗血清效价，操作步骤如下：

（1）抗血清采集：从小鼠尾部静脉取血，所获得血液在37℃水浴锅内静置30 min，后在4℃条件下12000 r/min离心20 min，吸取上层血清，备用。

（2）包被：用包被缓冲液（1.59 g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH9.6）稀释检测抗原TRX-αB-CTX₄融合蛋白至终浓度为5 μg/mL，加入酶标板，每孔100 μL，放置4℃冰箱中孵育过夜后将抗原倒出。

（3）封闭（Block）：配制PBSM溶液（5wt%脱脂奶粉+0.01 M pH7.4的PBS缓冲液），按200μL/孔加入到酶标孔中，置于4℃冰箱里封闭过夜后，用0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗板3次，洗完后拍干。

（4）一抗：用PBSM溶液将步骤（1）采集得到的抗血清以1:500为起始作倍比稀释，依次加入酶标孔，每孔100 μL，放置37℃恒温箱孵育1 h，同时用PBSM溶液作阴性对照。

（5）二抗：用PBSM溶液以1:8000的稀释比稀释酶标二抗（羊抗鼠-偶联辣根过氧化物酶，HAMA-HRP），每孔加入100 μL二抗，于37℃恒温箱孵育1 h。

（6）显色：量取TMB A液（17 mM C₆H₈O₇+0.33 M CH₃COONa+0.3 mL 30% H₂O₂）和TMBB液（10 mM C₆H₈O₇+1.2 mM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈+1.8 mM TMB+50 mL Glycerol），将二者等体积混匀，得到TMB显色液，用移液枪吸取TMB显色液按100 μL/孔加入到酶标孔中，于37℃恒温箱中孵育15 min。

（7）终止：取出显色后的酶标板，随即向酶标孔中加入2M的H₂SO₄溶液终止显色反应，每孔50 μL，显色终止后将酶标板置于酶标仪上检测OD450 nm值。

3）细胞融合

取第五次免疫后一周，加强免疫2天后的小鼠的脾脏通过研磨过滤获得脾细胞。将1.0×10⁷个SP2/0细胞与3.0×10⁷个脾细胞混合，室温1100 r/min离心7 min，弃掉上清液，将离心管里细胞沉淀弹松散。将含有细胞沉淀的离心管置于37℃温水中水浴，向其中缓缓滴加1 mL预热的PEG 1450溶液，滴加过程按照先慢后快的原则，在1 min钟内加完，之后静置1 min。静置之后，缓慢加入40 mL预热的1640不完全培养基终止融合，按照先慢后快的滴加原则，头一分钟内缓慢滴加1 mL培养基，第二分钟内加完3 mL培养基，第三分钟内加完5mL培养基，以此类推，直至加完40 mL 1640不完全培养基，之后将细胞混合液放置CO₂培养箱中静置10 min。将静置之后的细胞混合液室温离心7 min，转速1100 r/min，弃掉上清，将细胞沉淀转移至含有100 mL预热的2vol% HAT完全培养基（含20vol%胎牛血清）的无菌玻璃瓶中，轻轻晃动玻璃瓶，使细胞散开，然后放进CO₂培养箱中静置10 min，后用8孔排枪往事先铺好饲养细胞的96孔板中加入融合后的细胞，每孔100 μL，铺10板，细胞融合后观察细胞生长情况，如图3所示。

4）阳性杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合之后的第8 d，利用iELISA法对融合后的细胞进行筛选。事先用包被缓冲液（1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH9.6）将TRX-αB-CTX₄融合蛋白稀释至浓度为5μg/mL，100μL/well，并封闭好，做10板ELISA酶标板，用8孔排枪取细胞培养板中的培养上清，每孔取100 μL，加入到酶标板中，放置于37℃恒温箱中孵育1 h，同时细胞培养板的每孔补充120μL 2vol% HAT完全培养基。1h后用0.01M PBST洗三遍，再用0.01MPBS洗三遍，拍干后加入稀释的山羊抗小鼠-HRP，每孔100μL，置于37℃恒温箱中孵育1h，后加入配好的TMB显色液，每孔100μL，于37℃恒温箱中放置15 min，取出酶标板，添加50 μL 2M H₂SO₄溶液终止显色反应，后测定OD450 nm的值，筛选杂交瘤细胞的同时使用融合小鼠的血液上清做阳性对照，以阳性对照值为参考，并在阳性孔中挑取单个细胞集落转移至新孔培养，一段时间后使用icELISA法进行特异性检测，选取状态好杂交瘤细胞做亚克隆，并检测细胞抗体亚型，最后获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5E4。

5）腹水的制备与纯化

将杂交瘤细胞株5E4以1×10⁶ cells/只的量注射到石蜡致敏过一周的雌性Balb/c小鼠腹腔中，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，后置于4℃离心20min，转速13000r/min，离心后可观察到腹水分为三个液相层（由下向上依次为细胞沉淀，含有大量单克隆抗体的澄清透亮层，脂质层）。用移液枪吸取中间液相层置于新的EP管中，后用封口膜封好置于-80℃超低温冰箱储存。杂交瘤细胞株5E4分泌的抗体属于IgG2b型抗体，利用Protein G亲和层析法从腹水中纯化单克隆抗体，使用BCA法测定抗体蛋白浓度，此次诱生纯化的抗体浓度为1.6mg/mL，接着用10% SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图4所示。从图中可以看出，纯化后的抗体在40-50 kDa处和25-30 kDa处有明显的条带，分别对应IgG2b抗体的重链和轻链，而且几乎没有杂带，表明Protein G亲和层析介质法纯化IgG2b抗体效果很好，然后将纯化的单克隆抗体（mAb 5E4）于-20℃保存。

4 单克隆抗体的特性鉴定

1）染色体分析：用0.1wt%秋水仙素（0.25μmol/L）处理处于生长对数期的杂交瘤细胞5E4，培养6 h后悬起细胞，将细胞重悬液收集至15 mL离心管内，室温离心8 min，转速1200 r/min，离心后轻轻倒掉上清，向细胞沉淀中加入8 mL预热的0.075 mol/L氯化钾溶液，用移液枪轻柔地将细胞吹起，细胞悬液置于37℃培养箱继续孵育30 min。在细胞悬液中加入1 mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液（甲醇：冰醋酸的体积比为3:1），摇匀之后室温静置5 min，室温下1200 r/min离心8 min，向离心后的沉淀中再次加入5mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪轻轻吹起细胞沉淀，室温静置30min，之后在室温下1200 r/min离心8 min，向离心后的沉淀中加入5mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪吹起摇匀，置于4℃冰箱过夜。隔天取出在室温下1200 r/min离心8 min，将离心后的细胞沉淀用300μL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液吹起摇匀。在冰冻的载玻片上滴加10μL细胞悬液，立即吹散，自然干燥，用新配制1:10 Giemsa磷酸缓冲液染色10-15 min，蒸馏水冲洗，晾干后镜检，显微照相与核型分析。如图5所示，用0.1wt%秋水仙素对阳性杂交瘤细胞5E4进行处理后，染色并显微镜下观测，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为106条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。

2）单克隆抗体亲和力测定

根据Beatty的方法，用iELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液将TRX-αB-CTX融合蛋白分别稀释成5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL包被在ELISA酶标板中。用5% PBSM对纯化后的单克隆抗体倍比稀释作一抗，最终将抗体分别稀释成332.5ng/mL、166ng/mL、83ng/mL、41.5ng/mL、20.75ng/mL、10.375ng/mL、5.188ng/mL、2.594ng/mL。取出事先包被好的酶标板，然后各吸取100 μL稀释好的抗体加入到酶标孔内，其余步骤同以上iELISA检测。

记录数据并分析计算不同浓度梯度的TRX-αB-CTX融合蛋白抗原在IC₅₀时所对应的抗体浓度，根据下面所列公式可以计算出单克隆抗体的亲和力常数。

上述公式中：[Ab]的值为抗原浓度在[Ag]时，其IC50时的抗体浓度；

[Ab]t的值则为抗原浓度在[Ag]t时，其IC50时的抗体浓度；

n则为为[Ag]与[Ag]t的比值

测定结果如图6所示，利用Origin8.0软件进行拟合曲线的制作，根据各曲线中的IC₅₀，按照亲和常数测定公式技算出抗体的亲和力为0.947×10⁸ L/mol。

3）单克隆抗体特异性iELISA特异性分析

用iElISA检测方法测定单克隆抗体的特异性。用包被缓冲液稀释不同的完全抗原（TRX-αB-CTX融合蛋白、GST-αB-CTX融合蛋白、TRX-μ-CTX融合蛋白、GST-μ-CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白、青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285）至浓度为10μg/mL，用移液枪以每孔100 μL的量包被到96孔酶标板中，用5% PBSM溶液将抗体稀释至浓度为83ng/mL，然后以每孔100μL的量加进包被好的酶标板内，同时做阴性对照组，实验具体操作步骤同iELISA法，最终测定其OD450 nm值并记录数据，结果显示抗体特异性良好，如图7所示。其中，TRX-μ-CTX融合蛋白、GST-μ-CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白由福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室提供，青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

4）单克隆抗体竞争曲线与标准曲线

首先要确定抗原包被和一抗体稀释的最佳工作浓度，用包被缓冲液将TRX-αB-CTX融合蛋白抗原分别稀释成10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL。用5% PBSM对纯化后的抗体进行溶液稀释，最终将抗体稀释成332.5ng/mL、166ng/mL、83ng/mL、41.5ng/mL、20.75ng/mL、10.375ng/mL、5.188ng/mL、2.594ng/mL，用棋盘法做iELISA实验，选择OD450nm接近1的点，其对应的抗原包被浓度和一抗体稀释浓度即为最佳工作浓度，抗原包被的最佳浓度为10μg/mL，一抗体稀释的最佳浓度为80ng/mL。

用已经确定的包被抗原浓度和一抗工作浓度作icELISA，从而建立CTX的标准竞争曲线。包被TRX-αB-CTX融合蛋白抗原（10μg/mL），用5%PBSM溶液稀释GST-αB-CTX融合蛋白浓度为20000ng/mL，以此进行倍比稀释，浓度依次为10000ng/mL，5000ng/mL，2500ng/mL，1250ng/mL，625ng/mL，312.5ng/mL，156.25ng/mL，9.7656ng/mL，2.4414ng/mL，0.305175ng/mL，将稀释好的GST-αB-CTX融合蛋白溶液与稀释成80ng/mL的抗CTX单克隆抗体等体积混匀（实际抗体浓度较上述抗体浓度减半），置于37℃恒温培养箱孵育1h，后从混合液中每管吸取100μL加入至酶标孔中，同时做阳性对照和阴性对照，后按iELISA法操作。对获得的数据进行处理，横坐标为GST-αB-CTX融合蛋白实际浓度的对数值，纵坐标为B/B0，用Origin 8.0拟合竞争曲线以及标准曲线如图8，曲线方程为y=0.0728+[(1.04855-0.0728)/(1+x/504.72267)^0.93827]，R²=0.99232，其中IC50=661ng/mL，计算毒素CTX最低检测浓度约为81ng/mL。实验发现在IC₂₀~IC₈₀之间具有良好的线性关系，因此将此线性区间的点重新拟合成标准直线，如图9，公式y=1.97071-0.51887x，计算αB-CTX的线性检测范围为117～3798ng/mL。

实施例2 胶体金及胶体金免疫探针（GNP-mAb）的制备

1）胶体金（GNP）溶液的制备：将1g HAuCl₄溶于100mL ddH₂O中，得到1wt%的氯金酸水溶液，然后按1mL/管平均分装于1.5mL的无菌EP管中，用锡箔纸密封后置于-20℃冰箱中保存备用。取1mL 1wt%的氯金酸水溶液溶于100mL ddH₂O，混匀后加热煮沸，随后加入2mL1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7min。观察氯金酸水溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，放置室温冷却后，用无菌ddH₂O定容至100mL，即得到直径12.2nm胶体金溶液，于4℃冰箱冷藏备用。

2）胶体金（GNP）的表征：所制胶体金胶体溶液为酒红色，未见浑浊，底部无沉淀，分散性良好，如图10所示；紫外可见光谱扫描，最大吸收峰约为520nm，峰形较宽，如图11所示。

3）胶体金免疫探针（GNP-mAb）的制备：

最适标记抗体量：取酶标条分别加入200μL胶体金（GNP）溶液，各加入0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7μL mAb 5E4（1.6 mg/mL），充分混匀后置于37℃恒温箱孵育30min；分别加入20μL 10wt% NaCl，混匀，5 min后观测颜色变化，寻找孔内无沉淀且抗体用量少的孔，确定最适抗体标记量为2μL 1.6mg/mL mAb 5E4 / 200μL GNP（在放大体系中添加量为此处的120%）。

最适标记pH值：取酶标条分别加入200μL胶体金（GNP）溶液，各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8 、10、11μL 0.1M K₂CO₃，后每孔各加入上述确定的最适抗体抗体量，充分混匀后置于37℃恒温箱孵育30min；分别加入20μL 10wt% NaCl， min后观测颜色最深且稳定的孔，确定最适标记pH为3μL 0.1M K₂CO₃/ 200μL GNP（在放大体系中添加量为此处的120%）。

金标抗体的纯化：取10mL胶体金（GNP）溶液置冰水浴，在搅拌状态下用180μL 0.1MK₂CO₃调至最适标记pH，后缓慢滴加120μL mAb 5E4抗体（1.6 mg/mL），维持冰水浴低速搅拌1h；按终浓度1wt%加入BSA，维持冰水浴，低速搅拌30min；按终浓度0.5wt%加入PEG 20000，继续搅拌30min；静置4℃平衡体系过夜。置4℃、3000 r/min离心20 min，将离心后的上清置4℃、12000 r/min离心20 min，保留沉淀，用20μL金标稀释液重悬，即得到胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液。其中，金标稀释液配方按质量分数计为：1%人血清白蛋白+ 0.5% PEG20000+0.01M pH6.5 PB缓冲液。

实施例3 纳米花及纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的制备

1）纳米花（AuNF）制备：取100 mL ddH₂O，依次向其中加入直径12.2 nm胶体金溶液100μL，1wt%柠檬酸钠300μL，1wt% HAuCl₄ 750μL，混合均匀，调节pH值至7.0；剧烈搅拌，一次性快速加入750μL 0.03mM对苯二酚，搅拌至溶液颜色变为蓝色即得到纳米花金溶液；置4℃保存。

2）纳米花（AuNF）的表征：所制金纳米花胶体为深蓝色，未见浑浊，底部无沉淀，分散性良好，如图12所示；紫外可见光谱扫描，最大吸收峰约为603nm，峰形较宽，如图13所示。

3）纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的制备：

最适标记抗体量：取酶标条分别加入200μL纳米花（AuNF），各加入0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7μL mAb 5E4（1.6mg/mL），充分混匀后置于37℃恒温箱孵育30min；分别加入20μL 10wt% NaCl，混匀，5min后观测颜色变寻找孔内无沉淀且抗体用量少的孔，确定最适抗体标记量为0.5μL 1.6mg/mL mAb5E4 / 200μL GNP（在放大体系中添加量为此处的120%）。

最适标记pH值：取酶标条分别加入200μL纳米花（AuNF），各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8 、10、11μL 0.1M K₂CO₃，后每孔各加入上述确定的0.5μL最适抗体标记量，充分混匀后置于37℃恒温箱孵育30min；分别加入20μL 10wt% NaCl，5min后观测颜色最深且稳定的孔，确定最适标记pH为添加3μL 0.1M K₂CO₃/ 200μL GNP。

金标抗体的纯化：取10mL纳米花（AuNF）溶液置冰水浴，低速搅拌，用180μL 0.1MK₂CO₃调至最适标记pH，后缓慢滴加30μL mAb 5E4（1.6 mg/mL），维持冰水浴低速搅拌1h；按终浓度1wt%加入BSA，维持冰水浴，低速搅拌30min；按终浓度0.5wt%加入PEG 20000，继续搅拌30min；静置4℃平衡体系过夜。置4℃、3000r/min离心20min，弃沉淀，取上清置4℃、12000r/min离心20min，保留沉淀，用20μL金标稀释液重悬，即得到纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液。其中，金标稀释液配方按质量百分比计为：1% 人血清白蛋白+0.5% PEG20000+0.01M pH7.0 PB缓冲液。

实施例4 胶体金免疫侧流层析检测卡的制备

（1）抗体及抗原的制备

选用杂交瘤细胞株5E4分泌产生的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体作为标记抗体，选用TRX-αB- CTX融合蛋白抗原作为检测线包被抗原，选用羊抗小鼠IgG2b抗体作为质控线包被抗体；

（2）检测膜的制备

将1.6mg/mL的检测线包被抗原和1 mg/mL的质控线包被抗体用0.01M pH7.4的PBS缓冲液分别按1/0.5和1/1进行稀释，将二者以0.5cm的间隔在硝酸纤维膜上划线，划线量为2 μL/cm，得到检测线（T线）和质控线（C线），37℃干燥备用；

（3）样品垫的制备

将玻纤GL-b02样品垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液（封闭液配方按质量分数计为：0.01M pH7.4 PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.5% PEG20000+0.5%吐温20）中浸泡1小时后，取出，37℃干燥备用；

（4）金标垫的制备

将聚酯MA0280金标垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥；将胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液以4μL的量点涂于金标垫上，37℃干燥备用；

（5）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，37℃干燥备用；

（6）检测卡的组装

在DB-6卡式底板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm，得到试纸条；将组装好的试纸条裁切成宽0.3cm长6cm的小条，置于塑料卡壳的卡槽内，盖上上盖，压紧，即得到所述胶体金免疫侧流层析检测卡。

胶体金免疫层析检测卡特异性测定：将5种不同的抗原（TRX-μ-CTX融合蛋白、GST-μ-CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白、青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285）用0.01MPBS缓冲液（pH7.4）稀释至终浓度为25μg/mL，同时做阳性（GST-α-CTX用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）稀释至终浓度为25μg/mL）、阴性对照（0.01M PBS缓冲液（pH7.4））。分别在检测卡点样区缓慢滴入100 μL稀释好的不同抗原，10 min内观察显色情况。结果如图14所示：加入GST-αB-CTX融合蛋白抗原的检测卡的T线完全消失，结果为阳性；而加入其它5种蛋白抗原时，检测卡T线均显色，且与阴性对照相同，显示为阴性。表明胶体金免疫层析检测卡只与GST-αB-CTX融合蛋白抗原反应，与其它抗原均无反应，证明该胶体金免疫层析检测卡特异性强，无交叉反应。

胶体金免疫层析检测卡灵敏度测定：将GST-αB-CTX融合蛋白抗原稀释至终浓度为25μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL和0.5μg/mL，并设置阴性对照（0.01M pH7.4的PBS）。分别在检测卡点样区缓慢滴入100 μL稀释好的不同浓度抗原， 10min内观察显色情况。实验结果如图15（A）所示：在GST-αB-CTX融合蛋白抗原浓度为25μg/mL时，肉眼观察T线颜色呈无色，T线消失，随着GST-αB-CTX融合蛋白抗原浓度的降低，结合胶体金探针的能力逐渐减弱，抗原竞争逐渐削弱，肉眼观察到T线的颜色逐渐变深，当GST-αB-CTX融合蛋白抗原浓度稀释至5μg/mL时，T线及C线的显色与没有加入GST-αB-CTX融合蛋白抗原所显示的一致，说明此时已经达到了胶体金免疫层析检测卡的下限。进一步验证了上述所述的本实验制备的胶体金免疫层析试纸的最低检测限为5ng/mL。

实施例5 纳米花免疫侧流层析检测卡的制备

（1）抗体及抗原的制备

选用杂交瘤细胞株5E4分泌产生的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体作为标记抗体，选用TRX-αB- CTX融合蛋白抗原作为检测线包被抗原，选用羊抗小鼠IgG2b抗体作为质控线包被抗体；

（2）检测膜的制备

将1.6mg/mL的检测线包被抗原和1 mg/mL的质控线包被抗体用0.01M pH7.4的PBS缓冲液分别按1/0.5和1/1进行稀释，将二者以0.5cm的间隔在硝酸纤维膜上划线，划线量为2 μL/cm，得到检测线（T线）和质控线（C线），37℃干燥备用；

（3）样品垫的制备

将玻纤GL-b02样品垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，37℃干燥备用；

（4）金标垫的制备

将聚酯MA0280金标垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥；将纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA- CTX单克隆抗体溶液以4μL的量点涂于金标垫上，37℃干燥备用；

（5）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，37℃干燥备用；

（6）检测卡的组装

在DB-6卡式底板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm，得到试纸条；将组装好的试纸条裁切成宽0.3cm长6cm的小条，置于塑料卡壳的卡槽内，盖上上盖，压紧，即得到所述纳米花免疫侧流层析检测卡。

纳米花免疫层析检测卡特异性测定：将5种不同的抗原（TRX-μ-CTX融合蛋白、GST-μ-CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白、青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285）用0.01MPBS（pH7.4）稀释至终浓度为20μg/mL，同时做阳性（GST-αB-CTX融合蛋白用0.01M PBS（pH7.4）稀释至终浓度为20μg/mL）、阴性对照（0.01M PBS（pH7.4））。分别在检测卡点样区缓慢滴入100μL稀释好的不同抗原，10min内观察显色情况。结果如图16所示：加入GST-αB-CTX融合蛋白抗原的检测卡的T线完全消失，结果为阳性；而加入其它5种蛋白抗原时，检测卡T线均显色，显示为阴性。表明纳米花免疫层析检测卡只与GST-αB-CTX融合蛋白抗原反应，与其它抗原均无反应，证明该免疫层析检测方法特异性强，无交叉反应。

纳米花免疫层析检测卡灵敏度测定：将GST-αB-CTX融合蛋白抗原稀释至终浓度为20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2μg/mL，1.5μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，并设置阴性对照。分别在检测卡点样区缓慢滴入100μL稀释好的不同抗原，10min内观察显色情况。实验结果如下图17（A）所示：在GST-α-CTX融合蛋白抗原浓度为20μg/mL时，肉眼观察T线颜色呈无色，T线消失，随着GST-αB-CTX融合蛋白抗原浓度的降低，结合纳米花探针的能力逐渐减弱，抗原竞争逐渐削弱，肉眼观察到T线的颜色逐渐变深，当GST-αB-CTX融合蛋白抗原浓度稀释至1.5μg/mL时，T线，C线的显色与没有加入GST-αB-CTX融合蛋白抗原所显示的一致，说明此时已经达到了纳米花免疫层析检测卡的下限。进一步验证了上述所述的本实验制备的纳米花免疫层析试纸的最低检测限为1.5μg/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttcgttgcc tggaaaaatc tggtgctcag ccgaacaaac tgttccgtcc gccgtgctgc 60

cagaaaggtc cgtctttcgc tcgtcactct cgttgcgttt actacaccca gtctcgtgaa 120

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtgaattcg ttcg 14

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaaagcttt tcacgag 17

<210> 4

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattcgttc gttgcctgga aaaatctggt gctcagccga acaaactgtt ccgtccgccg 60

tgctgccaga aaggtccgtc tttcgctcgt cactctcgtt gcgtttacta cacccagtct 120

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aaactgttcc gtccgccgtg ctgccagaaa ggtccgtctt tcgctcgtca ctctcgttgc 480

gtttactaca cccagtctcg tgaaaagctt 510

Claims (8)

1.一株杂交瘤细胞株5E4，其特征在于：其分类命名为抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年05月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.22347。

2.一种抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体，其特征在于：其亚型为IgG2b，其由保藏编号为CGMCC No.22347的杂交瘤细胞株5E4分泌产生。

3.一种芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX的免疫侧流层析检测卡，其特征在于：所述检测卡包括样品垫、金标垫、检测膜、吸水垫和塑料卡壳；所述检测膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG2b抗体，所述检测线上包被有TRX-αB-CTX融合蛋白抗原；所述金标垫上含有胶体金或纳米花标记的权利要求2所述的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体。

4.一种如权利要求3所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）抗体及抗原的制备

选用权利要求1所述的杂交瘤细胞株5E4分泌产生的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体作为标记抗体，选用TRX-αB-CTX融合蛋白抗原作为检测线包被抗原，选用羊抗小鼠IgG2b抗体作为质控线包被抗体；

2）检测膜的制备

将1.6mg/mL的检测线包被抗原和1mg/mL的质控线包被抗体用0.01M pH7.4的PBS缓冲液分别按1/0.5和1/1进行稀释，将二者以0.5cm的间隔在硝酸纤维膜上划线，划线量为2μL/cm，得到检测线和质控线，干燥备用；

3）样品垫的制备

将玻纤GL-b02样品垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；

4）金标垫的制备

将聚酯MA0280金标垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥；将胶体金或纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体溶液以4μL的量点涂于金标垫上，干燥备用；

5）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；

6)检测卡的组装

在DB-6卡式底板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm，得到试纸条；将组装好的试纸条裁切成宽0.3cm长6cm的小条，置于塑料卡壳的卡槽内，盖上上盖，压紧，即得到所述免疫侧流层析检测卡；

其中，所述封闭液配方按质量分数计为：0.01M pH7.4 PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.5% PEG20000+0.5%吐温20。

5.根据权利要求4所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述胶体金的制备方法为：将1g HAuCl₄溶于100mL ddH₂O中，得到1wt%的氯金酸水溶液，然后按1mL/管平均分装于1.5mL无菌的EP管中，用锡箔纸密封后置于-20℃冰箱中保存备用；取1mL 1wt%的氯金酸水溶液溶于100mL ddH₂O中，混匀后加热煮沸，随后向其中加入2mL 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7min，观察氯金酸水溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，将其放置室温冷却后，用无菌ddH₂O定容至100mL，即得到直径12.2nm的胶体金溶液。

6.根据权利要求4所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述纳米花的制备方法为：取100μL直径12.2nm胶体金溶液加入至100mL ddH₂O中，然后向其中加入750μL1wt%的氯金酸水溶液混匀，再加入300μL 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，调节pH值至7.0，再向其中加入750μL 0.03 M的对苯二酚溶液，搅拌至溶液颜色变为蓝色即得到纳米花溶液。

7.根据权利要求4所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体溶液的制备方法为：取10mL直径12.2nm胶体金溶液置于冰水浴，在搅拌状态下向其中加入180μL 0.1M的K₂CO₃溶液，随后缓慢滴加120μL2.41mg/mL的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆IgG2b抗体溶液，维持冰水浴搅拌1 h，随后加入终浓度1wt%的牛血清白蛋白，维持冰水浴搅拌30 min，再加入终浓度0.5wt%的PEG20000，维持冰水浴继续搅拌30 min，4℃静置过夜后，在4℃、3000 r/min的条件下离心20min，将离心得到的上清再次在4℃、12000 r/min的条件下离心20 min，将离心后的沉淀用20μL金标稀释液重悬，即得到所述胶体金标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体溶液；其中，所述金标稀释液配方按质量分数计为：0.01M pH6.5 PB缓冲液+1%牛血清白蛋白+ 0.5% PEG20000。

8.根据权利要求4所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体溶液的制备方法为：取10mL纳米花溶液置于冰水浴，在搅拌状态下向其中加入180μL 0.1M的K₂CO₃溶液，随后缓慢滴加30μL 1.6mg/mL的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆IgG抗体溶液，维持冰水浴搅拌1 h，再加入终浓度1wt%的牛血清白蛋白，维持冰水浴搅拌30 min，再加入终浓度0.5wt%的PEG 20000，维持冰水浴继续搅拌30 min，4℃静置过夜后，在4℃、3000 r/min的条件下离心20 min，将离心得到的上清再次在4℃、12000 r/min的条件下离心20 min，将离心后的的沉淀用20μL金标稀释液重悬，即得到所述纳米花标记的抗芋螺毒素αB-VxXXIVA-CTX单克隆抗体溶液；其中，所述金标稀释液配方按质量份数计为：0.01M pH7.0 PB缓冲液+1%牛血清白蛋白+ 0.5% PEG20000。

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