CN113621079A - Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，其中目标抗体可选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。本发明将Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶在哺乳动物细胞中融合表达，既能克服化学标记方法的各种缺陷，又可获取高比活酶标抗体。所制备的融合蛋白可应用于免疫诊断领域，如化学发光免疫法，酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等。

Description

Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，还涉及该融合蛋白的其制备方法。
背景技术
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能。除此之外，碱性磷酸酶做为酶缀合物可应用于诊断领域，如基于抗原抗体反应的免疫诊断检测系统，比如化学发光平台或酶联免疫平台，或使DNA脱磷酸化。目前已知的天然AP中，比活性最高的是源自牛肠的碱性磷酸酶。小牛肠碱性磷酸酶天然蛋白或重组蛋白广泛应用于免疫诊断以及分子诊断领域，如酶促化学发光免疫诊断领域。其中酶标记步骤是制备诊断试剂过程中的关键步骤，将碱性磷酸酶标记相关分子(如抗原、抗体或小分子)，结合靶分子后，与碱性磷酸酶底物反应脱磷酸基团，从而氧化发光，通过测量发光强度定量靶分子浓度。
目前免疫酶标试剂制备方式是采用化学标记方法，如使用双功能试剂，戊二醛，过碘酸盐，SMCC试剂{4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯等)}，2-IT试剂(亚氨基噻吩盐酸盐)等，将抗体与酶偶联，但是化学偶联方法操作复杂，偶联效率低，由于偶联位点不固定且条件剧烈，易导致抗体或酶活性降低，抗体与酶的结合物不均一，需要分离去除未结合的酶和抗体，且去除未结合的抗体至关重要，因为游离的抗体会与酶标记抗体竞争相应的抗原，减低结合到固相上的酶标抗体量，因而降低了检测的灵敏度。
Fab抗体又为抗原结合片段(Antigen-binding fragment)，由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链结构(可变区和一个恒定区片段)组成，轻链与重链通过一个二硫键连接。每一个Fab相当于“Y”字形抗体的左臂或右臂，体积较小(分子量47-48kDa)。
由于Fab同时具备了抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备了亲本抗体一样的抗体-抗原亲和力、而且具有单链抗体(scFv)优秀的组织穿透力等，相比于单链抗体(scFv)拥有更稳定的结构，从而在临床诊断和治疗上发挥巨大的作用。
运用基因工程方法，重组表达抗体与碱性磷酸酶融合蛋白是较好的方式，可以替代传统化学偶联方法。已报道的方法，多选用大肠杆菌碱性磷酸酶与葡萄球菌蛋白A或ScFv在大肠杆菌或酵母细胞中融合表达，用于ELISA(酶联免疫吸附测定法)。但是大肠杆菌表达的碱性磷酸酶比活低，无法应用于发光免疫分析。大肠杆菌表达Fab抗体、或Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白缺乏翻译后修饰，如糖基化对维持碱性磷酸酶活性重要，且易形成不溶性包涵体，需要对包涵体蛋白进行变复性，难以获取高活性Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白。葡萄球菌蛋白A与碱性磷酸酶融合蛋白虽然可以结合IgG抗体，形成碱性磷酸酶标记抗体，但同样可以结合包被抗体，对免疫分析实验造成干扰。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，本发明的目的之二在于还提供Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的其制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，目标抗体选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。
进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述嵌合抗体选自人鼠嵌合抗体，人兔嵌合抗体或鼠兔嵌合抗体。
进一步，在本发明的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，目标抗体为鼠源抗体CA724-B72.3。
进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽，所述柔性连接肽为(GGGGS)n或(GGGS)n，刚性连接肽为A(EAAAK)nA，n为3,4,5,6,7,8之一。
进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述柔性连接肽为(GGGGS)4。
2、Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法，具体制备方法的步骤如下：
a.根据目标抗体的VL-CL和VH-CH1核苷酸序列，连接肽核苷酸序列，小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成后酶切基因，分别连接到载体上；
b.将构建后的重组载体转染到哺乳细胞中，经培养细胞后，即可在细胞培养液上清得到Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，步骤b中哺乳细胞为CHO细胞，HEK293细胞，Expi293细胞，COS7细胞，NSO细胞或BHK21细胞。
进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，所述载体为pCDNA/GS载体，重组载体转染到哺乳细胞后还包括步骤c，将用抑制剂加压筛选表达高活性蛋白的克隆，再采用批培养，Fed-batch培养筛选，结合高通量酶活鉴定方法，获取高表达Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白稳定细胞株，继续放大Fed-batch培养生产，10-14天后收集上清。
进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，步骤b中培养细胞时，培养基中含有2mM MgCl2,0.1mM ZnCl2。
进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，还包括步骤d蛋白纯化，收集细胞培养液上清，加入50-55％硫酸铵沉淀，沉淀溶解于缓冲液A中，经PhenylHP疏水层析，洗脱蛋白再经DEAE弱阴离子交换层析，最后得到的高活性Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
3、由以上方法制备的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白在免疫检测试剂中的应用也属于本发明所保护的范围。
本发明的有益效果在于：本发明将Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶在哺乳动物细胞中融合表达，既能克服化学标记方法的各种缺陷，又可获取高比活酶标抗体。所制备的融合蛋白可应用于免疫诊断领域，如化学发光免疫法，酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等作检测试剂用。相比较传统的化学偶联碱性磷酸酶方式，所表达的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白，具有如下优势：
(1)传统化学偶联方式，工艺流程长，偶联工艺复杂，条件剧烈，导致工艺不稳定，偶联产物得率低且批次之间稳定性不佳。Fab抗体与碱性磷酸酶融合表达简单且工艺稳定，避免了繁琐且低效率的酶与蛋白质的化学交联。
(2)传统化学偶联方式，为了获取较佳的偶联产物，通常需要对目标偶联产物进行纯化，从而去除未连接的酶与抗体分子，纯化不完全，在检测时会产生假阳性结果。Fab抗体与碱性磷酸酶融合表达方法则克服了这一缺点。
(3)传统化学偶联方式，偶联后的酶与抗体复合物不均一，而Fab抗体与碱性磷酸酶融合表达产物中Fab抗体与单体碱性磷酸酶分子比例为1:1或1:2，且在镍柱纯化时可分离开，保证酶与抗体复合物均一。
(4)传统化学偶联方式，由于偶联化学活性试剂结合位置不固定，可能会结合到抗体可变区，从而影响抗体与目标抗原结合；或者偶联化学活性试剂结合到碱性磷酸酶活性位点附近，影响碱性磷酸酶与底物结合；这两种情况均可导致偶联复合物活性下降，在检测时易得到假阴性的结果。而Fab抗体与碱性磷酸酶融合表达方式，Fab抗体与碱性磷酸酶通过连接肽结合，不影响Fab抗体与碱性磷酸酶活性。
(5)Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白，由于碱性磷酸酶本身是一个同源二聚体蛋白，Fab抗体与单体碱性磷酸酶分子比例为1:1情况下的融合蛋白上抗体效价也是二价，亲和力等同亲本抗体，简称为(Fab)2-AP。Fab抗体与单体碱性磷酸酶分子比例为1:2情况下的融合蛋白，酶标记比例高，标记产物酶活力更高，信号放大效果更佳，简称为Fab-AP。
(6)Fab抗体相较于单链抗体，在抗体稳定性，效价等方面有较大优势，基本上类似亲本抗体，除本发明所示意所有的抗体分子均可通过这种方式生产碱性磷酸酶偶联分子。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为HEK293细胞瞬时表达的Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M道是蛋白Marker，1是培养基上清液，蛋白marker分子量从上往下依次是116KDa,67KDa,45KDa,35KDa,25KDa,18KDa,14KDa，三个箭头从上往下依次对应的是VH-CH1-AP，6*His-AP,VL-CL。
图2为Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白镍亲和纯化的SDS-PAGE电泳图，其中，M道是蛋白Marker，泳道1～13依次为上样，流出，5mM咪唑洗脱组分1～6，300mM咪唑洗脱组分1～5,蛋白marker分子量从上往下依次是116KDa,67KDa,45KDa,35KDa,25KDa,18KDa,14KDa。三个箭头表示同图1。
图3为最终纯化后Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的SDS-PAGE图，其中，M道是蛋白Marker，泳道1为(Fab)2-AP，泳道2为Fab-AP。
图4为最终纯化后Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab)2-AP的SEC-HPLC图。
图5为最终纯化后Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的酶比活性对比数据。
图6为Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab)2-AP与传统酶化学标记抗体ELISA检测抗体活性比较图。
图7为Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab)2-AP与传统酶化学标记抗体ELISA检测综合活性比较图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
Fab抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(Fab antibody-Alkaline Phosphatase fusionprotein，简写Fab-ALP)。本发明是通过以下技术方案实现的：一类Fab抗体-碱性磷酸酶融合蛋白，是由Fab抗体和碱性磷酸酶构成的融合蛋白，其一经产生即具有与亲本IgG抗体类似的抗原结合活性和AP催化活性，且二者标记比例为1∶1或1:2；该类融合蛋白的酶比活力为3500±30U/mg或4670±30U/mg，酶活性接近理论碱性磷酸酶活性；结合活性近似于亲本IgG抗体，本发明下面实施例所制备得到的是1∶1和1:2Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白。
实施例1
选取CA724-B72.3抗体的完整的轻链(VL-CL)和部分重链结构(VH-CH1)，CA724为胃癌抗原，B72.3是识别CA724的单抗。
(1)实施例1抗体为鼠源抗体CA724-B72.3；运用生物信息学工具或uniprot数据库信息，获取相应抗体对应的VL-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)以及VH-CH1(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)序列信息。
(2)在VH-CH1羧基末端与小牛肠碱性磷酸酶(AP)氨基前端中间添加连接肽，在VH-CH1-AP融合蛋白、VL-CL蛋白、小牛肠碱性磷酸酶(AP)N端分别添加信号肽并进行密码子优化，基因合成与构建表达载体。
(3)Linker(连接肽)选择柔性连接肽，柔性连接肽为(GGGGS)4。
(4)碱性磷酸酶选取为小牛肠碱性磷酸酶，基因序列如SEQ ID NO.5所示，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。在基因的5’端添加kozak序列与限制性内切酶酶切位点，添加信号肽基因序列以及组氨酸标签基因(6*His)序列，在3’端添加终止密码子与酶切位点与保护碱基(EcoRI/BamHI)。采用重叠PCR技术合成基因，合成完成，酶切基因，分别连接到pCDNA3.1与pCDNA/GS载体上，使用商业化质粒抽提试剂盒抽提质粒。通过限制性内切酶分析和测序分析以此方式插入的基因序列是否无误。该表达载体被称为pCDNA3.1-6*His-AP,pCDNA/GS-6*His-AP。
(5)碱性磷酸酶可位于Fab抗体羧基末端(C端)，碱性磷酸酶与Fab抗体中间加linker序列(GGGGS)4，CA724-B72.3重链与碱性磷酸酶融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.8；CA724-B72.3轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2；
按照哺乳动物细胞密码子偏好性对蛋白序列2,8进行优化，优化后的基因序列分别为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.7所示，(SEQ ID NO.3为CA724-B72.3重链核苷酸序列)，并在基因的5’端添加kozak序列与限制性内切酶酶切位点，在3’端添加终止密码子与酶切位点与保护碱基(EcoRI/BamHI)，优化好的基因序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成完成，酶切基因，分别连接到pCDNA3.1与pCDNA/GS载体上。使用商业化质粒抽提试剂盒抽提质粒。通过限制性内切酶分析和测序分析以此方式插入的基因序列是否无误。该表达载体被称为pCDNA3.1-CA724-B72.3-VH-CH1-AP，pCDNA3.1-CA724-B72.3-VL-CL，pCDNA/GS-CA724-B72.3-VH-CH1-AP，pCDNA/GS-CA724-B72.3-VL-CL。
实施例2
HEK293细胞瞬时表达Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白
转染前一天将细胞传至0.5～0.7*106个/ml，转染当天调整宿主细胞HEK293悬浮细胞密度至1.0～1.2*106个/ml，保证活力95％以上，细胞状态良好。按照1ml细胞，加入1ug质粒(pCDNA3.1-VH-CH1-AP、pCDNA3.1-VL-CL、pCDNA3.1-6*His-AP各0.33ug质粒)，6ug PEI转染试剂进行转染，表达Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab-ALP)。6天后取细胞上清进行SDS-PAGE检测表达情况，包括融合蛋白表达水平，图1为HEK293表达Fab-ALP的SDS-PAGE图。进一步对表达的融合蛋白进行纯化，具体纯化参考以下实施例5。对Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白用pNPP法测定Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的碱性磷酸酶活性，可参考实施例6。并进行ELISA测定Fab抗体结合抗原效价，可参考实施例7。
实施例3
CHOK1细胞培养，电穿孔，铺96孔板与压力筛选
转染前使宿主细胞CHOK1处于对数生长期，保证活力95％以上。电穿孔转染：细胞计数，取1×10 7个细胞，800rpm/5min离心，去上清，离心后细胞用2ml PBS重悬洗涤一遍。用700ul CD-CHO培养基(不含谷氨酰胺)重悬细胞，加入pCDNA/GS-VH-CH1-AP，pCDNA/GS-VL-CL，pCDNA/GS-6*His-AP质粒(1mg/ml)各6.6ug，总计20ug质粒DNA，用移液器吸打混合均匀，转移至0.4cm电转杯中。设置电转仪，进行电击。电转指数波参数：250V，960uF，电阻无穷大。加入300ul CD-CHO培养基(不含谷氨酰胺)，静置5min。用CD-CHO培养基(不含谷氨酰胺)稀释100倍，使得细胞密度为0.1×10 6个/ml。按每孔50ul/5000个细胞进行96孔板铺板，放置CO2培养箱中培养。转染24h后每孔补加150ul CD-CHO培养基(不含谷氨酰胺)，66.6uMMSX，放置CO2培养箱中培养。转染21～28天，取长出克隆的细胞上清，测定Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的碱性磷酸酶活力，更具体的内容见后面实施例6。筛选出若干个表达水平高、Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab-ALP)的碱性磷酸酶活力高的克隆(表1)转移到24孔板中，长2～3天后转移至6孔板，细胞密度达到80％后冻存细胞。
表1高表达克隆高通量筛选，部分克隆96孔板上清活性数据
克隆号 序号 405nm 稀释倍数 对应稀释后酶活
1B5 1 0.163 10 34.21
1B7 2 0.213 10 44.63
1E2 3 0.277 10 57.96
1G3 4 0.146 10 30.67
2C3 5 0.175 10 36.71
2D8 6 0.234 10 49.00
2E7 7 0.163 10 34.21
2E8 8 0.142 10 29.83
2G3 9 0.289 10 60.46
3D7 10 0.163 10 34.21
3E5 11 0.185 10 38.79
3G6 12 0.201 10 42.13
4D2 13 0.237 10 49.63
4D6 14 0.116 10 24.42
5G5 15 0.187 10 39.21
6F3 16 0.149 10 31.29
6G9 17 0.159 10 33.38
7B3 18 0.168 10 35.25
7G3 19 0.225 10 47.13
8C5 20 0.208 10 43.58
9B8 21 0.218 10 45.67
9C7 22 0.128 10 26.92
10G8 23 0.135 10 28.38
实施例4
批培养，Fed-batch
将实施例3中高表达克隆细胞株，扩大陪养至悬浮培养，培养基为CDFortiCHOTMMedium(ThermoFisher，A1148301)，冻存细胞。按照细胞密度0.5*106个/ml接种20ml细胞至三角细胞培养瓶中，转速120rpm，5％CO2摇床培养箱中培养。待细胞存活率降至70％以下时，收获细胞培养上清进行酶活分析，筛选出具有高酶活性细胞(表2示意为本发明筛选的部分克隆活性数据)。具有高活力细胞进入Fed-batch(分批补料式培养)筛选，按照细胞密度0.5*106个/ml接种20ml细胞至三角细胞培养瓶中，转速120rpm，5％CO2，37℃摇床培养箱中培养，第四天开始测糖含量，如果糖含量低于4g/L，补糖至4g/L，第5天开始调节摇床温度至33℃，第5,7,9,11天按照8％的体积比进行补料CD EfficientFeedTMCAGTTMNutrient Supplement(ThermoFisher，A1327504)。并添加2mM MgCl2,0.1mM ZnCl2，至细胞存活率低于70％收取细胞上清，进行表达水平以及酶活力分析(表3为部分Fed-batch克隆活性数据)，选择2G3克隆进入实施例5步骤。
表2高表达克隆高通量筛选，部分克隆20ml悬浮批培养上清活性数据
克隆号 序号 405nm 稀释倍数 对应稀释后酶活
1B7 1 0.365 500 105.92
1E2 2 0.278 500 69.67
2D8 3 0.344 500 97.17
2G3 4 0.585 500 197.58
3G6 5 0.166 500 23
4D2 6 0.321 500 87.58
7G3 7 0.433 500 134.25
8C5 8 0.256 500 60.5
9B8 9 0.389 500 115.92
表3高表达克隆高通量筛选，3克隆悬浮补料培养上清活性数据
克隆号 序号 405nm 稀释倍数 对应稀释后酶活
2G3 1 0.366 5000 106.33
7G3 2 0.233 5000 50.92
9B8 3 0.209 5000 40.92
实施例5，放大生产与纯化
按照细胞密度0.5*106个/ml接种1L细胞至4个2L体积的三角细胞培养瓶中，转速120rpm，5％CO2摇床培养箱中培养，第四天开始测糖含量，如果糖含量低于4g/L，补糖至4g/L，第5天开始调节摇床温度至33℃，第5,7,9,11天按照8％的体积比进行补料CDEfficientFeedTMC AGTTMNutrient Supplement(ThermoFisher，A1327504)。并添加2mMMgCl2,0.1mM ZnCl2，至细胞存活率低于70％收取细胞上清，进行表达水平以及酶活力分析。一般可到第14天，收取细胞上清进行纯化。纯化步骤如下，
A.55％硫酸铵沉淀
待纯化的细胞表达上清碱性磷酸酶表达水平为1.1g/L，向收取的细胞上清(1L)中加入称取的硫酸铵粉末，称取量按照326g/1L细胞上清。放置4℃搅拌40min，离心8000rpm/15min，沉淀用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2,1M硫酸铵，pH7.5进行溶解，再次离心11000rpm/15min，取出上清后，用0.45um孔径的过滤膜进行过滤。
B.疏水层析
装填250ml苯基(Phenyl HP)疏水层析柱，用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，1M硫酸铵，pH7.5缓冲液平衡柱料2～3个柱体积，至紫外吸光值趋基线完毕再进行进样，进样速度控制在15ml/min，保留时间为15～20min。上样完毕用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mMZnCl2，1M硫酸铵，pH7.5缓冲液进行清洗。清洗完毕，再进行线性洗脱(缓冲液硫酸铵浓度从1M至0M，其余组分为20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5)，流速控制为15ml/min，时间为300min。按照吸光值进行分管收集组分，其中峰1为含Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白活性峰。收集峰1组分，透析样品至10L，20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5中，12小时后更换一次透析缓冲液。
C.阴离子交换柱纯化
装填20ml阴离子交换柱(DEAE–
Figure BDA0003249732360000091
Fast Flow)，将透析后的蛋白液进行阴离子交换层析(DEAE–
Figure BDA0003249732360000092
Fast Flow)，用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5缓冲液平衡柱料2～3个柱体积，至紫外吸光值趋基线完毕再进行进样，进样速度控制在5ml/min，保留时间为4min。上样完毕用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5缓冲液进行清洗，清洗完毕，再进行线性洗脱(缓冲液氯化钠浓度从0M至0.5M，其余组分为20mMTris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5)，流速控制为5ml/min，时间为80min。对洗脱样品进行检测，收集并合并目的蛋白。
D.镍亲和柱纯化
将合并的目的蛋白进行镍亲和柱纯化，用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5缓冲液平衡柱料2～3个柱体积，至紫外吸光值趋基线完毕再进行进样，进样速度控制在3ml/min，保留时间为10min。上样完毕用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5缓冲液进行清洗。清洗完毕，分别用20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2，pH7.5,3mM咪唑缓冲液与20mM Tris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2,pH7.5,300mM咪唑缓冲液进行洗脱(图2)，FAB抗体与碱性磷酸酶融合蛋白镍亲和纯化的SDS-PAGE电泳图，其中M道是蛋白Marker，泳道1～13依次为上样，泳道1样品为上样前蛋白样品，泳道2样品为上样流出液，3mM咪唑洗脱组分有7个收集样品，依次为泳道3-9；300mM咪唑洗脱组分有4个收集样品，依次为泳道10-13。蛋白marker分子量从上往下依次是116KDa,67KDa,45KDa,35KDa,25KDa,18KDa,14KDa。三个箭头从上往下依次是VH-CH1-AP，6*His-AP,VL-CL，经纯化后，Fab抗体与单体碱性磷酸酶分子比例为1:1或1:2的Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白完全分离开。将3mM咪唑以及300mM咪唑洗脱的蛋白液透析至最终储存缓冲液NaCl,150mM mol/l；ZnCl2,0.1mmol/l；Tris,20mM；MgCl2,5mmol/l，pH7.5。将各浓度咪唑洗脱的样品合并后对最终Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，图3为最终纯化后FAB抗体与碱性磷酸酶融合蛋白SDS-PAGE图，其中，M道是蛋白Marker，泳道1为(Fab)2-AP，泳道2为FAB-AP，Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白分子量符合理论分子量预测大小。SEC-HPLC分析纯度(图4)，纯化后纯度大于96％。活力检测，碱性磷酸酶比活与理论酶活相符合(见图5)。
实施例6
Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的碱性磷酸酶酶活性测定
待96孔板中克隆大小长至30％以上覆盖面积时，从96孔吸取克隆上清，用Assaybuffer(1mol/L二乙醇胺，0.5mmol/L MgCl2,pH9.8)将蛋白样品按照1/10比例进行稀释，按照每150ul Assay buffer加2.5ul pNPP(0.67M)，根据实际需要测定的样品数，配制底物混合液并置于金属浴中37℃预热。取5ul酶加入至PCR管中，置于金属浴，并用排枪加入75ul底物混合液，开始计时。3分钟后，每孔加入75ul终止液(3M NaOH)终止反应。吸取100ul反应液到酶标板，测定405nm的吸光值，计算对应的酶活，部分测试结果如表1所示。
对纯化的Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白进行定量，定量方法如下，用ddH2O做对照，测定纯化样品UV280吸光值，吸光值即为蛋白浓度。用Assay buffer(1mol/L二乙醇胺，0.5mmol/L MgCl2,pH9.8)将蛋白样品浓度稀释至0.05mg/ml，在此基础上，再稀释50倍。按照每150ul Assay buffer加2.5ul pNPP(0.67M)，根据实际需要测定的样品数，配制底物混合液并置于金属浴中37℃预热。取5ul酶加入至PCR管中，置于金属浴，并用排枪加入75ul底物混合液，开始计时。3分钟后，每孔加入75ul终止液(3M NaOH)终止反应。吸取100ul反应液到酶标板，测定405nm的吸光值，最终纯化样品(Fab)2-AP与Fab-AP酶比活值分别为3500U/mg与4670U/mg，结果如图5所示，按照碱性磷酸酶理论分子量52.3KDa与Fab抗体理论分子量(49KDa)，(Fab)2-AP分子中FAB与酶比例近似于1:1，Fab-AP分子中FAB与酶比例近似于1:2，换算下来Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白(Fab)2-AP与Fab-AP的碱性磷酸酶活性接近理论酶活。
实施例7，Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白抗体活性测定
B72.3抗原用包被稀释液稀释后(100ng/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃温育过夜，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)洗涤5min，洗涤3次；每孔加入封闭液200μL，于37℃封闭1h，TBST洗涤5min，洗涤3次；将Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白、对应原始抗体以及对照抗体化学标记ALP蛋白(同仁化学碱性磷酸酶标记试剂盒-巯基)以适当梯度稀释后，37℃温育1h，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)洗涤5min，洗涤3次；每孔加入HRP标记的羊抗鼠Fab二抗，37℃温育1h，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)洗涤5min，洗涤3次；拍干后加入TMB溶液100uL/孔显色，显色时间30℃温育10min；加入50uL/孔的终止液，终止反应；在15min内在酶标仪上读数，读数波长主波长450nm，副波长620nm(图6)，Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白换算下来与对应原始抗体在抗体活性方面，单位抗体活性相当，而对照抗体化学标记ALP蛋白抗体活性高值降低了1倍。
实施例8，Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白综合活性测定
待检抗原用包被稀释液稀释后(100ng/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃温育过夜，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)洗涤5min，洗涤3次；每孔加入封闭液200μL，于37℃封闭1h，TBST洗涤5min，洗涤3次；将Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白以及化学标记(同仁化学碱性磷酸酶标记试剂盒-巯基)的对应目标抗体以适当梯度稀释后，37℃温育1h，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)洗涤5min，洗涤3次；每孔加入pNPP底物液100μL，37℃反应3min，每孔加入终止液75μL，于20min内测定405nm。从图7可以看出对比的化学标记抗体随着标记抗体浓度提升，最高吸光值到达0.8左右，已经到平稳期，后续提高浓度已无法提高吸光值。而本发明制备的融合蛋白效价随着抗体浓度提升，吸光值可到达1.2左右，而且还在线性范围内，未到达平稳期，表明本发明制备的融合蛋白可以较大的提高信号值，增加反应灵敏度。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 金标优尼科（无锡）生物科技有限公司
<120> Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctgtac ctacacaggt gctgggactt cttctgctgt ggttgaccga tgcacgctgc 60
gacattcaga tgacccagtc acctgccagc ctttctgtgt ccgtcgggga gctggtgacc 120
atcacttgcc gcgcaagcga gaatatatat agtaatcttg cctggtacca gcagaaacag 180
ggcaagagtc cccagctgct ggtctacgct gctaccaatc ttgccgatgg cgtgcctagt 240
cgcttttctg gatccggcag tggcacccag tattctctga agatcaactc acttcagagc 300
gaagattttg gaagttacta ttgccagcat ttctggggga ccccctatac attcggtgga 360
ggaacaaagt tggaaatcaa gcgcgctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 702
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Thr Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn
85 90 95
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
100 105 110
Asn Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 3
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaatggt cttgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccaccggagt acacagccag 60
gtacagctcc agcagtcaga cgccgagttg gtaaagcctg gagcatccgt gaaaataagc 120
tgcaaggcat ctggctatac cttcaccgat cacgctattc attgggcaaa acagaagcct 180
gagcagggct tggagtggat tggctacatt tctcctggta acgatgatat caagtataat 240
gagaaattca agggaaaagc tactctgact gctgacaaat catcatctac agcctacatg 300
cagttgaact ctctcacatc tgaagatagc gcagtgtatt tctgcaagcg atcctattac 360
ggtcattggg ggcagggtac caccctcacc gttagcagtg ccaaaacgac acccccatct 420
gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact cgatggtgac cctgggatgc 480
ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc 540
agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc tctacactct gagcagctca 600
gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg 660
gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgccacggg actgc 705
<210> 4
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser
180 185 190
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg
195 200 205
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225 230 235
<210> 5
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgatccccg ccgaagagga gaaccccgcc ttctggaaca gacaggccgc ccaggccctg 60
gacgtggcta agaagctgca gcccatccag accgctgcca aaaacgtgat cctgttcctg 120
ggcgacggaa tgggcgtgcc caccgtgacc gctaccagaa ttttgaaggg acagatgaac 180
ggaaagctgg gacccgagac ccccctggcc atggatcagt tcccttacgt ggctctgtct 240
aagacataca acgtggacag acaggtgccc gacagcgccg gcaccgctac agcttacctg 300
tgcggcgtga aaggaaacta cagaaccatc ggggtgagcg ccgccgctag atacaaccag 360
tgcaacacca ccaggggcaa cgaagtgacc agcgtgatca acagagccaa aaaggccggc 420
aaggccgtgg gggtggtgac cacaacaaga gtgcagcacg cttctcccgc cggcgcctac 480
gctcacacag tgaatagaaa ctggtacagc gacgccgacc tgcccgccga cgctcagaaa 540
aacggatgtc aggatatcgc cgcccagctg gtgtataata tggacatcga cgtgatcctg 600
ggcggaggcc ggatgtacat gttccccgaa ggaacccccg accccgagta tcccgacgac 660
gccagcgtga acggcgtgag aaaggacaag cagaacctgg tgcaggagtg gcaggccaag 720
caccagggcg cccagtacgt gtggaacaga accgccctgc tgcaggccgc tgacgacagt 780
agcgtgaccc acctgatggg cctgttcgag cccgccgata tgaagtacaa cgtgcagcag 840
gaccatacca aagaccccac cctggccgaa atgaccgaag ccgccctgca ggtgctgagc 900
agaaaccccc gcggctttta cctgtttgtg gaaggaggca gaatcgacca tggccaccac 960
gacggcaagg cctacatggc tctgaccgag gccatcatgt tcgacaacgc tatcgccaag 1020
gccaacgaac tgaccagcga actggacacc ctgatcctgg tgaccgccga ccacagccac 1080
gtgttctcct tcggcggata cacactgaga ggcaccagca tcttcggcct ggcccccgga 1140
aaagccctgg acagcaagtc ctatacctcc atcctgtatg gcaacggccc cggctacgct 1200
ctgggcggag gatctagacc agacgtgaac ggcagcacca gcgaagaacc cagctacaga 1260
cagcaggccg ccgtgcccct ggcctctgaa acccacggcg gagaagacgt ggccgtgttc 1320
gctaggggac cccaggccca cctggtgcat ggagtgcagg aggaaacctt cgtggcccac 1380
atcatggcct ttgccggctg tgtggagccc tacacagact gtaacctgcc cgcccctgcc 1440
acagctacca gcattcccga c 1461
<210> 6
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala
20 25 30
Ala Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Pro Thr
35 40 45
Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly Lys Leu Gly
50 55 60
Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Arg Thr Ile Gly Val
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125
Val Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly
130 135 140
Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr
145 150 155 160
Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala
165 170 175
Asp Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Ala Gln Leu Val Tyr
180 185 190
Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe
195 200 205
Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Ala Ser Val Asn
210 215 220
Gly Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys
225 230 235 240
His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala
245 250 255
Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala
260 265 270
Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu
275 280 285
Ala Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His
305 310 315 320
Asp Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala Ile Met Phe Asp Asn
325 330 335
Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile
340 345 350
Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr
355 360 365
Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Leu Asp
370 375 380
Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala
385 390 395 400
Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly Ser Thr Ser Glu Glu
405 410 415
Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His
420 425 430
Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu
435 440 445
Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe
450 455 460
Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Ala
465 470 475 480
Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp
485
<210> 7
<211> 2226
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggaatggt cttgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccaccggagt acacagccag 60
gtacagctcc agcagtcaga cgccgagttg gtaaagcctg gagcatccgt gaaaataagc 120
tgcaaggcat ctggctatac cttcaccgat cacgctattc attgggcaaa acagaagcct 180
gagcagggct tggagtggat tggctacatt tctcctggta acgatgatat caagtataat 240
gagaaattca agggaaaagc tactctgact gctgacaaat catcatctac agcctacatg 300
cagttgaact ctctcacatc tgaagatagc gcagtgtatt tctgcaagcg atcctattac 360
ggtcattggg ggcagggtac caccctcacc gttagcagtg ccaaaacgac acccccatct 420
gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact cgatggtgac cctgggatgc 480
ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc 540
agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc tctacactct gagcagctca 600
gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg 660
gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgccacggg actgcggcgg cggcggctct 720
ggcggcggcg gctctggcgg cggcggctct ggcggcggcg gctctctgat ccccgccgaa 780
gaggagaacc ccgccttctg gaacagacag gccgcccagg ccctggacgt ggctaagaag 840
ctgcagccca tccagaccgc tgccaaaaac gtgatcctgt tcctgggcga cggaatgggc 900
gtgcccaccg tgaccgctac cagaattttg aagggacaga tgaacggaaa gctgggaccc 960
gagacccccc tggccatgga tcagttccct tacgtggctc tgtctaagac atacaacgtg 1020
gacagacagg tgcccgacag cgccggcacc gctacagctt acctgtgcgg cgtgaaagga 1080
aactacagaa ccatcggggt gagcgccgcc gctagataca accagtgcaa caccaccagg 1140
ggcaacgaag tgaccagcgt gatcaacaga gccaaaaagg ccggcaaggc cgtgggggtg 1200
gtgaccacaa caagagtgca gcacgcttct cccgccggcg cctacgctca cacagtgaat 1260
agaaactggt acagcgacgc cgacctgccc gccgacgctc agaaaaacgg atgtcaggat 1320
atcgccgccc agctggtgta taatatggac atcgacgtga tcctgggcgg aggccggatg 1380
tacatgttcc ccgaaggaac ccccgacccc gagtatcccg acgacgccag cgtgaacggc 1440
gtgagaaagg acaagcagaa cctggtgcag gagtggcagg ccaagcacca gggcgcccag 1500
tacgtgtgga acagaaccgc cctgctgcag gccgctgacg acagtagcgt gacccacctg 1560
atgggcctgt tcgagcccgc cgatatgaag tacaacgtgc agcaggacca taccaaagac 1620
cccaccctgg ccgaaatgac cgaagccgcc ctgcaggtgc tgagcagaaa cccccgcggc 1680
ttttacctgt ttgtggaagg aggcagaatc gaccatggcc accacgacgg caaggcctac 1740
atggctctga ccgaggccat catgttcgac aacgctatcg ccaaggccaa cgaactgacc 1800
agcgaactgg acaccctgat cctggtgacc gccgaccaca gccacgtgtt ctccttcggc 1860
ggatacacac tgagaggcac cagcatcttc ggcctggccc ccggaaaagc cctggacagc 1920
aagtcctata cctccatcct gtatggcaac ggccccggct acgctctggg cggaggatct 1980
agaccagacg tgaacggcag caccagcgaa gaacccagct acagacagca ggccgccgtg 2040
cccctggcct ctgaaaccca cggcggagaa gacgtggccg tgttcgctag gggaccccag 2100
gcccacctgg tgcatggagt gcaggaggaa accttcgtgg cccacatcat ggcctttgcc 2160
ggctgtgtgg agccctacac agactgtaac ctgcccgccc ctgccacagc taccagcatt 2220
cccgac 2226
<210> 8
<211> 742
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser
180 185 190
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg
195 200 205
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn Arg Gln Ala Ala
260 265 270
Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala Ala
275 280 285
Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Pro Thr Val
290 295 300
Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly Lys Leu Gly Pro
305 310 315 320
Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys
325 330 335
Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala Thr
340 345 350
Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Arg Thr Ile Gly Val Ser
355 360 365
Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val
370 375 380
Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly Val
385 390 395 400
Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr Ala
405 410 415
His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala Asp
420 425 430
Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Ala Gln Leu Val Tyr Asn
435 440 445
Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe Pro
450 455 460
Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Ala Ser Val Asn Gly
465 470 475 480
Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys His
485 490 495
Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala Ala
500 505 510
Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala Asp
515 520 525
Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu Ala
530 535 540
Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly
545 550 555 560
Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Asp
565 570 575
Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala Ile Met Phe Asp Asn Ala
580 585 590
Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile Leu
595 600 605
Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr Leu
610 615 620
Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Leu Asp Ser
625 630 635 640
Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala Leu
645 650 655
Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly Ser Thr Ser Glu Glu Pro
660 665 670
Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His Gly
675 680 685
Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val
690 695 700
His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe Ala
705 710 715 720
Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Ala Thr
725 730 735
Ala Thr Ser Ile Pro Asp
740

Claims (10)

1.Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，目标抗体选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。
3.根据权利要求2所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗体选自人鼠嵌合抗体，人兔嵌合抗体或鼠兔嵌合抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽，所述柔性连接肽为(GGGGS)n或(GGGS)n，刚性连接肽为A(EAAAK)nA，n为3,4,5,6,7,8之一。
5.权利要求1-4任一项所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体制备方法的步骤如下：
a.根据目标抗体的VL-CL和VH-CH1核苷酸序列，连接肽核苷酸序列，小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成后酶切基因，分别连接到载体上；
b.将构建后的重组载体转染到哺乳细胞中，经培养细胞后，即可在细胞培养液上清得到Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b中哺乳细胞为CHO细胞，HEK293细胞，Expi293细胞，COS7细胞，NSO细胞或BHK21细胞。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pCDNA/GS载体，重组载体转染到哺乳细胞后还包括步骤c，将用抑制剂加压筛选表达高活性蛋白的克隆，再采用批培养，Fed-batch培养筛选，结合高通量酶活鉴定方法，获取高表达Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白稳定细胞株，继续放大Fed-batch培养生产，10-14天后收集上清。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b中培养细胞时，培养基中含有2mMMgCl2,0.1mM ZnCl2。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤d蛋白纯化，收集细胞培养液上清，加入50-55％硫酸铵沉淀，沉淀溶解于缓冲液A中，经Phenyl HP疏水层析，洗脱蛋白再经DEAE弱阴离子交换层析，最后得到的高活性Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
10.权利要求1-4任一项所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白在免疫检测试剂中的应用。
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