CN108642017B - 一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗芋螺毒素（ω‑CTX MVIIA）的单克隆抗体细胞株及应用。该杂交瘤细胞株2E5，已于2018年1月31日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号是：CGMCC NO.15295。本发明以原核表达纯化GST‑ω‑CTX MVIIA重组抗原为免疫抗原，TRX‑ω‑CTX MVIIA重组抗原为检测抗原包被酶标板。通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为建立ω‑CTX MVIIA免疫检测方法奠定了基础。

Description

一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗芋螺毒素（ω-CTX MVIIA）单克隆抗体的杂交瘤细胞株（IgG）及其应用。

背景技术

芋螺毒素（Conotoxin，CTX）是芋螺（Cone snails）分泌的用于捕食和防御的一种具有生物活性的小分子多肽类神经毒素，一般含有10~30个氨基酸，大多富含二硫键，靶定神经系统的离子通道和受体，人和动物被叮咬后一般会出现麻痹、抽搐、惊厥甚至死亡。ω-芋螺毒素MVIIA（ω-CTX MVIIA）含有25个氨基酸残基，是特异与可逆的N-型电压敏感性钙离子通道的阻断剂，可当做镇痛剂治疗剧烈的和慢性的疼痛。是神经生物学、药物药理学、多肽化学、分子生物学等领域的研究热点，因此对其检测有重要意义。

目前芋螺毒素的检测方法有高效液相色谱法(High performance liquidchromatography, HPLC)、电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法（Electrospray ionization/quadrupole time of flight mass spectrometry，ESI-Qq-TOF-MS）、铜螯合纳米磁珠结合生物质谱法（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS）等。这些方法具有比较高的灵敏度，可以精确的分析样品中毒素的含量，但是其设备昂贵、对样品的纯度要求高、操作复杂、需要经过专业培训的人员操作，因此不适合推广。免疫分析法（immuno-analysis）是近十多年来发展起来的新方法，是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种分析方法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低，对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛普及应用于各种毒素的检测。所以，近十几年来用于生物毒素检测的酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）方法得到迅速发展。

由于ω-CTX MVIIA是小分子多肽，具有抗原性但不具有免疫原性，直接免疫动物无法获得相应的抗体，因此较少看到ω-CTX MVIIA的免疫学检测方法。只有基于多克隆抗体、单链抗体和单克隆抗体（IgM）的ω-CTX MVIIA免疫检测方法，而未见基于单克隆抗体（IgG）的ω-CTX MVIIA免疫分析。因此，制备出能稳定分泌抗ω-CTX MVIIA的单克隆抗体（IgG）杂交瘤细胞株，为商品化开发生产高质量的酶联检测试剂盒奠定坚实的基础。

发明内容

本发明目的是提供一株能稳定分泌抗ω-CTX MVIIA单克隆抗体（IgG）的杂交瘤细胞株。

本发明首先保护一株杂交瘤细胞株2E5，分类命名为抗芋螺毒素（ω-CTX MVIIA）单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是:CGMCC NO.15295。

其次保护一种由所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体（IgG）。

所述的单克隆抗体的制备方法，是将杂交瘤细胞株2E5，通过制备腹水和纯化，获得单克隆抗体（IgG）。

本发明还保护了所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体的应用，是将杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体（IgG）用于检测ω-CTX MVIIA。

所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体的应用，是将所述的单克隆抗体配制在检测ω-CTX MVIIA的免疫试剂盒中。

所述的杂交瘤细胞2E5产生的单克隆抗体的制备方法是：ω-CTX为小分子肽类毒素，仅由24-29个氨基酸组成，为半抗原。若直接以其进行动物免疫，无法产生免疫效果。因此表达纯化芋螺毒素与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的重组蛋白GST-ω-CTX MVIIA，作为小鼠免疫用抗原；同时还表达纯化了芋螺毒素与硫氧还蛋白（TRX）的重组蛋白TRX-ω-CTXMVIIA，作为检测用抗原。小鼠免疫后，将血清效价达到1：10⁶的小鼠脾细胞与SP2/0用50%PEG1450按照常规方法进行融合；用含20%胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用融合表达的抗原包被酶标板进行ELISA检测；将阳性孔细胞进行多次有限稀释法克隆化后获得可稳定分泌抗ω-CTX MVIIA单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E5。将此细胞株以1×10⁶/只的量注射到用液体石蜡预致敏过的Balb/c小鼠的腹腔中，一周后观察小鼠，待小鼠服部明显膨大且腹腔皮肤有紧张感时抽取腹水（腹水中含大量的杂交瘤细胞株2E5分泌的单克隆抗体）。12000 r/min离心30 min后取上清，-20℃保存。

本发明以原核表达纯化GST-ω-CTX MVIIA重组抗原为免疫抗原，TRX-ω-CTXMVIIA重组抗原为检测抗原包被酶标板。通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞2E5，该杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体（IgG）为建立ω-CTX MVIIA免疫检测方法奠定了基础。

本发明的优点在于：

目前的检测方法存在设备昂贵、对样品的纯度要求高、操作复杂、需要经过专业培训的人员操作等缺点，因此不适合推广。而本研究使用的免疫分析法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低，对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，并且还未有基于单克隆抗体（IgG）的ω-CTX MVIIA免疫分析的报道。

附图说明

图1 是本发明重组抗原的表达与纯化电泳图。泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-32a总蛋白；泳道2：pET-32a-ctx总蛋白；泳道3-4: 纯化的TRX-CTX蛋白；泳道5：空载pGEX-6P-1总蛋白；泳道6：pGEX-6P-1-ctx总蛋白；泳道7-8：纯化的GST-CTX蛋白。

图2 是本发明免疫小鼠血清效价测定。

图3 是本发明细胞融合结果。

图4 是本发明抗体纯化结果鉴定。泳道M：Maker；泳道1：腹水总蛋白；泳道2：纯化的抗-ω-CTX MVIIA单克隆抗体。

图5 是本发明杂交瘤细胞株染色体分析。

图6 是本发明单克隆抗体亲和力检测结果。

图7 是本发明单克隆抗体间接iELISA特异性分析结果。

图8 是本发明单克隆抗体间接竞争icELISA特异性分析结果。

图9 是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测曲线图。

图10 是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测直线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的杂交瘤细胞株2E5，分类命名为抗芋螺毒素（ω-CTX MVIIA）单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北层西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCCNO.15295。

实施例1本发明单克隆抗体的制备与鉴定

1、抗原载体构建

1）ω-CTX MVIIA蛋白质序列及基因序列的获得在NCBI网站上查到ω-CTX MVIIA中具有功能的成熟肽区域序列为：CKGKGAKCSR LMYDCCTGSC RSGKC。根据芋螺毒素成熟肽区的氨基酸序列，按照大肠杆菌的密码子偏爱性，推导出该毒素的DNA序列，在序列的两端直接加入酶切位点，化学合成之后就可直接插入到载体之中。最后确定的序列如下：

正链：5'-GA TCC TGC AAA GGT AAA GGT GCG AAA TGC TCT CGT CTG ATGTAC GACTGC TGC ACC GGT TCT TGC CGT TCT GGT AAA TGC TGA C-3'

负链5'-TC GAG TCA GCA TTT ACC AGA ACG GCA AGA ACC GGT GCA GCAGTC GTACAT CAG ACG AGA GCA TTT CGC ACC TTT ACC TTT GCA G-3'

2）ω-CTX MVIIA基因寡核苷酸链的处理

将化学合成的寡核苷酸链分别加入25 µL的无菌水溶解，配制成终浓度50 µmol/L。各取2 µL混合后加入到16 µL的Taq聚合酶Buffer中，混匀后放到PCR中进行退火。95℃加热10 min后直接放入保温杯中冷却至室温。

化学合成的寡核苷酸链两端都是羟基，与载体进行连接时效率比较低下，可以通过T4多聚核苷酸激酶对5'进行磷酸化修饰，反应体系如下：

37℃水浴30 min；75℃水浴10min。

3）重组质粒pGEX-6p-1-ctx的构建

将处理好的芋螺毒素基因插入到同样经过BamH I和Xho I双酶切处理的pGEX-6p-1载体中，用T4-DNA连接酶连接过夜，从而得到了重组质粒pGEX-6p-1-ctx。转入E.coliBL21 (DE3)感受态细胞，涂布于LB+Amp平板上。

4）重组质粒pET32a-ctx的构建

将处理好的芋螺毒素基因插入到同样经过BamH I和Xho I双酶切处理的pET32a载体中，用T4-DNA连接酶连接过夜，从而得到了重组质粒pET32a-ctx。转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于LB+Amp平板上。

5）重组质粒的筛选、检测

挑取LB+Amp平板上的单菌落，接种于LB+Amp的液体培养基于37℃摇床培养8 h，将菌体送去测序鉴定。

2、芋螺毒素的重组抗原的表达与纯化

1）菌株BL21(DE3)/pGEX-6p-1-ctx和BL21(DE3)/pET32a-ctx活化与蛋白表达，取1mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Amp)，37℃、180 r/min摇床震荡培养约3 h。待菌液OD600 nm约为0.8 h，加入100 μL 1.0 mol/L的IPTG，16℃、180 r/min震荡摇床过夜培养。

2）GST-ω-CTX MVIIA融合蛋白纯化

将100 mL菌液分装于50 mL离心管，4℃、8000 r/min离心10 min。弃上清，加Buffer A将菌体重悬，用超声破碎仪破碎，工作5 s，暂停10 s，直至菌液由浑浊变澄清。将超声破碎后的菌液4℃、10000 r/min离心10 min。离心后收集上清加入Buffer A平衡过的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，静置后流出柱内液体，然后用Buffer B缓慢流过柱子洗去杂蛋白。加入Buffer C将目的蛋白洗脱出来，收集流出液。纯化所得蛋白进行SDS-PAGE电泳，如图1所示。

3）TRX-ω-CTX MVIIA融合蛋白纯化

将100 mL菌液分装于50 mL离心管，4℃、8000 r/min离心10 min。弃上清，加PBS将菌体重悬，用超声破碎仪破碎，工作5 s，暂停10 s，直至菌液由浑浊变澄清。将超声破碎后的菌液，4℃、10000 r/min离心10 min离心后收集上清加入PBS平衡过的GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱，静置后流出柱内液体，然后用40 mL PBS缓慢流过柱子洗去杂蛋白。加入10 mM还原性谷胱甘肽洗脱并收集流出液。纯化所得蛋白进行SDS-PAGE电泳，如图1所示。

3、单克隆抗体的制备

1）小鼠免疫

以完全抗原GST-ω-CTX MVIIA免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠。

第一次免疫：取完全抗原GST-ω-CTX 100 μg稀释于PBS缓冲液，并与等体积弗氏完全佐剂混匀，用注射器抽吸乳化完全后，对Balb/c小鼠进行皮下多点注射。第二次免疫：两周后对小鼠进行二次免疫，取完全抗原GST-ω-CTX MVIIA 75 μg稀释于PBS缓冲液，并与等体积弗氏不完全佐剂混匀，用注射器抽吸乳化完全后，对Balb/c小鼠进行皮下多点注射。第三次免疫：两周后对小鼠进行三次免疫，方法同第二次。免疫一周后尾部取血，以TRX-ω-CTX MVIIA完全抗原包被酶标板，间接ELISA检测血清效价。若效价达到1:10⁶的小鼠脾细胞可用于融合实验，如图2所示。若未达到效价的小鼠可继续按照常规方法免疫，直至效价达到为止。加强免疫：取血清效价达到1:10⁶的小鼠，融合前3天取完全抗原GST-ω-CTX用生理盐水稀释混匀后每只50 μg的量腹腔注注射Balb/c小鼠；

2）免疫血清效价测定

采用iELISA方法进行小鼠血清效价的测定，实验方法如下：

（1）获得血清：从小鼠尾部静脉取血，获得血液于37℃水浴30 min。之后12000 r/min离心15 min，用移液枪吸取上层血清。

（2）包被：用包被缓冲液稀释TRX-ω-CTX MVIIA蛋白至终浓度为5 μg/mL，100 µL/孔加样。37℃孵育2 h。

（3）洗涤：用1×PBS洗板3次，200 µL/孔，洗完后拍干。

（4）封闭：加入4% PBSM封闭液，200 µL/孔，37℃孵育2 h。

（5）一抗：重复步骤（3），用封闭液稀释抗体，稀释如下（1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000）。100 µL/孔，37℃孵育1 h。并用未免疫小鼠血清作为阴性对照。

（6）二抗：重复步骤（3），HRP酶标羊抗鼠IgG用封闭液按1:8000稀释，100 µL/孔，37℃孵育1 h。

（7）显色：重复步骤（3），加入TMB显色缓冲液，100 μL/孔，37℃孵育15 min。

（8）终止：最后加入2 mol/L H₂SO₄，50 μL/孔。酶标仪测定OD450 nm值。

3）细胞融合

将加强免疫3天后的小鼠颈椎脱臼处死，解剖取脾脏。将1×10⁸个脾细胞与1×10⁷个SP2/0细胞混合，1000 r/min离心7 min后弃上清，将离心管里细胞沉淀弹松散。37℃水浴条件下，1 min内缓慢加入1 mL预热的PEG 1450溶液。静置1 min后，缓慢加入40 mL1640培养基终止融合。37℃培养箱静置10 min。1000 r/min离心7 min，弃上清，将细胞沉淀重悬于100 mL预热的HAT培养基。将融合细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板，100 μL每孔。放入37℃二氧化碳培养箱培养。每天观察一次，查看是否有污染以及融合情况，融合一星期后更换HAT培养基，换液量为一半。

4）阳性杂交瘤细胞的筛选

用间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择OD值较高的阳性孔用有限稀释法进行克隆化2-3次，直至阳性率为100%为止。最后获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E5，如图3所示。从图中可以看出，在倒置显微镜下观察到该杂交瘤细胞株的细胞状态良好，细胞增殖速度快，折光性好，细胞孔中背景很干净。然后将该细胞株扩大培养后冻存。

5）腹水的制备与纯化

将杂交瘤细胞株2E5以1×10⁶/只的量注射到石蜡致敏过的雌性Balb/c小鼠腹腔中，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，离心后分为三层（由下向上依次为细胞沉淀，含有大量单克隆抗体的澄清透亮层，脂质层），然后取其澄清透亮的中间层。该细胞分泌的抗体属于IgG₁型抗体，利用Protein G亲和层析介质法从腹水中纯化单克隆抗体，接着用10% SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图4所示。从图中可以看出，纯化后的抗体在40-50 kDa处和25-30 kDa处有明显的条带，分别对应IgG抗体的重链和轻链，而且几乎没有杂带，表明Protein G亲和层析介质法纯化IgG抗体效果很好，然后将纯化的单克隆抗体于-20℃保存。

4、单克隆抗体的特性鉴定

1）染色体分析：用0.1%秋水仙素（0.25 μmol/L）处理对数生长期细胞，培养4-6 h后悬起细胞，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入37℃预热的0.075 mol/L KCl 10 mL重悬细胞，37℃温箱静置15-20 min；在细胞悬液中加入1 mL新配制的甲醇-冰醋酸（3:1）固定液，混匀后室温静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；向细胞沉淀中再加入5 mL固定液，缓慢地重悬混匀细胞，室温固定20-30 min，1000 r/min离心10 min，弃上清，再加入5mL的固定液对细胞固定过夜。次日早上，1000 r/min离心10 min，弃上清。再加入200-300 μL的固定液，将细胞轻轻地吹起，混匀。在冰冻的载玻片上滴加1-2滴细胞悬液，立即吹散，自然干燥，用新配制1:10 Giemsa磷酸缓冲液染色10-15 min，蒸馏水冲洗，晾干后镜检，显微照相与核型分析。如图5所示，用0.1%秋水仙素对阳性杂交瘤细胞2E5进行处理后，染色并显微镜下观测，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为106±6条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。

2）单克隆抗体亲和力测定

根据Beatty的方法，用iELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液将TRX-ω-CTX MVIIA稀释成10、5、2.5 μg/mL包被在ELISA酶标板中。用5% PBSM将纯化后的单克隆抗体倍比稀释作一抗，加入酶标孔。其余步骤同以上iELISA检测。

计算出，每一个抗原浓度在IC₅₀对应的抗体浓度，按照下面公式可以计算出抗体亲和力常数。

式中：[Ab]表示抗原浓度为[Ag]时，在IC50处的抗体浓度；

[Ab]t表示抗原浓度[Ag]t时，在IC50处的抗体浓度；

n=[Ag]/[Ag]t

测定结果如图6所示，利用Origin8.0软件进行拟合曲线的制作，根据各曲线中的IC50，按照亲和常数测定公式技算出抗体的亲和力为2.79×10⁹ L/mol，为高亲和力抗体。

3）单克隆抗体特异性iELISA特异性分析

用iElISA检测方法进行测定。将TRX-ω-CTX MVIIA、GST-ω-CTX MVIIA、GST-α-CTX、GFP、KLH、OVA、BSA这6各种毒素的完全抗原按用包被缓冲液稀释至终浓度为5 μg/mL进行包被，单克隆抗体作为一抗按1:70000稀释，HRP酶标羊抗鼠IgG为二抗，按1:8000稀释加入，其余具体操作步骤同iELISA法。所得数据统计如图7。

4）单克隆抗体特异性icELISA特异性分析

通过icELISA法测定单克隆抗体与其它海洋毒素的交叉反应性。将TRX-ω-CTXMVIIA抗原用包被缓冲液稀释至5 μg/mL的浓度包被酶标板中。将纯化后的单克隆抗体用5%PBSM按1:64000稀释，同时将ω-CTX MVIIA、α-CTX、TTX、OA、GFP、DA、TLH总共7种标品用PBSM，稀释分别至0、0.8、1.6、3、6、12、25、50、100 μg/mL，然后各取50 μL稀释的毒素标品与50 μL的稀释后的抗体混合均匀，37℃反应1 h，后加入酶孔中，反应1 h。其余具体步骤同以上iELISA法。所得数据统计如图8。

5）单克隆抗体检测曲线与标曲

用已经确定的包被抗原浓度和一抗工作使用浓度作icELISA，从而建立

ω-CTX MVIIA的标准竞争曲线。用PBSM将ω-CTX标品按倍比稀释，然后将稀释好的毒素与抗体1:1混合反应1 h后加到酶标板孔中，反应1 h进行检测。以没有加毒素反应的为对照，其余具体步骤同以上iELISA法。所得数据用Origin 9.0分析软件作图，以ω-CTXMVIIA标准品浓度的对数值为横坐标，以抑制率（B/B0）为纵坐标，做出它的拟合曲线如图9，曲线方程为y=0.02042+[(1.02876-0.02042)/(1+x/1.30623)0.85738]，R²=0.98533，因此可得半抑制率IC₅₀=1.306 μg/mL，将[B/B₀]×100%为90%带入上述公式，得出能检测到ω-CTX MVIIA最低浓度为0.138 μg/mL。且由于在IC₂₀~IC₈₅之间具有较好的线性关系，把此区间的点绘制成标准直线如图10，得到方程式y=0.55854-0.41452x，计算得到它的线性检测范围为0.198-7.219 μg/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys

1 5 10 15

Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys

20 25

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatcctgcaa aggtaaaggt gcgaaatgct ctcgtctgat gtacgactgc tgcaccggtt 60

cttgccgttc tggtaaatgc tgac 84

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgagtcagc atttaccaga acggcaagaa ccggtgcagc agtcgtacat cagacgagag 60

catttcgcac ctttaccttt gcag 84

Claims (3)

1.一株杂交瘤细胞株2E5，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号是:CGMCC NO. 15295。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体。

3.如权利要求2所述单克隆抗体在制备检测ω-芋螺毒素MVIIA的免疫试剂盒中的应用。

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